Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59982

⸱

2 sierpnia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Cellular Neurophysiology, Institute of Physiology CAS

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę badania transportu receptora glutaminianu (GluR) w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Wykorzystując podejście oparte na podawaniu przeciwciał do znakowania endogennych lub nadmiernie eksprymowanych receptorów w połączeniu z podejściami farmakologicznymi, metoda ta pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję powierzchniową GluR poprzez modulację procesów internalizacji lub recyklingu.

Streszczenie

Odpowiedzi komórkowe na bodźce zewnętrzne w dużej mierze zależą od zestawu receptorów wyrażonych na powierzchni komórki w danym momencie. W związku z tym populacja receptorów o ekspresji powierzchniowej stale się dostosowuje i podlega ścisłym mechanizmom regulacji. Paradygmatycznym przykładem i jednym z najczęściej badanych zdarzeń związanych z handlem w biologii jest regulowana kontrola synaptycznej ekspresji receptorów glutaminianu (GluR). GluR pośredniczą w zdecydowanej większości neurotransmisji pobudzającej w ośrodkowym układzie nerwowym i kontrolują zależne od aktywności fizjologicznej zmiany funkcjonalne i strukturalne na poziomie synaptycznym i neuronalnym (np. plastyczność synaptyczną). Modyfikacje liczby, lokalizacji i składu podjednostek GluR wyrażanych na powierzchni głęboko wpływają na funkcję neuronów, a w rzeczywistości zmiany w tych czynnikach są związane z różnymi neuropatiami. Przedstawiono metodę badania transportu GluR w zdysocjowanych neuronach pierwotnych hipokampa. Podejście "oparte na karmieniu przeciwciałami" jest stosowane do zróżnicowanej wizualizacji populacji GluR wyrażanych na powierzchni i błonach wewnętrznych. Poprzez znakowanie receptorów powierzchniowych na żywych komórkach i utrwalanie ich w różnym czasie, aby umożliwić endocytozę receptorów i/lub recykling, te procesy transportu mogą być oceniane i selektywnie badane. Jest to wszechstronny protokół, który może być stosowany w połączeniu z podejściami farmakologicznymi lub nadekspresją zmienionych receptorów w celu uzyskania cennych informacji na temat bodźców i mechanizmów molekularnych wpływających na transport GluR. Podobnie, można go łatwo dostosować do badania innych receptorów lub białek o ekspresji powierzchniowej.

Wprowadzenie

Komórki wykorzystują aktywny proces transportu do mobilizacji białek do określonych lokalizacji subkomórkowych i wywierają ścisłą czasoprzestrzenną regulację nad swoją funkcją1. Proces ten jest szczególnie ważny dla receptorów transbłonowych, ponieważ odpowiedzi komórkowe na różne bodźce środowiskowe opierają się na kaskadach wewnątrzkomórkowych wyzwalanych przez aktywację receptora. Komórki są w stanie modyfikować te odpowiedzi poprzez zmianę gęstości, lokalizacji i składu podjednostek receptorów wyrażających się na powierzchni komórki poprzez regulację transportu subkomórkowego receptora2. Wprowadzenie nowo zsyntetyzowanych receptorów do błony plazmatycznej, wraz z endocytozą i recyklingiem istniejących receptorów, to przykłady procesów transportowych, które określają pulę netto receptorów wyrażonych powierzchniowo2. Wiele mechanizmów molekularnych współpracuje w celu regulacji transportu białek, w tym interakcji białko-białko i modyfikacje potranslacyjne, takie jak fosforylacja, ubikwitynacja lub palmitoilacja2.

Regulacja transportu receptorów jest szczególnie wymagana w silnie spolaryzowanych komórkach o wysoce wyspecjalizowanych strukturach. Przykładem paradygmatycznym jest kontrola funkcji neuronów poprzez regulowany transport receptorów glutaminianu (GluRs)3,4. Glutaminian, główny neuroprzekaźnik pobudzający, wiąże i aktywuje GluR wyrażane powierzchniowo w celu kontrolowania podstawowych fizjologicznych funkcji neuronalnych, takich jak neurotransmisja synaptyczna i plastyczność synaptyczna. Fakt, że zmieniony transport GluR zaobserwowano w szerokim spektrum neuropatii, od zaburzeń neurorozwojowych po choroby neurodegeneracyjne, podkreśla znaczenie tego procesu5. W związku z tym zrozumienie zdarzeń molekularnych, które kontrolują transport GluR, jest interesujące w wielu obszarach badań.

