Artykuł metodologiczny

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

DOI:

10.3791/59980

⸱

15 października 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Iowa, 2Medical Scientist Training Program, University of Iowa, 3Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 4Graduate Program in Molecular Medicine, University of Iowa

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie jelito jest skolonizowane przez biliony bakterii, które wspierają funkcje fizjologiczne, takie jak metabolizm żywności, zbieranie energii i regulacja układu odpornościowego. Sugeruje się, że zaburzenia zdrowego mikrobiomu jelitowego odgrywają rolę w rozwoju chorób zapalnych, w tym stwardnienia rozsianego (SM). Czynniki środowiskowe i genetyczne mogą wpływać na skład mikrobiomu; Dlatego identyfikacja społeczności drobnoustrojów związanych z fenotypem choroby stała się pierwszym krokiem w kierunku zdefiniowania roli mikrobiomu w zdrowiu i chorobie. Zastosowanie sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA do profilowania społeczności bakteryjnej pomogło w postępie w badaniach nad mikrobiomem. Pomimo jego szerokiego zastosowania, nie ma jednolitego protokołu analizy profilowania taksonomicznego opartego na 16S rRNA. Kolejnym ograniczeniem jest niska rozdzielczość przypisania taksonomicznego ze względu na trudności techniczne, takie jak mniejsze odczyty sekwencjonowania, a także stosowanie w analizie końcowej tylko odczytów do przodu (R1) ze względu na niską jakość odczytów wstecznych (R2). Istnieje potrzeba zastosowania uproszczonej metody o wysokiej rozdzielczości do scharakteryzowania różnorodności bakteryjnej w danej próbce biologicznej. Postępy w technologii sekwencjonowania z możliwością sekwencjonowania dłuższych odczytów w wysokiej rozdzielczości pomogły przezwyciężyć niektóre z tych wyzwań. Obecna technologia sekwencjonowania w połączeniu z publicznie dostępnym potokiem analiz metagenomicznych, takim jak oparty na R algorytm denoisingu divisive amplicon-2 (DADA2), pomogła w rozwoju profilowania mikrobiologicznego w wysokiej rozdzielczości, ponieważ DADA2 może przypisywać sekwencję na poziomie rodzaju i gatunku. Poniżej opisano przewodnik dotyczący wykonywania profilowania bakteryjnego przy użyciu dwuetapowej amplifikacji regionu V3-V4 genu 16S rRNA, a następnie analizy przy użyciu ogólnodostępnych narzędzi analitycznych (tj. DADA2, Phyloseq i METAGENassist). Uważa się, że ten prosty i kompletny przepływ pracy będzie doskonałym narzędziem dla badaczy zainteresowanych przeprowadzeniem badań profilowania mikrobiomu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiota odnosi się do zbioru mikroorganizmów (bakterii, wirusów, archeonów, bakteriofagów i grzybów) żyjących w określonym środowisku, a mikrobiom odnosi się do zbiorowego genomu mikroorganizmów rezydujących. Ponieważ bakterie są jednymi z najliczniejszych drobnoustrojów u ludzi i myszy, badanie to koncentruje się wyłącznie na profilowaniu bakterii. Ludzkie jelita są skolonizowane przez biliony bakterii i setki szczepów bakteryjnych1. Prawidłowa mikrobiota jelitowa odgrywa istotną rolę w utrzymaniu zdrowego stanu gospodarza poprzez regulację funkcji (tj. utrzymanie nienaruszonej bariery jelitowej, metabolizm pokarmu, homeostazę energetyczną, hamowanie kolonizacji przez organizmy chorobotwórcze i regulację odpowiedzi immunologicznej)2,3,4,5. Zaburzenia składu mikrobioty jelitowej (dysbioza jelitowa) zostały powiązane z wieloma chorobami człowieka, w tym zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi6, otyłość7,8, stroke9, cancer10, diabetes8,11, reumatoidalne zapalenie stawów12, alergie13oraz choroby związane z ośrodkowym układem nerwowym, takie jak stwardnienie rozsiane (SM)14,15 i choroba Alzheimera (AD)8,16. Dlatego w ostatnich latach rośnie zainteresowanie narzędziami do identyfikacji składu bakteryjnego w różnych miejscach ciała. Niezawodna metoda powinna charakteryzować się takimi cechami, jak wysoka przepustowość i łatwość użycia, możliwość klasyfikowania mikrobioty bakteryjnej z wysoką rozdzielczością oraz niski koszt.

