Artykuł metodologiczny

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

DOI:

10.3791/59985

⸱

16 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, Endocrinology, Diabetes & Metabolism, Baylor College of Medicine, 3Scientific Center, Shandong Provincial Hospital affiliated to Shandong University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cukrzyca typu 1 (T1D) charakteryzuje się autoimmunizacją specyficzną dla wysp trzustkowych, prowadzącą do niszczenia komórek beta i absolutnej utraty produkcji insuliny. W mysim modelu spontanicznej cukrzycy nieotyłej (NOD) insulina jest głównym celem, a manipulacja genetyczna tych zwierząt w celu usunięcia jednego kluczowego epitopu insuliny zapobiega chorobie. Tak więc selektywna eliminacja profesjonalnych komórek prezentujących antygen (APC) zawierających ten patogenny epitop jest podejściem do hamowania niepożądanych odpowiedzi autoimmunologicznych specyficznych dla insuliny i prawdopodobnie ma większy potencjał translacyjny.

Chimeryczne receptory antygenowe (CAR) mogą przekierowywać limfocyty T do selektywnego celowania w chorobotwórcze antygeny. Technika ta ma fundamentalne znaczenie dla ostatnich prób wykorzystania inżynierii komórkowej w adoptywnej terapii komórkowej w leczeniu wielu nowotworów. W tym protokole opisujemy zoptymalizowany protokół transdukcji retrowirusa limfocytów T (RV) i ekspansji in vitro, który generuje dużą liczbę funkcjonalnych komórek CAR-T CD8 specyficznych dla antygenu, zaczynając od niewielkiej liczby komórek naiwnych. Wcześniej opisano wiele protokołów komórkowych CAR-T, ale zazwyczaj ze stosunkowo niską wydajnością transdukcji i żywotnością komórek po transdukcji. W przeciwieństwie do tego, nasz protokół zapewnia do 90% skuteczności transdukcji, a wygenerowane komórki mogą przetrwać ponad dwa tygodnie in vivo i znacznie opóźnić początek choroby po pojedynczej infuzji. Zapewniamy szczegółowy opis protokołu konserwacji i transdukcji komórek, aby można było łatwo wykonać krytyczne kroki. Całą procedurę od pierwotnej izolacji komórek do ekspresji CAR można przeprowadzić w ciągu 14 dni. Ogólna metoda może być zastosowana do każdego modelu choroby myszy, w którym znany jest cel. Podobnie, specyficzne zastosowanie (ukierunkowane na patogenny peptyd/kompleks MHC klasy II) ma zastosowanie do każdego innego modelu choroby autoimmunologicznej, dla którego zidentyfikowano kluczowy kompleks.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę prawdopodobne zmniejszone ryzyko wystąpienia niepożądanych efektów, terapie immunologiczne specyficzne dla antygenu (ASI) są obiecującymi metodami leczenia chorób autoimmunologicznych, takich jak T1D. Coraz więcej dowodów sugeruje, że odpowiedź immunologiczna na (pre)insulinę może być szczególnie ważna w cukrzycy typu 1D1. W ciągu ostatniej dekady badania przeprowadzone w wielu grupach, w tym w naszym, zdecydowanie sugerują, że prezentacja epitopu zawierającego aminokwasy łańcucha B insuliny od 9 do 23 przez specyficzne cząsteczki MHC klasy II (B:9-23/MHCII), odgrywa ważną rolę w rozwoju T1D u myszy i ludzi2,3,4,5. Aby selektywnie celować w kompleks B: 9-23 / MHCII, wygenerowaliśmy przeciwciało monoklonalne o nazwie mAb287, które nie ma reaktywności krzyżowej z hormonem insuliną lub kompleksami zawierającymi inne peptydy6. MAb287 blokuje prezentację antygenu in vitro, a cotygodniowe podawanie mAb287 myszom NOD ze stanem przedcukrzycowym opóźniało rozwój T1D u 35% leczonych myszy 6. Aby zablokować prezentację antygenu in vivo, zwykle wymagane są częste wstrzyknięcia w celu utrzymania wysokiego stężenia we krwi. Postawiliśmy hipotezę, że możemy przezwyciężyć tę trudność, wykorzystując wysoką specyficzność Ab287 do przeprogramowania limfocytów T, zapewniając w ten sposób ulepszoną terapię limfocytami T specyficznymi dla antygenu dla T1D7.