W tym protokole, metoda oparta na podawaniu przeciwciał jest używana do ilościowego określenia poziomu GluR wyrażanych powierzchniowo w pierwotnych neuronach hipokampa, a także do oceny, jak zmiany w internalizacji i recyklingu skutkują obserwowaną ekspresją powierzchniową netto. Zastosowanie farmakologii i/lub nadekspresji receptorów egzogennych zawierających określone mutacje sprawia, że protokół ten jest szczególnie skutecznym podejściem do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw adaptacji neuronów do różnych bodźców środowiskowych. Ostatnim przykładem użyteczności tego protokołu jest badanie, w jaki sposób wieloczynnikowe zmiany w środowisku (np. w modelach chorobowych) wpływają na transport GluR poprzez badanie ekspresji powierzchniowej w takich modelach.

Na konkretnych przykładach, początkowo pokazano, jak manipulacja farmakologiczna naśladująca fizjologiczną stymulację synaptyczną [chemiczną LTP (cLTP)] zwiększa powierzchniową ekspresję endogennej podjednostki GluA1 typu AMPA GluRs (AMPARs)6. Transportowanie nadeksprymowanej fosfo-mimetycznej formy podjednostki GluN2B GluR typu NMDA (NMDAR) jest również analizowane w celu zilustrowania, w jaki sposób protokół ten może być wykorzystany do badania regulacji transportu GluR przez określone modyfikacje potranslacyjne. Chociaż te konkretne przykłady są używane, protokół ten można łatwo zastosować do innych GluR oraz innych receptorów i białek, które posiadają antygenowe domeny zewnątrzkomórkowe. W przypadku, gdy nie ma dostępnych przeciwciał dla domen zewnątrzkomórkowych, nadekspresja białek znakowanych epitopami zewnątrzkomórkowymi (np. Flaga, Myc, GFP itp.) może pomóc w znakowaniu białek.

Obecny protokół zawiera instrukcje dotyczące ilościowego określania gęstości określonego podtypu GluR i transportu za pomocą specyficznych przeciwciał. Protokół ten można wykorzystać do badania 1) całkowitej ekspresji powierzchni GluR, 2) internalizacji GluR i 3) recyklingu GluR. Aby przestudiować każdy proces indywidualnie, zaleca się rozpoczęcie od sekcji 1 i 2, a następnie kontynuowanie w sekcji 3, 4 lub 5. We wszystkich przypadkach zakończ sekcjami 6 i 8 (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Praca dotycząca przygotowania hodowli pierwotnej hipokampa została przejrzana i zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Northwestern (protokół #IS00001151).