Techniki mikrobiologiczne oparte na kulturach nie są wystarczająco czułe, aby zidentyfikować i scharakteryzować złożony mikrobiom jelitowy z powodu niepowodzenia kilku bakterii jelitowych w rozwoju w kulturze. Pojawienie się technologii opartej na sekwencjonowaniu, zwłaszcza sekwencjonowania metagenomicznego opartego na 16S rRNA, przezwyciężyło niektóre z tych wyzwań i zmieniło badania nad mikrobiomem17. Zaawansowana technologia sekwencjonowania oparta na 16S rRNA pomogła w ustaleniu kluczowej roli mikrobiomu jelitowego w zdrowiu człowieka. Human Microbiome Project, inicjatywa National Institutes of Health18, oraz projekt MetaHIT (inicjatywa europejska)19 pomogły w ustanowieniu podstawowych ram analizy mikrobiomu. Inicjatywy te pomogły zainicjować wiele badań mających na celu określenie roli mikrobiomu jelitowego w zdrowiu i chorobach człowieka.

Wiele grup wykazało dysbiozę jelit u pacjentów z chorobami zapalnymi12,14,15,20,21,22. Pomimo tego, że jest szeroko stosowany do profilowania taksonomicznego ze względu na możliwość multipleksacji i niskie koszty, nie ma jednolitych protokołów profilowania taksonomicznego opartego na 16S rRNA. Kolejnym ograniczeniem jest niska rozdzielczość przypisania taksonomicznego ze względu na mniejsze odczyty sekwencjonowania (150 bp lub 250 bp) oraz stosowanie tylko odczytu sekwencjonowania do przodu (R1) ze względu na niską jakość odczytów sekwencjonowania wstecznego (R2). Jednak postępy w technologii sekwencjonowania pomogły przezwyciężyć niektóre z tych wyzwań, takie jak możliwość sekwencjonowania dłuższych odczytów przy użyciu odczytów sparowanych końców (np. Illumina MiSeq 2x300bp).

Obecna technologia sekwencjonowania może sekwencjonować 600 bp odczytów dobrej jakości, co pozwala na łączenie odczytów R1 i R2. Te połączone dłuższe odczyty R1 i R2 umożliwiają lepsze przypisania taksonomiczne, zwłaszcza dzięki otwartej platformie DADA2 (Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2) opartej na języku R. DADA2 wykorzystuje przypisania oparte na wariantach sekwencji amplikonów (ASV) zamiast operacyjnych jednostek taksonomicznych (OTU) opartych na 97% podobieństwie wykorzystanym przez QIIME23. Dopasowania ASV skutkują dokładnym dopasowaniem sekwencji w bazie danych w obrębie 1–2 nukleotydów, co prowadzi do przypisania na poziomie rodzaju i gatunku. W związku z tym połączenie dłuższych, dobrej jakości odczytów sparowanych końców i lepszych narzędzi do przypisywania taksonomii (takich jak DADA2) zmieniło badania mikrobiomu.

Dostępny tutaj jest przewodnik krok po kroku do wykonywania profilowania bakteryjnego za pomocą dwuetapowej amplifikacji regionu V3–V4 16S rRNA i analizy danych przy użyciu potoków DADA2, Phyloseq i METAGENassist. W tym badaniu wykorzystano transgeniczne myszy z ludzkim antygenem leukocytarnym (HLA) klasy II, ponieważ niektóre allele HLA klasy II są związane z predyspozycją do chorób autoimmunologicznych, takich jak MS20,24,25. Jednak znaczenie genów HLA klasy II w regulacji składu mikrobioty jelitowej jest nieznane. Przypuszcza się, że cząsteczka HLA klasy II będzie wpływać na społeczność drobnoustrojów jelitowych poprzez selekcję określonych bakterii. Myszy z nokautem klasy II (AE.KO) lub myszy eksprymujące ludzkie cząsteczki HLA-DQ8 (HLA-DQ8) (HLA-DQ8) 24,25,26 zostały wykorzystane w celu zrozumienia znaczenia cząsteczek HLA klasy II w kształtowaniu społeczności drobnoustrojów jelitowych. Uważa się, że ten kompletny i uproszczony przepływ pracy z analizą danych opartą na języku R będzie doskonałym narzędziem dla naukowców zainteresowanych przeprowadzeniem badań profilowania mikrobiomu.