Cytotoksyczne limfocyty T są w stanie zabić swój cel, jeśli nawet jedna kopia ich pokrewnego liganda zostanie wyrażona8,9,10. W związku z tym oczekuje się, że limfocyty T CD8 specyficzne dla B: 9-23 / MHCII będą miały wyższą skuteczność w eliminowaniu niepożądanej prezentacji antygenu niż przeciwciało macierzyste, które prawdopodobnie będzie musiało związać się z wieloma kompleksami na tym samym APC, aby wywrzeć swój efekt. Limfocyty CAR T były używane w leczeniu wielu nowotworów u ludzi11,12,13, i mogą być również skuteczne w autoimmunizacji14. Jednak komórki CAR-T ze swoistością dla patogennych kompleksów peptyd-MHC nie były do tej pory wykorzystywane do modyfikowania progresji T1D. Korzystając ze zoptymalizowanej techniki transdukcji limfocytów T CD8 opisanej poniżej, niedawno wykazaliśmy dowód na zasadę, że jest to rzeczywiście realne podejście7.

W tym protokole przedstawiamy efektywną i uproszczoną metodę transdukcji i ekspansji. Nasz protokół ma zastosowanie w innych badaniach wymagających generacji mysich limfocytów CD8 CAR T o wysokiej wydajności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy były utrzymywane w specyficznych warunkach wolnych od patogenów w ośrodku dla myszy transgenicznych, a wszystkie eksperymenty na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt Baylor College of Medicine.

UWAGA: Eksperyment wymaga równoległego przygotowania wirusa i limfocytów T. Tabela 1 podsumowuje protokół. Kluczowe odczynniki i są wymienione w Tabeli materiałów. Koncentrujemy się na generowaniu i ekspansji komórek CAR-T ukierunkowanych na określone populacje APC w tym protokole.

1. Generowanie i walidacja jednołańcuchowych przeciwciał Fab (scFab)-CARs.

UWAGA: CAR zazwyczaj zawierają 3 domeny krytyczne - domenę celującą w antygen, domenę dystansową/transbłonową i domenę sygnalizacji cytoplazmatycznej. Dokładny projekt każdego CAR zależy od zamierzonego celu, a zatem, poza kluczowymi cechami konstruktu istotnymi dla generacji retrowirusa, nie zostanie szczegółowo opisany w niniejszym protokole. Ogólny projekt CAR wykorzystanych w badaniach opisanych poniżej przedstawiono na rysunku Rysunek 1. Krótko mówiąc, domena celowa obejmuje cały łańcuch lekki i domenę zmienną oraz domenę CH1 łańcucha ciężkiego z macierzystego przeciwciała monoklonalnego połączonego półsztywnym łącznikiem. Domena dystansowa / transbłonowa pochodzi z mysiego CD28, a domena sygnalizacyjna to fuzja zawierająca pierwiastki z mysich CD28, CD137 (4-1BB) i CD247 (CD3ζ). Pierwiastki te są składane za pomocą standardowych procedur biologii molekularnej, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy nakładającej się na splot (PCR) lub synteza odpowiedniego "bloku genu". Szczegóły dotyczące generacji mAB287 CAR znajdują się w Zhang et al.7. Sekwencje cDNA można uzyskać od autorów na życzenie.

  1. Montaż konstrukcji CAR
    1. Zsyntetyzuj oddzielnie jednołańcuchowe przeciwciało Fab (scFab) i połączone domeny dystansowe/sygnalizacyjne i użyj techniki ligacji "3-punktowej"15, aby złożyć ostateczną konstrukcję (Rysunek 1).
      UWAGA: Kluczowym wymaganiem dla insertu CAR jest to, że powinna ona zawierać flankujące miejsca endonukleazy restrykcyjnej umożliwiające ligację do retrowirusowego wektora ekspresyjnego pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II) lub pokrewnej pochodnej 15 są również odpowiednie.
  2. Walidacja wyrażenia powierzchni CAR
    1. Transdukuj komórki hybrydoma za pomocą cząstek retrowirusowych pochodzących z pMIG II, generowanych przez standardowy protokół (np. Holst i wsp.16).
    2. Uruchom analizę cytometrii przepływowej, aby wykryć ekspresję GFP z wektora CAR vector17.
    3. Barwienie ekspresji powierzchni CAR transdukowanych hybrydomów przy użyciu znakowanych przeciwciał przeciwko mysiemu łańcuchowi κ (np. klon RMK-45)17.
      UWAGA: 18.
  3. Walidacja swoistości CAR
    1. Stymulować transdukowane komórki hybrydoma odpowiednimi antygenami związanymi z płytkami lub antygenami komórkowymi. Po całonocnej wspólnej hodowli zebrać supernatanty i wydzielane cytokiny, a następnie oznaczyć za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA)7.
      UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby każdy CAR został niezależnie zweryfikowany przed użyciem do transdukcji. Na tym etapie eksperyment może zostać wstrzymany i ponownie uruchomiony później.

