Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59977

⸱

3 października 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Streszczenie

Manipulowanie genami w krwiotwórczych komórkach macierzystych przy użyciu konwencjonalnych metod transgenezy może być czasochłonne, kosztowne i trudne. Korzystając z postępów w technologii edycji genomu i systemów dostarczania transgenów za pośrednictwem lentiwirusa, opisano tutaj wydajną i ekonomiczną metodę, która zakłada myszy, u których geny są manipulowane specyficznie w hematopoetycznych komórkach macierzystych. Lentiwirusy są używane do transdukcji ujemnych komórek szpiku kostnego z ekspresją Cas9 za pomocą przewodnika RNA (gRNA) ukierunkowanego na określone geny i gen reporterowy czerwonej fluorescencji (RFP), a następnie komórki te są przeszczepiane do śmiertelnie napromieniowanych myszy C57BL / 6. Myszy, którym przeszczepiono lentiwirusa z ekspresją niedocelowego gRNA, są używane jako kontrole. Wszczepienie transdukowanych hematopoetycznych komórek macierzystych ocenia się za pomocą analizy cytometrii przepływowej leukocytów RFP-dodatnich krwi obwodowej. Stosując tę metodę, można osiągnąć ~90% transdukcji komórek szpikowych i ~70% komórek limfoidalnych po 4 tygodniach od przeszczepu. Genomowe DNA jest izolowane z komórek krwi RFP-dodatnich, a części DNA w miejscu docelowym są amplifikowane metodą PCR w celu walidacji edycji genomu. Protokół ten zapewnia wysokoprzepustową ocenę genów regulujących hematopoezę i może być rozszerzony na różne modele chorób myszy z udziałem komórek krwiotwórczych.

Wprowadzenie

Wiele badań z zakresu hematologii i immunologii opiera się na dostępności genetycznie modyfikowanych myszy, w tym konwencjonalnych i warunkowo transgenicznych/nokautujących myszy, które wykorzystują specyficzne dla układu krwiotwórczego sterowniki Cre, takie jak Mx1-Cre, Vav-Cre i inne1,2,3,4,5. Strategie te wymagają stworzenia nowych szczepów myszy, co może być czasochłonne i obciążające finansowo. Podczas gdy rewolucyjne postępy w technologii edycji genomu umożliwiły wygenerowanie nowych szczepów myszy w ciągu zaledwie 3-4 miesięcy dzięki odpowiedniej wiedzy technicznej6,7,8,9, potrzeba znacznie więcej czasu, aby amplifikacja kolonii myszy została przeprowadzona przed rozpoczęciem eksperymentów. Ponadto procedury te są kosztowne. Na przykład Jackson Laboratory podaje obecną cenę usług generowania myszy knock-out na poziomie 16 845 USD za szczep (stan na grudzień 2018 r.). W związku z tym metody, które są bardziej ekonomiczne i wydajne niż konwencjonalne mysie podejścia transgeniczne, są korzystniejsze.

Technologia CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9) doprowadziła do opracowania nowych narzędzi do szybkiej i efektywnej edycji genomu opartego na RNA, specyficznej dla sekwencji. Pierwotnie odkryty jako bakteryjny adaptacyjny mechanizm immunologiczny do niszczenia atakującego DNA patogenu, system CRISPR/Cas9 został wykorzystany jako narzędzie zwiększające skuteczność edycji genomu w komórkach eukariotycznych i modelach zwierzęcych. Zastosowano szereg podejść do przesyłania maszynerii CRISPR/Cas9 do hematopoetycznych komórek macierzystych (tj. elektroporacja, nukleofekcja, lipofekcja, dostarczanie wirusa i inne).