Pokolenie myszy pozbawione endogennych mysich genów MHC klasy II (AE.KO) i AE-/-. Transgeniczne myszy HLA-DQA1*0103, DQB1*0302 (HLA-DQ8) z tłem C57BL/6J zostały opisane wcześniej26. Próbki kału pobiera się od myszy obojga płci (w wieku 8–12 tygodni). Myszy były wcześniej hodowane i utrzymywane w ośrodku dla zwierząt Uniwersytetu Iowa zgodnie z wytycznymi NIH i instytucjonalnymi. Strategie kontroli zanieczyszczeń, takie jak odsadzanie myszy w komorze z przepływem laminarnym, zmiana rękawiczek między różnymi szczepami myszy i właściwa konserwacja myszy, są kluczowymi krokami w profilowaniu mikrobiomu jelitowego.

Odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) są wysoce zalecane podczas całej procedury. Odpowiednie kontrole ujemne powinny być włączone podczas przeprowadzania etapów izolacji DNA, amplifikacji PCR1 i PCR2 oraz sekwencjonowania. Zaleca się stosowanie sterylnych, wolnych od DNaz, RNaz i pirogenów materiałów. Przez cały czas trwania protokołu należy używać wyznaczonego pipetora do pracy z mikrobiomem i końcówek pipet z filtrem. Analiza mikrobioty składa się z siedmiu etapów: 1) pobranie i przetworzenie próbki kału; 2) ekstrakcja DNA; 3) amplifikacja genu 16S rRNA; 4) budowa biblioteki DNA z wykorzystaniem indeksowanego PCR; 5) oczyszczanie i kwantyfikacja indeksowanego PCR (biblioteka); 6) Sekwencjonowanie MiSeq; oraz 7) przetwarzanie danych i analiza sekwencji. Schemat ideowy wszystkich kroków protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Iowa.

1. Pobieranie i postępowanie z próbkami kału

  1. Wysterylizuj pudełka rozdzielające (patrz Tabela materiałów, Rysunek uzupełniający 1) 70% etanolem.
  2. Wstępnie oznaczyć probówki do mikrowirówek (po jednej na mysz) identyfikatorem próbki i grupą poddawaną działaniu substancji (jeśli dotyczy).
  3. Umieść myszy w wysterylizowanych pudełkach do rozdzielania i pozwól im normalnie się wypróżniać przez maksymalnie 1 godzinę.
  4. Zbierz granulki kału do pustej, wstępnie oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą sterylnych kleszczyków i dokładnie zamknij probówkę. Wysterylizuj kleszcze po zebraniu z każdej myszy.
  5. Umieść probówkę do mikrowirówki zawierającą granulki kału w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.
    nuta: Pudełka z przegrodami są korzystne, ponieważ umożliwiają jednoczesne pobieranie próbek kału od wielu myszy (do 12) w tym samym czasie.

2. Ekstrakcja DNA

  1. Wyjmij próbki kału (mysz lub człowiek) z zamrażarki i rozmroź w temperaturze pokojowej (RT).
    nuta: Zaleca się rozmrażanie próbek kału ludzkiego przez noc w temperaturze 4 °C, w zależności od potrzeb w celu pobrania 200 mg lub wymaganej ilości z próbek podstawowych.
  2. Użyć 200 mg materiałów wyjściowych i wymyć DNA do końcowej objętości 50 μl.
  3. Dołącz ślepy zestaw do izolacji DNA, do którego nie dodaje się próbki kału, ale jest ona przetwarzana przez wszystkie etapy ekstrakcji DNA.
    nuta: Użyto specjalnego zestawu do izolacji DNA (patrz tabela materiałów), ponieważ zawiera on specyficzne odczynniki do usuwania materiałów hamujących, takich jak biologiczne odpady stałe, niestrawiony materiał roślinny i związki hemowe z lizowanych czerwonych krwinek obecnych w próbkach kału ludzkiego i myszy.
  4. Umieścić rurkę z kulkami w homogenizatorze (patrz tabela materiałów) i homogenizować próbki przez 45 s przy temperaturze pokojowej i prędkości 4,5 m/s.
    nuta: Można zastosować homogenizator do ubijania kulek dowolnego producenta. Zaleca się jednak standaryzację metody, a w szczególności szybkości i czasu trwania homogenizacji, w przypadku stosowania homogenizatora do ubijania kulek od innego dostawcy.
  5. Wyizolować DNA z poszczególnych próbek kału myszy za pomocą zestawu do izolacji bakteryjnego DNA zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów) z niewielkimi modyfikacjami. Określić ilościowo wyizolowany DNA, ładując 1 μl DNA do fluorymetru lub na chip do elektroforezy o wysokiej czułości (patrz tabela materiałów).
    nuta: Oczekiwana wydajność DNA może wynosić od 500 do 2,500 ng, zaczynając od 200 mg próbki kału.
  6. Dostosuj stężenie DNA do 4–20 ng/μl za pomocą buforu elucyjnego. Ponownie określić ilościowo DNA (jak to zrobiono w kroku 2.5) przed przystąpieniem do amplifikacji genu 16S rRNA (PCR1), jeśli PCR1 nie zostanie wykonany tego samego dnia.