2. Transfekcja komórek producenta wirusa (dzień od -4 do dnia 3)

UWAGA: Retrowirus jest wytwarzany przy użyciu komórek Phoenix-ECO (zobacz Tabelę Materiałów)19,20. Należy stosować odpowiednie środki ostrożności w celu wytworzenia potencjalnie zakaźnych czynników (najlepiej w tym wyznaczoną szafkę BSL-2 i oddzielny inkubator do hodowli transfekowanych/wyindukowanych komórek).

  1. Rozmrażanie komórek Feniksa (dzień -4)
    1. Rozmrozić 2 x 106 ogniw Phoenix-Eco. Zwiększ liczbę komórek Phoenix, jeśli planowane jest wiele transdukcji.
    2. Umieść je w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej z 10 ml pożywki (zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierająca 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS)).
  2. Komórki Passage Phoenix (Dzień -3)
    1. Usunąć pożywkę i przemyć 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
    2. Dodać 3 ml 0,25% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 10% CO2 przez 3 minuty.
    3. Zbierz komórki, a następnie osadź przez odwirowanie przez 3 minuty przy 200 x g. Ponownie rozszczepić komórki w 10 ml świeżej pożywki i inkubować w temperaturze 37 °C.
  3. Napromienianie komórek Feniksa (dzień -1 po południu)
    1. Aby zminimalizować dalszy podział komórek, zbierz komórki Feniksa zgodnie z opisem w kroku 2.2, ponownie zawieś w 5 ml pożywki i naświetlaj komórki promieniami gamma na lodzie (1000 rad).
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas prac związanych z promieniowaniem, aby uniknąć narażenia personelu.
    2. Odwirować napromieniowane komórki, zawiesić ponownie w świeżej pożywce, rozmieścić na płytce 2 x 106 komórek (w 10 ml pożywki)/płytkę/CAR i inkubować.
  4. Transfekcja (Dzień 0 - rano)
    1. Odessać supernatant z komórek Phoenixa, przemyć 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i ostrożnie dodać kroplami 7 ml zredukowanej pożywki surowicy (np. Opti-MEM) do bocznej ścianki płytki, aby uniknąć naruszenia monowarstwy. Przenieś komórki z powrotem do inkubatora.
    2. Weź dwie probówki polipropylenowe o pojemności 14 ml z okrągłym dnem i dodaj do każdej 1,5 ml zredukowanej pożywki surowicy. Do jednej probówki dodać 40 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów).
    3. Do drugiej probówki dodać 15 μg plazmidu Ab-CAR (wygenerowanego w kroku 1) i 5 μg plazmidu otoczkowego i opakowaniowego (5 μg pCL-Eco). Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Dodać mieszaninę odczynników do transfekcji z kroku 2.4.2 kroplami do drugiej probówki, nie dotykając boków probówki, i wymieszać, delikatnie pipetując roztwór w górę i w dół 3 razy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut.
    5. Dodać kroplami 3 ml mieszaniny do komórek Feniksa i umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych.
    6. Po 4–5 godzinach dodać 1 ml FCS. Hodowla komórek przez noc w temperaturze 37 °C.
  5. Średnia zmiana (dzień 1)
    1. Usunąć supernatant zawierający kompleksy plazmid/odczynnik do transfekcji i usunąć je zgodnie z procedurami instytucjonalnymi dotyczącymi postępowania z materiałem zakaźnym. Dodaj 4 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do komórek.
  6. Żniwo wirusa do transdukcji (dzień 2)
    1. Zebrać pożywkę zawierającą wirusa z komórek Phoenixa za pomocą sterylnej strzykawki, przefiltrować (0,45 μm) w celu usunięcia resztek komórek i zebrać w nowej probówce.
    2. Dodać zapas rhIL-2 do końcowego stężenia 200 j.m./ml. Wirusa należy natychmiast użyć do transdukcji (krok 5.3). Dodaj 4 ml świeżej pożywki do komórek Phoenixa i umieść w inkubatorze.
  7. Powtórz zbieranie wirusów (dzień 3)
    1. Powtórz krok 2.6, ale odrzuć komórki Phoenix jako odpad zakaźny, zamiast dodawać świeżą pożywkę. Ten supernatant jest używany w kroku 5.4.

3. Izolacja i aktywacja pierwotnych limfocytów T CD8 (dzień -1 do dnia 0)

UWAGA: Poprzednio, pobieraj limfocyty T CD8 od samic myszy NOD po 4-5 tygodniach, czyli w momencie poprzedzającym rozpoczęcie zapalenia wysp trzustkowych21,22. Obsługuj wszystkie myszy zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez IACUC. Limfocyty T CD8 są wzbogacane ze splenocytów przy użyciu komercyjnego zestawu do selekcji negatywnej.

