Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek nabłonka na fibronektynie podczas stresu oksydacyjnego

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59989

⸱

13 października 2019

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Chemistry, High Point University, 3Biotechnology Program and the Department of Molecular Biomedical Sciences, North Carolina State University

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda jest przydatna do ilościowego określania wczesnej dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek zależnych od zakotwiczenia na fibronektynie. Ponadto test ten może być wykorzystany do zbadania wpływu zmienionej homeostazy redoks na rozprzestrzenianie się komórek i/lub wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe związane z adhezją komórek.

Streszczenie

Adhezja i rozprzestrzenianie się komórek na macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) są niezbędnymi procesami komórkowymi podczas rozwoju organizmu i homeostazy tkanek dorosłych. Co ciekawe, stres oksydacyjny może zmieniać te procesy, przyczyniając się w ten sposób do patofizjologii chorób takich jak rak z przerzutami. Dlatego zrozumienie mechanizmu(ów) tego, w jaki sposób komórki przyczepiają się i rozprzestrzeniają na ECM podczas zaburzeń statusu redoks, może zapewnić wgląd w stany normalne i chorobowe. Poniżej opisano krok po kroku protokół, który wykorzystuje test oparty na immunofluorescencji do specyficznego ilościowego określenia adhezji komórek i rozprzestrzeniania się unieśmiertelnionych komórek fibroblastów na fibronektynie (FN) in vitro. Krótko mówiąc, komórki zależne od zakotwiczenia są utrzymywane w zawiesinie i wystawiane na działanie inhibitora kinazy ATM Ku55933 w celu wywołania stresu oksydacyjnego. Komórki są następnie powlekane na powierzchni pokrytej FN i pozostawiane do przyczepienia przez określony czas. Komórki, które pozostają połączone, są utrwalane i znakowane markerami adhezji przeciwciał na bazie fluorescencji (np. Paxillin) i rozprzestrzeniania się (np. F-aktyna). Akwizycja i analiza danych odbywa się przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu laboratoryjnego, w tym mikroskopu epifluorescencyjnego oraz ogólnodostępnego oprogramowania Fidżi. Procedura ta jest bardzo wszechstronna i może być modyfikowana dla różnych linii komórkowych, białek ECM lub inhibitorów w celu zbadania szerokiego zakresu pytań biologicznych.

Wprowadzenie

Zrosty macierzy komórkowej (tj. zrosty ogniskowe) to duże i dynamiczne wielocząsteczkowe kompleksy białkowe, które pośredniczą w adhezji i rozprzestrzenianiu się komórek. Procesy te mają kluczowe znaczenie dla rozwoju, utrzymania i funkcji fizjologicznych tkanek. Zrosty ogniskowe składają się z receptorów związanych z błoną, takich jak integryny, a także białek rusztowania, które łączą aktynę cytoszkieletu z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)1. Kompleksy te są zdolne do reagowania na sygnały fizykochemiczne obecne w środowisku zewnątrzkomórkowym poprzez aktywację różnych szlaków transdukcji sygnałowej. W związku z tym zrosty ogniskowe służą jako centra sygnalizacyjne do propagacji zewnątrzkomórkowych sygnałów mechanicznych do wielu procesów komórkowych, w tym ukierunkowanej migracji, regulacji cyklu komórkowego, różnicowania i przeżycia1,2. Jedna grupa cząsteczek sygnałowych, które regulują i oddziałują z zrostami ogniskowymi, obejmuje członków rodziny małych GTPaz Rho. GTPazy Rho są kluczowymi białkami, które regulują migrację komórek i dynamikę adhezji poprzez ich specyficzną aktywację czasoprzestrzenną3. Nic dziwnego, że rozregulowanie funkcji białka Rho jest związane z wieloma patologiami u ludzi, takimi jak przerzuty, angiogeneza i inne. Szczególnie interesujący jest status redoks komórkowego odgrywa dominującą rolę w modulacji migracji i adhezji komórek. Wykazano, że zmiany w homeostazie redoks, takie jak wzrost reaktywnych form tlenu (ROS), regulują aktywność białka Rho, a także adhezję, w wielu typach komórek i chorobach ludzkich4,5,6,7,8. Na przykład osoby cierpiące na zaburzenie neurologiczne ataksja-teleangiektazja (A-T), które jest spowodowane mutacją w kinazie serynowo-treoninowej A-T (ATM) naprawiającej uszkodzenia DNA, mają zwiększone ryzyko raka z przerzutami9,10. Utrata aktywności kinazy ATM u tych pacjentów i linii komórkowych, albo przez mutację genetyczną, albo przez hamowanie chemiczne, powoduje wysoki poziom stresu oksydacyjnego z powodu dysfunkcji szlaku pentozofosforanowego7,11,12. Co więcej, ostatnie badania laboratoryjne podkreśliły patofizjologiczną rolę ROS w A-T poprzez zmianę dynamiki cytoszkieletu (tj. adhezji i rozprzestrzeniania się) jako bezpośredniego wyniku aktywacji GTPaz rodziny Rho in vitro5. Ostatecznie te zmiany w dynamice cytoszkieletu spowodowane aktywacją rodziny Rho mogą prowadzić do zwiększonego ryzyka raka z przerzutami obserwowanego u pacjentów z A-T5,13. Dlatego zrozumienie wzajemnych zależności między interakcjami komórka-macierz podczas stresu oksydacyjnego może dostarczyć informacji na temat regulacji adhezji i rozprzestrzeniania się. Badania te mogą również przygotować grunt pod dalsze badania nad możliwą rolą GTPaz rodziny Rho w tych procesach sygnalizacyjnych.

