Artykuł metodologiczny

Badanie dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek nabłonka na fibronektynie podczas stresu oksydacyjnego

DOI:

10.3791/59989

⸱

13 października 2019

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Chemistry, High Point University, 3Biotechnology Program and the Department of Molecular Biomedical Sciences, North Carolina State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda jest przydatna do ilościowego określania wczesnej dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek zależnych od zakotwiczenia na fibronektynie. Ponadto test ten może być wykorzystany do zbadania wpływu zmienionej homeostazy redoks na rozprzestrzenianie się komórek i/lub wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe związane z adhezją komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adhezja i rozprzestrzenianie się komórek na macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) są niezbędnymi procesami komórkowymi podczas rozwoju organizmu i homeostazy tkanek dorosłych. Co ciekawe, stres oksydacyjny może zmieniać te procesy, przyczyniając się w ten sposób do patofizjologii chorób takich jak rak z przerzutami. Dlatego zrozumienie mechanizmu(ów) tego, w jaki sposób komórki przyczepiają się i rozprzestrzeniają na ECM podczas zaburzeń statusu redoks, może zapewnić wgląd w stany normalne i chorobowe. Poniżej opisano krok po kroku protokół, który wykorzystuje test oparty na immunofluorescencji do specyficznego ilościowego określenia adhezji komórek i rozprzestrzeniania się unieśmiertelnionych komórek fibroblastów na fibronektynie (FN) in vitro. Krótko mówiąc, komórki zależne od zakotwiczenia są utrzymywane w zawiesinie i wystawiane na działanie inhibitora kinazy ATM Ku55933 w celu wywołania stresu oksydacyjnego. Komórki są następnie powlekane na powierzchni pokrytej FN i pozostawiane do przyczepienia przez określony czas. Komórki, które pozostają połączone, są utrwalane i znakowane markerami adhezji przeciwciał na bazie fluorescencji (np. Paxillin) i rozprzestrzeniania się (np. F-aktyna). Akwizycja i analiza danych odbywa się przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu laboratoryjnego, w tym mikroskopu epifluorescencyjnego oraz ogólnodostępnego oprogramowania Fidżi. Procedura ta jest bardzo wszechstronna i może być modyfikowana dla różnych linii komórkowych, białek ECM lub inhibitorów w celu zbadania szerokiego zakresu pytań biologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrosty macierzy komórkowej (tj. zrosty ogniskowe) to duże i dynamiczne wielocząsteczkowe kompleksy białkowe, które pośredniczą w adhezji i rozprzestrzenianiu się komórek. Procesy te mają kluczowe znaczenie dla rozwoju, utrzymania i funkcji fizjologicznych tkanek. Zrosty ogniskowe składają się z receptorów związanych z błoną, takich jak integryny, a także białek rusztowania, które łączą aktynę cytoszkieletu z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)1. Kompleksy te są zdolne do reagowania na sygnały fizykochemiczne obecne w środowisku zewnątrzkomórkowym poprzez aktywację różnych szlaków transdukcji sygnałowej. W związku z tym zrosty ogniskowe służą jako centra sygnalizacyjne do propagacji zewnątrzkomórkowych sygnałów mechanicznych do wielu procesów komórkowych, w tym ukierunkowanej migracji, regulacji cyklu komórkowego, różnicowania i przeżycia1,2. Jedna grupa cząsteczek sygnałowych, które regulują i oddziałują z zrostami ogniskowymi, obejmuje członków rodziny małych GTPaz Rho. GTPazy Rho są kluczowymi białkami, które regulują migrację komórek i dynamikę adhezji poprzez ich specyficzną aktywację czasoprzestrzenną3. Nic dziwnego, że rozregulowanie funkcji białka Rho jest związane z wieloma patologiami u ludzi, takimi jak przerzuty, angiogeneza i inne. Szczególnie interesujący jest status redoks komórkowego odgrywa dominującą rolę w modulacji migracji i adhezji komórek. Wykazano, że zmiany w homeostazie redoks, takie jak wzrost reaktywnych form tlenu (ROS), regulują aktywność białka Rho, a także adhezję, w wielu typach komórek i chorobach ludzkich4,5,6,7,8. Na przykład osoby cierpiące na zaburzenie neurologiczne ataksja-teleangiektazja (A-T), które jest spowodowane mutacją w kinazie serynowo-treoninowej A-T (ATM) naprawiającej uszkodzenia DNA, mają zwiększone ryzyko raka z przerzutami9,10. Utrata aktywności kinazy ATM u tych pacjentów i linii komórkowych, albo przez mutację genetyczną, albo przez hamowanie chemiczne, powoduje wysoki poziom stresu oksydacyjnego z powodu dysfunkcji szlaku pentozofosforanowego7,11,12. Co więcej, ostatnie badania laboratoryjne podkreśliły patofizjologiczną rolę ROS w A-T poprzez zmianę dynamiki cytoszkieletu (tj. adhezji i rozprzestrzeniania się) jako bezpośredniego wyniku aktywacji GTPaz rodziny Rho in vitro5. Ostatecznie te zmiany w dynamice cytoszkieletu spowodowane aktywacją rodziny Rho mogą prowadzić do zwiększonego ryzyka raka z przerzutami obserwowanego u pacjentów z A-T5,13. Dlatego zrozumienie wzajemnych zależności między interakcjami komórka-macierz podczas stresu oksydacyjnego może dostarczyć informacji na temat regulacji adhezji i rozprzestrzeniania się. Badania te mogą również przygotować grunt pod dalsze badania nad możliwą rolą GTPaz rodziny Rho w tych procesach sygnalizacyjnych.