1. Przygotowanie przed etykietowaniem

  1. Przygotowanie i utrzymanie pierwotnych kultur hipokampa
    1. Przygotuj pierwotne kultury hipokampa o gęstości 150 000 komórek posianych na pokrytych poli-D-lizyną (0,1 mg/ml) szkłach nakrywkowych o średnicy 18 mm. Dostępne są doskonałe przewodniki dotyczące przygotowania zdysocjowanej hodowli neuronalnej7,8.
      nuta: W razie potrzeby hodowle można poddać działaniu arabinozydu cytozyny (Ara-C, 10 μM z DIV1), aby uniknąć proliferacji gleju w preparacie.
      nuta: Zamiast poli-D-lizyny można stosować alternatywne odczynniki powlekające, takie jak fibronektyna (1 mg/ml) lub laminina (5 μg/ml).
    2. Utrzymuj hodowle w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w 2 ml / studzienka pożywki neuropodstawowej uzupełnionej witaminą B27 i 2 mM L-glutaminą.
      nuta: W razie potrzeby można zastosować substytuty L-glutaminy (np. Glutamax).
    3. Co tydzień należy usunąć połowę objętości pożywki i zastąpić ją taką samą objętością uzupełnionego podłoża nerwowo-podstawnego.
  2. OPCJONALNIE: Transfekcja zmutowanych i/lub znakowanych epitopami receptorów
    UWAGA:     Neurony powinny być transfekowane co najmniej 3-4 dni przed punktem czasowym analizy, aby umożliwić ekspresję receptora. Wykorzystanie młodych neuronów [Days in vitro 6–9 (DIV6–9)] skutkuje lepszą wydajnością transfekcji niż w przypadku starszych neuronów (DIV15–20), ale wystarczająca liczba transfekowanych komórek (>20) może być osiągnięta niezależnie od zastosowanego DIV.
    1. Dla każdego dołka 12-dołkowej płytki rozcieńczyć 1,5 μg plazmidu zawierającego interesujący nas konstrukt w 100 μl świeżej pożywki neurobazalnej bez suplementacji witaminą B27 lub glutaminą w probówce mikrowirówkowej i wymieszać przez szybkie wirowanie.
      nuta: Dla udanej transfekcji bardzo ważne jest, aby zastosowane podłoże nerwowo-bazowe było jak najświeższe, najlepiej mniej niż 1 tydzień po otwarciu butelki.
    2. W drugiej probówce do mikrowirówki wymieszaj 1 μl odpowiedniego odczynnika do lipofekcji w 100 μl świeżej pożywki neuropodstawowej i delikatnie wymieszaj.
      nuta: Nie mieszać mieszaniny odczynników do lipofekcji. Stosowanie świeżych odczynników do lipofekcji może poprawić wydajność transfekcji.
    3. Inkubować probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    4. Dodawać kroplami mieszaninę odczynników do lipofekcji do mieszaniny DNA, delikatnie mieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Dostosuj objętość pożywki w każdym dołku do 1 ml kondycjonowanego podłoża.
    6. Dodaj kroplami odczynnik do lipofekcji - mieszaninę DNA do studzienki.
    7. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze i odczekaj co najmniej 3-4 dni na ekspresję białka.
      nuta: Dla celów opisanych poniżej protokołów internalizacji i recyklingu, neurony hipokampa transfekowano w DIV11-12 z konstruktami wyrażającymi GluN2B oznaczonymi GFP w domenie zewnątrzkomórkowej (GFP-GluN2B) i zobrazowano w DIV15-16.
  3. OPCJONALNIE: Inkubacja komórek z lekami (przewlekle lub ostro) w kondycjonowanej pożywce aż do utrwalenia.
    UWAGA:     W przypadku leczenia ostrego należy rozpocząć leczenie komórek przed znakowaniem. W zależności od zastosowanego protokołu leczenia farmakologicznego, komórki mogą być utrzymywane w pożywkach zawierających lek podczas sekcji 2. W naszym przykładzie komórki DIV21 podlegały protokołowi cLTP w celu zwiększenia wyrażonej powierzchniowo klasy AMPAR9.
    1. Wymień kondycjonowane podłoże na roztwór zewnątrzkomórkowy (ECS).
    2. Traktuj komórki glicyną 300 μM w ECS przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Jako kontrolę, siostrzane szkiełko nakrywkowe należy potraktować ECS (bez glicyny).
    3. Przemyć komórki 3x roztworem ECS w temperaturze 37 °C i umieścić komórki w ECS (bez glicyny) w inkubatorze komórek na 20 minut przed kontynuacją czynności opisanych w sekcji 2.
      UWAGA: ECS (w mM): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 glukozy, 0,001 TTX, 0,01 strychniny i 0,03 pikrotoksyny przy pH 7,4.

2. Etykietowanie na żywo receptorów o ekspresji powierzchniowej

  1. Przygotuj szkiełka nakrywkowe do etykietowania
    1. Aby zaoszczędzić odczynniki i ułatwić manipulację, przenieś szkiełka nakrywkowe stroną komórkową do góry na tackę pokrytą folią parafinową.
      nuta: Bardzo ważne jest, aby nigdy nie dopuścić do wyschnięcia próbek.
    2. Przechowuj i utrzymuj kondycjonowane podłoże w temperaturze 37 °C na etapie inkubacji i mycia.
      nuta: W przypadku szkiełka nakrywkowego o średnicy 18 mm zaleca się inkubację z 75–100 μl pożywki do znakowania przeciwciał i 120–150 μl do internalizacji/recyklingu.
  2. Znakowanie receptorów powierzchniowych przeciwciałem pierwszorzędowym
    1. Inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w kondycjonowanej pożywce przez 15 minut w temperaturze RT.
      nuta: W przypadku receptorów znakowanych GFP zastosowano królicze przeciwciało anty-GFP w rozcieńczeniu 1:1000. W przypadku endogennego GluA1 zastosowano mysi anty-GluA1 w rozcieńczeniu 1:200.
    2. Ostrożnie odessać pożywkę zawierającą przeciwciała za pomocą pipety próżniowej i trzykrotnie umyć komórki kondycjonowaną pożywką.
      nuta: Jeżeli kondycjonowane media są niedostępne, wszystkie etapy płukania można przeprowadzić przy użyciu PBS+ [sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) zawierająca 1 mM MgCl2 i 0,1 mM CaCl2]. Ręczne zasysanie za pomocą mikropipety może być wykonane, jeśli delikatne zasysanie próżniowe nie jest dostępne.