Opisany tutaj jest protokół do badania wczesnej dynamiki komórkowej tworzenia i rozprzestrzeniania się adhezji podczas stresu oksydacyjnego spowodowanego hamowaniem aktywności kinazy ATM. Test ten opiera się na dobrze scharakteryzowanym mechanizmie zależnej od zakotwiczenia adhezji komórek do białka ECM fibronektyny (FN). Gdy komórki utrzymywane w zawiesinie są posiewane na FN, kilka GTPaz Rho koordynuje kontrolę przebudowy cytoszkieletu aktyny3,14. Zmiany morfologiczne obserwuje się, gdy komórki zmieniają się z okrągłych i okrągłych w spłaszczone i rozszerzone. Obserwowaniom tym towarzyszy rozwój licznych zrostów matrycy z ECM. Zmiany te przypisuje się dwufazowej aktywacji RhoA z Rac1 w ciągu pierwszej godziny, gdy komórki przylegają i rozprzestrzeniają się 15,16.

Do badania adhezji, morfologii i dynamiki oraz rozprzestrzeniania się komórek wykorzystano różne metody. Metody te opierają się jednak na zaawansowanych, długoterminowych systemach obrazowania fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) lub mikroskopii konfokalnej. W związku z tym użytkownicy muszą mieć dostęp do specjalistycznego sprzętu i oprogramowania. Co więcej, czas konfiguracji wymagany przez te systemy obrazowania biologicznego sprawia, że uchwycenie wczesnych zdarzeń adhezji jest wyzwaniem, zwłaszcza w przypadku jednoczesnego testowania wielu inhibitorów lub warunków leczenia.

Opisane tutaj metody zapewniają prosty, ekonomiczny, a jednocześnie ilościowy sposób oceny parametrów rządzących montażem adhezyjnym i rozprzestrzenianiem się in vitro. Protokół wykonywany jest przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak mikroskop epifluorescencyjny i kamera CCD. Test ten polega na nałożeniu komórek zależnych od zakotwiczenia na powierzchnię pokrytą FN po okresie stresu oksydacyjnego spowodowanego chemicznym hamowaniem aktywności kinazy ATM, co wykazano wcześniej5. Po posiewaniu komórki mogą się przyczepiać i przylegać przez określony czas. Nieprzyłączone komórki są wypłukiwane, podczas gdy przyłączone komórki są utrwalane i znakowane przeciwciałami opartymi na fluorescencji przeciwko markerom adhezji (np. paxilliny) i rozprzestrzeniania się (np. F-aktyna)2,5. Białka te są następnie wizualizowane i rejestrowane za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Późniejsza analiza danych odbywa się za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania Fidżi. Co więcej, metodę tę można dostosować do badania dynamiki adhezji w szerokim zakresie warunków, w tym różnych białek ECM, traktowania różnymi utleniaczami/warunkami hodowli komórkowej lub różnymi liniami komórkowymi zależnymi od zakotwiczenia, aby odpowiedzieć na szeroki zakres pytań biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowania

UWAGA: Opisany poniżej protokół został zoptymalizowany do stosowania z komórkami REF52 oraz ludzkimi fibroblastami ATM+/+ lub ATM-/-. Inne typy komórek mogą wymagać dalszej optymalizacji, zgodnie z opisem w poniższych sekcjach uwag i rozwiązywania problemów.