Tutaj system lentiwirusowy jest używany do transdukcji komórek ze względu na jego zdolność do skutecznego infekowania mysich hematopoetycznych komórek macierzystych z ekspresją Cas9 i pakowania razem przewodnika ekspresji RNA, promotorów, sekwencji regulatorowych i genów kodujących fluorescencyjne białka reporterowe (np. GFP, RFP). Za pomocą tej metody uzyskano edycję genów ex vivo krwiotwórczych komórek macierzystych myszy, a następnie udaną rekonstytucję szpiku kostnego u śmiertelnie napromieniowanych myszy10. Wektor lentiwirusowy zastosowany w tym badaniu wykazuje ekspresję genów reporterowych Cas9 i GFP ze wspólnego rdzeniowego promotora EF1a z wewnętrznym rybosomalnym miejscem wejścia przed genem reporterowym. Sekwencja przewodnikowego RNA jest wyrażana z oddzielnego promotora U6. System ten jest następnie wykorzystywany do tworzenia mutacji insercyjnych i delecyjnych w kandydujących genach napędzających hematopoezę klonalną Tet2 i Dnmt3a10. Jednak wydajność transdukcji tą metodą jest stosunkowo niska (~5%-10%) ze względu na duży rozmiar wstawki wektorowej (13 Kbp), który ogranicza wydajność transdukcji i zmniejsza miano wirusa podczas produkcji.

W innych badaniach wykazano, że większy rozmiar wirusowego RNA negatywnie wpływa zarówno na produkcję wirusa, jak i na efektywność transdukcji. Na przykład, wzrost rozmiaru wkładki o 1 kb zmniejsza produkcję wirusa o ~50%, a wydajność transdukcji spadnie do ponad 50% w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy11. Dlatego korzystne jest maksymalne zmniejszenie rozmiaru wstawki wirusowej, aby poprawić wydajność systemu.

To niedociągnięcie można przezwyciężyć poprzez zastosowanie transgenicznych myszy Cas9, u których białko Cas9 jest wyrażane w sposób konstytutywny lub indukowalny12. Składowe myszy knock-in CRISPR / Cas9 eksprymują endonukleazę Cas9 i EGFP z promotora CAG w locus Rosa26 w powszechny sposób. W ten sposób konstrukt z sgRNA pod kontrolą promotora U6 i genu reporterowego RFP pod kontrolą głównego promotora EF1a może być dostarczony przy użyciu wektora lentiwirusa w celu uzyskania edycji genomu. Dzięki temu systemowi geny hematopoetycznych komórek macierzystych zostały pomyślnie zredagowane, wykazując ~90% skuteczność transdukcji. W ten sposób protokół ten zapewnia szybką i skuteczną metodę tworzenia myszy, u których do układu krwiotwórczego wprowadzane są docelowe mutacje genów. Chociaż nasze laboratorium wykorzystuje głównie tego typu technologię do badania roli klonalnej hematopoezy w procesach chorób sercowo-naczyniowych13,14,15, ma ona również zastosowanie do badań nad nowotworami hematologicznymi16. Ponadto protokół ten można rozszerzyć o analizę wpływu mutacji DNA w HSPC na inne choroby lub procesy rozwojowe w układzie krwiotwórczym.

Aby stworzyć solidny system wektorów lentiwirusowych, potrzebne są zapasy wirusów o wysokim mianie oraz zoptymalizowane warunki do transdukcji i przeszczepu komórek krwiotwórczych. W protokole w sekcji 1 znajdują się instrukcje dotyczące przygotowania szczepu wirusa o wysokim mianie, optymalizacji warunków hodowli mysich krwiotwórczych komórek macierzystych w sekcji 2, metod przeszczepiania szpiku kostnego w sekcji 3 oraz oceny wszczepienia w sekcji 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Wirginii.

1. Wytwarzanie i oczyszczanie cząsteczek lentiwirusa

UWAGA: Cząsteczki lentiwirusa zawierające zoptymalizowany przewodnik RNA mogą być wytwarzane za pomocą szczegółowych protokołów dostarczonych przez Addgene: . Zoptymalizowane metody przygotowania i przechowywania lentiwirusa o wysokim mianie są omówione w innym miejscu17,18. Krótko mówiąc, lentiwirusy są wytwarzane przez jednoczesną transfekcję plazmidu wektorowego lentiwirusa, psPAX2 i pMD2.G do komórek HEK 293T. Supernatant hodowli zbiera się po 48 godzinach od transfekcji i zagęszcza przez ultrawirowanie. Miano lentiwirusa określa się za pomocą dostępnego na rynku testu opartego na qPCR. Procedura ta powinna być wykonywana w komorze bezpieczeństwa biologicznego II klasy.

