Zautomatyzowane sięganie pojedynczych śruin szczura z 3-wymiarową rekonstrukcją trajektorii łap i palców

Podsumowanie

Umiejętne sięganie gryzoni jest powszechnie używane do nauki zręczności, ale wymaga znacznego czasu i wysiłku do wykonania zadania i przeanalizowania zachowania. Opisujemy zautomatyzowaną wersję umiejętnego docierania ze śledzeniem ruchu i trójwymiarową rekonstrukcją trajektorii zasięgu.

Streszczenie

Umiejętne sięganie gryzoni jest powszechnie używane do nauki zręczności, ale wymaga znacznego czasu i wysiłku do wykonania zadania i przeanalizowania zachowania. W ostatnim czasie opracowano kilka zautomatyzowanych wersji umiejętnego docierania. Tutaj opisujemy wersję, która automatycznie prezentuje granulki szczurom podczas nagrywania wideo w wysokiej rozdzielczości pod różnymi kątami przy dużej liczbie klatek na sekundę (300 kl./s). Łapa i poszczególne palce są śledzone za pomocą DeepLabCut, algorytmu uczenia maszynowego do szacowania pozycji bez znaczników. System ten może być również zsynchronizowany z zapisami fizjologicznymi lub może być wykorzystany do wyzwalania interwencji fizjologicznych (np. stymulacji elektrycznej lub optycznej).

Wprowadzenie

Ludzie polegają w dużym stopniu na umiejętnościach zręcznościowych, definiowanych jako ruchy, które wymagają precyzyjnie skoordynowanych ruchów wielostawowych i palcowych. Na umiejętności te wpływa szereg powszechnych patologii ośrodkowego układu nerwowego, w tym zmiany strukturalne (np. udar, guz, zmiany demielinizacyjne), choroby neurodegeneracyjne (np. Choroba Parkinsona) i nieprawidłowości funkcjonalne obwodów motorycznych (np. dystonia). Zrozumienie, w jaki sposób umiejętności zręcznościowe są nabywane i wdrażane przez centralne obwody motoryczne, może zatem poprawić jakość życia dużej populacji. Co więcej, takie zrozumienie może poprawić sprawność motoryczną u zdrowych ludzi poprzez optymalizację strategii treningowych i rehabilitacyjnych.

Analizowanie obwodów neuronalnych leżących u podstaw zręczności u ludzi jest ograniczone względami technologicznymi i etycznymi, co wymaga użycia modeli zwierzęcych. Naczelne są powszechnie wykorzystywane do badania zręczności kończyn ze względu na podobieństwo ich układów motorycznych i repertuaru behawioralnego do ludzi¹. Jednak naczelne inne niż ludzie są drogie, mają długi czas pokoleniowania, co ogranicza liczbę badanych i interwencji genetycznych. Co więcej, chociaż zestaw narzędzi neuronaukowych mających zastosowanie do naczelnych jest większy niż do ludzi, wiele najnowszych osiągnięć technologicznych jest albo niedostępnych, albo znacznie ograniczonych u naczelnych.

Umiejętne sięganie do gryzoni jest uzupełniającym podejściem do nauki zręczności motorycznej. Szczury i myszy można wyszkolić, aby sięgały, chwytały i aportowały granulki cukru w stereotypowej sekwencji ruchów homologicznej do ludzkich wzorców sięgania². Ze względu na ich stosunkowo krótki czas wytwarzania i niższe koszty mieszkaniowe, a także zdolność do zdobywania umiejętności w ciągu kilku dni lub tygodni, możliwe jest studiowanie dużej liczby przedmiotów zarówno w fazie uczenia się, jak i utrwalania umiejętności. Wykorzystanie gryzoni, zwłaszcza myszy, ułatwia również korzystanie z potężnych nowoczesnych narzędzi neuronaukowych (np. optogenetyki, obrazowania wapnia, genetycznych modeli chorób) do badania umiejętności zręcznościowych.

Umiejętne docieranie do gryzoni jest używane od dziesięcioleci do badania normalnej kontroli motorycznej i tego, jak wpływają na nią określone patologie, takie jak udar mózgu i choroba Parkinsona³. Jednak większość wersji tego zadania jest pracochłonna i czasochłonna, co łagodzi korzyści płynące z badania gryzoni. Typowe wdrożenia polegają na umieszczeniu gryzoni w komorze sięgającej z półką przed wąską szczeliną, przez którą gryzoń musi sięgnąć. Badacz ręcznie umieszcza granulki cukru na półce, czeka, aż zwierzę dotrze, a następnie umieszcza kolejny. Zasięgi są oceniane jako sukcesy lub porażki w czasie rzeczywistym lub za pomocą przeglądu wideo⁴. Jednak samo ocenianie zasięgu jako sukcesów lub porażek ignoruje bogate dane kinematyczne, które mogą dostarczyć informacji o tym, w jaki sposób (a nie tylko czy) docieranie jest upośledzone. Ten problem rozwiązano przez wprowadzenie szczegółowego przeglądu filmów docierających do odbiorców w celu zidentyfikowania i częściowego ilościowego oceny zasięgu podruchów⁵. Chociaż dodało to trochę danych dotyczących kinematyki zasięgu, znacznie wydłużyło to czas i wysiłek eksperymentatorów. Co więcej, wysoki poziom zaangażowania eksperymentatorów może prowadzić do niespójności w metodologii i analizie danych, nawet w obrębie tego samego laboratorium.