  1. Powlekanie płytek przeciwciałami CD3/CD28 (dzień -1)
    1. Dodać 1 ml mieszaniny przeciwciał anty-mysich CD3 i CD28 (oba w stężeniu 1 μg/ml w PBS) do każdego dołka na 24-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Następnego dnia należy przemyć płytki 1 ml sterylnego PBS 3 razy przed dodaniem mysich limfocytów T CD8 (krok 4.1).
      UWAGA: Liczba studzienek, które mają być pokryte, będzie się różnić dla każdego eksperymentu, w zależności od całkowitej wymaganej liczby aktywowanych limfocytów T CD8.
  2. Zbiór splenocytów (dzień 0)
    1. Poddaj eutanazji dwie samice myszy NOD w wieku 4-5 tygodni za pomocą inhalacji CO2 , a następnie dekapitacji. Zbierz śledziony i umieść je na sitku do komórek, namoczonym w 10 ml PBS w naczyniu do hodowli komórkowych na lodzie.
    2. W kapturze do hodowli komórkowej pokrój każdą śledzionę na 3-5 kawałków, dociśnij tkanki sterylnym tłokiem strzykawki o pojemności 3 lub 5 ml, aby rozsunąć fragmenty śledziony i umożliwić komórkom przejście przez drucianą siatkę.
    3. Delikatnie usuń czerwone krwinki, ponownie zawieszając splenocyty w rozcieńczonym w stosunku 1:4 buforze do lizy krwinek czerwonych (1 ml buforu do lizy w 3 ml PBS na jedną śledzionę) i inkubując przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Następnie rozcieńczyć 10 μl zawiesiny komórek roztworem barwnika trypanowego do zliczania komórek za pomocą hemocytometru, a resztę komórek zagnieździć przez odwirowanie przy 350 x g przez 7 minut.
  3. Wzbogacenie limfocytów T CD8 (dzień 0)
    1. Wzbogać limfocyty T CD8 przez selekcję negatywną za pomocą mysiego zestawu do izolacji limfocytów T CD8, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Aby zapewnić wysoką czystość, zawsze zaokrąglaj liczbę komórek w górę podczas obliczania objętości biotynylowanego przeciwciała, które ma zostać dodane (np. użyj objętości odczynników sugerowanej dla 108 komórek dla obliczonych 9,1 x 107 komórek).
    2. Zawiesić osady komórkowe w 400 μl buforu i 100 μl koktajlu biotyna-przeciwciało na 1 x 108 komórek, dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut w lodówce (4 °C), aby umożliwić związanie przeciwciał.
    3. Dodać 300 μl buforu do znakowania i 200 μl mikrokulek antybiotyny na 1 x10 8 komórek, dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    4. W oczekiwaniu na wiązanie mikrokulek ustaw kolumnę separacyjną na separatorze. Przemyć kolumnę, przepłukując ją 3 ml buforu do etykietowania.
    5. Przepuścić 1000 μl mieszaniny kulek/komórek przez sitko o wielkości 40 μm przed załadowaniem do kolumny separacyjnej w celu usunięcia agregatów komórkowych. Zebrać przepływ z kolumny do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 15 ml.
    6. Umyj kolumnę zgodnie z instrukcją producenta, zbierając wszystkie ścieki do tej samej rurki. Oznaczyć liczbę komórek (tak samo jak w kroku 3.2.4) i zbierać przez odwirowanie w stężeniu 350 x g przez 5 minut. Przemyć komórki przez ponowne zawieszenie w 2 ml kompletnej pożywki z limfocytów T (RPMI-1640 zawierającej FCS, 2-merkaptoetanol, rhIL-2 (200 U/mL), mIL-7 (0,5 ng/mL), ITS, HEPES i penicyliny-streptomycyny) i odwirowanie przy 350 x g przez 5 min.
    7. Zawiesić komórki we wstępnie podgrzanym (37 °C) kompletnym podłożu limfocytów T o stężeniu 0,25–0,5 x 106/ml.

4. Aktywacja limfocytów T (Dzień 0 do 2)

  1. Dodać 2 ml zawiesiny komórkowej (0,25–0,5 x 106/ml) do każdej powlekanej studzienki 24-dołkowej płytki pokrytej przeciwciałem CD3/CD28 od kroku 3.1.2. Użyj ruchu wirowego, aby równomiernie dozować komórki.
    UWAGA: Dodaj komórki ruchem wirowym, aby równomiernie je rozprowadzić i zminimalizować efekty krawędzi. Jeśli komórki skupią się wzdłuż krawędzi studzienek, zarówno szybkość transdukcji, jak i żywotność komórek zostaną zmniejszone.
  2. Jako kontrolę, umieść tę samą liczbę limfocytów T CD8 w pojedynczym niepowlekanym dołku płytki. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z gazem o stężeniu 10% CO2 przez 48 godzin
    UWAGA: Po 48 godzinach aktywację można potwierdzić za pomocą mikroskopu; aktywowane komórki będą większe niż komórki, które nie napotkały przeciwciał anty-CD3/CD28.