Opisany tutaj jest protokół do badania wczesnej dynamiki komórkowej tworzenia i rozprzestrzeniania się adhezji podczas stresu oksydacyjnego spowodowanego hamowaniem aktywności kinazy ATM. Test ten opiera się na dobrze scharakteryzowanym mechanizmie zależnej od zakotwiczenia adhezji komórek do białka ECM fibronektyny (FN). Gdy komórki utrzymywane w zawiesinie są posiewane na FN, kilka GTPaz Rho koordynuje kontrolę przebudowy cytoszkieletu aktyny3,14. Zmiany morfologiczne obserwuje się, gdy komórki zmieniają się z okrągłych i okrągłych w spłaszczone i rozszerzone. Obserwowaniom tym towarzyszy rozwój licznych zrostów matrycy z ECM. Zmiany te przypisuje się dwufazowej aktywacji RhoA z Rac1 w ciągu pierwszej godziny, gdy komórki przylegają i rozprzestrzeniają się 15,16.

Do badania adhezji, morfologii i dynamiki oraz rozprzestrzeniania się komórek wykorzystano różne metody. Metody te opierają się jednak na zaawansowanych, długoterminowych systemach obrazowania fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) lub mikroskopii konfokalnej. W związku z tym użytkownicy muszą mieć dostęp do specjalistycznego sprzętu i oprogramowania. Co więcej, czas konfiguracji wymagany przez te systemy obrazowania biologicznego sprawia, że uchwycenie wczesnych zdarzeń adhezji jest wyzwaniem, zwłaszcza w przypadku jednoczesnego testowania wielu inhibitorów lub warunków leczenia.

Opisane tutaj metody zapewniają prosty, ekonomiczny, a jednocześnie ilościowy sposób oceny parametrów rządzących montażem adhezyjnym i rozprzestrzenianiem się in vitro. Protokół wykonywany jest przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak mikroskop epifluorescencyjny i kamera CCD. Test ten polega na nałożeniu komórek zależnych od zakotwiczenia na powierzchnię pokrytą FN po okresie stresu oksydacyjnego spowodowanego chemicznym hamowaniem aktywności kinazy ATM, co wykazano wcześniej5. Po posiewaniu komórki mogą się przyczepiać i przylegać przez określony czas. Nieprzyłączone komórki są wypłukiwane, podczas gdy przyłączone komórki są utrwalane i znakowane przeciwciałami opartymi na fluorescencji przeciwko markerom adhezji (np. paxilliny) i rozprzestrzeniania się (np. F-aktyna)2,5. Białka te są następnie wizualizowane i rejestrowane za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Późniejsza analiza danych odbywa się za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania Fidżi. Co więcej, metodę tę można dostosować do badania dynamiki adhezji w szerokim zakresie warunków, w tym różnych białek ECM, traktowania różnymi utleniaczami/warunkami hodowli komórkowej lub różnymi liniami komórkowymi zależnymi od zakotwiczenia, aby odpowiedzieć na szeroki zakres pytań biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowania

UWAGA: Opisany poniżej protokół został zoptymalizowany do użytku z komórkami REF52 i ludzkimi fibroblastami ATM+/+ lub ATM-//-. Inne typy komórek mogą wymagać dalszej optymalizacji zgodnie z opisem w poniższych uwagach i sekcjach dotyczących rozwiązywania problemów.