3. Wyrażenie powierzchniowe (Rysunek 2)

  1. Wtórne znakowanie przeciwciał receptorów o ekspresji powierzchniowej
    1. Umyj raz za pomocą PBS+.
    2. Utrwal komórki poprzez inkubację z 4% paraformaldehydem (PFA) i 4% sacharozą w PBS przez 7–8 min.
      nuta: W przeciwieństwie do innych metod utrwalania, takich jak inkubacja metanolu, PFA nie przenika przez błonę plazmatyczną i dlatego nadaje się do analizy ekspresji powierzchniowej. Aby uzyskać optymalne rezultaty, użyj świeżo przygotowanego PFA. Krótkotrwałe przechowywanie PFA w temperaturze 4 °C lub długotrwałe (do 30 dni) przechowywanie w temperaturze -20 °C jest dopuszczalne w celu odpowiedniego utrwalenia.
      ostrożność: PFA jest znanym czynnikiem rakotwórczym. Podczas obsługi należy używać odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej i kaptura ochronnego.
    3. Umyj komórki trzykrotnie zwykłym PBS.
      nuta: Alternatywnie, 0,1 M glicyny może być użyta do mycia PFA zamiast PBS, ponieważ glicyna ugasi wszelkie pozostałe utrwalacze, które mogą zwiększyć tło w preparacie.
    4. Blokuj niespecyficzne miejsca wiązania przez inkubację z 10% normalną surowicą kozią (NGS) w PBS przez 30 minut w RT.
      nuta: Czas blokowania można wydłużyć bez negatywnego wpływu na etykietowanie.
    5. Inkubować z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu znakowania receptorów znakowanych przeciwciałami pierwszorzędowymi (tj. wyrażanych powierzchniowo).
      nuta: W tych przykładach zastosowano rozcieńczenie 1:500 przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z Alexa 555: koziego anty-królika dla receptorów znakowanych GFP i koziego anty-mysiego dla GluA1.
    6. Umyj komórki PBS 3x.
  2. Znakowanie receptorów wewnątrzkomórkowych
    1. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,25% Triton X-100 w PBS przez 5–10 minut w temperaturze RT.
      nuta: Aby sprawdzić, czy początkowa runda znakowania przeciwciałami zajmuje wszystkie epitopy powierzchniowe, ten etap przepuszczalności można pominąć w siostrzanej kulturze. W takim przypadku nie należy uzyskiwać sygnału dla receptorów wewnątrzkomórkowych. Dodatkowo, aby sprawdzić, czy żadne wewnętrzne receptory nie zostały oznaczone w poprzedniej sekcji 2 (tj. pokazując integralność błon plazmatycznych w hodowli), etap przepuszczalności można pominąć w siostrzanej hodowli, a pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko białku wewnątrzkomórkowemu (np. PSD-95 lub MAP2) można zastosować w kroku 2.2.1. W tych warunkach nie należy uzyskiwać sygnału z tego pierwotnego. W tym przypadku zastosowano królicze przeciwciało anty-PSD-95 (1:500).
    2. Blokuj z 10% NGS w PBS przez 30 minut w RT.
    3. Znakować receptory wewnątrzkomórkowe poprzez inkubację przepuszczalnych komórek z tym samym przeciwciałem pierwszorzędowym, które zastosowano w sekcji 2.2, rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w RT.
      nuta: Rozcieńczenie przeciwciał do znakowania receptorów wewnątrzkomórkowych może być inne niż wymagane do znakowania receptorów o ekspresji powierzchniowej. W przykładzie GluA1 zastosowano to samo rozcieńczenie przeciwciała (1:200).
    4. Umyj komórki 3x PBS.
    5. Znakować drugim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w RT.
      nuta: W tych przykładach zastosowano rozcieńczenie 1:500 koziego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z Alexa 647 przeciwko myszy (dla GluA1).
    6. Umyj komórki 3x PBS.

