Artykuł metodologiczny

Indywidualne podejście do enzymatycznej produkcji i oczyszczania naturalnych produktów diterpenoidowych

DOI:

10.3791/59992

⸱

4 października 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Biology, University of California Davis

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy łatwe w użyciu protokoły produkcji i oczyszczania metabolitów diterpenoidowych poprzez kombinatoryczną ekspresję enzymów biosyntetycznych w Escherichia coli lub Nicotiana benthamiana, a następnie chromatograficzne oczyszczanie produktu. Otrzymane metabolity nadają się do różnych badań, w tym charakterystyki struktury molekularnej, badań funkcjonalnych enzymów i testów bioaktywności.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diterpenoidy tworzą różnorodną klasę małych cząsteczek naturalnych produktów, które są szeroko rozpowszechnione w królestwach życia i pełnią kluczowe funkcje biologiczne w procesach rozwojowych, interakcjach międzyorganizmowych i adaptacji do środowiska. Ze względu na te różne bioaktywności wiele diterpenoidów ma również znaczenie gospodarcze jako farmaceutyki, dodatki do żywności, biopaliwa i inne bioprodukty. Zaawansowana genomika i podejścia biochemiczne umożliwiły szybki wzrost wiedzy na temat genów, enzymów i szlaków metabolicznych diterpenoidów. Jednak złożoność strukturalna diterpenoidów i wąski rozkład taksonomiczny poszczególnych związków w często tylko jednym gatunku pozostają czynnikami ograniczającymi ich wydajną produkcję. Dostępność szerszego zakresu enzymów metabolicznych zapewnia obecnie zasoby do produkcji diterpenoidów o wystarczającym mianie i czystości, aby ułatwić dokładniejsze badanie tej ważnej grupy metabolitów. Opierając się na uznanych narzędziach do koekspresji enzymów mikrobiologicznych i roślinnych, przedstawiamy łatwy w obsłudze i konfigurowalny protokół enzymatycznego wytwarzania diterpenoidów w Escherichia coli lub Nicotiana benthamiana oraz oczyszczania pożądanych produktów za pomocą chromatografii krzemionkowej i półpreparatywnej HPLC. Na przykładzie grupy diterpenoidów dolabraleksyny kukurydzy (Zea mays) podkreślamy, w jaki sposób modularne kombinacje syntazy diterpenowej (diTPS) i enzymów monooksygenazy cytochromu P450 (P450) można wykorzystać do generowania różnych rusztowań diterpenoidowych. Oczyszczone związki mogą być wykorzystywane w różnych dalszych zastosowaniach, takich jak analizy strukturalne metabolitów, badania struktury i funkcji enzymów oraz eksperymenty bioaktywności in vitro i in planta.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diterpenoidy stanowią chemicznie zróżnicowaną grupę ponad 12 000 głównie policyklicznych 20-węglowych naturalnych produktów, które odgrywają kluczową rolę w wielu organizmach1. Grzyby i rośliny wytwarzają największą różnorodność diterpenoidów, ale wykazano również, że bakterie tworzą bioaktywne diterpenoidy (patrz recenzje2,3,4,5). Zakorzenione w ogromnej różnorodności strukturalnej, diterpenoidy pełnią wiele funkcji biologicznych. Niektóre diterpenoidy, takie jak hormony wzrostu gibereliny, pełnią podstawowe funkcje w procesach rozwojowych5. Jednak większość diterpenoidów służy jako mediatory obrony chemicznej i interakcji międzyorganizmowych. Wśród nich najszerzej zbadano kwasy żywicy diterpenowej w ochronie przed szkodnikami i patogenami drzew iglastych oraz specyficzne dla gatunku mieszanki przeciwdrobnoustrojowych diterpenoidów w głównych uprawach spożywczych, takich jak kukurydza (Zea mays) i ryż (Oryza sativa)6,7. Te bioaktywności stanowią bogate repozytorium chemiczne do zastosowań komercyjnych, a wybrane diterpenoidy są używane jako ważne farmaceutyki, dodatki do żywności, kleje i inne bioprodukty codziennego współczesnego życia8,9,10. Aby posunąć naprzód badania nad naturalną różnorodnością i biologicznymi funkcjami diterpenoidów, a ostatecznie promować szersze zastosowania komercyjne, potrzebne są narzędzia do opłacalnego przygotowywania czystych związków. Izolacja na dużą skalę od materiału roślinnego została ustalona dla kilku bioproduktów diterpenoidowych, takich jak kwasy żywicy diterpenowej, które są wytwarzane jako produkt uboczny przemysłu celulozowo-papierniczego8. Jednak akumulacja diterpenoidów tylko w określonych tkankach i pod ścisłą regulacją przez bodźce środowiskowe często ogranicza izolację wystarczających ilości produktu od naturalnego producenta2. Ponadto złożoność strukturalna diterpenoidów utrudnia ich produkcję poprzez syntezę chemiczną, chociaż takie podejścia okazały się skuteczne w kilku przypadkach11,12. Wraz z dostępnością zaawansowanych technologii genomicznych i biochemicznych, platformy produkcji enzymatycznej zyskują coraz większą uwagę na wytwarzaniu szeregu związków diterpenoidowych (patrz recenzje13,14,15,16,17,18).