[umieść tutaj rysunek 2]

5. Transdukcja aktywowanych limfocytów T CD8 (dni od 1 do 3)

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje metodę transdukcji spinowej. Wymagana jest wirówka z odchylanym rotorem i adapterami do kultur tkankowych, która jest w stanie utrzymać temperaturę wewnętrzną 37 °C. Aby zapewnić maksymalną wydajność, w dniu transdukcji należy wstępnie ogrzać wirówkę do temperatury 37 °C przed zebraniem wirusa.

  1. Przygotowanie płytek pokrytych ludzkim fragmentem fibronektyny (dzień 1 do dnia 2)
    1. W pierwszym dniu dodać 0,5 ml fibronektyny (50 μg/ml w PBS) do dołków 24-dołkowej płytki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Zazwyczaj wymagane są dwie studzienki pokryte fibronektyną na płytkę transfekowanych komórek Phoenix.
    2. W 2 dniu usuń roztwór fibronektyny i zastąp go 1 ml 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby "zablokować" niespecyficzne miejsca wiązania.
    3. Umyj poddane działaniu studzienek 1 ml sterylnego PBS. Po usunięciu roztworu myjącego płytka jest gotowa do użycia; lub mogą być szczelnie zamknięte i przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
  2. Pobranie aktywowanych limfocytów T CD8 (dzień 2)
    1. Pobrać aktywowane limfocyty T CD8, policzyć i obliczyć żywotność komórek za pomocą błękitu trypanowego lub odpowiedniego automatycznego urządzenia.
    2. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić w temperaturze 5 x 106 żywych komórek/ml w celu transdukcji. Utrzymać małą porcję komórek w hodowli w kompletnej pożywce z limfocytów T w inkubatorze CO2 w celu zapewnienia kontroli dla późniejszego sortowania komórek transdukowanych przez fluorescencję aktywowanych fluorescencją (etap 6).
      UWAGA: Po aktywacji przez 48 godzin całkowita liczba komórek powinna wzrosnąć około 1,5 raza i mieć żywotność większą niż 95%.
  3. Transdukcja (dzień 2)
    1. Dodaj 100 μl aktywowanej zawiesiny komórek CD8 na studzienkę (0,5 x 106 komórek) do płytki pokrytej fibronektyną. Następnie dodaj 1,5-2 ml pożywki zawierającej wirusa (z kroku 2.6) do każdej studzienki. Wymieszaj ruchem wirowym, aby równomiernie dozować komórki (Rysunek 2).
    2. Umieść płytkę w plastikowej torbie z zamkiem błyskawicznym i zamknij (w celu zapewnienia wtórnej hermetyzacji). Wirować przy 2000 x g przez 90 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Wyjmij płytkę z wirówki. W przypadku bezpieczeństwa biologicznego szafka ostrożnie wyjmij plastikową torbę i upewnij się, że zewnętrzna strona płytki nie jest zanieczyszczona żadnym medium.
    4. Następnie przenieść płytkę do dedykowanego inkubatora CO2 o temperaturze 37 °C. Po 4 godzinach usuń 1 ml pożywki z każdej studzienki i zastąp 1 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki z komórek T. Wymień płytkę w inkubatorzeCO2.
      UWAGA: Wszystkie media z transdukowanych komórek należy traktować jako odpady zakaźne.
  4. Druga transdukcja (dzień 3)
    1. W dedykowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego pochyl płytkę zawierającą transdukowane komórki, opierając ją na pokrywie i ostrożnie usuń większość pożywki (pozostawiając 100–200 μl), uważając, aby nie zetknąć się z komórkami na dnie studzienki.
    2. Dodaj pożywkę zawierającą wirusa zebraną w kroku 2.7 i powtórz kroki 5.3.2–5.3.4.
      UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że trzecia transdukcja rzadko poprawia ogólną wydajność. Ponadto żywotność komórek prawdopodobnie znacznie spadnie, jeśli zostanie zastosowana trzecia transdukcja. Jeśli komórki są posiane w stężeniu wyższym niż 0,5 x 106 / basenik, limfocyty T mogą osiągnąć konfluencję po całonocnej inkubacji po drugim etapie transdukcji. W tym przypadku podziel komórki po 4 godzinach inkubacji w 3 dniu.
  5. Umyj komórki (dzień 4)
    1. Usunąć 1 ml pożywki z każdej studzienki, ponownie zawiesić komórki w pozostałym podłożu i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Przemyć studzienki 1 ml kompletnej pożywki z limfocytów T i dodać do probówki zawierającej zebrane komórki z każdej transdukcji.
    2. Wirować przy 350 x g przez 7 minut, a następnie przemyć dwukrotnie, ponownie zawieszając w 2 ml kompletnej pożywki z limfocytów T i granulując. Na koniec ponownie zawiesić w 2 ml pożywki i określić liczbę komórek.
      UWAGA: Jeśli pierwotnie transdukowano 1 x 106 komórek, wydajność na tym etapie powinna wynosić ~3 x 106.
  6. przelać
    1. Przenieść podwielokrotności 0,5–1 x 106 komórek w 2 ml kompletnej pożywki z limfocytów T do studzienek nowej 24-dołkowej płytki i inkubować w temperaturze 37 °C. Około 48–72 godzin po transdukcji komórki są gotowe do analizy ekspresji CAR i sortowania komórek.
      UWAGA: Na tym etapie liczba komórek CAR-T zwykle podwaja się co 24 godziny. Bardzo ważne jest, aby nigdy nie dopuścić do ich przerostu. Podziel komórki natychmiast, jeśli gęstość jest wyższa niż 2 x 106/ml (lub jeśli podłoże kiedykolwiek stanie się jasnożółte). Z naszego doświadczenia wynika, że komórki CAR-T namnażają się silniej w płytkach 24-dołkowych i 12-dołkowych niż w przypadku przeniesienia do większego naczynia.