  1. Przygotować 500 mL kompletnej pożywki do hodowli komórek REF52. Do 500 mL pożywki Dulbecco's modified Eagle’s medium (DMEM) z wysoką zawartością glukozy dodać 10% FBS, 2 mM L-glutaminy oraz 100 jednostek/mL penicyliny i streptomycyny.
  2. Przygotować roztwór fibronektyny (FN) o stężeniu 25 μg/mL, dodając 300 μL roztworu FN o stężeniu 1 mg/mL do 12 mL sterylnego 1x roztworu buforu fosforanowego (PBS), pH 7,4. Dobrze wymieszać.
  3. Przygotować 0,5% (w/v) roztwór odtłuszczonej (tzn. wolnej od kwasów tłuszczowych) albuminy surowicy bydlęcej (dlBSA) w bezsurowiczej pożywce DMEM. Dodać 0,5 g dlBSA do 100 mL bezsurowiczej pożywki DMEM. Dobrze wymieszać roztwór, nie używając wkręcarki (vortexa). Przed użyciem przefiltrować roztwór przez sterylny filtr strzykawkowy 0,22 μM do nowego sterylnego pojemnika. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować 3,7% roztwór paraformaldehydu, rozpuszczając 3,7 g paraformaldehydu w 100 mL 1x PBS. W celu rozpuszczenia paraformaldehydu zastosować łagodne ogrzewanie i mieszanie.
    UWAGA: Roztwór paraformaldehydu jest światłoczuły i powinien być chroniony przed światłem. Przechowywany w temperaturze 4 °C zachowuje stabilność do jednego tygodnia.
    OSTRZEŻENIE: Paraformaldehyd jest toksyczny, łatwopalny, żrący i stanowi zagrożenie dla zdrowia. Przed użyciem zapoznać się z kartą charakterystyki substancji dla paraformaldehydu. Podczas pracy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym osłonę oczu, przyłbicę, pełnomaskowy respirator przeciwpyłowy, rękawiczki i fartuch laboratoryjny.
  5. Przygotować roztwór do permeabilizacji zawierający 0,2% niejonowego surfaktanta w 1x PBS (v/v). Aby przygotować 100 mL, powoli dodać 0,2 mL Triton X-100 do 100 mL 1x PBS podczas mieszania.
  6. Przygotować bufor blokujący do immunofluorescencji zawierający 2,5% BSA, 5% surowicy koziej i 0,05% niejonowego surfaktanta (w/v/v) rozpuszczonych w roztworze 1x PBS. Aby przygotować 100 mL, dodać 5 mL surowicy koziej, 2,5 g BSA i 0,05 mL Triton X-100 do ok. 95 mL 1x PBS podczas mieszania.
  7. Hodować komórki REF52 w kompletnej pożywce DMEM na płytce do hodowli komórek o powierzchni 10 cm2 (lub w naczyniu o innym rozmiarze) w inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.

2. Powlekanie płytek hodowlanych białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej – fibronektyną

UWAGA: Tę sekcję należy przeprowadzić z zastosowaniem techniki aseptycznej i sterylnych odczynników w certyfikowanej komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy BSL-2. Przed rozpoczęciem pracy należy zapoznać się z Rysunkiem 1A, który przedstawia przegląd kluczowych etapów.

  1. Używając certyfikowanej do hodowli tkankowej płytki 24-dołkowej, umieść jedno szkiełko podstawowe (12-Cir-1) w każdym dołku. Opisz płytkę zgodnie z Rysunkiem 1B.
  2. Do każdego dołka płytki 24-dołkowej pipetuj 500 μL roztworu FN o stężeniu 25 μg/mL.
  3. Pipetuj roztwór nad każdym szkiełkiem kilka razy, aby zapewnić równomierne pokrycie i całkowite zanurzenie. Nałóż pokrywkę z powrotem na płytkę.
  4. Inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 h.
    UWAGA: Alternatywnie można inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Po 1 h wyjmij płytkę z inkubatora i odessij roztwór FN z dołków.
  6. Przemyj dołki trzykrotnie 500 μL 1x PBS. Odessij ostatnią porcję 1x PBS.
  7. Zablokuj dołki, dodając 500 μL 0,5% roztworu dlBSA, na minimum 15 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  8. Odessij roztwór dlBSA przed wysianiem komórek w kroku 3 poniżej.
    UWAGA: W przypadku przechowywania płytek, po odessaniu roztworu dlBSA dodaj 500 μL 1x PBS na każde szkiełko. Płytki można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia.