Ostatnio opracowano kilka zautomatyzowanych wersji umiejętnego docierania. Niektóre dołączają do klatki domowej^6,7, eliminując potrzebę przenoszenia zwierząt. Zmniejsza to zarówno stres u zwierząt, jak i eliminuje konieczność aklimatyzacji ich w specjalistycznej komorze dosięgowej. Inne wersje pozwalają na śledzenie łap, dzięki czemu można badać zmiany kinematyczne pod wpływem określonych interwencji^8,9,10, lub mają mechanizmy automatycznego określania, czy granulki zostały strącone z półki¹¹. Zautomatyzowane zadania związane z umiejętnością sięgania są szczególnie przydatne w przypadku treningu o wysokiej intensywności, ponieważ mogą być wymagane do rehabilitacji po kontuzji¹². Zautomatyzowane systemy pozwalają zwierzętom na wykonywanie dużej liczby wysięgów przez długi czas bez konieczności intensywnego zaangażowania badaczy. Co więcej, systemy, które umożliwiają śledzenie łap i automatyczną ocenę wyników, skracają czas poświęcany przez badaczy na analizę danych.

Opracowaliśmy zautomatyzowany system docierania do szczurów z kilkoma specjalistycznymi funkcjami. Po pierwsze, używając ruchomego postumentu do ustawienia śrutu w "pozycji sięgającej" od dołu, uzyskujemy prawie niezakłócony widok na kończynę przednią. Po drugie, system luster umożliwia wiele jednoczesnych widoków zasięgu za pomocą jednej kamery, co pozwala na trójwymiarową (3D) rekonstrukcję trajektorii zasięgu przy użyciu szybkiej kamery o wysokiej rozdzielczości (300 kl./s). Dzięki niedawnemu rozwojowi solidnych algorytmów uczenia maszynowego do śledzenia ruchu bez znaczników¹³, śledzimy teraz nie tylko łapę, ale także poszczególne kostki, aby uzyskać szczegółowy zasięg i kinematykę uchwytu. Po trzecie, frame-grabber, który wykonuje proste przetwarzanie wideo, umożliwia identyfikację w czasie rzeczywistym różnych faz docierania. Informacje te są wykorzystywane do wyzwalania akwizycji wideo (ciągłe pobieranie wideo nie jest praktyczne ze względu na rozmiar pliku), a także mogą być wykorzystywane do wyzwalania interwencji (np. optogenetyki) w określonych momentach. Wreszcie, poszczególne klatki wideo są wyzwalane przez impulsy logiki tranzystor-tranzystor (TTL), co pozwala na precyzyjną synchronizację wideo z nagraniami neuronowymi (np. elektrofizjologią lub fotometrią). Tutaj opisujemy, jak zbudować ten system, wyszkolić szczury do wykonania zadania, zsynchronizować aparaturę z systemami zewnętrznymi i zrekonstruować trajektorie dotarcia 3D.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody związane z wykorzystaniem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.

1. Ustawianie komory sięgającej

UWAGA: Zobacz Ellens et al.¹⁴ po szczegóły i schematy aparatu. Numery części odnoszą się do Rysunek 1.