  1. Przygotować 500 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych dla komórek REF52. Do 500 ml wysokoglukozowego roztworu zawierającego zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco dodaj 10% FBS, 2 mM L-glutaminy i 100 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny.
  2. Przygotować roztwór fibronektyny (FN) o stężeniu 25 μg/ml, dodając 300 μl roztworu 1 mg/ml roztworu FN do 12 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (PBS), pH 7,4. Dobrze wymieszaj.
  3. Przygotować 0,5% (w/v) zdelipidowany (tj. wolny od kwasów tłuszczowych) roztwór albuminy surowicy bydlęcej (dlBSA) w pożywce do hodowli komórek DMEM bez surowicy. Dodaj 0,5 g dlBSA do 100 ml pożywki DMEM wolnej od surowicy. Dobrze wymieszaj roztwór, ale nie wiruj. Przed użyciem sterylnie przefiltrować roztwór do nowego sterylnego pojemnika, używając filtra strzykawkowego 0,22 μM. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować 3,7% roztwór paraformaldehydu, rozpuszczając 3,7 g paraformaldehydu w 100 ml 1x PBS. Użyj delikatnego podgrzewania i mieszania, aby paraformaldehyd znalazł się w roztworze.
    UWAGA: Roztwór paraformaldehydu jest wrażliwy na światło i należy go chronić przed światłem. Jest dobry do jednego tygodnia przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny, łatwopalny, i stanowi zagrożenie dla zdrowia. Zapoznaj się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej dla paraformaldehydu przed użyciem. Podczas obchodzenia się z materiałem należy używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, w tym osłony oczu, osłony twarzy, maski przeciwpyłowej, rękawic i fartucha laboratoryjnego.
  5. Przygotować roztwór permeabilizacji zawierający 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego w 1x PBS (v/v). W przypadku 100 ml powoli dodawaj 0,2 ml Triton X-100 do 100 ml 1x PBS, mieszając.
  6. Przygotować bufor blokujący immunofluorescencję zawierający 2,5% BSA, 5% koziej surowicy i 0,05% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (w/v/v) rozpuszczony w 1x roztworze PBS. Na 100 ml dodaj 5 ml koziej surowicy, 2,5 g BSA i 0,05 ml Triton X-100 w ~ 95 ml 1x PBS, mieszając.
  7. Hodować komórki REF52 na kompletnym pożywce DMEM na płytce poddanej działaniu hodowli komórkowej o średnicy 10cm2 (lub innej wielkości naczynia) w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

2. Powlekanie płytek hodowli komórkowych białkiem fibronektyny macierzy zewnątrzkomórkowej

UWAGA: Wykonaj tę sekcję używając techniki aseptycznej i sterylnych odczynników w okapie z przepływem laminarnym z certyfikatem BSL-2. Zapoznaj się z Rysunek 1A, aby zapoznać się z przeglądem kluczowych kroków przed rozpoczęciem.

  1. Używając 24-dołkowej płytki z certyfikatem hodowli tkankowej, umieść jedno szklane szkiełko nakrywkowe (12-Cir-1) w każdym dołku. Oznacz tabliczkę zgodnie z Rysunek 1B.
  2. Odpipetować 500 μl roztworu FN o stężeniu 25 μg/ml do każdego dołka na płytce 24-dołkowej.
  3. Odpipetować roztwór na każde szkiełko nakrywkowe kilka razy, aby zapewnić równomierne pokrycie i całkowite zanurzenie. Umieść pokrywkę z powrotem na talerzu.
  4. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 h.
    UWAGA: Alternatywnie inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Po 1 godzinie wyjąć płytkę z inkubatora i odessać roztwór FN z dołków.
  6. Przemyć studzienki trzy razy 500 μL 1x PBS. Odessać końcowe płukanie 1x PBS.
  7. Zatkać studzienki 500 μl 0,5% roztworu dlBSA przez co najmniej 15 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  8. Odessać roztwór dlBSA przed posiewem komórek w kroku 3 poniżej.
    UWAGA: W przypadku przechowywania płytek należy dodać 500 μl 1x PBS do każdego szkiełka nakrywkowego po zasysaniu roztworu dlBSA. Talerze można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.