6. Oczyszczanie transdukowanych komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) (dzień 5 lub dzień 6)

  1. Zbierz komórki.
    1. Ponownie zawiesić komórki, pipetując wielokrotnie w górę i w dół (uważając, aby nie spowodować spienienia), przenieść do probówek o pojemności 15 ml i odwirować przy 350 x g przez 5 minut.
    2. Zawiesić w buforze sortującym (2% BSA w sterylnym PBS zawierającym gentamycynę) w stężeniu 1 x 106 komórek/ml. Pobrać również kontrolne (nietransdukowane) limfocyty T CD8 z kroku 5.2).
      UWAGA: Z 1 x 106 komórek w dniu 2 oczekuje się wydajności ~ 2 x 107 transdukowanych komórek w tym punkcie czasowym.
  2. Przemyć komórki raz buforem sortującym, odwirowując przy 350 x g przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić w buforze sortującym w ilości 1 x 107 komórek/ml. Usunąć małą porcję do kontroli kompensacjiGFP Foxp3 (do użycia w kroku 6.4.1), a pozostałą część wybarwić znakowanym anty-mysim CD8 (klon 53-6,7; 0,2 μg przeciwciała/5 x 106 komórek) przez inkubację przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    1. Podobnie, wybarwić podwielokrotność nietransdukowanych limfocytów T CD8, aby zapewnić kontrolę kompensacyjną dla fluoroforu znakującego przeciwciało anty-CD8.
      UWAGA: Unikaj dodawania azydku sodu do jakiegokolwiek buforu, ponieważ jest to toksyczne dla komórek.
  3. Dwukrotnie przemyć oznakowane komórki buforem sortującym, ponownie zawiesić w buforze do sortowania na zimno w proporcjach 1 x 107 komórek/ml.
  4. Posortuj komórki.
    1. Sortuj komórki CD8 GFP+ dodatnie do wstępnie schłodzonej, kompletnej pożywki z limfocytów T (Rysunek 3B). Weź małą porcję do analizy po sortowaniu, aby określić czystość.
      UWAGA: Aby zmaksymalizować czystość posortowanych komórek, należy stosować szczelne bramki. Użyj dyszy 100 μm, aby zapewnić wysoką żywotność komórek. Zminimalizuj czas, przez jaki posortowane komórki są przechowywane na lodzie. Limfocyty T, które były trzymane na lodzie przez ponad 3 godziny, potrzebują znacznie więcej czasu na regenerację niż komórki schłodzone przez mniej niż 2 godziny. Tak więc, jeśli 3 transdukowane linie komórkowe muszą zostać posortowane, zbierz i oznacz drugą linię, podczas gdy pierwsza jest sortowana i tak dalej, zamiast zmuszać drugą i trzecią linię do spędzania dłuższego czasu w temperaturze 0 °C. Ekspresja innych markerów limfocytów T, takich jak CD28 i CD3, może być również monitorowana (Figura 3C), ale nie jest niezbędna do celów sortowania.
    2. (Alternatywna strategia sortowania) Przed barwieniem populacji masowej przeanalizuj ekspresję CD8 w małej populacji transdukowanych limfocytów T. Jeśli czystość wynosi >99%, to populację masową można bezpiecznie sortować wyłącznie na podstawie wyrażenia GFP.