4. Internalizacja (Rysunek 3)

  1. Internalizacja receptorów powierzchniowych znakowanych przeciwciałami
    1. Po znakowaniu receptorów z ekspresją powierzchniową i przemyciu przeciwciał (sekcja 2.2), należy utrzymać komórki w kondycjonowanym podłożu bez przeciwciał i zwrócić je do inkubatora (37 °C), aby umożliwić internalizację.
      nuta: W przypadku receptorów NMDA zaleca się 30 minut na internalizację. Jako kontrola, siostrzana hodowla może być utrzymywana z kondycjonowanymi pożywkami w temperaturze 4 °C podczas procesu internalizacji. W tych warunkach powinna nastąpić minimalna internalizacja receptora.
  2. Znakowanie receptorów powierzchniowych
    1. Umyj komórki raz za pomocą PBS+.
    2. Napraw komórki za pomocą 4% PFA i 4% sacharozy w PBS przez 7–8 min.
      ostrożność: Podczas obchodzenia się z PFA należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej i kaptura ochronnego.
    3. Umyj komórki 3x zwykłym PBS.
    4. Blokuj z 10% NGS w PBS przez 30 minut w RT, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
    5. Inkubować próbki z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w temperaturze RT w celu znakowania pierwszorzędowych receptorów znakowanych przeciwciałami (tj. receptorów o ekspresji powierzchniowej, które nie zostały zinternalizowane).
      nuta: W tym przykładzie do znakowania użyto sprzężonego z Alexa 555 koziego przeciwciała wtórnego przeciwko królikowi (1:500).
    6. Umyj komórki 3x PBS.
  3. Znakowanie zinternalizowanych receptorów
    1. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,25% Triton X-100 w PBS przez 5–10 minut.
    2. Zablokuj niespecyficzne wiązanie przez inkubację z 10% NGS w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Inkubować próbki ze znakowanym fluorescencyjnie przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu znakowania zinternalizowanych receptorów znakowanych przeciwciałami.
      nuta: W tym przykładzie do znakowania stosuje się sprzężone z Alexa 647 kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi (1:500).
    4. Umyj komórki 3x PBS.

5. Recykling (Rysunek 4)

  1. Internalizacja receptorów powierzchniowych znakowanych przeciwciałami
    1. Po znakowaniu receptorów z ekspresją powierzchniową i przemyciu przeciwciał (sekcja 2.2), należy utrzymać komórki w kondycjonowanym podłożu bez przeciwciał i zwrócić je do inkubatora (37 °C), aby umożliwić internalizację.
      nuta: W przypadku receptorów NMDA zaleca się 30 minut na internalizację.
  2. Blokowanie stabilnych receptorów wyrażających ekspresję powierzchniową
    1. Aby zablokować epitopy na pierwotnym przeciwciałie przyłączonym do receptorów o ekspresji powierzchniowej, które nie zostały zinternalizowane, należy inkubować komórki z niesprzężonymi fragmentami przeciwciała anty-IgG Fab (H + L) (przeciwko podstawowemu zastosowanemu w sekcji 2.2) rozcieńczonym w kondycjonowanym podłożu (20 μg / ml) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Leczenie to zapobiega przyszłym interakcjom z przeciwciałami drugorzędowymi.
      nuta: W tym przykładzie użyto fragmentów Fab przeciwko królikom Goat.
      nuta: Eksperyment kontrolny: aby upewnić się, że nastąpiło całkowite zablokowanie receptorów wyrażanych powierzchniowo, siostrzane szkiełka nakrywkowe mogą być inkubowane z Fab i bez niego. Kultury należy utrwalić natychmiast po leczeniu Fab, a obie kultury inkubuje się z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z Alexa 555. Brak sygnału Alexa 555 w inkubowanych komórkach Fab wskazuje na prawidłowe blokowanie przeciwciał.
    2. Umyj komórki 3x kondycjonowanym medium.
    3. Inkubować komórki z kondycjonowaną pożywką zawierającą 80 μM dynasore, aby zapobiec dalszej internalizacji i zwrócić komórki do inkubatora (37 °C), aby umożliwić recykling zinternalizowanych receptorów. Dynasore jest inhibitorem GTPazy, który hamuje dynaminę, a tym samym zapobiega internalizacji.
      UWAGA: Zalecane jest 45 minut na recykling NMDAR. Należy zauważyć, że Dynasore blokuje wyłącznie proces internalizacji zależny od dynaminy (np. internalizacja NMDAR). Jednak internalizacja innego białka synaptycznego (niezależna od dynaminy) może nadal zachodzić w obecności Dynasore.
  3. Znakowanie receptorów pochodzących z recyklingu
    1. Umyj komórki raz za pomocą PBS+.
    2. Napraw komórki za pomocą 4% PFA i 4% sacharozy w PBS przez 7–8 min.
      ostrożność: Podczas obchodzenia się z PFA należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej i kaptura ochronnego.
    3. Umyj komórki 3x PBS.
    4. Blokuj z 10% NGS w PBS przez 30 minut w RT, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
    5. Oznakować komórki pierwszym fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w RT.
      nuta: W tym przykładzie do znakowania użyto sprzężonego z Alexa 555 koziego przeciwciała anty-królika (1:500).
    6. Umyj komórki 3x za pomocą PBS.
      nuta: Dłuższe mycie PBS (5–10 min) może pomóc w zmniejszeniu tła w preparacie.
  4. Znakowanie zinternalizowanych receptorów
    1. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,25% Triton X-100 w PBS przez 5–10 minut.
    2. Blokuj z 10% NGS w PBS przez 30 minut w RT.
    3. Znakować drugim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w RT.
      nuta: W tym przykładzie do znakowania użyto sprzężonego z Alexa 647 koziego przeciwciała anty-królika (1:500).
    4. Umyj komórki 3x PBS.