Wszystkie terpenoidy, w tym diterpenoidy, pochodzą z dwóch izomerycznych prekursorów izoprenoidów, difosforanu izopentenylu (IPP) i difosforanu dimetyloallilu (DMAPP)19, które z kolei powstają poprzez szlak mewalonianu (MVA) lub metylerytrytolu-5-fosforanu (MEP). Biosynteza terpenoidów przebiega przez szlak MEP u bakterii i szlak MVA u grzybów, podczas gdy rośliny posiadają cytozolowy szlak MVA i plastydialny szlak MEP, przy czym ten ostatni jest główną drogą do tworzenia diterpenoidów20. Kondensacja IPP i DMAPP przez transferazy prenylowe daje centralny 20-węglowy prekursor wszystkich diterpenoidów, difosforan geranylgeranylu (GGPP)20. Po powstaniu GGPP dwie rodziny enzymów, syntazy terpenów (TPS) i monooksygenazy cytochromu P450 (P450), w dużej mierze kontrolują powstawanie ogromnej różnorodności chemicznej metabolizmu terpenoidów21,22. Syntazy diterpenowe (diTPS) katalizują zaangażowaną cyklizację i rearanżację GGPP napędzaną karbokationem, tworząc różne stereospecyficzne bi-, poli- lub makrocykliczne rusztowania diterpenowe1,3,23,24. Natlenienie i dalsza funkcjonalna dekoracja tych rusztowań jest następnie ułatwiona przez enzymy P450 i wybrane inne rodziny enzymów22,25. TPS i P450 powszechnie występują jako specyficzne dla gatunku, wielogenowe rodziny, które mogą tworzyć modułowe sieci biosyntetyczne, w których połączenie różnych modułów enzymatycznych wzdłuż wspólnego schematu umożliwia tworzenie szerokiej gamy związków2,26. Szybkie odkrycie w ostatnich latach funkcjonalnie odrębnych enzymów działających w modułowych szlakach terpenoidowych stworzyło rozszerzające się możliwości ich wykorzystania jako wszechstronnej listy części do inżynierii metabolicznej częściowych lub całkowitych szlaków zarówno w mikrobiologicznych, jak i roślinnych platformach produkcyjnych. Na przykład drożdże (Saccharomyces cerevisiae) zostały z powodzeniem zastosowane do inżynierii wieloenzymatycznych szlaków do wytwarzania bioproduktów terpenoidowych, takich jak lek przeciwmalaryczny artemizynina27, biopaliwa seskwiterpenoidowe bisabolen i farnesene28, ale także wybierz diterpenoidy29,30,31. Podobnie, stworzono zmodyfikowane platformy Escherichia coli do produkcji na skalę przemysłową dla kilku metabolitów diterpenoidowych, w tym taksadenu prekursora Taxol stosowanego jako lek przeciwnowotworowy oraz alkoholu diterpenowego, sclareolu, stosowanego w przemyśle perfumeryjnym13,32,33,34. Postępy w inżynierii genetycznej i technologiach transformacji sprawiły również, że systemy gospodarzy roślin stają się coraz bardziej opłacalne w wytwarzaniu naturalnych produktów roślinnych9,14,35,36. W szczególności bliski krewny tytoniu, Nicotiana benthamiana, stał się szeroko stosowanym podwoziem do analizy i inżynierii szlaków terpenoidowych, ze względu na łatwość transformacji wielu kombinacji genów za pośrednictwem Agrobacterium, wydajną biosyntezę endogennych prekursorów i wysoką biomasę14,35,36.

Opierając się na tych uznanych platformach biosyntezy terpenoidów, opisujemy tutaj łatwe w użyciu i opłacalne metody enzymatycznej produkcji diterpenoidów i oczyszczania pojedynczych związków. Przedstawione protokoły ilustrują, w jaki sposób platformy E. coli i N. benthamiana zaprojektowane do zwiększonej biosyntezy prekursorów diterpenoidów mogą być wykorzystane do kombinatorycznej ekspresji różnych enzymów diTPS i P450 w celu wytworzenia pożądanych związków diterpenoidowych. Zastosowanie tego protokołu do produkcji i oczyszczania strukturalnie różnych diterpenoidów pokazuje przykład wyspecjalizowanych diterpenoidów z kukurydzy (Zea mays), zwanych dolabraleksinami, których endogenna biosynteza rekrutuje dwa diTPS i jeden enzym P450. Oczyszczanie różnych dolabraleksin, od olefin po utlenione pochodne, uzyskuje się następnie poprzez połączenie ekstrakcji w lejku separacyjnym z wielkoskalową chromatografią kolumnową krzemionki i preparatywną chromatografią cieczową pod wysokim ciśnieniem (HPLC). Opisane protokoły są zoptymalizowane pod kątem produkcji diterpenoidów, ale można je również łatwo dostosować do pokrewnych klas terpenoidów, a także innych produktów naturalnych, dla których dostępne są zasoby enzymatyczne. Związki wytwarzane przy użyciu tego podejścia nadają się do różnych dalszych zastosowań, w tym między innymi do charakterystyki strukturalnej za pomocą analizy magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), wykorzystania jako substraty do badań funkcjonalnych enzymów oraz szeregu testów bioaktywności.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Opisane tutaj protokoły obejmują używanie niebezpiecznych substancji chemicznych, ostrych przedmiotów, urządzeń elektrycznych, gorących przedmiotów i innych zagrożeń, które mogą spowodować obrażenia. Należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i przestrzegać odpowiednich procedur bezpieczeństwa, w tym szkoleń w zakresie bezpieczeństwa.