7. Ekspansja posortowanych komórek CAR-T (Dzień 5 do 10)

  1. Rozbudowa komórek CAR-T
    1. Umyj posortowane komórki CAR-T raz, a następnie ponownie zawieś we wstępnie podgrzanym, kompletnym podłożu z limfocytów T o stężeniu 2,5–5 x 105 komórek/ml i umieść 2 ml podwielokrotności na płytkach 24-dołkowych.
    2. Policz i podziel komórki co 1–2 dni. Zwykle liczba komórek podwaja się każdego dnia aż do ~ dnia 10, a żywotność utrzymuje się powyżej 95%.
      UWAGA: Bez ponownej stymulacji komórki CAR-T przestaną się namnażać około 10 dnia i ostatecznie umrą. W związku z tym testy czynnościowe limfocytów T i transfery adoptywne powinny być odpowiednio zaplanowane.
  2. Alternatywna strategia ekspansji
    1. Po sortowaniu hodować komórki CAR-T w kompletnej pożywce z limfocytów T zawierającej rhIL-2 w stężeniu 100 U/ml, a nie 200 U/mL.
      UWAGA: Komórki CAR-T namnażają się w tym pożywce w nieco wolniejszym tempie. Jednak często będą się rozmnażać do 11 do 13 dni bez ponownej stymulacji. W związku z tym, chociaż ta alternatywna strategia ekspansji nie generuje większej liczby komórek, zapewnia nieco dłuższe okno czasowe na przeprowadzenie dalszych testów.

8. Weryfikacja swoistości antygenowej i funkcjonalności limfocytów CAR T.

UWAGA: Specyficzność wiązania komórek CAR T ukierunkowanych na kompleksy peptyd/MHC można zweryfikować za pomocą barwienia tetramerowego7,23. Podobnie, ich funkcjonalność można potwierdzić, mierząc wydzielanie cytokin lub cytotoksyczność po stymulacji przez pokrewne im ligandy. NIH Tetramer Core Facility (TCF) na Uniwersytecie Emory jest zalecanym źródłem "tetramerów" i odpowiednich protokołów barwienia.