3. Amplifikacja genu 16S rRNA (PCR1)

  1. Ustawić amplifikację genu 16S rRNA (PCR1) w 96-dołkowej płytce PCR, używając objętości reakcyjnej 25 μl.
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 12,5 μl 2x mieszanki enzymów polimerazy o wysokiej wierności wraz z buforem, oprócz dNTP (patrz tabela materiałów): 40 ng DNA w całkowitej objętości do 10,5 μl (dostosuj całkowitą objętość wodą klasy PCR): 1 μl (każdy) starterów do przodu i do tyłu przy stężeniu 1 μM.
    nuta: Sekwencje starterów są następujące:
    starter do przodu = 5'-TCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGA CAGCCTACGGGGGGCWGCAG-3' starter odwrotny = 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGATCTAATC C-3'. Dołącz ślepą próbę zestawu z kroku 2.3 (kontrola odczynnika w zestawie) do płytki PCR.
  3. Uszczelnić płytkę PCR i odwirować przy 1 000 x g w temperaturze 20 °C przez 1 minutę w wirówce stołowej (patrz tabela materiałów) i przeprowadzić PCR w termocyklerze zaprogramowanym na: 95 °C przez 3 min; 25 cykli po 1) 95 °C przez 30 s, 2) 55 °C przez 30 s, 3) 72 °C przez 30 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min; i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    nuta: Chociaż ta metoda amplifikacji genu 16S rRNA powinna działać z różnymi typami próbek biologicznych, zaleca się standaryzację liczby cykli amplifikacji podczas rozpoczynania nowego projektu.
  4. Potwierdź wielkość produktu PCR1, ładując 1 μl DNA na chip do elektroforezy o wysokiej czułości. Alternatywnie, uruchom 5 μl produktu amplifikowanego 16S rRNA na 1,5% żelu agarozowym, aby potwierdzić 550 pz produktu PCR1.
    nuta: Oczyszczanie produktu amplifikowanego 16S rRNA jest opcjonalne i zależy od zastosowanego zestawu/metody izolacji DNA. W przypadku stosowania własnej metody izolacji DNA, produkt PCR1 można oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania DNA mikrobiomu zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów). Zastosowany tutaj zestaw do izolacji DNA daje ultraczyste DNA i nie wymaga czyszczenia produktu PCR1.