3. Przygotowanie komórek zależnych od zakotwiczenia do testu adhezyjnego

UWAGA: Wykonaj tę sekcję używając techniki aseptycznej i sterylnych odczynników w okapie z przepływem laminarnym z certyfikatem BSL-2.

  1. Co najmniej 30 minut przed posiewem komórek należy wstępnie podgrzać następujące roztwory: kompletną pożywkę DMEM, roztwór dlBSA, 1x PBS, 0,5% roztwór trypsyny-EDTA i surowicę neutralizującą trypsynę (TNS) w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
  2. Zaczynając od zlewającej się monowarstwy komórek REF52 w naczyniu o długości 10cm2, umyj komórki dwukrotnie 6 ml ciepłego 1x PBS. Surowica głodza komórki przez co najmniej 1 godzinę (w zależności od typu komórki) w 6 ml ciepłego roztworu dlBSA o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Umyj komórki 6 ml podgrzanego 1x PBS, odessaj PBS i dodaj 1,5 ml ciepłego 0,5% roztworu trypsyny-EDTA.
  4. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na ~ 2 min.
  5. Obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że odłączenie jest całkowite. Jeśli po stuknięciu w płytkę na blacie stołu nadal przylegają, należy wrócić do inkubatora w temperaturze 37 °C na dodatkowe 2 minuty. Trypsynizuj komórki tak krótko, jak to konieczne.
  6. Odpipetuj 1,5 ml ciepłego roztworu neutralizującego trypsynę (TNS) do naczynia, aby zatrzymać trypsynizację i zebrać oderwane komórki. Kilkakrotnie pipetować roztwór w górę i w dół po dnie płytki, aby usunąć wszystkie pozostałe przylegające komórki. Jeśli komórki wydają się grudkowate, należy następnie rozcierać zawiesinę komórek, delikatnie pipetując w górę iw dół po tylnej stronie naczynia.
  7. Policz komórki za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego i hemocytometru pod mikroskopem świetlnym. Alternatywnie użyj automatycznego licznika komórek.
  8. Usuń odpowiednią ilość komórek, aby utworzyć zawiesinę komórek 1,0 - 3,0 x 104 komórek/ml w 5 ml dlBSA w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  9. Odwirować komórki przy ~ 300 x g przez 5 minut za pomocą wirnika o stałym kącie w wirówce stołowej.
  10. Odessać supernatant z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w sumie 7 ml ciepłego roztworu dlBSA. Nie pozwól, aby komórki nadmiernie zlewały się podczas powlekania szkiełka nakrywkowego, ale były równomiernie rozłożone, z kilkoma komórkami stykającymi się ze sobą.
  11. Równomiernie podzielić zawiesinę komórkową na dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml, jedną do kontroli samego nośnika (DMSO) i jedną do Ku55933 (inhibitor kinazy ATM, utleniacz)5. Upewnij się, że każda probówka zawiera 3,5 ml zawiesiny komórek.
  12. Za pomocą rotatora probówkowego obracać probówki w temperaturze 37 °C przez 90-120 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych.
  13. 30 minut przed posiewem dodaj końcowe stężenie 10 μM Ku55933 i DMSO (1:1,000) do każdej odpowiedniej probówki. Umieść zawiesinę ogniw z powrotem na rotatorze na pozostały czas.
  14. Bezpośrednio przed posiewem komórek należy pobrać 24-dołkową płytkę z inkubatora i odessać roztwór dlBSA.
  15. Po obracaniu zawiesiny komórek przez 90-120 minut, usuń 500 μl zawiesiny komórek z każdej grupy poddawanej działaniu substancji i dodaj do jednego szkiełka nakrywkowego pokrytego FN na płytce 24-dołkowej z kroku 2, jak pokazano (Rysunek 1B). Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , a zawiesinę komórek z powrotem do rotacji.
  16. Po umieszczeniu zawiesiny komórek na szkiełkach nakrywkowych FN, należy pozostawić komórki do przylegania przez żądany czas (np. 10 min, 15 min, 20 min, 30 min), a następnie natychmiast przejść do kroku 4.