1. Połącz przezroczyste panele poliwęglanowe z cementem akrylowym, aby zbudować komorę dostępową (15 cm szerokości 40 cm długości i 40 cm wysokości) (część #1). Na jednym panelu bocznym (część #2) znajdują się drzwi na zawiasach (18 cm szerokości i 15 cm wysokości) z zamkiem. Jeśli szczur będzie przywiązany do, wytnij szczelinę (5 cm szerokości i 36 cm długości) w suficie komory, aby go pomieścić (część #12). Panel podłogowy ma wyciętych 18 otworów (o średnicy 1,75 cm) (część #13) i nie jest połączony z resztą komory.
2. Zamontuj i wyrównaj czujniki podczerwieni (część #3) w panelach bocznych 4.5 cm od tyłu komory i 3.8 cm od podłogi. Oprogramowanie behawioralne ma wskaźnik ("IR Back"), który jest zielony, gdy wiązka podczerwieni jest nieprzerwana, i czerwona, gdy wiązka jest przerwana. Po skonfigurowaniu oprogramowania można go użyć do sprawdzenia wyrównania czujnika.
3. Zamontuj lustro (15 cm x 5 cm, część #4) 10 cm nad szczeliną sięgającą (część #14). Ustaw lustro pod takim kątem, aby pręt doprowadzający granulki był widoczny dla kamery.
4. Umieść komorę na nadającym się do dezynfekcji pudełku (59 cm szerokości, 67,3 cm długości i 30,5 cm wysokości, część #5). Komora znajduje się nad otworem w skrzynce nośnej (12 cm szerokości i 25 cm długości), który umożliwia wypadanie śmieci przez otwory w podłodze (część #13) i wydostawanie się z komory sięgającej. Wytnij drugi otwór (7 cm szerokości i 6 cm długości, część #15) w skrzynce nośnej przed szczeliną sięgającą, która umożliwia prętowi dostarczającemu pelety doprowadzenie granulek do szczeliny sięgającej.
5. Zamontuj dwa lustra (8.5 cm szerokości x 18.5 cm wysokości, część #6) do podłogi za pomocą magnesów po obu stronach komory tak, aby długa krawędź lustra stykała się z panelem bocznym 3 cm od przodu skrzynki sięgającej. Ustaw lusterka pod takim kątem, aby kamera mogła zajrzeć do pudełka i obszaru przed szczeliną sięgającą, do której zostanie dostarczony śrut
.
6. Zamontuj kamerę o wysokiej rozdzielczości (część #7) 17 cm od szczeliny dosięgowej, przodem do pudełka.
7. Zamontuj papier (część #18) po obu stronach aparatu, tak aby tło w lusterkach bocznych było ciemne. Zwiększa to kontrast, aby poprawić wykrywanie łap w czasie rzeczywistym i offline.
8. Zamontuj siłownik liniowy (część #16) na nadającej się do dezynfekcji ramie (25 cm szerokości, 55 cm długości i 24 cm wysokości, część #8) za pomocą. Siłownik jest zamontowany do góry nogami, aby zapobiec gromadzeniu się pyłu peletowego w potencjometrze wykrywającym położenie.
9. Włóż piankowy O-ring do szyjki zbiornika na pelety (lejka) (część #9), aby zapobiec gromadzeniu się kurzu w zespole. Zamontuj lejek poniżej otworu (średnica ~6 cm, część #17) w górnej części ramy, wsuwając krawędzie lejka nad trzy wywiercone w dolnej części górnej części ramy. Włóż rurkę prowadzącą (część #10) do szyjki lejka.
10. Przymocuj plastikowe złącze T do końca stalowego pręta siłownika. Włóż stożkowy koniec pręta doprowadzającego pelety do górnej części złącza, a zakończony koniec przez rurkę prowadzącą do zbiornika na pelety.
11. Umieść zespół siłownika liniowego pod komorą dozującą do pomiaru tak, aby pręt doprowadzający pelety mógł wystawać przez otwór (część #15) przed szczeliną sięgającą.
12. Całe urządzenie sięgające umieść w szafce na kółkach (121 cm x 119 cm x 50 cm) wentylowanej wentylatorami komputerowymi (wnętrze nagrzewa się, gdy jest dobrze oświetlone) i wyłożonej pianką akustyczną.
13. Zbuduj pięć paneli świetlnych (część #11), przyklejając paski świetlne LED do paneli nośnych o wymiarach 20,3 cm na 25,4 cm. Zamontuj folię dyfuzora na paskach świetlnych. Zamontuj jeden panel świetlny na suficie nad obszarem pręta doprowadzającego pelety. Zamontuj pozostałe cztery po bokach szafek wzdłuż komory sięgającej.
    UWAGA: Ważne jest, aby oświetlić obszar wokół szczeliny sięgającej i pręta doprowadzającego śrut w celu identyfikacji łapy w czasie rzeczywistym.

2. Konfiguracja komputera i sprzętu

1. Zainstaluj frame grabber FPGA i cyfrowe karty rozszerzeń zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
   UWAGA: Zalecamy co najmniej 16 GB pamięci RAM i wewnętrzny dysk twardy półprzewodnikowy do przechowywania danych, ponieważ przesyłanie strumieniowe wideo z dużą szybkością wymaga znacznej pojemności buforowania.
2. Zainstaluj sterowniki kamery o wysokiej rozdzielczości i podłącz ją do framegrabbera FPGA. Oprogramowanie behawioralne musi być uruchomione i współpracować z kamerą, aby można było korzystać z oprogramowania powiązanego z kamerą.
   UWAGA: Dołączony kod (patrz pliki dodatkowe) uzyskuje dostęp do programowalnych rejestrów w aparacie i może nie być kompatybilny z innymi markami. Zalecamy nagrywanie z prędkością co najmniej 300 klatek na sekundę (fps); Przy 150 klatkach na sekundę stwierdziliśmy, że kluczowe zmiany w postawie łap były często pomijane.
3. Skopiuj dołączony kod (projekt) w "SR Automation_dig_ext_card_64bit" na komputer.