  1. Przygotuj roztwór kolagenu (0,0005%) w proporcji 1:200 w 1x PBS.
  2. Pokryj 6-dołkową płytkę roztworem kolagenu i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez ~30 min.
  3. Wysiewać komórki 293T o gęstości 1 x 106 komórek na studzienkę i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez ~ 2 godziny.
  4. Aby przygotować mieszaninę trzech plazmidów transfekcyjnych dla jednej studzienki, połącz 0,9 μg wektora lentiwirusa, 0,6 μg psPAX2 i 0,3 μg pMD2.G, a następnie osiągnij całkowitą objętość 10 μl, dodając wodę dejonizowaną. Dostosuj odpowiednio ilości w zależności od liczby dołków. Ilość i stosunek każdego plazmidu może wymagać dalszej optymalizacji, aby odpowiadał potrzebom badaczy.
  5. Ostrożnie dodać 50 μl 1x PBS i 5 μL rozcieńczonego PEI MAX (1,0 mg/mL) do mieszaniny plazmidu i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) (Tabela 1).
  6. Dodaj 1 ml DMEM do mieszaniny.
  7. Odessać pożywkę z płytki 6-dołkowej, dodać 1 ml mieszaniny plazmidu i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez ~ 3 godziny.
  8. Zastąp pożywkę 2 ml świeżego DMEM i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
  9. Dodać 1 ml świeżego DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez dodatkowe 24 godziny (całkowity czas inkubacji wynosi 48 godzin).
  10. Przenieść supernatant hodowli do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 3 000 x g przez 15 minut w celu usunięcia wszelkich swobodnie pływających komórek.
  11. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,45 μm.
  12. Przenieść filtrat do polipropylenowych probówek wirówkowych.
  13. Ultrawirować w temperaturze 4 °C i 72 100 x g przy rmax przez 3 godziny.
  14. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając biały osad.
  15. Zawiesić osad ze 100 μl pożywki do namnażania komórek krwiotwórczych bez surowicy bez napowietrzania.
  16. Zachować 10 μl podwielokrotności do pomiaru miana wirusa i przechowywać wszystkie pozostałe podwielokrotności w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie to wymagane.
  17. Miareczkować wirusa za pomocą testu opartego na qPCR zgodnie z instrukcjami producenta, używając 10 μl podwielokrotności wirusa.

2. Izolacja i transdukcja komórek line-ujemnych ze szpiku kostnego myszy (Rysunek 1A)

UWAGA: Zazwyczaj, aby wyizolować wystarczającą ilość komórek, z każdej myszy pobiera się pary piszczeli, kości udowych i ramiennych. Kości miednicy i kręgosłupa mogą być również pobierane jako źródło komórek ujemnych pod względem linii.