4. Utrwalanie komórek i barwienie przeciwciał w celu immunofluorescencji

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane w niesterylnych warunkach i w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Po upływie pożądanego czasu przylegania należy odessać roztwór komórek z każdego szkiełka nakrywkowego w płytce.
  2. Używając ścianek studzienki, delikatnie dozuj 500 μl 3,7% roztworu paraformaldehydu na każde szkiełko nakrywkowe i odczekaj 10-15 minut.
  3. Usuń roztwór paraformaldehydu i przemyj każde szkiełko nakrywkowe 500 μl 1x PBS w sumie dwa razy.
    UWAGA: Odpady paraformaldehydu należy utylizować w sposób odpowiedzialny, zgodnie z planem ochrony środowiska i bezpieczeństwa instytucji.
  4. Odessać PBS i przepuszczalnie komórki na każdym szkiełku nakrywkowym za pomocą 500 μl 0,2% Triton X-100 w 1x PBS (v/v) przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Umyj każde szkiełko nakrywkowe trzykrotnie 500 μl 1x PBS.
  6. Zablokuj komórki na każdym szkiełku nakrywkowym 500 μl buforu blokującego immunofluorescencję zawierającego 5% koziej surowicy, 2,5% BSA i 0,05% Triton X-100 rozpuszczonych w 1 x roztworze PBS przez 30-60 minut.
  7. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało anty-paksyliny (1:250) w buforze blokującym. Dobrze wymieszać i dodać 200 μl roztworu przeciwciała do każdego szkiełka nakrywkowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godz.
    UWAGA: Alternatywnie, roztwór przeciwciała pierwotnego można inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Istnieje wiele popularnych ogniskowych markerów adhezji, które można wykorzystać do barwienia kompleksów adhezyjnych i późniejszej analizy FA. Należą do nich przeciwciała przeciwko następującym białkom: podjednostki integryny (β1, α5 lub αV), talin lub winkulina2.
  8. Odessać roztwór przeciwciała i przemyć każde szkiełko nakrywkowe 500 μl 1x PBS trzy razy przez 10 minut każdy. Od tego momentu należy chronić próbki przed światłem.
  9. Rozcieńczyć sondę F-aktyny falloidyny sprzężoną z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym Alexa 594 (1:1000) i fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko myszom kozy 488 (1:400) w tym samym roztworze buforu blokującego. Dobrze wymieszać i dodać 200 μl roztworu przeciwciała do każdego szkiełka nakrywkowego przez 30 min.
    UWAGA: Można również stosować fluorescencyjnie sprzężone przeciwciała drugorzędowe innych gatunków. Jednak stosowanie przeciwciał pochodzących od innych gatunków będzie wymagało modyfikacji blokującej surowicy buforowej.
  10. Odessać roztwór przeciwciała i przemyć każde szkiełko nakrywkowe 500 μl 1x PBS trzy razy przez 10 minut każdy.
  11. Odessać 1x PBS i spłukać jednorazowo 500 μl dIH2O.
  12. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI.
  13. Pozostaw szkiełka mikroskopowe na noc w ciemności w temperaturze pokojowej.
  14. Szkiełka mikroskopowe należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania i do czasu obrazowania.
    UWAGA: Obraz przy użyciu standardowych technik immunofluorescencji. Zaleca się stosowanie 60-krotnej soczewki obiektywowej o dużej mocy, aby zapewnić wystarczającą rozdzielczość, aby zauważyć zrosty ogniskowe i peryferyjne pomarszczenia na krawędziach komórek. Uzyskaj obrazy 20-30 komórek w wielu polach widzenia dla każdego szkiełka nakrywkowego w każdych warunkach i czasie leczenia. Z połączonych powtórzeń powinno to dać co najmniej 60 komórek w celu przeprowadzenia analizy statystycznej. Zapisywanie i eksportowanie obrazów fluorescencyjnych jako plików . Plik TIFF o rozdzielczości co najmniej 300 dpi.