3. Przygotowanie komórek zależnych od adhezji do testu przylegania

UWAGA: Tę część procedury należy przeprowadzić z zachowaniem zasad aseptyki i przy użyciu sterylnych odczynników w certyfikowanej dygestorium z laminarnym przepływem powietrza klasy BSL-2.

  1. Na co najmniej 30 min przed wysianiem komórek podgrzać następujące roztwory: pełne medium DMEM, roztwór dlBSA, 1x PBS, 0,5% roztwór trypsyny-EDTA oraz surowicę neutralizującą trypsynę (TNS) w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
  2. Zacząć od konfluencyjnej monowarstwy komórek REF52 w naczyniu o powierzchni 10 cm2, przemyć komórki dwukrotnie 6 mL ciepłego 1x PBS. Poddać komórki głodzeniu surowiczemu przez co najmniej 1 h (w zależności od typu komórek) w 6 mL ciepłego roztworu dlBSA w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  3. Przemyć komórki 6 mL podgrzanego 1x PBS, odessać PBS i dodać 1,5 mL ciepłego 0,5% roztworu trypsyny-EDTA.
  4. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na ok. 2 min.
  5. Obserwować komórki pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że odczepienie jest całkowite. Jeśli komórki nadal przylegają po opukaniu naczynia o blat, zwrócić je do inkubatora 37 °C na dodatkowe 2 min. Trypsynizować komórki przez jak najkrótszy czas, jaki jest niezbędny.
  6. Do naczynia pipetować 1,5 mL ciepłego roztworu neutralizującego trypsynę (TNS), aby zatrzymać trypsynizację i zebrać odczepione komórki. Wielokrotnie pipetować roztwór w górę i w dół po dnie naczynia, aby usunąć wszystkie pozostałe przylegające komórki. Jeśli komórki wydają się tworzyć skupiska, dodatkowo triturować zawiesinę komórkową, delikatnie pipetując w górę i w dół po tylnej ściance naczynia.
  7. Policzyć komórki metodą wykluczania błękitu trypanowym i za pomocą hemocytometru pod mikroskopem świetlnym. Alternatywnie można użyć automatycznego licznika komórek.
  8. Odebrać odpowiednią ilość komórek, aby przygotować zawiesinę o stężeniu 1,0 - 3,0 x 104 komórek/mL w 5 mL dlBSA w probówce stożkowej 15 mL.
  9. Wirować komórki przy ok. 300 x g przez 5 min, używając rotora kątowego w wirówce stołowej.
  10. Odessać supernat z osadu komórkowego i resuspender komórki w łącznej objętości 7 mL ciepłego roztworu dlBSA. Nie dopuścić do zbyt wysokiej konfluencji komórek podczas wysiewania na szkiełko cover-slip, aby były równomiernie rozmieszczone i niewiele z nich stykało się ze sobą.
  11. Równomiernie podzielić zawiesinę komórkową do dwóch probówek stożkowych 15 mL, jednej dla kontroli samego nośnika (DMSO) i jednej dla Ku55933 (inhibitor kinazy ATM, utleniacz)5. Upewnić się, że każda probówka zawiera 3,5 mL zawiesiny komórkowej.
  12. Używając rotatora do probówek, obracać probówki w temperaturze 37 °C przez 90-120 min w inkubatorze do hodowli komórkowych.
  13. Na 30 min przed wysianiem dodać do każdej z odpowiednich probówek końcowe stężenie 10 μM Ku55933 oraz DMSO (1:1 000). Umieścić zawiesinę komórkową z powrotem na rotatorze na pozostały czas.
  14. Bezpośrednio przed wysianiem komórek wyjąć płytkę 24-dołkową z inkubatora i odessać roztwór dlBSA.
  15. Po obracaniu zawiesiny komórkowej przez 90-120 min, pobrać 500 μL zawiesiny komórkowej z każdej grupy badawczej i dodać do jednego szkiełka cover-slip powleczonego FN w płytce 24-dołkowej z kroku 2, jak zilustrowano (Rysunek 1B). Zwrócić płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2), a zawiesinę komórkową do rotacji.
  16. Po wysianiu zawiesiny komórkowej na szkiełkach cover-slip powleczonych FN, pozwolić komórkom przylegnąć przez pożądany czas (np. 10 min, 15 min, 20 min, 30 min), a następnie niezwłocznie przejść do kroku 4.