3. Trening behawioralny

1. Przygotuj szczury przed treningiem.
   1. Szczury domowe Long-Evans (samce lub samice, w wieku 10–20 tygodni) w grupach po 2–3 osobniki w klatce w odwróconym cyklu światła/ciemności. Trzy dni przed treningiem należy ograniczyć pokarm u szczurów, aby utrzymać masę ciała o 10–20% poniżej wartości wyjściowej.
   2. Dotykaj szczurów przez kilka minut dziennie przez co najmniej 5 dni. Po obróbce umieść 4-5 granulek cukru na szczura w każdej klatce domowej, aby wprowadzić nową karmę.
2. Przyzwyczaj szczura do komory docierania (1-3 dni)
   1. Włącz światła LED i umieść 3 granulki cukru z przodu iz tyłu komory.
   2. Umieść szczura w komorze i pozwól mu eksplorować przez 15 minut. Monitoruj, czy zjada granulki. Powtarzaj tę fazę, aż szczur zje wszystkie granulki z podłogi.
   3. Wyczyść komorę etanolem między szczurami.
      UWAGA: Wykonuj trening i testowanie w ciemnej fazie. Trenuj szczury codziennie o tej samej porze.
3. Naucz szczura sięgać i obserwować preferencje łap (1-3 dni).
   1. Włącz światła i umieść szczura w komnacie wprawnego sięgania.
   2. Za pomocą kleszczy przytrzymaj śrut przez szczelinę sięgającą z przodu pudełka (Rysunek 1, Rysunek 2). Pozwól szczurowi zjeść 3 granulki z kleszczy.
   3. Następnym razem, gdy szczur spróbuje zjeść wypluwkę z kleszczy, pociągnij ją z powrotem. W końcu szczur będzie próbował sięgnąć łapą po wypluwkę.
   4. Powtórz to 11 razy. Łapa, której szczur używa najczęściej z 11 prób, to "preferencja łapy" szczura.
      UWAGA: Próba jest definiowana jako wyciągnięcie łapy poza szczelinę sięgającą. Szczur nie musi pomyślnie zdobyć i zjeść granulki.
4. Naucz szczura, aby sięgał do pręta dostarczającego pellet (1-3 dni)
   1. Ustaw pręt doprowadzający granulat tak, aby strona szczeliny sięgającej była przeciwległa do preferowanej łapy szczura (użyj prowadnicy, aby zapewnić stałe umieszczenie 1.5 cm od przodu komory sięgającej). Górna część pręta podającego powinna zrównać się z dolną częścią szczeliny sięgającej (Rysunek 2B). Umieść granulat na pręcie podającym.
      UWAGA: Ustawienie pręta podającego naprzeciwko preferowanej łapy szczura utrudnia szczurowi uzyskanie granulki za pomocą niepreferowanej łapy. Nie mieliśmy problemów ze szczurami używającymi swojej niepreferowanej łapy. Jednak w niektórych modelach (np. udar mózgu) może to nadal wystąpić i można dodać ograniczenie dla niepreferowanej kończyny sięgającej.
   2. Zwabić szczura wypluwką trzymaną za pomocą kleszczy, ale skieruj szczura w stronę pręta dostawczego, tak aby jego łapa uderzyła w wypluwkę na pręcie. Jeśli szczur strąci granulkę z pręta, wymień ją. Niektóre szczury mogą początkowo nie sięgać wystarczająco daleko. W takim przypadku przesuń pręt dostarczający pellet bliżej szczeliny sięgającej, a następnie powoli odsuń go dalej, gdy szczur się poprawi.
   3. Po około 5-15 dotarciu przynęty szczur zacznie spontanicznie sięgać po wypluwkę na pręcie dostawczym. Gdy szczur spróbuje 10 sięgnąć do pręta dostawczego bez przynęty, może przejść do następnej fazy.
5. Naucz szczura, aby prosił o granulkę (2-8 dni).
   UWAGA: Chociaż odnieśliśmy 100% sukces w szkoleniu szczurów, aby sięgały po granulki, około 10% szczurów nie udaje się nauczyć prosić o granulkę, przesuwając się na tył komory.
   1. Ustaw pręt do dostarczania pelletu w oparciu o preferencje łapy szczura i ustaw go w pozycji 2 (Rysunek 2A). Ustaw pozycje wysokości pręta doprowadzającego pelety za pomocą pilota siłownika. Przytrzymanie przycisków 1 i 2 jednocześnie przesuwa pręt podający w górę, a przytrzymanie przycisków 3 i 2 przesuwa pręt podający w dół. Gdy pręt podający znajdzie się na odpowiedniej wysokości, przytrzymaj żądaną liczbę, aż lampka zacznie migać na czerwono, aby ustawić.
   2. Umieść szczura w komorze i zwabić szczura do tyłu granulką. Gdy szczur przesunie się na tyle daleko do tyłu komory, że przerwałby wiązkę podczerwieni, gdyby wersja automatyczna była uruchomiona, przesuń pręt doprowadzający granulki do pozycji 3 (Rysunek 2B).
   3. Poczekaj, aż szczur sięgnie po wypluwkę, a następnie przesuń pręt do dostarczania pelletu z powrotem do pozycji 2 (Rysunek 2A). Umieść nowy granulat na pręcie podającym, jeśli został strącony.
   4. Powtarzaj te kroki, stopniowo nęcąc szczura coraz mniej, aż szczur zacznie: (i) przesuwać się na tył, aby poprosić o granulkę bez bycia przynętą, oraz (ii) natychmiast przesuwać się na przód po poproszeniu o śrut z tyłu. Gdy szczur zrobi to 10 razy, jest gotowy do treningu w zautomatyzowanym zadaniu.