5. Kwantyfikacja włókien naprężeniowych, okrągłości komórek i tworzenia zrostów ogniskowych

UWAGA: Poniższe analizy obrazów są wykonywane przy użyciu najnowszej wersji pakietu do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym Fiji Is Just Image J (Fiji), który można pobrać bezpłatnie ze strony (http://fiji.sc/).

  1. Ogólne przetwarzanie obrazu
    UWAGA: Wszystkie obrazy będą musiały być przygotowane do analiz obliczeniowych, wykonując kroki 5.1.1-5.1.5 poniżej (Rysunek 2). Następnie można wybrać dowolną lub wszystkie kolejne procedury oznaczania ilościowego.
    1. Otwórz plik . Obraz fluorescencyjny TIFF z wykorzystaniem Fidżi. Upewnij się, że obrazy są 8-bitowe i w skali szarości.
    2. Wybierz Image-Adjust-Window/level i wybierz Auto (Rysunek 2A).
    3. Wybierz opcję Process-Retract Background (Odejmij tło), aby odjąć fluorescencję tła. Sprawdź paraboloidę ślizgową i wybierz opcję promienia toczącej się kuli wynoszącego 50 pikseli (Rysunek 2B).
      UWAGA: Aby sprawdzić prawidłowy rozmiar promienia toczącej się kuli, wybierz narzędzie Linia i narysuj promień na największej przyczepności na obrazie. Wybierz opcję Zmierz, aby sprawdzić długość narysowanej linii. Jeśli wartość promienia jest zbyt duża, elementy, w tym zrosty, zostaną utracone na obrazie. Jeśli promień jest zbyt mały, spowoduje to powstawanie artefaktów w przetwarzanym obrazie z powodu szumu tła.
    4. Wybierz Image-Adjust- Brightness/Contrast, aby sprawdzić intensywność przyczepności do tła. W razie potrzeby wyreguluj.
      UWAGA: Aby zoptymalizować jasność/kontrast i uniknąć nasycenia sygnału, użyj narzędzia wyszukiwania obrazu, aby sprawdzić jego histogram w celu dostosowania jasności/kontrastu.
    5. W obszarze Pomiary zestawu analiz wybierz następujące parametry: Obszar, Średnia wartość szarości, Deskryptory kształtu i Gęstość zintegrowana.
  2. Analiza tworzenia włókien naprężeniowych
    UWAGA: Włókna naprężeniowe można określić ilościowo na wiele sposobów, w zależności od fenotypu.
    1. Policz liczbę komórek z włóknami stresu w procentach w stosunku do całkowitej liczby komórek. Ta analiza jest najlepsza, jeśli istnieją wizualne różnice w liczbie włókien naprężeniowych powstałych w różnych warunkach eksperymentalnych.
    2. Policz liczbę włókien naprężeniowych, które przecinają komórkę. Analiza ta pozwala na porównanie liczby włókien naprężeniowych utworzonych na komórkę.
    3. Zmierz całkowitą intensywność fluorescencji wynikającą z barwienia falloidyną (np. F-aktyną) na komórkę17,18. Ta metoda podkreśli drastyczne wzrosty/spadki intensywności fluorescencji spowodowane barwieniem F-aktyną.
      1. Ustaw parametry pomiaru w kroku 5.1.5 powyżej.