  1. Izolacja komórek szpiku kostnego
    1. Eutanazja 8-10-tygodniowych samców myszy knock-in CRISPR/Cas9 za pomocą 5% izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy, a następnie dezynfekcja ich skóry 70% etanolem.
    2. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj poprzeczne nacięcie w skórze tuż pod klatką piersiową i oderwij skórę dystalnie w obu kierunkach, aby odsłonić nogi i ramiona.
    3. Ostrożnie oddziel kończyny dolne od kości biodrowej, zwichając staw biodrowy. Przeciąć wzdłuż głowy kości udowej, aby całkowicie usunąć kość udową z biodra. Zwichnąć kolano i przeciąć staw, aby oddzielić kość udową i piszczelową, zachowując nienasadę kości. Zwichnij staw skokowy i oderwij stopę i dodatkowe mięśnie.
    4. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć ramię, aby odłączyć kończyny górne. Zwichnij ramię, a następnie przeciąć staw łokciowy, aby pobrać kość ramienną.
    5. Użyj chusteczek z włókien celulozowych, aby ostrożnie usunąć mięśnie z kości udowych, piszczeli i kości ramiennej. Podejmij dodatkowe środki ostrożności, aby upewnić się, że kości nie pękną podczas tego procesu.
    6. Umieść odizolowane kości w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej RPMI i umieść na lodzie.
      UWAGA: Następujące czynności należy wykonać w komorze klasy bezpieczeństwa biologicznego II.
    7. Przenieś kości do sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm.
    8. Chwyć kość kleszczami i za pomocą nożyczek preparacyjnych ostrożnie przetnij obie nasady.
      UWAGA: Niewystarczające cięcie doprowadzi do niepełnego wypłukania szpiku kostnego, podczas gdy zbyt agresywne cięcie spowoduje utratę komórek.
    9. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml lodowatym RPMI i za pomocą igły 22 G przepłucz szpik kostny z trzonu do nowego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm.
      UWAGA: Kości staną się białe i półprzezroczyste, jeśli trzon kości został dobrze przepłukany. Jeśli nie, ponownie odetnij końce kości i ponownie przepłucz.
    10. Po pobraniu całego szpiku kostnego należy sporządzić zawiesinę jednokomórkową, kilkakrotnie przepuszczając szpik kostny przez strzykawkę o pojemności 10 ml z igłą 18 G. Powtórz 10 razy, aby zapewnić zawiesinę jednokomórkową.
    11. Zawiesinę komórek filtracyjnych przez sitko o pojemności 70 μm do stożkowej rurki o pojemności 50 ml.
    12. Wirować przy 310 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    13. Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w odpowiedniej objętości zoptymalizowanego buforu separacyjnego do następnego procesu separacji komórek.
  2. Izolacja i transdukcja lentiwirusa komórek line-ujemnych
    UWAGA: Komórki ujemne pod względem linii myszy są izolowane ze szpiku kostnego myszy transgenicznych Cas9 3 lub innych szczepów myszy, przy użyciu zestawu do zmniejszania linii zgodnie z instrukcjami producenta. Zazwyczaj komórki ujemne pod względem linii stanowią 2%-5% komórek jądrzastych całego szpiku kostnego, a czystość jest zwykle większa niż 90% po izolacji. Izolowane komórki ujemne pod względem linii są hodowane w pożywce do eksploratorium komórek krwiotwórczych bez surowicy, uzupełnionym rekombinowanym mysim TPO o stężeniu 20 ng / ml i rekombinowanym mysim SCF o stężeniu 50 ng / mL, a następnie transdukowane wektorem lentiwirusa przez 16 godzin przy wielokrotności infekcji (MOI) = 100.
    1. Aby wyizolować komórki o ujemnym wpływie linii, użyj zestawu do zubożenia komórek liniowych zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Po izolacji ponownie zawiesić komórki ujemne pod względem linii w 1 ml pożywki do ekspandowania komórek krwiotwórczych bez surowicy.
    3. Zasiej komórki na płytce 6-dołkowej o gęstości 1,5 x 106 komórek/ml (5 x 10,5 komórek ujemnych linii/myszy).
    4. Dodać rekombinowane mysie TPO i SCF do studzienek w końcowych stężeniach odpowiednio 20 ng / ml i 50 ng / ml.
    5. Wstępną inkubację komórek w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez ~ 2 godziny.
    6. Dodać lentiwirusa w MOI = 100, 4 μg/ml polibrenu i penicyliny/streptomycyny do studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 16-20 godzin (Rysunek 1B).
    7. Następnego dnia zebrać transdukowane komórki lentiwirusa do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 g przez 10 minut.
    8. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl RPMI na mysz. Utrzymuj komórki w RT do czasu przeszczepienia myszom (sekcja 3).

3. Przeszczepienie transdukowanych komórek do śmiertelnie napromieniowanych myszy

  1. W dniu przeszczepu szpiku kostnego należy umieścić myszy biorcy w klatce z ośmioma plasterkami ciasta i poddać je dwóm dawkom napromieniania całego ciała (550 Rad/dawkę, dawka całkowita = 1100 Rad), z około 4 godzinami między każdą sesją napromieniania.
  2. Po drugiej sesji napromieniania wstrzyknąć transdukowane komórki ujemne linii do każdej znieczulonej myszy biorcy przez splot żyły zaoczodołowej (łącznie 200 μl) za pomocą strzykawki insulinowej (Ryc. 1C).
  3. Po napromienieniu myszy powinny być trzymane w wysterylizowanych klatkach i zapewnić im miękką dietę oraz wodę pitną uzupełnioną antybiotykami przez 14 dni.
  4. Po 3-4 tygodniach od przeszczepienia szpiku kostnego należy przeanalizować krew obwodową, aby sprawdzić, czy doszło do wszczepienia transdukowanych komórek dawcy (sekcja 4).