6. Montaż i obrazowanie próbek

  1. Zamontuj komórki, delikatnie kładąc szkiełka nakrywkowe komórką do dołu na 12–15 μl odpowiedniego podłoża montażowego.
    nuta: Zasysanie nadmiaru nośnika montażowego poprawi jakość obrazów.
  2. Obrazowanie komórek pod odpowiednim mikroskopem konfokalnym.
    nuta: Zaleca się obrazowanie stosu z przy 60-krotnym powiększeniu z krokami co 0,35 μm, obejmującymi całą grubość neuronu.

7. Rozważania dotyczące czasu

  1. Jest to długi protokół, który można zatrzymać w kilku punktach. W razie potrzeby należy przeprowadzić etapy inkubacji przeciwciał blokujących i pierwotnych przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
  2. Alternatywnie, w razie potrzeby, użyj mikrofalowego procesora tkankowego, aby znacznie przyspieszyć czas inkubacji po utrwaleniu. Na wszystkich etapach użyj 150 W przy 30 °C dla ustawień "Włącz".
    1. Aby zablokować, uruchom procesor po 2 minutach "Włączone", 1 minutach "Wyłączone" i 2 minutach "Włączone".
    2. W przypadku etapów inkubacji przeciwciał pierwotnych i wtórnych uruchom procesor po 3 minutach "Włączone", 2 minuty "Wyłączone" i 3 minuty "Włączone"
      nuta: Nie obserwujemy żadnej różnicy w jakości po wprowadzeniu powyższych zmian w protokole.