4. Szkolenie szczurów za pomocą automatycznego systemu

1. Skonfiguruj zautomatyzowany system.
   1. Włącz światła w komorze i w razie potrzeby napełnij zbiornik na pelety.
   2. Ustaw pręt doprowadzający granulat zgodnie z preferencjami łapy szczura. Sprawdź, czy pozycje siłownika są ustawione prawidłowo (jak w Rysunek 2A).
   3. Włącz komputer i otwórz program Umiejętne docieranie (SR_dig_extension_card_64bit_(HOST)_3.vi). Wprowadź numer identyfikacyjny szczura w polu Temat i wybierz preferencję łapy z menu rozwijanego Ręka. Określ ścieżkę zapisu dla filmów.
   4. Ustaw czas sesji i maksymalną liczbę filmów (liczbę filmów, przy których sesja ma się zakończyć). Program przestanie działać przy tym limicie, który zostanie osiągnięty jako pierwszy.
   5. Ustaw czas podnoszenia granulki (czas, w którym pręt dostarczający pozostaje w pozycji "3" po tym, jak szczur poprosi o pellet). Włącz lub wyłącz karę wczesnego zasięgu (pręt dostawczy resetuje się do pozycji "1", a następnie z powrotem do "2", jeśli szczur sięgnie przed zażądaniem granulki).
2. Wykonaj obrazy kalibracyjne. Rekonstrukcja trajektorii 3-D wykorzystuje zestaw narzędzi do przetwarzania obrazów w celu określenia odpowiednich macierzy transformacji, co wymaga zidentyfikowania pasujących punktów w każdym widoku. Aby to zrobić, użyj małego sześcianu z wzorami szachownicy po każdej stronie (Rysunek 3).
   1. Umieść pomocną dłoń w komorze sięgającej i wbij zacisk krokodylkowy przez szczelinę sięgającą. Przytrzymaj kostkę przed szczeliną sięgającą za pomocą zacisku krokodylkowego.
   2. Ustaw sześcian tak, aby czerwona strona znajdowała się w górnym lustrze, zielona strona w lewym lustrze, a niebieska strona w prawym lustrze. Cała powierzchnia każdego z trzech boków powinna być widoczna w lustrach (Rysunek 3).
   3. W programie behawioralnym upewnij się, że próg zwrotu z inwestycji jest ustawiony na bardzo dużą wartość (np. 60000). Kliknij przycisk uruchamiania (biała strzałka). Gdy przycisk Camera Initialized (Inicjalizacja kamery) zmieni kolor na zielony, naciśnij przycisk START. Zwróć uwagę, że film jest pobierany.
   4. Kliknij opcję Cal Mode (Tryb kalibracji). Następnie zrób zdjęcie, klikając przycisk Take Cal Image. Ścieżka katalogu obrazu pojawi się teraz w obszarze ".png ścieżka" z nazwą pliku .png sformatowaną jako "GridCalibration_YYYYMMDD_img#.png".
   5. Przesuń lekko kostkę i zrób kolejny obraz. Powtórz tę czynność, aby uzyskać łącznie 3 obrazy.
   6. Zatrzymaj program, klikając STOP, a następnie przycisk znaku stop. Wyjmij pomocną dłoń i kostkę z pudełka.
   7. Uważaj, aby nie uderzyć w nic w komorze behawioralnej po wykonaniu zdjęć kalibracyjnych tego dnia. Jeśli coś się rusza, należy wykonać nowe obrazy kalibracyjne.
3. Uruchom zautomatyzowany system.
   UWAGA: Określ ustawienia "Progu zwrotu z inwestycji" (opisane poniżej) dla każdego lustra przed uruchomieniem szczurów w celu faktycznego pozyskiwania danych. Po ustaleniu tych ustawień należy je wstępnie ustawić przed uruchomieniem programu i w razie potrzeby dostosować podczas akwizycji.
   1. Umieść szczura w komorze wprawnego sięgania. Kliknij białą strzałkę, aby uruchomić program.
   2. Przed kliknięciem START ustaw pozycję ROI do wykrywania łapy, dostosowując x-Offset (współrzędna x lewego górnego rogu prostokąta ROI), y-Offset (współrzędna y lewego górnego rogu ROI), szerokość ROI i wysokość ROI.
   3. Umieść ROI w lusterku bocznym, które pokazuje grzbiet łapy, bezpośrednio przed otworem sięgającym (Rysunek 2C). Upewnij się, że pręt dostarczający granulki nie wchodzi w ROI i że ROI nie rozciąga się do pudełka, aby zapobiec wyzwalaniu wideo przez granulkę lub futro szczura, gdy szczur nie sięga.
   4. Kliknij START, aby uruchomić program.
   5. Dostosuj wartość "Niskiego progu zwrotu z inwestycji", aż "Wartość wyzwalania zwrotu na żywo" będzie oscylować między "0" a "1" (gdy szczur nie zbliża się). Ta wartość to liczba pikseli w obszarze zwrotu z wartościami intensywności w zakresie progowym.
   6. Ustaw próg zwrotu z inwestycji. Obserwuj wartość wyzwalającą zwrot z inwestycji na żywo, gdy szczur wsadza nos w ROI i gdy szczur sięga po granulkę. Ustaw próg ROI tak, aby był znacznie większy niż "Wartość wyzwalająca zwrot z inwestycji na żywo" podczas szturchania nosem i niższy niż "Wartość wyzwalająca zwrot z inwestycji na żywo", gdy szczur osiągnie. Dostosuj, aż filmy będą konsekwentnie uruchamiane, gdy szczur dotrze, ale nie wtedy, gdy wystawi nos przez szczelinę
      UWAGA: Zakłada się, że łapa jest jaśniejsza niż nos; Regulacje zostaną odwrócone, jeśli łapa jest ciemniejsza niż nos.
   7. Monitoruj kilka pierwszych prób, aby upewnić się, że wszystko działa poprawnie. Kiedy szczur sięga przed poproszeniem o wypluwkę (pręt dostawczy w pozycji "2"), liczba "Early Reaches" wzrasta. Kiedy szczur dotrze po zażądaniu śrutu (pręt dostarczający w pozycji "3"), liczba "Filmy" zwiększa się i film jest zapisywany jako plik .bin o nazwie "RXXXX_YYYYMMDD_HH_MM_SS_trial#".
      UWAGA: Domyślnie filmy powinny zawierać 300 klatek (tj. 1 s) przed i 1000 klatek po zdarzeniu wyzwalania (można to skonfigurować w oprogramowaniu), co jest wystarczająco długie, aby pomieścić cały ruch sięgania do chwytania, w tym wycofanie łapy.
   8. Po osiągnięciu czasu sesji lub maksymalnej liczby filmów program zatrzymuje się. Naciśnij przycisk znaku stop.
   9. Oczyść komorę etanolem i powtórz z innym szczurem, a jeśli zrobisz to na cały dzień, przejdź do konwersji filmów.
4. Konwertuj pliki .bin na .avi files.
   UWAGA: Kompresja filmów podczas akwizycji powoduje gubienie klatek, więc pliki binarne są przesyłane strumieniowo na dysk podczas akwizycji (użyj dysku SSD ze względu na wysokie szybkości przesyłania danych). Te pliki binarne muszą być skompresowane w trybie off-line lub wymagania dotyczące pamięci masowej są zbyt duże.
   1. Otwórz program "bin2avi-color_1473R_noEncode.vi".
   2. W sekcji "Kontrola ścieżki pliku" kliknij przycisk folderu, aby wybrać sesję (np. R0235_20180119a), którą chcesz przekonwertować. Powtórz tę czynność dla każdej sesji (do sześciu).
   3. Kliknij białą strzałkę (uruchom), a następnie "START", aby rozpocząć. Możesz monitorować kompresję wideo na pasku "Ogólny postęp (%)". Pozwól programowi działać przez noc.
   4. Zanim zaczniesz trenować zwierzęta następnego dnia, sprawdź, czy filmy zostały przekonwertowane i usuń pliki .bin, aby było wystarczająco dużo miejsca na pobranie nowych filmów.