1. Przygotowanie materiałów i roztworów

  1. Przygotować i autoklawować pożywkę bulionową lizogenną (LB) przez 30 minut: Na 1 l pożywki wymieszać 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdży bakteryjnych i 10 g NaCl i rozpuścić w 1 l wody dejonizowanej (DI).
  2. W przypadku 1 l kultur o jednoczesnej ekspresji przygotuj i autoklawuj pożywkę Terrific Bulth (TB) przez 30 minut: W kolbie Erlenmeyera o pojemności 2,8 l wymieszaj 12 g tryptonu, 24 g ekstraktu drożdżowego i 40 ml 10% (v/v) glicerolu i rozpuść w 860 ml wody DI. Przygotować i autoklawować 1,3 l 10x buforu fosforanowego [1,3 l wody demineralizowanej, 30,03 g fosforanu monopotasowego (KH2PO4) i 163,02 g fosforanu dipotasowego (K2HPO4)] i dodać do powyższej pożywki.
  3. Przygotuj bulion Super Optimal z pożywką do tłumienia katabolitów (SOC).
    1. Przygotować i sterylizować w autoklawie przez 30 minut roztwór zawierający 2% (w/v) tryptonu, 0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego bakteryjnego, 8,5 mM NaCl i 2,5 mM KCl.
    2. Dodać sterylnyMgSO4 i glukozę o końcowym stężeniu 20 mM. Użyj 1 M NaOH, aby dostosować się do pH 7,0. Przechowuj nośnik SOC w temperaturze -20 °C.
  4. Przygotować 1 l 1 M pirogronianu sodu. Autoklaw przez 15 minut i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotować 20 ml 1 M izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) w sterylnej wodzie demineralizowanej. Przechowywać 1–2 ml porcji w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotować bufor infiltracyjny: 10 mM MES (1,952 g) i 10 mM MgCl2 (2,033 g) rozpuszczone w 1 l wody demineralizowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Przygotuj i autoklaw agaru LB przez 30 minut: Na 100 ml wody DI dodaj 1 g tryptonu, 0,5 g ekstraktu drożdżowego bakteryjnego, 1 g NaCl i 1,5 g agaru. Gdy agar LB ostygnie na tyle, aby poradzić sobie z butelką, dodaj antybiotyki zgodnie z wymaganiami dla pożądanych kombinacji plazmidów. Wlać płytki agarowe za pomocą szalek Petriego i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    1. Patrz tabela 1 w celu zapoznania się ze specyfikacjami dotyczącymi produkcji związków odpowiednio u E. coli i N. benthamiana. Owinąć płytki zawierające ryfampicynę w folię, aby zapobiec degradacji podczas przechowywania.
Rozdział Rozdział ) Rozdział Rozdział Rozdział )
Stężenie robocze (μg/ml)
antybiotykZapas (mg/ml)rozpuszczalnik1 plazmid2 plazmidy3 lub 4 plazmidy
Karbenicylina50H2O502520
chloramfenikolRozdział 30EtOH (EtOHRozdział 302020
Kanamycyna50H2O502520
SpektynomycynaRozdział 30H2ORozdział 302520
Gentamycyna50H2ORozdział 30
Ryfampicyna10MeOH (Białko MeOH10

Tabela 1: Stężenia antybiotyków dla koekspresji plazmidu u E. coli lub N. benthamiana.

2. Produkcja metabolitów diterpenoidowych w E. coli

UWAGA: Opisany tutaj protokół wytwarzania metabolitów diterpenoidowych u E. coli został zaadaptowany z wcześniej opisanej platformy koekspresji enzymów opracowanej przez grupę dr Reubena J. Petersa (Iowa State University, IA, USA)13,32.

  1. Transformacja kompetentnych komórek za pomocą kombinacji plazmidów.
    1. Rozmrozić chemicznie kompetentne komórki E. coli na lodzie (w tym protokole użyto komórek BL21DE3-C41).
    2. Dodać 1 μl roztworu 100 ng/μl każdego konstruktu użytego do koekspresji do 25 μl kompetentnych komórek w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml. Nie mieszać wirować ani nie mieszać przez pipetowanie.
      UWAGA: Aby uzyskać optymalną ekspresję i aktywność enzymów TPS i P450, należy rozważyć kilka modyfikacji sekwencji. W przypadku TPS usunięcie N-końcowego peptydu pasażowego plastydialnego jest często niezbędne. W szczególności plastydialne mono- i di-TPS zazwyczaj wymagają usunięcia przewidywanego peptydu tranzytowego (przy użyciu wspólnych algorytmów predykcyjnych37), podczas gdy cytozolowy sesqui-TPS może być zwykle używany jako geny o pełnej długości. W odniesieniu do P450, optymalizacja kodonów, a także usunięcie lub zastąpienie sekwencją lidera, MAKKTSSKGK N-końcowej domeny transbłonowej, okazała się skuteczna w wielu przypadkach38,39. Ponadto, podczas koekspresji enzymów P450, należy włączyć reduktazę cytochromu P450 (CPR), aby zapewnić wystarczającą aktywność P450.
    3. Inkubuj mieszaninę na lodzie przez 30 minut. Mieszaj co 10 minut, delikatnie zeskrobując probówkę na stojaku na mikroprobówki.
    4. Wstępnie inkubować pożywkę SOC i płytki agarowe LB w temperaturze 37 °C zawierające antybiotyki, zgodnie z wymaganiami dla pożądanej kombinacji konstruktów.
      UWAGA: Każdy konstrukt, który ma być poddany jednoczesnej transformacji, musi mieć wyraźną oporność na antybiotyki, a także odrębne pochodzenie replikacji, aby zapewnić optymalną ekspresję białka.
    5. Szok termiczny mieszaniny komórek w temperaturze 42 °C przez 1 minutę, a następnie inkubować na lodzie przez co najmniej 2 minuty.
    6. Dodaj 200 μl ciepłej pożywki SOC.
    7. Wstrząsać mieszaniną komórek przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 200 obr./min.
    8. Dodaj około 10 autoklawowanych szklanych kulek do podgrzanej płytki agarowej LB. Dodać 100 μl mieszaniny komórek i założyć pokrywkę. Potrząśnij talerzem poziomo z założoną pokrywką, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Usuń szklane koraliki, stukając nimi do pojemnika na odpady. Alternatywnie można użyć innych preferowanych metod powlekania.
    9. Inkubować płytkę agarową LB w temperaturze 37 °C przez noc z powlekaną powierzchnią skierowaną w dół. Płytka z przekształconymi koloniami E. coli może być używana następnego dnia lub przechowywana w temperaturze 4 °C szczelnie zamknięta w folii parafinowej przez okres do 2 tygodni.
  2. Przygotowanie kultur inokulacyjnych
    1. Następnego dnia przygotować roztwór pożywki LB z antybiotykami wymaganymi dla transformowanej kombinacji plazmidów, stosując stężenia podane w tabeli 1.
    2. W sterylnym kapturze przenieś 5 ml pożywki LB do 15 ml sterylnej szklanej probówki z plastikową, oddychającą nakrętką. Przygotuj jedną małą probówkę hodowlaną dla każdej żądanej dużej (1 l) kultury.
    3. Wybierz poszczególne kolonie E. coli z płytki agarowej LB za pomocą końcówki pipety. Zaszczepić każdą probówkę LB kolonią E. coli, wyrzucając jedną końcówkę pipety zawierającą wybraną kolonię do każdej probówki.
    4. Zakryj każdą probówkę do hodowli inokulacji oddychającą plastikową nasadką. Umieść zamknięte małe kultury E. coli w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C na 12–24 godziny.
  3. Przygotowanie i indukcja kultur koekspresji
    1. Następnego dnia dodać 100 ml przygotowanego 10x buforu fosforanowego do 900 ml przygotowanego TB, aby uzyskać końcowe stężenie buforu fosforanowego 1x. Dodać niezbędne antybiotyki o stężeniach zgodnych z tabelą 1.
    2. Wstrząsać z prędkością 140 obr./min w temperaturze 37 °C, aż będzie ciepły (około 30 min).
    3. Zaszczepić każdą kolbę z pożywką dla 1 l kultur 5 ml kultury do inokulacji. Końcówkę pipety używaną do inokulacji kultur zaszczepiania należy zachować w probówce do zaszczepiania kultur do zaszczepiania, tak aby po ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym w kolejnych etapach nie było ekstrahowanych zanieczyszczeń z tworzywa sztucznego.
    4. Inkubować z wytrząsaniem przy 200 obr./min, aż gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) osiągnie 0,6, około 3 godziny. Aby zmierzyć OD600 za pomocą spektrofotometru, użyj mieszaniny sterylnej gruźlicy z buforem fosforanowym jako ślepej próby.
    5. Przy żądanej średnicy zewnętrznej600 ustaw ustawienia inkubatora na 16 °C.
    6. Podczas koekspresji P450 należy świeżo przygotować ryboflawinę i kwas aminolewulinowy, które są niezbędne do wystarczającej produkcji kofaktora P450. Do każdego eksperymentu przygotuj 4 g/l ryboflawiny i 150 g/l kwasu aminolewulinowego. Roztwór należy przechowywać zawinięty w folię do czasu użycia, ponieważ ryboflawina jest wrażliwa na światło.
    7. Gdy inkubator osiągnie temperaturę 16 °C (około 30 minut), do każdej hodowli dodać 1 ml 1 M IPTG, 1 ml 4 g/l ryboflawiny i 1 ml 150 g/l kwasu aminolewulinowego. Do produkcji diterpenoidów należy dodać 25 ml 1 M pirogronianu sodu do każdej kultury, aby zapewnić wystarczające tworzenie prekursorów.
      UWAGA: Wszystkie konstrukty użyte w tym teście znajdowały się pod tym samym promotorem indukowanym przez IPTG. W razie potrzeby można stosować różne promotory.
    8. Inkubować w temperaturze 16 °C i 140 obr./min przez 72 godziny. Dodawać 25 ml pirogronianu sodu każdego kolejnego dnia po indukcji, jeśli wytwarza się diterpenoidy. Kultury natychmiast użyte są natychmiast używane do ekstrakcji metabolitów w lejku separatorowym; Nie zbieraj ani nie przechowuj kultur.