4. Ocena chimeryzmu krwi obwodowej

  1. Znieczulić myszy 5% izofluranem i uzyskać próbkę krwi z żyły zaoczodołowej za pomocą kapilar i zebrać ją do probówek K2EDTA (objętość w jednej probówce kapilarnej jest wystarczająca do następnego testu).
  2. Przenieś 20 μl krwi z probówek K2EDTA do probówek z polistyrenu o pojemności 5 ml z okrągłym dnem i umieść na lodzie.
  3. Dodaj 1,5 ml buforu do lizy RBC, aby zlizować czerwone krwinki. Inkubować przez 5 minut na lodzie.
  4. Aby zneutralizować bufor do lizy, przemyj próbki buforem FACS (1,5 ml/próbkę).
  5. Wirować przy 609 x g przymaksymalnej prędkości obrotowej przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  6. Inkubować komórki z koktajlem przeciwciał monoklonalnych (rozcieńczonych w 100 μl buforu/próbce FACS) w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności. Pełna lista przeciwciał znajduje się w sekcji Materiały powyżej.
  7. Przemyć komórki raz buforem FACS (2 ml/próbkę). Wirować przy 609 x g przymaksymalnej prędkości obrotowej (1 800 obr./min) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant.
  8. Utrwalić komórki buforem utrwalającym zawierającym paraformaldehyd (100 μl/probówkę) przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Umyć komórki raz buforem FACS (3 ml/próbkę). Wirować przy 609 x g przymaksymalnej prędkości obrotowej (1 800 obr./min) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant.
  10. Zawiesić osad w 400 μl buforu FACS.
  11. Próbki należy utrzymywać w temperaturze 4 °C do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisany powyżej protokół, uzyskano około 0,8-1,0 x 108 komórek szpiku kostnego na mysz. Liczba uzyskanych przez nas komórek lineage-negative wynosi około 3 x 106 komórek na mysz. Zazwyczaj wydajność komórek szpiku kostnego lineage-negative stanowi 4%-5% całkowitej liczby jądrzastych komórek szpiku kostnego.

Chimeryzm przetransdukowanych komórek (RFP-dodatnich) ocenia się za pomocą cytometrii przepł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zaletą tego protokołu jest tworzenie modeli zwierzęcych zawierających specyficzne mutacje w komórkach krwiotwórczych w szybki i wysoce opłacalny sposób w porównaniu z konwencjonalnymi metodami transgenicznymi na myszach. Stwierdzono, że metodologia ta umożliwia generowanie myszy z manipulacją genami komórek krwiotwórczych w ciągu 1 miesiąca. W tym protokole jest kilka krytycznych kroków, które wymagają dalszego rozważenia.