5. Analizowanie filmów za pomocą DeepLabCut

UWAGA: Różne sieci są trenowane dla każdej preferencji łapy (prawa łapa i lewa łapa) i dla każdego widoku (widok bezpośredni i widok w lewym lustrze dla szczurów z prawą łapą, widok bezpośredni i widok z prawego lustra dla szczurów z lewymi łapami). Widok z górnego lustra nie jest używany do rekonstrukcji 3D - tylko do wykrywania, kiedy nos wchodzi w szczelinę, co może być przydatne do uruchomienia interwencji (np. optogenetyki). Każda sieć jest następnie używana do analizy zestawu filmów przyciętych dla odpowiedniej łapy i widoku.

1. Szkolenie sieci DeepLabCut (szczegółowe instrukcje znajdują się w dokumentacji DeepLabCut na stronie https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut).
   1. Utwórz i skonfiguruj nowy projekt w DeepLabCut, algorytmie uczenia maszynowego do szacowania pozycji bez znaczników¹³.
   2. Użyj programu, aby wyodrębnić klatki z wykwalifikowanych filmów docierających i przyciąć obrazy do widoku, który ma zostać uwzględniony (widok bezpośredni lub lustrzany) w interfejsie programu. Ramki kadrowania są na tyle duże, aby szczur i obie przednie łapy były widoczne.
      UWAGA: Sieci zazwyczaj wymagają 100–150 ramek treningowych. Ze względu na oświetlenie potrzeba więcej ramek treningowych, gdy łapa znajduje się w środku, w porównaniu niż na zewnątrz komory. Ciaśniejsze przycinanie skraca czas przetwarzania, ale należy uważać, aby przycięte obszary były wystarczająco duże, aby wykryć pełną trajektorię łapy dla każdego szczura. Powinien być na tyle szeroki, aby całe ciało szczura zmieściło się w ramie (widok bezpośredni) i widziało jak najdalej w głąb komory i przed prętem podającym (widok lustrzany).
   3. Użyj graficznego interfejsu użytkownika programu, aby oznaczyć części ciała. Oznacz 16 punktów w każdej ramce: 4 stawy śródręczno-paliczkowe (MCP), 4 stawy międzypaliczkowe bliższe (), 4-cyfrowe końcówki, grzbiet sięgającej łapy, nos, grzbiet niesięgającej łapy i wypluwka (Ryc. 4).
   4. Postępuj zgodnie z instrukcjami DeepLabCut (w skrócie DLC), aby utworzyć zestaw danych treningowych, przeszkolić sieć i ocenić wytrenowaną sieć.
2. Analizuj filmy i udoskonalaj sieć.
   1. Zanim przeanalizujesz wszystkie filmy w nowo wyszkolonej sieci, przeanalizuj 10 filmów, aby ocenić wydajność sieci. Jeśli w niektórych pozach występują stałe błędy, wyodrębnij dodatkowe klatki treningowe zawierające te pozy i ponownie przetrenuj sieć.
   2. Analizując filmy, upewnij się, że wyprowadzasz pliki .csv, które zostaną wprowadzone do kodu w celu rekonstrukcji trajektorii 3D.