4. Fixacja komórek i barwienie przeciwciałami do immunofluorescencji

UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane w warunkach niesterylnych i w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej.

  1. Po upływie pożądanego czasu adhezji, odessać roztwór komórek z każdego szkiełka podstawowego w płytce.
  2. Wykorzystując ścianki dołka, ostrożnie nanieść 500 μL 3,7% roztworu paraformaldehydu na każde szkiełko podstawowe i odczekać 10-15 min.
  3. Usunąć roztwór paraformaldehydu i przemyć każde szkiełko podstawowe 500 μL 1x PBS łącznie dwa razy.
    UWAGA: Odpady z paraformaldehydu należy utylizować w sposób odpowiedzialny, zgodnie z instytucjonalnym planem ochrony zdrowia i środowiska.
  4. Odessać PBS i przeprowadzić permeabilizację komórek na każdym szkiełku podstawowym przy użyciu 500 μL 0,2% Triton X-100 w 1x PBS (v/v) przez 10-15 min w temperaturze pokojowej.
  5. Przemyć każde szkiełko podstawowe 500 μL 1x PBS trzy razy.
  6. Zablokować komórki na każdym szkiełku podstawowym przy użyciu 500 μL buforu blokującego do immunofluorescencji zawierającego 5% surowicy koziej, 2,5% BSA i 0,05% Triton X-100 rozpuszczonych w roztworze 1 x PBS przez 30-60 minut.
  7. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało anty-paksyllinowe (1:250) w buforze blokującym. Dobrze wymieszać i dodać 200 μL roztworu przeciwciał do każdego szkiełka podstawowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 h.
    UWAGA: Alternatywnie roztwór przeciwciał pierwszorzędowych można inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Istnieje wiele powszechnych markerów adhezji ogniskowej, które mogą być użyte do barwienia kompleksów adhezyjnych i późniejszej analizy FA. Obejmują one przeciwciała przeciwko następującym białkom: podjednostkom integryny (β1, α5 lub αV), talinie lub winkulinie2.
  8. Odessać roztwór przeciwciał i przemyć każde szkiełko podstawowe 500 μL 1x PBS trzy razy przez 10 min każdego mycia. Od tego momentu chronić próbki przed światłem.
  9. Rozcieńczyć sondę faloidyny do F-aktyny sprzężoną z czerwonym fluorescencyjnym barwnikiem Alexa 594 (1:1000) oraz wtórne przeciwciało fluorescencyjne kozie anty-mysie 488 (1:400) w tym samym roztworze buforu blokującego. Dobrze wymieszać i nanieść 200 μL roztworu przeciwciał na każde szkiełko podstawowe na 30 min.
    UWAGA: Można również stosować wtórne przeciwciała sprzężone fluorescencyjnie pochodzące od innych gatunków. Jednakże zastosowanie przeciwciał od innych gatunków będzie wymagało modyfikacji surowicy w buforze blokującym.
  10. Odessać roztwór przeciwciał i przemyć każde szkiełko podstawowe 500 μL 1x PBS trzy razy przez 10 min każdego mycia.
  11. Odessać 1x PBS i przepłukać jeden raz 500 μL dIH2O.
  12. Zamontować szkiełka podstawowe na szkiełkach mikroskopowych, używając medium montażowego zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI.
  13. Pozostawić szkiełka mikroskopowe do utwardzenia przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.
  14. Przechowywać szkiełka mikroskopowe w ciemności w temperaturze 4 ˚C w przypadku długoterminowego przechowywania oraz do momentu obrazowania.
    UWAGA: Obrazować przy użyciu standardowych technik immunofluorescencji. Zaleca się stosowanie wysokiej mocy obiektywu imersyjnego 60x, aby zapewnić rozdzielczość wystarczającą do zauważenia adhezji ogniskowej i obrzeżnych fałdowań na krawędziach komórek. Pozyskać obrazy 20-30 komórek w wielu polach widzenia dla każdego szkiełka podstawowego dla każdego warunku traktowania i czasu. Z połączonych powtórzeń powinno to dać co najmniej 60 komórek w celu przeprowadzenia analizy statystycznej. Zapisać i wyeksportować obrazy fluorescencyjne jako plik .TIFF z rozdzielczością minimum 300 dpi.