4. Budowa biblioteki DNA przy użyciu indeksowanego PCR (PCR2)

  1. Startery z kodami kreskowymi Indeksu 1 i Indeksu 2 należy umieścić w specjalnym stojaku (patrz Spis materiałów) dla 96 bibliotek.
    1. Ułóż starter indeksu 1 w kolumnach 1–12, a starter indeksu 2 w rzędach A–H specjalnego stojaka.
    2. Dodać 2,5 μl wskaźnika 1 w kolumnach 1–12 i startera indeksu 2 w rzędach A–H za pomocą pipet wielokanałowych. Umieść nową nasadkę (patrz Tabela materiałów) na starterach o indeksie 1 i indeksie 2 i przechowuj ją w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 12,5 μl 2x mieszanki enzymów polimerazy o wysokiej wierności zawierającej bufor, oprócz dNTP (patrz tabela materiałów); 5 μl wody klasy PCR i 2,5 μl produktu amplifikowanego 16S rRNA.
    nuta: Dodaj unikatowe indeksy do każdej próbki, aby multipleksować więcej niż 96 bibliotek w jednym przebiegu, zgodnie z opisem w Kiernan et al.27. Niniejszy protokół wykorzystuje adaptery z komercyjnego zestawu (np. Nextera XT Index Kit) zgodnie z instrukcją producenta dostarczoną w metodzie sekwencjonowania metagenomiki 16S (np. Illumina).
  3. Uszczelnić i odwirować zindeksowaną płytkę PCR przy 1 000 x g w temperaturze 20 °C przez 1 minutę i przeprowadzić PCR w termocyklerze zaprogramowanym na: 95 °C przez 3 minuty; 8 cykli po 1) 95 °C przez 30 s, 2) 55 °C przez 30 s, 3) 72 °C przez 30 s; i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min.
  4. Potwierdź wielkość zasady 630 indeksowanego produktu PCR, ładując 1 μl DNA na chip do elektroforezy o wysokiej czułości. Alternatywnie, uruchom 5 μl indeksowanego produktu PCR na 1,5% żelu agarozowym, aby potwierdzić wielkość i intensywność produktu.

5. Czyszczenie indeksowanego PCR (PCR2) i kwantyfikacja

  1. Zebrać 5 μl amplikonu PCR2 za pomocą pipet wielokanałowych z każdej studzienki do wielokanałowej tacy zbiornika wolnej od wykrywalnych DNaz, RNaz, ludzkiego DNA i bakterii pirogennych (patrz Tabela materiałów).
  2. Przenieś zebrany produkt z tacki zbiornika wielokanałowego do pustej, wstępnie oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przemieszaj do wymieszania.
  3. Oczyść produkt PCR2 za pomocą standardowego zestawu kulek magnetycznych (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta. Pozostałe 20 μl PCR2 należy zapieczętować i przechowywać na tej samej płytce w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania, jeśli zajdzie taka potrzeba.
  4. Przygotuj świeży 80% etanol, dodając 4 ml 100% etanolu do 1 ml wody klasy PCR.
  5. Zrównoważ koralik magnetyczny z RT i wiruj przez 30 sekund, aby równomiernie rozproszyć koraliki.
  6. Krótko odwirować i odwirować zebrane próbki amplikonu PCR2.
  7. Dodaj 80 μl kulek magnetycznych do wstępnie oznakowanej, sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z 80 μl połączonych produktów PCR, a następnie wiruj i krótko odwiruj, aby równomiernie zawiesić kulki magnetyczne.
  8. Inkubować zawartość w temperaturze pokojowej przez 15 minut, nie naruszając probówek.
  9. Umieść probówkę z DNA i kulkami magnetycznymi na stojaku magnetycznym (patrz Tabela Materiałów) na 5 minut.
  10. Ostrożnie usunąć i wyrzucić 150 μl supernatantu.
  11. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu bez naruszania kulek i inkubuj przez 30 sekund.
  12. Ostrożnie usunąć i wyrzucić cały supernatant.
  13. Powtórz kroki 5.11–5.12. Usuń pozostałą objętość za pomocą pipety P10. Pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut, pozostawiając probówkę wskaźnikową PCR na stojaku magnetycznym.
  14. Zdejmij ze stojaka magnetycznego. Dodać 33 μl buforu elucyjnego (dopuszczalny jest bufor elucyjny zestawu DNA). Dobrze odwiruj i wykonaj szybkie wirowanie, aby usunąć pozostały płyn z boku. Inkubować przez 2 minuty i umieścić na stojaku magnetycznym na 5 minut.
  15. Przenieść 30 μl supernatantu (czyste produkty PCR) do wstępnie znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  16. Oznacz ilościowo oczyszczoną pulę, ładując 1 μl oczyszczonej puli do fluorymetru lub chipa do elektroforezy o wysokiej czułości, ponieważ będzie to wymagane podczas sekwencjonowania. Wykonaj MiSeq zgodnie z opisem poniżej.