3. Separacja i oczyszczanie metabolitów

  1. Ekstrakcja metabolitów w lejku separatorowym
    UWAGA: W przypadku stosowania rozpuszczalników organicznych ważne jest, aby używać wyłącznie szklanych naczyń i szklanych pipet, aby zapobiec zanieczyszczeniu plastyfikatorem.
    1. W dygestoriach przymocować rozdzielacz do stojaka pierścieniowego. Umieścić zlewkę na odpady pod rozdzielaczem.
    2. Wlać 500 ml octanu etylu/heksanów w proporcji 50/50 (v/v) do rozdzielacza separatora.
      UWAGA: Mieszaninę rozpuszczalników należy dostosować w oparciu o rozpuszczalność i polarność docelowych metabolitów. Należy unikać rozpuszczalników mieszających się z wodą, aby zapewnić odpowiednią separację faz.
    3. Dodać 500 ml kultury E. coli do rozdzielacza i umieścić na szklanym korku.
    4. Potrząśnij lejkiem, aby wymieszać kulturę z rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym, około 5–10 razy. Często odgazowuj lejek, otwierając króciec, podczas gdy lejek jest trzymany do góry nogami i skierowany do dygestoria w celu uwolnienia ciśnienia. Powtórz procedurę wytrząsania i odgazowywania 2x.
    5. Umieść lejek pionowo na stojaku pierścieniowym i poczekaj, aż warstwa rozpuszczalnika (na górze) oddzieli się od warstwy wodnej (hodowlanej) (na dole), około 1 min.
      UWAGA: Gdy w interfazie obserwuje się dużą ilość pęcherzyków, można dodać niewielką objętość 5–10 ml EtOH w celu poprawy separacji faz.
    6. Usuń korek. Odcedź warstwę E. coli do zlewki na odpady, zatrzymując warstwę rozpuszczalnika w lejku.
    7. Powtórzyć procedurę, używając pozostałych 500 ml kultury E. coli i tych samych 500 ml rozpuszczalnika, które użyto do pierwszej ekstrakcji.
    8. Odcedzić rozpuszczalnik zawierający wyekstrahowane metabolity do czystej kolby. Unikać zanieczyszczenia kulturą E. coli.
  2. Stężenie parowania obrotowego
    1. Przygotować urządzenie do odparowywania rotacyjnego (rotovap): napełnić łaźnię wodną i ustawić temperaturę na 25 °C. W przypadku związków wrażliwych na ciepło użyj niższego ustawienia temperatury lub dodaj lód do łaźni wodnej. Napełnij komorę kondensacyjną suchym lodem i ustaw prędkość obrotową na 60–80 obr./min.
    2. Dodać około 700 ml wyekstrahowanych metabolitów do kolby odparowującej o pojemności 1 l, podłączyć do rotovapu i zanurzyć do łaźni wodnej. Włączyć grzałkę łaźni wodnej i ustawić ją na 25 °C.
    3. Rozpocząć obrót kolby parownika, włączyć system próżniowy i stopniowo zwiększać ssanie, aby uniknąć szybkiego wrzenia roztworu metabolitu do kolby odpadowej. Odparowany rozpuszczalnik powinien zacząć się skraplać i kapać do kolby zbierającej kondensat (odpadów).
    4. Gdy w kolbie odparowującej pozostało tylko kilka ml roztworu metabolitu, należy zatrzymać obroty i wyłączyć system próżniowy. Podnieś kolbę parownika i obniż ciśnienie, zamykając przewód próżniowy. Zachować stężony roztwór metabolitu pozostający w kolbie odparowującej. Wyrzuć odpady do pojemnika na odpady.
    5. Kontynuować odparowywanie rotacyjne, dodając do kolby odparowującej do 700 ml dodatkowego wyekstrahowanego roztworu metabolitu. Powtarzać proces, aż cały wyekstrahowany roztwór metabolitu zostanie zagęszczony.
    6. Usunąć skoncentrowane metabolity z kolby odparowującej, przenosząc szklaną pipetą do nowej probówki. Przepłukać kolbę parownika 5 ml octanu etylu/heksanów w proporcji 50/50 (v/v) lub dwukrotnie żądaną mieszaniną rozpuszczalników, przenosząc roztwór płuczący do probówki.
    7. Skoncentrowane metabolity należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C (w zależności od stabilności produktu) do czasu dalszego użycia.
  3. Oczyszczanie kolumny krzemionkowej
    1. Przygotować naczynia szklane, przepłukując zlewkę o pojemności 1 l, szklany lejek, probówki o pojemności 50 ml i kolumnę chromatograficzną o pojemności 3,2 l (wyposażoną w szklaną osłonę) raz heksanem, a raz octanem etylu. Oznacz probówki o pojemności 50 ml, które będą używane do zbierania frakcji.
    2. Dodać 2 litry żelu krzemionkowego (230–400 mesh, klasa 60) do 3,2 l kolumny chromatograficznej o pojemności 2 l i spiekanym krążku, a następnie załadować piasek, aby utworzyć 5 cm warstwę na górze kolumny.
    3. Przygotować kolumnę do chromatografii, przepłukując ją dokładnie 2 litrami heksanu. Przez cały czas nad warstwą piasku kolumny powinna znajdować się cienka (~0,5 cm) warstwa płynnego rozpuszczalnika, aby zapewnić, że kolumna nie wyschnie ani nie uzyska kieszeni powietrznych. Szklany adapter wlotowy podłączony do węża powietrznego może być użyty do delikatnego zwiększenia natężenia przepływu przez kolumnę, a nie tylko grawitacji.
    4. Załadować skoncentrowany ekstrakt metabolitowy (patrz sekcja 3.2) do kolumny. Przepłucz butelkę, w której znajdowała się próbka, 3 razy heksanem i dodaj do kolumny, aby upewnić się, że cała próbka została przeniesiona.
    5. Korzystając z poniższego gradientu, załaduj jednorazowo 100 ml i zbierz 50 ml frakcji w oznakowanych probówkach: 100% heksanów 3x, 10% (v/v) octan etylu w heksanach 3x, 12,5% (v/v) octan etylu w heksanach 3x, 15% (v/v) octan etylu w heksanach 3x, 20% (v/v) octan etylu w heksanach 3x, 40% (v/v) octan etylu w heksanach 3x, 60% (v/v) octan etylu w heksanach 3x i 100% octan etylu 4x,
      UWAGA: Gradient należy dostosować w zależności od wielkości i polaryzacji związku oraz pożądanej separacji.
    6. Za pomocą szklanej pipety przenieść 1 ml z każdej frakcji do oznaczonej fiolki GC. Analizuj każdą próbkę za pomocą GC-MS w celu określenia, które frakcje zawierają pożądane metabolity i ich poziom czystości.
      UWAGA: Metoda GC-MS odpowiednia dla metabolitów wytwarzanych tą metodą została opisana w Mafu et al. 201839. Krótko mówiąc, wszystkie analizy przeprowadzono na GC z detektorem XL MS przy użyciu kolumny HP-5MS (patrz tabela materiałów), objętości próbki 1 μL i rampie temperatury pieca od 50 °C do 300 °C przy 20 °C min-1.
    7. Po ustaleniu, które frakcje zawierają interesujący związek, połącz wszystkie frakcje, które zawierają ten sam związek. Frakcje, które nie zawierają żadnych związków, należy prawidłowo wyrzucać do pojemnika na odpady. Powtórzyć procedurę odparowywania rotacyjnego, jeśli jest to konieczne do zagęszczenia oczyszczonych metabolitów.
    8. Jeśli konieczne jest dodatkowe oczyszczanie, należy użyć (pół)preparatywnej HPLC w celu poprawy czystości produktu. Protokoły HPLC powinny być dostosowywane w oparciu o indywidualne specyfikacje sprzętu i związki będące przedmiotem zainteresowania.
      1. Zawiesić wysuszone próbki chromatografii krzemionkowej w 1 ml heksanu (węglowodory diterpenowe) lub acetonitrylu (utlenione diterpenoidy) i przefiltrować przez strzykawkę filtrującą, aby zapobiec zanieczyszczeniu małymi cząstkami.
      2. W przypadku diterpenoidów niepolarnych należy użyć kolumny CN (patrz tabela materiałów) o zalecanym natężeniu przepływu 1 ml/min i gradiencie heksanu:octanu etylu, z frakcjami zbieranymi co 1 minutę.
      3. W przypadku diterpenoidów polarnych należy użyć kolumny C18 (patrz tabela materiałów) o zalecanym natężeniu przepływu 3 ml/min i gradientu acetonitryl:woda, z frakcjami zbieranymi co 1 minutę.
      4. Wysuszyć wszystkie oczyszczone frakcje HPLC pod strumieniem azotu i ponownie zawiesić w 1 ml heksanu przed analizą GC-MS w celu oceny obfitości i czystości produktu.

4. Produkcja metabolitów diterpenoidowych przy użyciu N. benthamiana

UWAGA: Opisany tutaj protokół wytwarzania metabolitów diterpenoidowych u N. benthamiana został zaadaptowany z wcześniej zgłoszonych badań35,36,40,41. Poniższy protokół jest specyficzny dla infiltracji strzykawką liści N. benthamiana. Inne metody infiltracji, takie jak infiltracja próżniowa, są równie odpowiednie. Binarne systemy wektorów T-DNA, takie jak pCAMBIA130035Su (pLIFE33) lub pEAQ-HT40,41,42, które umożliwiają rozmnażanie w E. coli i A. tumefaciens oraz ekspresję genów w żywicielach roślin, są odpowiednie dla tego protokołu.

