Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Cukrzyca typu 1 (T1D) charakteryzuje się autoimmunizacją specyficzną dla wysp trzustkowych, prowadzącą do niszczenia komórek beta i absolutnej utraty produkcji insuliny. W mysim modelu spontanicznej cukrzycy nieotyłej (NOD) insulina jest głównym celem, a manipulacja genetyczna tych zwierząt w celu usunięcia jednego kluczowego epitopu insuliny zapobiega chorobie. Tak więc selektywna eliminacja profesjonalnych komórek prezentujących antygen (APC) zawierających ten patogenny epitop jest podejściem do hamowania niepożądanych odpowiedzi autoimmunologicznych specyficznych dla insuliny i prawdopodobnie ma większy potencjał translacyjny.
Chimeryczne receptory antygenowe (CAR) mogą przekierowywać limfocyty T do selektywnego celowania w chorobotwórcze antygeny. Technika ta ma fundamentalne znaczenie dla ostatnich prób wykorzystania inżynierii komórkowej w adoptywnej terapii komórkowej w leczeniu wielu nowotworów. W tym protokole opisujemy zoptymalizowany protokół transdukcji retrowirusa limfocytów T (RV) i ekspansji in vitro, który generuje dużą liczbę funkcjonalnych komórek CAR-T CD8 specyficznych dla antygenu, zaczynając od niewielkiej liczby komórek naiwnych. Wcześniej opisano wiele protokołów komórkowych CAR-T, ale zazwyczaj ze stosunkowo niską wydajnością transdukcji i żywotnością komórek po transdukcji. W przeciwieństwie do tego, nasz protokół zapewnia do 90% skuteczności transdukcji, a wygenerowane komórki mogą przetrwać ponad dwa tygodnie in vivo i znacznie opóźnić początek choroby po pojedynczej infuzji. Zapewniamy szczegółowy opis protokołu konserwacji i transdukcji komórek, aby można było łatwo wykonać krytyczne kroki. Całą procedurę od pierwotnej izolacji komórek do ekspresji CAR można przeprowadzić w ciągu 14 dni. Ogólna metoda może być zastosowana do każdego modelu choroby myszy, w którym znany jest cel. Podobnie, specyficzne zastosowanie (ukierunkowane na patogenny peptyd/kompleks MHC klasy II) ma zastosowanie do każdego innego modelu choroby autoimmunologicznej, dla którego zidentyfikowano kluczowy kompleks.
Wprowadzenie
Biorąc pod uwagę prawdopodobne zmniejszone ryzyko wystąpienia niepożądanych efektów, terapie immunologiczne specyficzne dla antygenu (ASI) są obiecującymi metodami leczenia chorób autoimmunologicznych, takich jak T1D. Coraz więcej dowodów sugeruje, że odpowiedź immunologiczna na (pre)insulinę może być szczególnie ważna w cukrzycy typu 1D1. W ciągu ostatniej dekady badania przeprowadzone w wielu grupach, w tym w naszym, zdecydowanie sugerują, że prezentacja epitopu zawierającego aminokwasy łańcucha B insuliny od 9 do 23 przez specyficzne cząsteczki MHC klasy II (B:9-23/MHCII), odgrywa ważną rolę w rozwoju T1D u myszy i ludzi2
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Myszy były utrzymywane w specyficznych warunkach wolnych od patogenów w ośrodku dla myszy transgenicznych, a wszystkie eksperymenty na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt Baylor College of Medicine.
UWAGA: Eksperyment wymaga równoległego przygotowania wirusa i limfocytów T. Tabela 1 podsumowuje protokół. Kluczowe odczynniki i są wymienione w Tabeli materiałów. Koncentrujemy się na generowaniu i ekspansji komórek CAR-T ukierunkowanych na określone populacje APC w tym protokole.
1. Generowanie i walidacj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zazwyczaj wydajność transdukcji przy zastosowaniu tego protokołu wynosi ~60-90%. W eksperymencie przedstawionym na Rysunku 3, przed sortowaniem około 70% limfocytów T CD8 wykazywało koekspresję GFP. Wykazywały one również koekspresję CD28 oraz CD3 (Rysunek 3C). Co istotne, wszystkie „testowe” komórki GFP+ były również dodatnie w barwieniu z tetramerami IAg7-B:R3, ale nie z tetramerem kontrolnym (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje skuteczną metodę wytwarzania specyficznych dla antygenu komórek CD8 CAR-T poprzez transdukcję retrowirusową. Wydajność transdukcji naszego protokołu jest zazwyczaj wysoka i ogólnie obserwuje się solidną ekspresję CAR. Rozszerzone limfocyty CAR T zachowują podstawowe cechy limfocytów T aktywowanych przez rodziców oraz swoistość przeciwciał i nadają się zarówno do stosowania in vitro, jak i in vivo. Zastosowaliśmy limfocyty T Ab-CAR CD8 w przeprogramowaniu cukrzycy typu 1 u myszy NOD7.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
MAb287 i jego pochodne są chronione amerykańskim patentem wydanym w 2014 roku.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez granty JDRF 1-INO-2015-74-S-B, 2--2016-238-S-B i-2-S-2018-648-S-B, Diabetes Education and Action Award, oraz Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine w Baylor College of Medicine. Sortowanie komórek było wspierane przez Cytometry and Cell Sorting Core w Baylor College of Medicine z finansowaniem z NIH (S10RR024574 i P30CA125123). Wszystkie tetramery peptydowe-MHC uzyskano z NIH Tetramer Core Facility.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-merkaptoetanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 μ M |
| 5' RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| przeciwciała anty-mysie CD28 | eBioscience | 14-0281-86 | końcowe stężenie przy 1&mikro; g/ml |
| przeciwciało anty-mysie CD3e | eBioscience | 145-2C11 | końcowe stężenie przy 1&mikro; g / ml |
| Biotyna Szczur Anty-Mysz IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Stężenie robocze przy 0,5 &mikro; g/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Zestaw Maxi-Prep bez endo-free | Qiagen | 12362 | |
| Gentamycyna | Gibco | 15750-060 | Final 50 µ g/ml. |
| Inaktywowany termicznie | Hyklon | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | Tetramer NIH Zakład w Emory | za zatwierdzenie | Stężenie robocze przy 6 &mikro; g / ml |
| IAg7-insulina P8E tetramer-BV421 | Tetramer NIH Zakład w Emory | za zatwierdzenie | Stężenie robocze przy 6 &mikro; g / ml |
| Insulina-Transferyna-Selen-Etanoloamina (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Końcowe stężenie to 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Kolumny | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Bufor separacyjny | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Zestaw do izolacji komórek T CD8a+ myszy | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Zestaw do izolacji komórek T CD8a+ myszy | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Pożywka Opti-MEM | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicylina-Streptomycyna (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Komórki Phoenix-ECO | ATCC | CRL-3214 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Oczyszczony szczur Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Stężenie robocze przy 3 &mikro; g / ml |
| Bufor do lizy krwinek czerwonych | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Stężenie robocze przy 50 &mikro; g/ml w PBS |
| rhIL-2 (stężenie podstawowe 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Stężenie końcowe przy 200 IU/ml |
| rmIL-7 (stężenie podstawowe 50ng/ul) | R& D | 407-ML-005 | Końcowe stężenie przy 0,5 ng / ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterylne sitka komórkowe | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
Bibliografia
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
- Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).
- Nakaya....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