6. Sekwencjonowanie MiSeq

  1. Utwórz arkusz próbny zawierający informacje o kodzie kreskowym specyficzne dla próbki do przepływu pracy metagenomiki i demultipleksowania na instrumencie MiSeq (patrz Tabela materiałów). Prześlij ten przykładowy arkusz do oprogramowania (np. Illumina Experiment Manager).
  2. Rozcieńcz biblioteki w puli od kroku 5.15 do 4 nM.
  3. Denaturyzacja połączonych bibliotek poprzez połączenie 5 μl z puli bibliotecznej 4 nM z 5 μl świeżo przygotowanego 0,2 M NaOH w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Krótko wirować w celu wymieszania, krótko odwirować i inkubować przez 5 minut w temperaturze otoczenia.
  4. Dodać 990 μl lodowatego buforu hybrydyzacyjnego (bufor HB) i delikatnie odpipetować do wymieszania. Da to bibliotekę o pojemności 20 pM.
  5. Połącz 2 μl z biblioteki kontrolnej 10 nM z 3 μl buforu EBT (10 mM Tris-HCl, pH = 8,5, z 0,1% Tween 20), aby uzyskać bibliotekę kontrolną 4 nM. Dodać 5 μl świeżo przygotowanego 0,2 N NaOH i krótko zmieszać. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Dodać 990 μl lodowatego buforu do hybrydyzacji (bufor HB) i delikatnie odpipetować do wymieszania. Spowoduje to otrzymanie bibliotek kontrolnych 20 pM.
    UWAGA: Zdenaturowane biblioteki kontrolne 20 pM mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do 4 tygodni. Po 4 tygodniach liczba klastrów ma tendencję do zmniejszania się.
    1. Połączyć 210 μl z biblioteki 20 pM z 40 μl biblioteki kontrolnej 20 pM (stężenie końcowe = ~18%) i dodać 350 μl buforu HB. Załaduj bibliotekę do końcowego stężenia 7 pM.
      nuta: Szczegóły danych wejściowych należy dostosować zgodnie z wydajnością przebiegu.
  7. Inkubować próbki przez 2 minuty w temperaturze 96 °C. Umieścić na lodzie na 5 minut. Załadować 600 μl końcowej puli do odpowiedniego dołka wkładów MiSeq.
    nuta: Sekcja 6 powyżej może być wykonana w ośrodku genomicznym/DNA.