6. Kalibracja pudełka

UWAGA: Te instrukcje są używane do wyznaczania matryc transformacji do konwersji punktów zidentyfikowanych w widoku bezpośrednim i lustrzanym na współrzędne 3D. Najbardziej aktualną wersję i więcej szczegółów na temat korzystania z pakietu boxCalibration można znaleźć na stronie Leventhal Lab GitHub: https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration, która zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące ich użytkowania.

1. Zbierz wszystkie obrazy kalibracyjne w tym samym folderze.
2. Korzystając z ImageJ/Fiji, ręcznie zaznacz punkty szachownicy dla każdego obrazu kalibracji. Zapisz ten obraz jako "GridCalibration_YYYYMMDD_#.tif", gdzie "RRRRMMDD" to data, której odpowiada obraz kalibracji, a "#" to numer obrazu dla tej daty.
   1. Użyj funkcji pomiaru w ImageJ (na pasku narzędzi wybierz Analizuj | Środek). Spowoduje to wyświetlenie tabeli zawierającej współrzędne wszystkich zaznaczonych punktów. Zapisz ten plik pod nazwą "GridCalibration_YYYYMMDD_#.csv", gdzie data i numer obrazu są takie same jak w odpowiadającym im pliku .tif.
3. Z pakietu boxCalibration otwórz plik 'setParams.m'. Plik ten zawiera wszystkie wymagane zmienne oraz ich opis. Edytuj zmienne zgodnie z potrzebami, aby dopasować je do specyfikacji projektu.
4. Uruchom funkcję calibrateBoxes. W oknie poleceń pojawi się kilka monitów. Pierwszy monit z pytaniem, czy przeanalizować wszystkie obrazy w folderze. Wpisanie Y zakończy monity, a wszystkie obrazy dla wszystkich dat zostaną przeanalizowane. Wpisanie N poprosi użytkownika o wprowadzenie dat do analizy.
   UWAGA: W folderze obrazów kalibracyjnych zostaną utworzone dwa nowe katalogi: 'markedImages' zawiera .png pliki ze zdefiniowanymi przez użytkownika znacznikami szachownicy na obrazie kalibracyjnym. Folder 'boxCalibration' zawiera pliki .mat z parametrami kalibracji pudełka.
5. Uruchom funkcję checkBoxCalibratation. Spowoduje to utworzenie nowego folderu "checkCalibration" w folderze "boxCalibration". Każda data będzie miała podfolder zawierający obrazy i kilka plików .fig, które są używane do sprawdzenia, czy kalibracja pudełka została dokładnie zakończona.

7. Rekonstrukcja trajektorii 3D

1. Złóż pliki .csv zawierające dane wyjściowe programu edukacyjnego w strukturę katalogów opisaną w skrypcie reconstruct3Dtrajectories.
2. Uruchom polecenie reconstruct3Dtrajectories. Ten skrypt przeszuka strukturę katalogów i dopasuje punkty bezpośrednie/lustrzane na podstawie ich nazw w programie pochylania (ważne jest, aby używać tych samych nazw części ciała w obu widokach).
3. Uruchom polecenie calculateKinematics. Skrypt ten wyodrębnia proste cechy kinematyczne z rekonstrukcji trajektorii 3D, które można dostosować do konkretnych potrzeb.
   UWAGA: Oprogramowanie szacuje położenie przesłoniętych części ciała na podstawie ich sąsiadów i ich położenia w widoku uzupełniającym (np. położenie części ciała w bezpośrednim widoku kamery ogranicza jej możliwe lokalizacje w widoku lustrzanym). W przypadku czasu, gdy łapa jest zasłonięta w widoku lustrzanym, gdy przechodzi przez szczelinę, współrzędne łapy są interpolowane na podstawie sąsiednich ramek.

Wyniki

Szczury szybko nabywają umiejętność sięgania po aklimatyzacji do aparatu, a wydajność stabilizuje się zarówno pod względem liczby zasięgów, jak i dokładności w ciągu 1-2 tygodni (Rysunek 5). Rysunek 6 pokazuje przykładowe klatki wideo wskazujące struktury zidentyfikowane przez DeepLabCut, a Rysunek 7 pokazuje nałożone na siebie indywidualne trajektorie zasięgu z pojedynczej sesji. Na koniec, w Rysunek 8, ilustruj...