5. Ilościowe określanie włókien stresowych, okrągłości komórek i tworzenia się adhezji ogniskowych

UWAGA: Poniższe analizy obrazów są wykonywane przy użyciu najnowszej wersji otwartoźródłowego pakietu do przetwarzania obrazów Fiji Is Just Image J (Fiji), który można pobrać bezpłatnie ze strony (http://fiji.sc/).

  1. Ogólne przetwarzanie obrazów
    UWAGA: Wszystkie obrazy muszą zostać przygotowane do analiz obliczeniowych poprzez wykonanie kroków od 5.1.1 do 5.1.5 opisanych poniżej (Rysunek 2). Następnie można wybrać dowolną lub wszystkie kolejne procedury ilościowe.
    1. Otwórz obraz fluorescencyjny w formacie .TIFF za pomocą programu Fiji. Upewnij się, że obrazy są 8-bitowe i w skali szarości.
    2. Wybierz Image-Adjust-Window/level i zaznacz opcję Auto (Rysunek 2A).
    3. Wybierz Process-Subtract Background, aby odjąć fluorescencję tła. Zaznacz Sliding Paraboloid i wybierz opcję Rolling Ball Radius o wartości 50 pikseli (Rysunek 2B).
      UWAGA: Aby zweryfikować prawidłowy rozmiar promienia toczącej się kuli (rolling ball radius), wybierz narzędzie Line Tool i narysuj promień na największej adhezji na obrazie. Wybierz Measure, aby sprawdzić długość narysowanej linii. Jeśli wartość promienia będzie zbyt duża, cechy obrazu, w tym adhezje, zostaną utracone. Jeśli promień będzie zbyt mały, w przetworzonym obrazie pojawią się artefakty wynikające z szumu tła.
    4. Wybierz Image-Adjust- Brightness/Contrast, aby sprawdzić intensywność adhezji względem tła. W razie potrzeby dokonaj korekty.
      UWAGA: Aby zoptymalizować jasność/kontrast i uniknąć nasycenia sygnału, użyj narzędzia przeglądania obrazu, aby zbadać jego histogram i dostosować jasność/kontrast.
    5. W menu Analyze-Set Measurements zaznacz następujące parametry: Area, Mean Gray Value, Shape Descriptors oraz Integrated Density.
  2. Analiza tworzenia włókien stresowych
    UWAGA: Włókna stresowe można kwantyfikować na kilka sposobów, w zależności od fenotypu.
    1. Policz liczbę komórek z włóknami stresowymi jako procent całkowitej liczby komórek. Ta analiza jest najbardziej przydatna, gdy występują widoczne różnice w liczbie włókien stresowych tworzonych w różnych warunkach eksperymentalnych.
    2. Policz liczbę włókien stresowych przecinających komórkę. Analiza ta pozwala na porównanie liczby włókien stresowych tworzonych w pojedynczej komórce.
    3. Zmierz całkowitą intensywność fluorescencji wynikającą z barwienia falloidyną (np. F-aktyną) na komórkę17,18. Metoda ta pozwoli uwidocznić drastyczne wzrosty lub spadki intensywności fluorescencji w barwieniu F-aktyny.
      1. Ustaw parametry pomiarowe zgodnie z krokiem 5.1.5 powyżej.