  1. Sadzenie Nicotiana benthamiana
    1. Napełnij jedną doniczkę o pojemności 750 ml ziemią doniczkową i podlej doniczkę. Dodaj ~20 nasion tytoniu i delikatnie postukaj palcem, aby znalazły się w glebie. Nie przykrywać ziemią.
      UWAGA: Nasiona mogą być generowane przez samozapylenie w celu rozmnażania nasion. Nasiona do tego eksperymentu zostały uzyskane z Wydziału Biologii Roślin Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis i są publicznie dostępne w repozytorium plazmy zarodkowej USDA (https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail.aspx?id=1450450).
    2. Pozostaw doniczkę w komorze wzrostowej w następujących warunkach, podlewając co drugi dzień, aby gleba nie wyschła. Uprawiaj rośliny w temperaturze 26 °C i wilgotności 60% w cyklu dzień-noc 16:8 h dla wszystkich etapów tego protokołu.
    3. Po 1 tygodniu napełnij ~20 doniczek ziemią doniczkową i podlej doniczki. Za pomocą kleszczy chwyć sadzonkę tytoniu za łodygę i delikatnie wyjmij ją z doniczki źródłowej, umieszczając po jednej sadzonce w każdej nowej doniczce i ostrożnie zadziorując korzenie. Nie uszkadzaj liści ani korzeni.
    4. Podlewaj rośliny co drugi dzień, umieszczając wodę w tacy, w której znajdują się doniczki (zwane również "podlewaniem od dołu"). Co czwarte podlewanie dodaj do wody nawóz generyczny zgodnie z instrukcją na opakowaniu.
  2. Transformacja zamrażalno-rozmrażająca kompetentnych komórek szczepu Agrobacterium tumefaciens GV3101
    1. Rozmrozić Agrobacterium tumefaciens szczep GV3101 (lub inny preferowany szczep) kompetentne komórki na lodzie (~1 h). Wstępnie schłodzić probówki mikrowirówkowe o pojemności 0,2 ml na lodzie. Ciepły nośnik SOC w temperaturze 28 °C.
    2. Delikatnie wymieszać komórki końcówką pipety (NIE pipetować w górę i w dół) i poddzielić 15 μl komórek na każdą przemianę w schłodzone mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodaj 1-5 μl (~400 ng) DNA do każdej probówki z kompetentnymi komórkami i delikatnie wymieszaj, skrobając probówkę wzdłuż stojaka na probówki.
      UWAGA: Pożądane konstrukty nie muszą mieć różnej oporności na antybiotyki, ponieważ każdy z nich jest przekształcany oddzielnie i zostanie zmieszany przed infiltracją.
    4. Umieść mikroprobówki w ciekłym azocie na 5 minut.
    5. Wyjmij mikroprobówki z ciekłego azotu i umieść probówki na stojaku do pomiaru temperatury pokojowej. Rozmrażaj probówki przez 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    6. Dodać 250 μl wstępnie podgrzanego (28 °C) SOC do każdej mikroprobówki. Wstrząsać w temperaturze 28–30 °C, 225 obr./min, przez 3 godziny.
    7. Umieścić 50 μl przekształconych komórek na płytkach agarowych LB zawierających niezbędne antybiotyki opisane w tabeli 1 przy użyciu sterylnych szklanych kulek, jak opisano w kroku 2.1.8.
    8. Inkubować płytki odwrócone w temperaturze 28–30 °C przez 48 godzin. Wzrost w ciągu 1dnia inkubacji może być oznaką zanieczyszczenia. Przekształcone A. tumifaciens mogą być stosowane po 2-dniowej inkubacji lub przechowywane w temperaturze 4 °C szczelnie zamknięte w folii parafinowej przez okres do 2 tygodni.
  3. Koekspresja przejściowych enzymów za pośrednictwem Agrobacterium u Nicotiana benthamiana
    1. Przycinaj 4-tygodniowe rośliny Nicotiana benthamiana 2 dni przed infiltracją, usuwając dolne liście. Pozostaw 4 najwyższe liście. Podlewaj rośliny. Nie podlewaj roślin na 24 godziny przed infiltracją, aby umożliwić otwarcie aparatów szparkowych i łatwiejszą infiltrację.
    2. Dodać 10 ml LB o stężeniach roboczych odpowiednich antybiotyków dla wybranych konstruktów i szczepu Agrobacterium (opisanego w Tabeli 1) do 50 ml sterylnej szklanej probówki z foliową pokrywką.
    3. Zaszczepić za pomocą końcówki pipety, aby pobrać wymaz z pojedynczej kolonii przekształconego Agrobacterium i wyrzucić końcówkę do pożywki LB. Każdy transformant Agrobacterium powinien mieć co najmniej 2 małe kultury.
    4. Inkubować przez noc w temperaturze 28 °C i 220 obr./min.
    5. Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) kultur nocnych za pomocą spektrofotometru. Rozcieńczyć kultury na noc do OD600 1,
      UWAGA: Optymalne wartości OD600 mogą się różnić w przypadku stosowania innych szczepów Agrobacterium.
    6. Rozprowadzić 10 ml rozcieńczonej kultury przez noc do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
    7. Zebrać bakterie przez odwirowanie z prędkością 3500 obr./min przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odlać i wyrzucić supernatant.