Badania przesiewowe sekwencji gRNA

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

S. S. był wspierany przez stypendium podoktoranckie American Heart Association 17POST33670076. K. W. był wspierany przez granty NIH R01 HL138014, R01 HL141256 i R01 HL139819.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093Medium
Sulfametoksazol i trimetoprim do wstrzykiwańTEVA0703-9526-01
1/2 cc STRZYKAWKA INSULINOWA LO-DOSEEXELINT26028zaopatrzenie ogólne
293T cellsATCC CRL-3216 -Linia komórkowa
APC-anty-mysz Ly6C (klon AL-21)BD Biosciences560599przeciwciała
APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)BD Biosciences552094Przeciwciała
Jednorazowe strzykawki BD Luer-Lok, 10 mlBD309604ogólnego zaopatrzenia
Probówki do pobierania krwi BD Microtainer, K2EDTA DodanoBD Bioscience365974ogólne
zaopatrzenie Igła BD Precisionglide, 18 GBD 305195ogólne
zaopatrzenie Igła BD Precisionglide, 22 G Ogólne zaopatrzenie305155 BD
BV510-anty-myszy CD8a (klon 53-6.7)Przeciwciała Biolegend100752
BV711-anty-myszy CD3e (klon 145-2C11)Przeciwciała Biolegend100349
Kolagen ze skóry cielęcejSigma-Aldrich9007-34-5dostawa ogólna
Corning Costar Ultra-Low Attachment Płytka wielodołkowa, 6-dołkowa Millipore Sigma CLS3471
CRISPR/Cas9Myszy028555Jackson
DietGel 76AClear H2O70-01-5022
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM) - wysoka glukozaSigma AldrichD6429Medium
eBioscience 1X RBC Lysis BufferThermo fisher Scientific00-4333-57Roztwór
Falcon 100 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TCNauki przyrodnicze353003zaopatrzenie ogólne
Falcon 5 ml probówka z polistyrenu o okrągłym dnie Naukiprzyrodnicze352054zaopatrzenie ogólne
Falcon 50 ml stożkowy Probówki wirówkoweFisher Scientific352098ogólne zaopatrzenie
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Multiwell Multiwell Cell Culture Plate z płaskim dnem Nauki przyrodnicze353046ogólne zaopatrzenie
Rurki kapilarne do mikrohematokrytu FisherbrandThermo Fisher Scientific22-362566zaopatrzenie ogólne
Sitka do komórek sterylnych Fisherbrand, 70 μ mFisher Scientific22363548ogólne zaopatrzenie
FITC-anti-mouse CD4 (klon RM4-5)Invitrogen11-0042-85
Bufor do utrwalaniaBD Bioscience554655Przewodnik po roztworach
-it Compete Systemy przesiewowe sgRNAClontech632636
Kit Roztwór izotezji (izofluranu)Henry Schein29404
Zestaw do miareczkowania Solution Lenti-X qRT-PCR Takara631235 Kit
Lineage Cell Depletion Kit, myszMiltenyi Biotec130-090-858Zestaw
filtra strzykawkowego Millex-HV, 0,45 mmMillipore SigmaSLHV004SLogólne zaopatrzenie
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Solution
PE-Cy7-anti-mouse CD115 (klon AFS98)eBioscience25-1152-82Przeciwciała
PEI MAXPolysciences24765-1Roztwór
Mieszanina penicyliny i streptomycynyLonza17-602FRoztwór
PerCP-Cy5.5-anty-myszy Ly6G (klon 1A8)BD Biosciences560602Przeciwciała
pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP Addgene57823Plazmid
pMG2DAddgene12259Plazmid
Polybrene Odczynnik do infekcji/transfekcjiSigma AldrichTR-1003-GRoztwór
Polipropylenowe probówki wirówkoweBECKMAN COULTER326823ogólne zaopatrzenie
psPAX2 Addgene12260Plazmid
RadDisk – Dysk naświetlacza gryzoniBraintree ScientificIRD-P MDostawa ogólna
Rekombinowana mysia SCFPeprotech250-03Roztwór
Rekombinowany mysz TPO Peprotech 315-14Solution
StemSpan SFEMSTEMCELL Technologies09600Solution
TOPO TA zestaw do klonowania do sekwencjonowania za pomocą One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E.coliThermo fisher ScientificK457501Kit
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend423102Solution 
Myszy knock-in Laboratory przeciwciał

Bibliografia

  1. Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
  2. Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
  3. Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
  4. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
  5. Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
  6. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
  7. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  8. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92(2017).
  9. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
  10. Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
  11. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
  12. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
  13. Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
  14. Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
  15. Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
  16. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
  17. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875(2015).
  18. Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98(2013).
  19. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168(2014).
  20. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888(2018).
  21. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
  22. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
  23. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
  24. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
  25. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
  26. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
  27. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
  28. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
  29. Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
  30. Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

hematopoetyczne komórki macierzystecytometria przepływowaprzeszczep szpiku kostnegokomórki lineage-negativegen reporterowy RFPpomiar miana wirusaanaliza krwi obwodowejPCR genomowego DNA
Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.