      2. Wybierz narzędzie Rysunek odręczny na pasku narzędzi Fidżi i ręcznie obrysuj interesujące Cię komórki. Wybierz opcję Analizuj-Mierz. Pojawi się nowe okno pokazujące wybrane parametry pomiaru.
      3. Wybierz narzędzie Rysunek odręczny na pasku narzędzi Fidżi i ręcznie obrysuj puste miejsce, w którym nie ma żadnych komórek. Wybierz opcję Analizuj-Mierz. Pomiar ten będzie służył jako fluorescencja tła.
      4. Użyj poniższego równania, aby określić całkowitą fluorescencję F-aktyny na komórkę:
        figure-protocol-1
        UWAGA: Wynikowy pomiar można znormalizować i porównać z innymi komórkami, aby uzyskać fluorescencję F-aktyny na komórkę.
  3. Analiza cyrkularności komórek
    UWAGA: Można również rejestrować informacje o powierzchni komórki (wskaźnik rozprzestrzeniania się komórek w czasie), a także o kolistości. Pomiar ten jest podawany jako stosunek od 0 do 1 jako sposób ilościowego określania komórek, które są odpowiednio wydłużone do zaokrąglonych.
    1. Wybierz narzędzie Rysunek odręczny na pasku narzędzi Fidżi i obrysuj pojedynczą komórkę. Wybierz opcję Image-Measure i zapisz pomiary obszaru i obwodu komórki dla każdej komórki. Powtórz tę procedurę dla każdej komórki.
      UWAGA: W ramach funkcji Set Measurements (Ustaw pomiary) okrągłość jest podawana jako pomiar Deskryptory kształtu (krok 5.1.5).
    2. Ręcznie policz wzbogacone aktyną zmarszczki lub wypukłości na komórkę, jak pokazano na Rysunek 3 i Rysunek 4.
  4. Analiza przyczepności ogniskowej
    UWAGA: Przed wykonaniem analizy przyczepności ogniskowej zainstaluj wtyczkę Mexican Hat Filter w najnowszej wersji Fidżi. Poniższy protokół został zmodyfikowany w stosunku do poprzednich badań19,20,21.
    1. Wybierz opcję Process-Enhance Local Contrast (Clahe), używając bloku o rozmiarze 19, przedziałów histogramu 256 i maksymalnego nachylenia 6, bez maski i nie szybkiego. (Rysunek 2C)
    2. Wybierz Process-Filters- Gaussian Blur with Sigma (Radius) 2.0, aby przefiltrować obraz (Rysunek 2D).
    3. Wybierz Plugins-Mexican Hat Filter (mhf) o promieniu 2.0 (Rysunek 2E).
    4. Uruchom Threshold i wybierz Ciemne tło i Powyżej/Poniżej, używając Huang lub Isodata jako metody progowania. Wybierz pozycję Auto-Threshold.
      UWAGA: Ten krok zapewnia, że zrosty są podświetlone, ale także różnią się od siebie.
    5. Wybierz Analizuj-Analizuj cząstki z wybranymi następującymi parametrami: rozmiar=20, piksele-nieskończoność i okrągłość=0,00-0,99. Sprawdź kontury, aby zapewnić prawidłowe wykrywanie i separację zrostów ogniskowych.
      UWAGA: Wyniki te dają opis, liczbę, powierzchnię i kształt poszczególnych zrostów ogniskowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny schemat eksperymentalnego układu