    8. Ponownie zawiesić kultury w 10 ml buforze infiltracyjnym, delikatnie potrząsając probówką i zwijając na stojaku na probówki. OD600 powinno być równe 1 dla każdej konstrukcji.
    9. Wygeneruj pożądane kombinacje dla infiltracji, łącząc równe objętości każdej przekształconej linii komórkowej. OD600 powinien być równy 1 dla każdej infiltracji. Oszacuj 5 ml roztworu infiltracyjnego na liść, 2 liście na roślinę.
    10. Przymocuj rurki poziomo do bujaka i delikatnie kołysz przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    11. Naciekać ~ 2 liście na roślinę N. benthamiana, używając około 5 ml mieszaniny infiltracyjnej na liść. Naciekaj zdrowe liście za pomocą bezigłowej strzykawki na spodniej stronie liści, wywierając jednocześnie przeciwny nacisk palcem na górną stronę liścia, aby upewnić się, że roztwór infiltracyjny wypełni tkankę liścia.
    12. Zaznacz wszystkie naciekane liście czarnym markerem lub innym wskaźnikiem. Umieść infiltrowane rośliny w komorze wzrostowej na 5 dni. Utrzymuj rośliny dobrze podlewane.
      UWAGA: Czas inkubacji wynoszący pięć dni okazał się wystarczający do osiągnięcia poziomów diterpenoidów wystarczających dla większości dalszych analiz, przy jednoczesnym zachowaniu efektywności czasowej tworzenia produktu. Można testować dłuższe okresy inkubacji, gdzie wymagane są większe ilości produktu.
  4. Ekstrakcja i oczyszczanie metabolitów z przekształconej Nicotiana benthamiana
    1. Zbierz naciekane liście z roślin, przycinając je z rośliny. Dodaj ~100 ml ciekłego azotu i pojedynczy liść do moździerza, a następnie zmiel za pomocą moździerza i tłuczka lub młynka do bibułek, aż do uzyskania drobnego proszku.
    2. Dodać sproszkowaną tkankę do fiolki GC-MS w celu rozgraniczenia 500 μl. Dodać 1,5 ml octanu etylu/heksanu w proporcji 50/50 (v/v) lub żądanej mieszaniny rozpuszczalnika do fiolki i szczelnie zakręcić.
      1. W przypadku ekspresji, które zostały przetestowane w celu dostarczenia pożądanych produktów, zmiel tkankę w większej kolbie lub probówce, a następnie dodaj ~2x więcej rozpuszczalnika niż objętość tkanki i wstrząśnij przez noc. Przejdź do kroku 4.4.5 w celu oczyszczenia.
    3. Umieść wszystkie fiolki w stojaku na mikroprobówki i mocno przyklej taśmą, aby zabezpieczyć. Ekstrakt pod energicznym wstrząsaniem przez noc w temperaturze pokojowej.
    4. Przenieść 400 μl ekstraktu i 600 μl heksanu do świeżej fiolki GC-MS. Nie należy podwielokrotniać żadnej tkanki liścia. Analizować próbki za pomocą GC-MS przy użyciu metody opisanej w kroku 3.3.6.1.
    5. Po przeprowadzeniu analizy za pomocą GC-MS na obecność pożądanych metabolitów, zebrać ekstrakty z liści razem i przejść przez odparowanie rotacyjne, chromatografię kolumnową krzemionki i HPLC w celu uzyskania czystych związków, jak opisano w sekcjach 3.2 i 3.3.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczny przepływ pracy dla produkcji diterpenoidów z wykorzystaniem E. coli
Rysunek 1 ilustruje opisany przebieg produkcji diterpenoidów. Przedstawiony tutaj protokół został zaadaptowany z wcześniej opisanej platformy E. coli do biosyntezy diterpenoidów13,32 do stosowania kultur o większej objętości i oczyszczania pożądanych produktów diterpenoidowych za pomocą chromatografii krzemionkowej. Aby zademonstrować zastosowanie tego protokołu, użyliśmy niedawno zidentyfikowanego szlaku dolabraleksyny z kukurydzy, który składa się z dwóch diTPS, ZmAN2 (Zm00001d029648) i ZmKSL4 (Zm00001d032858), wielofunkcyjnego P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134) i reduktazy cytochromu P450 (ZmCPR2, Zm00001d026483) (Rysunek 2). Krótko mówiąc, kompetentne komórki E. coli BL21DE3-C41 zostały wstępnie przekształcone za pomocą plazmidów pCDFDuet:IRS i pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 class<="xref">13,32. Plazmid pCDFDuet:IRS zawiera kluczowe enzymy do produkcji prekursorów diterpenoidów, w tym syntazę 1-deoksy-D-ksylulozo-5-fosforanu (dxs), reduktazę 1-deoksy-D-ksylulozo-5-fosforanową (dxr) i izomerazę izopentenylodifosforanu (idi) i wykazano, że zwiększa tworzenie diterpenoidów w E. coli13. Plazmid pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 zawiera syntazę difosforanu węgla ent-kopalylu ZmAN2 i syntazę GGPP z Abies grandis. Enzymy katalizujące zaangażowane reakcje w biosyntezie dolabraleksyny zostały następnie przekształcone w plazmidy pET28b:ZmKSL4 i pETDUET:ZmCPR2/ZmCYP71Z18. Szczegółowe informacje na temat sekwencji i konstruktów plazmidów można znaleźć w Mafu et al. 201839.