7. Przetwarzanie danych i analiza sekwencji

  1. Użyj oprogramowania R (wersja 3.5) do przetwarzania i analizy danych DADA2. W przypadku kroków 7.1–7.4 należy użyć oprogramowania o otwartym dostępie, zgodnie z opisem we wcześniej opracowanym samouczku online DADA2, który można znaleźć pod adresem .
    nuta: Łatwy w użyciu skrypt języka R został dołączony jako plik uzupełniający 2, a użytkownicy muszą zmienić nazwę i źródło plików sekwencjonowania (np. SAMPLENAME_R1_001.fastq i SAMPLENAME_R2_001.fastq).
  2. Wizualizacja profilów jakości odczytów do przodu i do tyłu za pomocą polecenia plotQualityProfile.
  3. Przycinanie nukleotydów z odczytów do przodu i do tyłu na podstawie wykresu jakości. Te parametry są określone przez parametr truncLen w DADA2.
    nuta: W tym przypadku 280 jest używany jako próg długości, dla którego odczyty do przodu zostaną odrzucone, a 260 jest używany jako próg długości, dla którego odczyty odwrotne zostaną odrzucone.
  4. Przetwarzaj surowe dane 16S jako pliki fastq przez potok DADA2, zgodnie z opisem w samouczku online (dostępnym pod adresem ), aby scalić odczyty R1 i R2 i utworzyć warianty sekwencji amplikonów (ASV), które są następnie używane do przypisywania taksonów do referencyjnej bazy danych Silva23.
    UWAGA: Przykładowa tabela wariantów sekwencji amplikonów wygenerowana z potoku DADA2 jest dołączona jako plik uzupełniający 3. Można użyć referencyjnej bazy danych Greengene lub Silva, ponieważ przy użyciu żadnej z tych baz danych nie stwierdzono żadnych różnic w klasyfikacji bakterii.
  5. Wygeneruj zdefiniowany przez użytkownika plik mapowania, który zawiera metadane (tj. genotyp, płeć, leczenie itp.) dla każdej próbki. Przykładowy plik metadanych został dołączony jako plik uzupełniający 4.
  6. Oblicz różnorodność alfa (indeks Shannona) i różnorodność beta za pomocą analizy współrzędnych głównych (PCA) na podstawie rozrzedzonych liczb OTU przy użyciu Phyloseq28, jak opisano w samouczku online, który znajduje się pod adresem .
  7. Wykonaj następującą analizę w METAGENassist29.
    UWAGA:     Przeprowadź analizę liczebności różnicowej za pomocą testu sumy rang Wilcoxona na poziomie rodzaju. Mapy cieplne i taksony o zróżnicowanej liczebności są wyróżniane za pomocą METAGENassist29, publicznie dostępnego internetowego potoku analiz.
    1. Przekaż tabelę liczebności taksonomicznej (format CSV) i wybierz pozycję Próbki w kolumnie.
    2. Przekaż plik mapowania (format CSV) i wybierz pozycję Przykłady w wierszu.
    3. Wybierz pozycję Opcje, aby usunąć zmienne z ponad 50% zerami i wykluczyć nieprzypisane i niezamapowane odczyty.
    4. Wybierz pozycję Opcje, aby znormalizować wiersze według sumy i dziennika normalizować kolumny.
    5. Utwórz wykres Volcano, PCA lub PLSDA, klikając go w tej samej kolumnie po lewej stronie, a następnie kliknij Usuń nazwę próbek, aby utworzyć wykres.
    6. Wykonaj test t (jeśli tylko dwie grupy) lub ANOVA (jeśli są większe niż dwie grupy), aby zobrazować cechy (bakterie), które różnią się między grupami. Kliknij opcję Wybrane obiekty, aby wyświetlić określone bakterie, które różnią się między grupami.
    7. Kliknij Dendrogram lub Mapa skupień, aby utworzyć odpowiednie wykresy. Można przeprowadzić dodatkową analizę, taką jak przykładowa wizualizacja według grup lub 25 najważniejszych funkcji opartych na teście/ANOVA.
    8. Kliknij pozycję RandomForest, aby utworzyć wykresy przedstawiające obiekty, których można użyć do klasyfikacji. Kliknij kartę Wariancja u góry, aby utworzyć wykresy dla najważniejszych obiektów, które różnią się między grupami. Kliknij opcję Szczegóły funkcji, aby wyświetlić listę bakterii, które różnią się między grupami, a następnie kliknij każdą bakterię, aby utworzyć jej graficzne podsumowanie.
    9. Kliknij kartę Outlier (Wartości odstające) u góry, aby wyświetlić przykłady, które są elementami odstającymi.
    10. Na koniec kliknij Pobierz i wybierz 1) plik zip zawierający całą wykonaną analizę lub 2) żądane funkcje do pobrania. Ten plik powinien zostać zapisany jako unikalna nazwa i będzie musiał zostać rozpakowany przed użyciem.