8. Analiza obrazu

  1. Zaleca się używanie FIJI do przeprowadzania analizy obrazu, ponieważ jest on kompatybilny z wieloma formatami plików. Do naszych danych pozyskano obrazy w formacie pliku Nikon ND2.
  2. Dostępny jest skrypt makra do łatwej kwantyfikacji partii różnych parametrów wstępnie wybranych przez FIDŻI. W makrze znajdują się następujące kroki:
    nuta: W tych przykładach zmierzono "intensywność zintegrowaną".
  3. Otwórz pliki obrazów na FIDŻI i oddzielne kanały.
  4. Rzutuj Z każdy stos kanałów jako projekcję o maksymalnej intensywności.
  5. Ustaw dolny próg dla każdego kanału.
    nuta: Progi powinny być wyznaczone empirycznie dla każdego zbioru danych doświadczalnych. Chociaż każdy kanał może mieć oddzielną dolną wartość progową, ważne jest, aby wartości progowe kanału były konsekwentnie zachowywane dla wszystkich obrazów tego samego zestawu danych.
  6. Wybierz od trzech do pięciu dendrytów drugo- lub trzeciorzędowych i zapisz je jako obszary zainteresowania (ROI).
  7. Zmierz zintegrowaną gęstość każdego zwrotu z inwestycji w kanałach powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych.
  8. Znormalizuj sygnał dla każdego ROI, dzieląc zintegrowaną wartość gęstości kanału powierzchniowego przez kanał wewnątrzkomórkowy.
  9. Powtórz pomiary dla wszystkich obrazów kontrolnych i eksperymentalnych i znormalizuj wartości eksperymentalne do wartości kontrolnych (np. GluN2B WT lub warunki bez glicyny).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół badania transportu receptorów glutaminianu opiera się na różnicowym znakowaniu receptorów eksponowanych na powierzchni komórki oraz tych zlokalizowanych w błonach wewnętrznych. Separację osiąga się poprzez znakowanie receptorów przed i po permeabilizacji błony, wykorzystując to samo przeciwciało pierwotne, ale przeciwciało wtórne sprzężone z innym fluorophorem. Jak wskazano w opcjonalnych krokach zawartych w protokole, jest to bardzo wszechstronna metoda badania różnych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Interakcja między komórką a jej środowiskiem (np. komunikacja z innymi komórkami, reakcja na różne bodźce itp.) w dużym stopniu zależy od prawidłowej ekspresji receptorów na powierzchni komórki. Szybka i precyzyjnie dostrojona regulacja zawartości receptorów wyrażanych powierzchniowo umożliwia prawidłową odpowiedź komórkową na stale zmieniające się środowisko. W szczególnym przypadku neuronów zmiany w liczbie, lokalizacji i składzie podjednostek receptorów o ekspresji synaptycznej silnie wpływają na komunikację synaptycz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Northwestern Center for Advanced Microscopy za korzystanie z mikroskopu konfokalnego Nikon A1 i pomoc w planowaniu i analizie eksperymentów. Badania te były wspierane przez NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.) i NIA (R00AG041225) oraz NARSAD Young Investigator Grant z Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S. -C.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm o grubości #1,5NeuvitroGG181.5
Alexa 555-sprzężona koza anty-mysz wtórneTechnologiesA21424
Alexa 555-sprzężona koza anty-królik wtórneTechnologiesA21429
Alexa 647-sprzężona koza anty-mysz wtórneTechnologiesA21236
Alexa 647-sprzężona koza anty-królik wtórneLife TechnologiesA21245
B27Gibco17504044
CaCl2SigmaC7902
Corning Costar Płaskie płytki do hodowli komórkowych Corning3513
DynasoreTocris2897
GlukozaSigmaG8270
GlycineTocris0219
Kozia anty-królicza fragmenty FabSigmaSAB3700970
HEPESSigmaH7006
KClSigmaP9541
L-GlutaminaSigmaG7513
Lipofectamina 2000Invitrogen11668019
Mouse przeciwciało anty-GluA1MilliporeMAB2263
NaClSigmaS6546
Neurobaseal MediaGibco21103049
NGSAbcamAb7481
ParafilmBemisPM999
PBSGibco10010023
Pelco BioWaveTed Pella36500
PFAAlfa Aesar43368
PikrotoksynaTocris1128
Bromowodorek poli-D-lizynySigmaP7280
ProLong Gold Anti-BlaknięcieMocowanie Life TechnologiesP36934
Królicze przeciwciało anty-GFPInvitrogenA11122
Królicze przeciwciało anty-PSD-95Sygnalizacja komórkowa2507
StrychninaTocris2785
SacharozaSigmaS0389
Szkiełka mikroskopowe Superfrost plusFisher12-550-15
Triton X-100SigmaX100
TTXTocris1078
Life Life Life

Bibliografia

  1. Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2001).
  2. Bedford, F. K. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. , Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).
  3. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
  4. Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).
  5. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
  6. Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
  7. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  8. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  9. Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).
  10. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).
  11. Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  12. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896(2014).
  13. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).
  14. Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
  15. Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , Chapter 6, Unit 6 10 (2001).
  16. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dysocjowane hodowle hipokampaznakowanie receptorów powierzchniowychinternalizacja receptorówrecykling receptorówobrazowanie mikroskopem konfokalnyminkubacja z przeciwciałem pierwotnymprotokół blokowania fragmentami Fabmetoda fiksacji PFA
Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.