  1. Barwienie tetramerem peptydowo-MHC.
    1. Oznaczyć podwielokrotności 2 x 105 transdukowanych komórek CAR-T w 100 μl buforu sortującego przez inkubację z ~0,6 μg znakowanych fluorescencyjnie tetramerów specyficznych dla antygenu i tetramerów kontrolnych w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    2. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut przy 350 x g, a następnie dwukrotnie przepłukać, ponownie zawieszając w 0,5 ml buforu sortującego i ponownie odwirowując. Na koniec ponownie zawieś komórki w 300 μl buforu sortującego i przeanalizuj za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 4).
      UWAGA: W tych badaniach zwykle używamy tetramerów IAg7-B:9-23(RE) (test) i IAg7-HEL (kontrolnych) znakowanych BV421. Zamiast tego można jednak zastosować dowolną kombinację fluoroforu i tetrameru, która jest odpowiednia dla badanego CAR(-ów). W takim przypadku stężenie i czas barwienia powinny być zoptymalizowane dla każdego użytego tetrameru. Do barwienia tetramerów można stosować zarówno posortowane, jak i niesortowane komórki CAR-T.
  2. Pomiar swoistości za pomocą stymulacji ligandem.
    1. Inkubować 2 x 105 posortowanych komórek CAR-T w 200 μl pożywki z limfocytów T wolnych od cytokin z odpowiednimi ligandami komórkowymi związanymi płytkami lub komórkami.
    2. Po 6–24 godzinach zmierz produkcję cytokin metodą ELISA lub barwienie wewnątrzkomórkowe zgodnie z protokołami producenta.
      UWAGA: W naszych badaniach przekierowanych limfocytów T IAg7-B: 9-23 hodujemy komórki przez noc za pomocą mysich komórek chłoniaka M12C3 z komórek B wykazujących ekspresję IAg7-B: R3 lub "pustego" IAg7 24,25, a następnie zbieramy supernatanty i mierzymy wydzielany mysi interferon gamma (IFN-γ) za pomocą ELISA26 (Rysunek 5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zazwyczaj wydajność transdukcji przy użyciu tego protokołu wynosi ~60-90%. W eksperymencie pokazanym w Rysunek 3, przed sortowaniem w przybliżeniu, 70% limfocytów T CD8 uległo koekspresji GFP. Ulegli również jednoczesnej ekspresji CD28 i CD3 (Rysunek 3C). Co ważne, wszystkie "testowe" komórki GFP+ były również wybarwione tetramerami IAg7-B:R3, ale nie tetramerem kontrolnym (Rysunek 4). Podobnie, po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje skuteczną metodę wytwarzania specyficznych dla antygenu komórek CD8 CAR-T poprzez transdukcję retrowirusową. Wydajność transdukcji naszego protokołu jest zazwyczaj wysoka i ogólnie obserwuje się solidną ekspresję CAR. Rozszerzone limfocyty CAR T zachowują podstawowe cechy limfocytów T aktywowanych przez rodziców oraz swoistość przeciwciał i nadają się zarówno do stosowania in vitro, jak i in vivo. Zastosowaliśmy limfocyty T Ab-CAR CD8 w przeprogramowaniu cukrzycy typu 1 u myszy NOD7...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MAb287 i jego pochodne są chronione amerykańskim patentem wydanym w 2014 roku.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty JDRF 1-INO-2015-74-S-B, 2--2016-238-S-B i-2-S-2018-648-S-B, Diabetes Education and Action Award, oraz Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine w Baylor College of Medicine. Sortowanie komórek było wspierane przez Cytometry and Cell Sorting Core w Baylor College of Medicine z finansowaniem z NIH (S10RR024574 i P30CA125123). Wszystkie tetramery peptydowe-MHC uzyskano z NIH Tetramer Core Facility.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanol (50mM)Gibco21985-02350 μ M
5' RACE PCRClontech634859
przeciwciała anty-mysie CD28eBioscience14-0281-86końcowe stężenie przy 1&mikro; g/ml
przeciwciało anty-mysie CD3eeBioscience145-2C11końcowe stężenie przy 1&mikro; g / ml
Biotyna Szczur Anty-Mysz IFN-γBD Biosciences554410Stężenie robocze przy 0,5 &mikro; g/ml
BSASigmaA7030
Zestaw Maxi-Prep bez endo-freeQiagen12362
GentamycynaGibco15750-060Final 50 µ g/ml.
Inaktywowany termicznieHyklonSH30087.03Final 10% FCS
HEPES (100X)Gibco15630-0801X
IAg7-CLIP tetramer-BV421Tetramer NIH Zakład w Emoryza zatwierdzenieStężenie robocze przy 6 &mikro; g / ml
IAg7-insulina P8E tetramer-BV421Tetramer NIH Zakład w Emoryza zatwierdzenieStężenie robocze przy 6 &mikro; g / ml
Insulina-Transferyna-Selen-Etanoloamina (ITS 100x)ThermoFisher51500056Końcowe stężenie to 1x
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
LS KolumnyMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Bufor separacyjnyMiltenyi Biotec130-091-221
Zestaw do izolacji komórek T CD8a+ myszyMiletenyi Biotec Inc130-104-075
Zestaw do izolacji komórek T CD8a+ myszyMiltenyi Biotec130-104-075
Pożywka Opti-MEMThermoFisher31985070
Penicylina-Streptomycyna (5000U/ml)ThermoFisher1507006350 U/ml
Komórki Phoenix-ECOATCCCRL-3214
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco10010-023
pMIG IIAddgene52107
pMSCV-IRES-GFP IIAddgene52107
Oczyszczony szczur Anti-Mouse IFN-γBD Biosciences551216Stężenie robocze przy 3 &mikro; g / ml
Bufor do lizy krwinek czerwonychSigmaR7767
RetroNectinTakaraT100AStężenie robocze przy 50 &mikro; g/ml w PBS
rhIL-2 (stężenie podstawowe 105 IU/ul)Peprotech200-02Stężenie końcowe przy 200 IU/ml
rmIL-7 (stężenie podstawowe 50ng/ul)R& D407-ML-005Końcowe stężenie przy 0,5 ng / ml
RPMI-1640Gibco11875-093
Sterylne sitka komórkoweFisher Scientific22-363-548
TrypleGibco12605-028
FCS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
  2. Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).
  3. Nakayama, M., et al. Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice. Nature. 435, 220-223 (2005).
  4. Crawford, F., et al. Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).
  5. Stadinski, B. D., et al. Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).
  6. Zhang, L., et al. Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).
  7. Zhang, L., et al. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).
  8. Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).
  9. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 3, 973-983 (2003).
  10. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, 845-849 (2002).
  11. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
  12. Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood. 116, 3875-3886 (2010).
  13. Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).
  14. Fishman, S., et al. Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes. Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).
  15. Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor. N.Y. (1982).
  16. Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).
  17. Johnstone, A., Thorpe, R. Immunochemistry in practice. , 3rd edn, Blackwell Science. Cambridge, MA. (1996).
  18. Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. Lymphocytes: a practical approach. , 2nd ed, Practical approach series. New York. (2000).
  19. Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).
  20. Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons. Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).
  21. Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse. PLoS One. 8 (3), e59701(2013).
  22. Jansen, A., et al. Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice. Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).
  23. Corbett, A. J., et al. T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways. Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).
  24. Griffith, I. J., et al. Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).
  25. Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).
  26. Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection. Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Limfocyty T specyficzne dla antygenuterapia kom rkami CAR Ttransdukcja retrowirusowaizolacja pierwotnych kom rekanaliza cytometrycznamodel cukrzycy typu 1leczenie chor b autoimmunizacyjnychchimeryczne receptory antygenoweekspansja limfocyt w T

Powiązane artykuły