      2. Wybierz narzędzie Freehand Tool na pasku narzędzi Fiji i ręcznie obrysuj interesujące komórki. Wybierz Analyze-Measure. Pojawi się nowe okno z wybranymi parametrami pomiarowymi.
      3. Wybierz narzędzie Freehand Tool na pasku narzędzi Fiji i ręcznie obrysuj pustą przestrzeń bez komórek. Wybierz Analyze-Measure. Pomiar ten posłuży jako fluorescencja tła.
      4. Użyj poniższego równania, aby wyznaczyć całkowitą fluorescencję F-aktyny na komórkę:
        Równanie fluorescencji F-aktyny; gęstość zintegrowana minus fluorescencja tła; schemat formuły.
        UWAGA: Wynikowy pomiar można znormalizować i porównać z innymi komórkami, aby uzyskać wartość fluorescencji F-aktyny na komórkę.
  3. Analiza kolistości komórek
    UWAGA: Można również zarejestrować informacje o polu powierzchni komórki (wskaźniku rozprzestrzeniania się komórek w czasie) oraz o jej kolistości. Pomiar ten podawany jest jako stosunek od 0 do 1, co pozwala na kwantyfikację komórek odpowiednio wydłużonych lub okrągłych.
    1. Wybierz narzędzie Freehand Tool na pasku narzędzi Fiji i obrysuj pojedynczą komórkę. Wybierz Image-Measure i zapisz pomiary pola powierzchni oraz obwodu dla każdej komórki. Powtórz tę procedurę dla każdej komórki.
      UWAGA: W funkcji Set Measurements kolistość jest dostarczana jako pomiar Shape Descriptors (krok 5.1.5).
    2. Ręcznie policz wzbogacone w aktynę pofałdowania lub wypustki na komórkę, jak pokazano na Rysunku 3 oraz Rysunku 4.
  4. Analiza adhezji ogniskowych
    UWAGA: Przed przeprowadzeniem analizy adhezji ogniskowych zainstaluj wtyczkę Mexican Hat Filter w najnowszej wersji programu Fiji. Poniższy protokół został zmodyfikowany na podstawie wcześniejszych badań19,20,21.
    1. Wybierz Process-Enhance Local Contrast (Clahe), używając rozmiaru bloku (block size) 19, liczby koszy histogramu (histogram bins) 256 i maksymalnego nachylenia (maximum slope) 6, bez maski i bez opcji „fast” (Rysunek 2C).
    2. Wybierz Process-Filters- Gaussian Blur z wartością Sigma (Radius) 2.0, aby przefiltrować obraz (Rysunek 2D).
    3. Wybierz Plugins-Mexican Hat Filter (Mhf) z promieniem (Radius) 2.0 (Rysunek 2E).
    4. Uruchom Threshold, wybierz Dark Background oraz Over/Under, stosując metodę progowania Huang lub Isodata. Wybierz Auto-Threshold.
      UWAGA: Krok ten zapewnia wyróżnienie adhezji, a jednocześnie ich odseparowanie od siebie.
    5. Wybierz Analyze-Analyze Particles z następującymi parametrami: size=20, pixels-infinity oraz circularity=0.00-0.99. Sprawdź kontury, aby upewnić się, że adhezje ogniskowe zostały prawidłowo wykryte i oddzielone.
      UWAGA: Wyniki te pozwalają uzyskać liczbę, pole powierzchni oraz opis kształtu poszczególnych adhezji ogniskowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny schemat układu eksperymentalnego