UWAGA: Szczegółowe testy statystyczne wykonywane podczas analizy mikrobiomu znajdują się w pracach Chen et al. oraz Hugerth et al.14,30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ cząsteczki MHC klasy II (HLA u ludzi) odgrywają kluczową rolę w adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i wykazują silne powiązania z predyspozycjami do MS24,25,26, postawiono hipotezę, że cząsteczka HLA klasy II wpłynie na skład mikrobiologiczny jelit. W związku z tym myszy pozbawione genu MHC klasy II (AE.KO) lub wykazującego ekspresję ludzkiego genu HLA-DQ8 (HLA-DQ8) wykorzystano do zrozumienia znaczenia cząsteczek H...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół jest prosty, z łatwymi do wykonania krokami do przeprowadzenia profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA z dużej liczby interesujących biopróbek. Sekwencjonowanie nowej generacji zmieniło badania nad ekologią drobnoustrojów, zwłaszcza w modelach chorób ludzkich i przedklinicznych31,32. Główną zaletą tej techniki jest jej zdolność do skutecznej analizy złożonych kompozycji mikrobiologicznych (drobnoustrojów hod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. M. otrzymywał tantiemy od Mayo Clinic (wypłacane przez Evelo Biosciences) jako jeden z wynalazców technologii twierdzącej, że Prevotella histicola ma zastosowanie w leczeniu chorób autoimmunologicznych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za finansowanie z NIAID/NIH (1R01AI137075-01), Carver Trust Medical Research Initiative Grant oraz University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml naturalna probówka do mikrowirówekUSA, Scientific1615-5500Ściągaczka do zbierania kału
do aplikatora ręcznego 3M PA1-G3M, MN, USŚciągaczka do prawidłowego uszczelniania płytki PCR
Agencourt AMPure XPBeckman Coulter, IN, USAA63880Oczyszczanie PCR, NGS Oczyszczanie, oczyszczanie PCR
Odczynnik Agilent DNA 1000 AgilentTechnologies, CA, USA5067-1504Kwantyfikacja DNA i kontrola jakości
Bioanalizator DNA 1000chip Agilent Technologies, CA, USA5067-1504Kwantyfikacja DNA i kontrola jakości
Wymienne nasadki do adoptowania indeksuIllumina, Inc., CA, USA15026762Nowa nasadka do startera o indeksie 1 i 2
DNeasy PowerLyzer PowerSoil KitMoBio teraz część QIAGEN, Walencja, Kalifornia, USA12855-100DNA izolacja
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x)Kapa Biosystem, MA, Stany ZjednoczoneKK2602Gotowa mieszanka PCR do Amplicon PCR1 i indeksowanego PCR2
Skrzynki dzielone LewisaPojemniki Lewisa, WI, USAND03080Zbiórka kału
Stojak magnetycznyNew England BioLabs, MA, USAS1509SDo czyszczenia PCR
MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytkareakcyjna MicroAmpApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, Stany Zjednoczone4346906PCR Plate
MicroAmp Optyczny klej foliowyApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA4311971PCR Plate Sealer
Microfuge 20 WirówkaBeckman Coulter, IN, USAB30154Wirówka używana do izolacji DNA
Zestaw odczynników MiSeq (600 cykli) v.3Illumina, Inc., CA, USAMS-102-3003Do sekwencjonowania MiSeq
Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera XTIllumina, Inc., CA, USAFC-131-100116S rRNA Biblioteka DNA Przygotowanie
odczynników Tace wielokanałoweASI, FL, USARS71-1Do poolingu płytki produktu PCR2
CetrifugeThermo Fisher Scientific, CA, USA75004393Do mieszania odczynników PCR i usuwania pęcherzyków powietrza z płyty
PhiX ControlIllumina, Inc., CA, USAFC-110-3001Do kontroli sekwencjonowania MiSeq
Zestaw do oczyszczania DNA mikrobiomuThermo Fisher Scientific, CA, USAA29789Do oczyszczania produktu PCR1
Homogenizator PowerLyzer 24Omni International, GA, USA19-001Ubijak do kulek do izolacji DNA
Zestaw do oznaczania kubitów DSDNA HS (wysoka czułość)Thermo Fisher Scientific, CA, USAQ32854Kwantyfikacja DNA
Oprawa płytki indeksowej TruSeqIllumina, Inc., CA, USAFC-130-1005Do układania starterów indeksowych
Dzielniki pionowe (duże)Pojemniki Lewisa, WI, USADV-2280Zbieranie kału
Pionowe przegrody (małe)Pojemniki Lewis, WI, USDV-1780Zbieranie kału
Ściągaczka 7100038651 zbiorników

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
  2. Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
  3. Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
  4. Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
  5. Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
  6. Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
  7. Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
  8. Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer's disease. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
  9. Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
  10. Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
  11. Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695(2018).
  12. Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189(2017).
  13. Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
  14. Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484(2016).
  15. Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
  16. Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
  17. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).
  18. Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
  19. Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, Suppl 1 23-28 (2010).
  20. Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015(2016).
  21. Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429(2015).
  22. Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
  23. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  24. Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
  25. Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
  26. Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
  27. Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn's Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn's & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
  28. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217(2013).
  29. Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
  30. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561(2017).
  31. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617(2015).
  32. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
  33. Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
  34. Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649(2013).
  35. Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
  36. Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
  37. Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462(2019).
  38. Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
  39. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52(2017).
  40. Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
  41. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
  42. Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112(2014).
  43. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24(2016).
  44. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87(2014).
  45. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564(2014).
  46. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
  47. Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
  48. Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
  49. Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie 16S rRNAsekwencjonowanie nowej generacjiizolacja bakteryjnego DNAprzetwarzanie pr bek ka uanaliza DADA2analiza Phyloseqanaliza METAGENassistamplifikacja regionu V3 V4

Powiązane artykuły