Chromatogram GC-MS ekstrahowanych produktów enzymatycznych jest pokazany w Rysunek 3A, ilustrujący powstawanie trzech związków dolabraleksyny, a mianowicie dolabradienu (kultura 1,2 ± 0,25 mg/L), epoksydolabrenu (kultura 0,65 ± 0,2 mg/L) i epoksydolabranolu (hodowla 11,4 ± 1,1 mg/L), jak określono ilościowo na podstawie krzywej wzorcowej przy użyciu sklarareolu diterpenoidowego. Jako wzorzec odniesienia zastosowano sclareol, ze względu na podobną budowę i właściwości chemiczne w porównaniu do dolabraleksin. Zazwyczaj obserwowane drobne produkty uboczne obejmują chloramfenikol, pochodne indolu oksyndol i indolo-5-aldehyd oraz prekursor difosforan geranylgeranylu (GGPP) (Rysunek 3). Indol zwykle stanowi główny produkt uboczny, ale nie jest tutaj pokazany, ze względu na jego czas retencji krótszy niż ustawione opóźnienie rozpuszczalnika wynoszące 7 minut, aby zachować integralność instrumentu GC-MS.

Schematyczny przebieg produkcji diterpenoidów przy użyciu N. benthamiana
Rysunek 4 przedstawia przegląd ekspresji szlaku dolabraleksyny u N. benthamiana. Dla opisanych tutaj produktów następujące konstrukty zostały przekształcone oddzielnie w szczep A. tumefaciens GV3101: pLife33:p19 (wyrażający białko supresorowe wyciszające gen p19), pLife33:ZmCYP71Z18, pLife33:ZmAN2, pLife33:ZmKSL4. Pełnowymiarowe natywne sekwencje genów szlaku dolabraleksyny kukurydzy zastosowano w binarnym wektorze T-DNA pLife3341 z opornością na kanamycynę do namnażania w E. coli i A. tumefaciens. Jednoczesna ekspresja genów szlaku terpenoidowego jest opcjonalna, ponieważ prekursor difosforan geranylgeranylu jest endogennie tworzony w N. benthamiana. Jednak w kilku badaniach z powodzeniem zastosowano takie podejścia w celu zwiększenia tworzenia diterpenoidów u N. benthamiana14,36,41. Jak pokazano w Rysunek 3, koekspresja z powodzeniem wytworzyła dolabradien i 15,16-epoksydolabren. W przeciwieństwie do koekspresji enzymu w E. coli, 15,16-epoksydolabranol nie został wykryty w ekstraktach metabolitów.