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat protokołu adhezji i rozprzestrzeniania się komórek, rozpoczynający się od głodzenia surowiczego komórek REF52, a kończący na analizie komputerowej uzyskanych obrazów fluorescencyjnych. Kluczowe kroki protokołu zilustrowano na osi czasu. Należy zauważyć, że krok 2 protokołu opisuje przygotowanie szkiełek podstawowych pokrytych FN, co powinno być wykonywane równolegle z krokiem 3: głodzeniem ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół jest wszechstronnym i ekonomicznym sposobem szybkiego badania przesiewowego wielu typów komórek zależnych od zakotwiczenia w celu dynamicznej przebudowy cytoszkieletu podczas rozprzestrzeniania się komórek. W szczególności metoda ta bada ilościowo powstawanie włókien naprężeniowych i adhezji ogniskowej podczas stresu oksydacyjnego, gdy komórki przylegają do FN (ryc. 1A). Co więcej, te fenotypy komórkowe mogą sugerować rolę regulacyjną dla członków rodziny Rho małych GT...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują doktorom Scottowi R. Huttonowi i Meghan S. Blackledge za krytyczną recenzję rękopisu. Ta praca została sfinansowana przez High Point University's Research and Sponsored Programs (MCS) oraz Biotechnology Program na North Carolina State University (MCS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna-EDTA (1x)Gibco firmy Life Technologies25300-054dysocjacja komórek
10 cm2 naczyniaCell Treat229620sterylne, poddane hodowli tkankowej
15 ml stożkowe probówkiFisher Scientific05-539-5sterylne
1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiCorning Cellgro21-031-CVPBS, sterylne, wolne od Mg2+ i Ca2+
24-dołkowe płytki poddane działaniu kultur komórkowychFisher Scientific07-200-740sterylne, hodowle tkankowe poddane działaniu
4° Lodówka CFisher Scientific
Mouse Przeciwciało pierwotne anty-paxillin IgG (klon 165)Laboratoria Transdukcji BD610620marker zrostów ogniskowych
AspiratorArgosEV310
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoNuairNU-477-400Klasa II, typ A, seria 5
Delipidowana albumina surowicy bydlęcej (bez kwasów tłuszczowych) w proszkuFisher ScientificBP9704-100dlBSA
DimetylosulfotlenekFisher ScientificBP231-100rozpuszczalnik organiczny do rozpuszczania Ku55933
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco,pożywka do hodowli komórkowychFisher Scientific11965092
Surowica bydlęca16000044Fisher Scientific, suplement pożywki do hodowli komórkowych
FidżiNational Institutes of Healthhttp://fiji.sc/program do analizy obrazu
Strzykawka filtrującaFisher Scientific6900-25020,2 i mikro; M, sterylne
szkiełka nakrywkowe szklane (12-Cir-1.5)Autoklaw Fisher Scientific12-545-81w folii do sterylizacji
koziego przeciwciała wtórnego anty-mysiego IgG Alexa Fluor 488InvitrogenA11001fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe, światłoczułe
Kozia surowicaGibco firmy Life Technologies16210-064składnik roztworu blokującego do hemocytometru immunofluorescencyjnego
Fisher Scientific22-600-107do zliczania komórek
Fibronektyna z ludzkiego osoczaGibco firmy Life Technologies33016-015FN
IX73 Fluorescencyjny mikroskop odwróconyMikroskop Olympusdo wizualizacji fluorescencji, morfologii komórek, zliczania i dysocjacji
Ku55933Sigma-AldrichSML1109-25MGinhibitor kinazy ATM, induktor reaktywnego tlenu gatunek
L-glutaminaFisher Scientific25-030-081pożywka do hodowli komórkowych
suplement Monochromatyczna kamera CMOS 16-bitowaOptimos
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148-500GPFA, utrwalacz do immunofluorescencji
Penicylina-streptomycynaFisher Scientific15-140-122P/S, roztwór antybiotyku do podłoża hodowlanego
Alexa Fluor 594 falloidyna (sonda F-aktyny)InvitrogenA12381marker F-aktyny, światłoczuły
ProLong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPIInvitrogenP36941media do montażu szkiełek nakrywkowych, w tym barwnik jądrowy DAPI, światłoczułe
ogniwaGraham, DM i wsp. Journal of Cell Biology 2018 Płytka
mieszająca z kontrolą ciepłaCorning IncorporatedPC-420D
StrzykawkaBD Biosciences30965360 ml
Inkubator do hodowli tkankowychNuair
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500detergent stosowany do przepuszczalności błon komórkowych
Roztwór błękitu trypanowegoFisher Scientific15-250-061do zliczania komórek
Roztwór neutralizujący trypsynę (1x)Gibco firmy Life TechnologiesR-002-100TNS, neutralizuje trypsynę zamiast płodu rotator rurki surowicy bydlęcej
Fisher Scientific11-676-341
kąpiel wodnaFisher ScientificFSGPD02
o wysokiej zawartości glukozy REF52 płodu Certyfikat REF52

Bibliografia

  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
  2. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
  3. Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958(2014).
  4. Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
  5. Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
  6. Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
  7. Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
  8. Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579(2014).
  9. Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
  10. Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
  11. Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
  12. Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
  13. Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
  14. Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
  15. Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
  16. Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
  17. Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
  18. Fitzpatrick, M. Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html (2014).
  19. Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025(2011).
  20. Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
  21. Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393(2014).
  22. Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
  23. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
  24. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  25. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  26. Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231(2016).
  27. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  28. Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
  29. Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rozprzestrzenianie komórekpowlekanie fibronektynątest immunofluorescencyjnybarwienie paksyllinysonda F-aktynymikroskopia epifluorescencyjnaoprogramowanie Fijitraktowanie Ku55933
Badanie dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek nabłonka na fibronektynie podczas stresu oksydacyjnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.