Dyskusja

Umiejętne docieranie do gryzoni stało się standardowym narzędziem do badania fizjologii i patofizjologii układu ruchu. Opisaliśmy, jak wdrożyć zautomatyzowane zadanie umiejętności sięgania szczura, które umożliwia: trening i testowanie przy minimalnym nadzorze, rekonstrukcję trajektorii 3D łapy i palca (podczas sięgania, chwytania i chowania łapy), identyfikację łapy w czasie rzeczywistym podczas sięgania oraz synchronizację z zewnętrzną elektroniką. Doskonale nadaje się do korelowania kinematyki kończyn przednich z fizj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
przezroczyste panele poliwęglanowe	TAP Tworzywa sztuczne		cięte na zamówienie (patrz projekt ramki)
źródło / detektor podczerwieni	Med Associates	ENV-253SD	30-calowa
kamera	zasięgu Basler	acA2000-340kc	2046 x 1086 CMV2000 340 fps Kolorowa kamera Link
obiektyw kamery	Megapiksel (computar)	M0814-MP2	2/3 "8mm f1.4 z blokadą Przysłony i do kamery do ustawiania ostrości
	Basler	#2000031083	PoCL Camera Link SDR/MDR Pełny, 5 m - do transmisji danych
lustra
	Concentrics	LACT6P	Siłownik liniowy Skok 6" (nominalny), siła 110 funtów, 12 VDC, z potencjometrem
zbiornik / lejek na pelety	Amico (Amazon)	a12073000ux0890	Lejek
rura prowadząca	ePlastics	ACREXT.500X.250	1/2" OD x 1/4" ID Przezroczysty. Wytłaczana rura akrylowa z pleksi x
pręt do dostarczania peletów	ePlastics	ACRCAR.250	0,250 "DIA. Odlewany pręt akrylowy (długość 2 '
plastikowe złącze T	Stany Zjednoczone Plastic Corp	# 62065	3/8 "x 3/8" x 3/8 " Identyfikator węża HDPE Tee
LED lights	Oświetlenie EVER	4100066-DW-F	Elastyczna wodoodporna taśma świetlna LED 12 V, taśma LED, światło dzienne białe, super jasne 300 jednostek 5050 diod LEDS, szpula 16,4 stopy 5 m Lekki
podkład	ePlastics	ACTLNAT0,125 x 12	36 0,125 "x 12" x 36 "Naturalny arkusz acetalu Folie
dyfuzora świetlnego	wynalazki	23114-01.007x8.5x11	", matowa dwustronna
szafka i niestandardowe materiały ramowe	różne (Home Depot itp.)		Płyta pilśniowa 3/4" (wymiary każdej konstrukcji znajdują się w protokole)
pianka akustyczna	Acoustic First		FireFlex Wedge Acoustical Foam (2 "Thick)
wentylatory	Cooler Master (Amazon)	B002R9RBO0	Łożysko karabinowe 80mm Cichy wentylator chłodzący do obudów komputerowych i chłodnic procesora
Zawiasy do drzwi szafy	Everbilt (Home Depot	#14609	zawias stalowy ciągły (1.4" x 48")
kółka szafki	Everbilt (Home Depot	#49509	Kółko z miękką gumową płytą obrotową o nośności 90 funtów i klamce drzwi szafki z hamulcem bocznym
	Everbilt (Home Depot	#15094	Biały lekki uchwyt do drzwi (4,5")
komputer	Hewlett Packard	Z620	HP Z620 Biurkowa stacja robocza
Camera Link Frame Grabber	National Instruments	#781585-01	PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - W pełni
wielofunkcyjna płyta RIO	National Instruments	#781100-01	PCIe-17841R
Analogowy do płyty RIO National	Instruments	SCH68M-68F-RMIO	Wielofunkcyjny
cyfrowy do płyty RIO	National Instruments	#191667-01	SHC68-68-RDIO Cyfrowy do
analogowej listwy zaciskowej	National Instruments	#782536-01	SCB-68A Tłumienie szumów, ekranowany blok złączy we/wy
Cyfrowa listwa zaciskowa	National Instruments	#782536-01	SCB-68A Odrzucający szumy, ekranowany blok złączy I/O
24-pozycyjny stojak przekaźnikowy	Measurement Computing Corp.	SSR-RACK24	Płyta montażowa przekaźnika półprzewodnikowego (przekaźniki typu Gordos/OPTO-22), 24-kanałowy
przełącznik DC	Measurement Computing Corp.	SSR-ODC-05	Moduł przekaźnika półprzewodnikowego, pojedynczy, przełącznik DC, 3 do 60 VDC @ 3.5 A
DC Sense	Measurement Computing Corp.	SSR-IDC-05	przekaźnika półprzewodnikowego, pojedynczy, czujnik DC, 3 do 32 VDC
Zasilacz DC	BK Precision	1671A	Potrójne wyjście 30 V, 5 A Wyświetlacz cyfrowy Zasilacz DC
Granulki cukru	Bio Serv	F0023	Bezpyłowe granulki precyzyjne, 45 mg, sacharoza (bezsmakowe)
LabVIEW	National Instruments	LabVIEW 2014 SP1, wersje 64 i 32-bitowe	64-bitowy LabVIEW jest wymagany, aby uzyskać dostęp do wystarczającej ilości pamięci do strumieniowego przesyłania filmów, ale kodowanie FPGA musi być wykonywane w 32-bitowym LabVIEW
MATLAB	Oprogramowanie	trajektorii bloków Matlab R2019a	jest napisane w Matlabie i wymaga zestawu narzędzi Computer Vision