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat protokołu adhezji i rozprzestrzeniania komórek, zaczynając od wytworzenia komórek REF52 w surowicy, a kończąc na analizie obliczeniowej uzyskanych obrazów fluorescencyjnych. Kluczowe etapy protokołu przedstawiono na osi czasu. Warto zauważyć, że krok 2 protokołu opisuje przygotowanie szkiełek nakrywkowych pokrytych FN, które powinno być wykonywane równocześnie z krokiem 3: surowica głodząca...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół jest wszechstronnym i ekonomicznym sposobem szybkiego badania przesiewowego wielu typów komórek zależnych od zakotwiczenia w celu dynamicznej przebudowy cytoszkieletu podczas rozprzestrzeniania się komórek. W szczególności metoda ta bada ilościowo powstawanie włókien naprężeniowych i adhezji ogniskowej podczas stresu oksydacyjnego, gdy komórki przylegają do FN (ryc. 1A). Co więcej, te fenotypy komórkowe mogą sugerować rolę regulacyjną dla członków rodziny Rho małych GT...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują doktorom Scottowi R. Huttonowi i Meghan S. Blackledge za krytyczną recenzję rękopisu. Ta praca została sfinansowana przez High Point University's Research and Sponsored Programs (MCS) oraz Biotechnology Program na North Carolina State University (MCS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna-EDTA (1x)Gibco firmy Life Technologies25300-054dysocjacja komórek
10 cm2 naczyniaCell Treat229620sterylne, poddane hodowli tkankowej
15 ml stożkowe probówkiFisher Scientific05-539-5sterylne
1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiCorning Cellgro21-031-CVPBS, sterylne, wolne od Mg2+ i Ca2+
24-dołkowe płytki poddane działaniu kultur komórkowychFisher Scientific07-200-740sterylne, hodowle tkankowe poddane działaniu
4° Lodówka CFisher Scientific
Mouse Przeciwciało pierwotne anty-paxillin IgG (klon 165)Laboratoria Transdukcji BD610620marker zrostów ogniskowych
AspiratorArgosEV310
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoNuairNU-477-400Klasa II, typ A, seria 5
Delipidowana albumina surowicy bydlęcej (bez kwasów tłuszczowych) w proszkuFisher ScientificBP9704-100dlBSA
DimetylosulfotlenekFisher ScientificBP231-100rozpuszczalnik organiczny do rozpuszczania Ku55933
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco,pożywka do hodowli komórkowychFisher Scientific11965092
Surowica bydlęca16000044Fisher Scientific, suplement pożywki do hodowli komórkowych
FidżiNational Institutes of Healthhttp://fiji.sc/program do analizy obrazu
Strzykawka filtrującaFisher Scientific6900-25020,2 i mikro; M, sterylne
szkiełka nakrywkowe szklane (12-Cir-1.5)Autoklaw Fisher Scientific12-545-81w folii do sterylizacji
koziego przeciwciała wtórnego anty-mysiego IgG Alexa Fluor 488InvitrogenA11001fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe, światłoczułe
Kozia surowicaGibco firmy Life Technologies16210-064składnik roztworu blokującego do hemocytometru immunofluorescencyjnego
Fisher Scientific22-600-107do zliczania komórek
Fibronektyna z ludzkiego osoczaGibco firmy Life Technologies33016-015FN
IX73 Fluorescencyjny mikroskop odwróconyMikroskop Olympusdo wizualizacji fluorescencji, morfologii komórek, zliczania i dysocjacji
Ku55933Sigma-AldrichSML1109-25MGinhibitor kinazy ATM, induktor reaktywnego tlenu gatunek
L-glutaminaFisher Scientific25-030-081pożywka do hodowli komórkowych
suplement Monochromatyczna kamera CMOS 16-bitowaOptimos
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148-500GPFA, utrwalacz do immunofluorescencji
Penicylina-streptomycynaFisher Scientific15-140-122P/S, roztwór antybiotyku do podłoża hodowlanego
Alexa Fluor 594 falloidyna (sonda F-aktyny)InvitrogenA12381marker F-aktyny, światłoczuły
ProLong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPIInvitrogenP36941media do montażu szkiełek nakrywkowych, w tym barwnik jądrowy DAPI, światłoczułe
ogniwaGraham, DM i wsp. Journal of Cell Biology 2018 Płytka
mieszająca z kontrolą ciepłaCorning IncorporatedPC-420D
StrzykawkaBD Biosciences30965360 ml
Inkubator do hodowli tkankowychNuair
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500detergent stosowany do przepuszczalności błon komórkowych
Roztwór błękitu trypanowegoFisher Scientific15-250-061do zliczania komórek
Roztwór neutralizujący trypsynę (1x)Gibco firmy Life TechnologiesR-002-100TNS, neutralizuje trypsynę zamiast płodu rotator rurki surowicy bydlęcej
Fisher Scientific11-676-341
kąpiel wodnaFisher ScientificFSGPD02
o wysokiej zawartości glukozy REF52 płodu Certyfikat REF52

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
  3. Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958(2014).
  4. Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
  5. Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
  6. Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
  7. Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
  8. Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579(2014).
  9. Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
  10. Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
  11. Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
  12. Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
  13. Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
  14. Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
  15. Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
  16. Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
  17. Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
  18. Fitzpatrick, M. Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html (2014).
  19. Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025(2011).
  20. Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
  21. Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393(2014).
  22. Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
  23. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
  24. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  25. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  26. Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231(2016).
  27. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  28. Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
  29. Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cell SpreadingFibronectin CoatingImmunofluorescence AssayPaxillin StainingF actin ProbeEpifluorescence MicroscopyFiji SoftwareKu55933 Treatment

Powiązane artykuły