Obecność 15,16-epoksydolabrenu w ekstraktach z liści wykazała aktywność CYP71Z18 u N. benthamiana. Ponieważ wykazano, że 15,16-epoksydolabranol jest stabilny po ekstrakcji z kultur mikrobiologicznych (Rysunek 3), a także po izolacji z tkanek korzenia kukurydzy w poprzednich badaniach39, wydaje się prawdopodobne, że hydroksylowany produkt jest glikozylowany przez endogenne glikozylotransferazy, a następnie sekwestrowany w wakuoli, co czyni go niedostępnym do ekstrakcji za pomocą mieszanin rozpuszczalników organicznych użytych tutaj do ekstrakcji36,43,44,45,46. Podobne niepożądane modyfikacje produktu w kontekście inżynierii ścieżki u N. benthamiana zostały zgłoszone w poprzednich badaniach47. Jak wykazano w przypadku koekspresji u E. coli, przejściowa ekspresja u N. benthamiana powoduje ekstrakcję kilku produktów ubocznych, w tym liniowych alkanów o różnej długości łańcucha, na podstawie porównania z referencyjnymi bazami danych widm mas. Stwierdzono, że miana związków ekstrahowanych z materiału liściowego wynoszą średnio 2,4 +/- 0,5 mg dolabradienu i 0,9 +/- 0,3 mg 15,16-epoksydolabrenu na g suchej tkanki liścia. Miana te nie mogą być bezpośrednio porównane z systemem koekspresji E. coli, biorąc pod uwagę różne konfiguracje eksperymentalne.

Oczyszczanie diterpenoidów
Oczyszczanie diterpenoidów uzyskano za pomocą chromatografii kolumnowej krzemionki, a następnie półpreparatywnej HPLC. Ekstrakty metabolitów z 12 l zbiorczych kultur E. coli oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej krzemionki w celu oddzielenia trzech ogniskowych związków dolabraleksyny (Rysunek 3A). Chromatografia krzemionkowa jest idealna do osiągnięcia wysokiej czystości związków docelowych, ponieważ umożliwia proste oddzielenie olefin diterpenowych i utlenionych pochodnych oraz łatwo usuwa główne zanieczyszczenie, oksydol, który jest zatrzymywany na matrycy krzemionkowej (Rysunek 3A).

figure-results-1
Rysunek 1: Proces produkcji diterpenoidów w E. coli i oczyszczanie metabolitów z płynnych kultur bakterii. Przerywane pola przedstawiają opcjonalne kroki, w których wymagane jest dodatkowe oczyszczanie. (A) Reprezentatywny obraz wyekstrahowanej kultury E. coli przy użyciu rozdzielacza. (B) Reprezentatywny obraz oczyszczania ekstraktu metabolitu za pomocą chromatografii krzemionkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Szlak biosyntezy dolabraleksyny i konstrukty genów wykorzystane w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wyniki GC-MS. Pokazano reprezentatywne chromatogramy GC-MS oczyszczonych produktów diterpenoidowych otrzymanych przy użyciu testów koekspresji enzymów w (A) E. coli i (B) N. benthamiana. Identyfikacja produktów opiera się na porównaniach z autentycznymi wzorcami i referencyjnymi widmami masowymi z biblioteki widm masowych National Institute of Standards and Technology (NIST). 1, oksydol; 2, indolo-5-aldehyd; 3, pirolo[1,2-a]pirazyno-1,4-dion, heksahydro-3-(2-metylopropylo)-; 4,6-O-acetylo-1-[[4-bromofenylo]tio]-a-d-glukozyd S,S-dwutlenek; 5, dolabradien; 6,15,16-epoksydolabren; 7, pirolo[1,2-a]pirazyno-1,4-dion, heksahydro-3-(fenylometylo)-; 8,15,16-epoksydolabranol; 9 i 12, nieznane; 10, chloramfenikol; 11, 3,7,11,15-tetrametylo-2-heksadecen-1-ol; 13-16, alkany. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 4: Produkcja diterpenoidów u N. benthamiana. (A) Przebieg produkcji diterpenoidów u N. benthamiana i oczyszczanie metabolitów z materiału liściowego. (B) Reprezentatywny obraz roślin N. benthamiana gotowych do eksperymentów infiltracyjnych przed przycinaniem. (C) Reprezentatywne zdjęcia roślin N. benthamiana po przycięciu. (D) Obraz liści naciekanych strzykawką. Ciemniejsze obszary zostały zinfiltrowane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szersze badania i zastosowanie naturalnych produktów diterpenoidowych wymaga prostych, niedrogich protokołów syntezy i oczyszczania wystarczających ilości pożądanych związków. Szybki wzrost liczby dostępnych enzymów metabolicznych diterpenoidów z szerokiego zakresu gatunków zapewnia obecnie ekspansywny inwentarz dla enzymatycznej produkcji diterpenoidów przy użyciu mikrobiologicznych i roślinnych systemów gospodarzy. Ponadto modułowa architektura wielu szlaków diterpenoidowych umożliwia wykorzystanie enzymów z tego samego lub różnych gatunków w podejściach inżynierii kombinatorycznej "plug & play" w celu wygenerowania szeregu naturalnych i nowych naturalnych produktów diterpenoidowych podobnych do natury 2,14,26,35.

E. coli jest preferowanym gospodarzem mikrobiologicznym do biosyntezy produktów naturalnych ze względu na swoją solidność, łatwość skalowania, ograniczoną złożoność chemiczną w celu zmniejszenia zanieczyszczenia produktami ubocznymi oraz bogactwo dostępnych narzędzi do optymalizacji składania i ekspresji DNA. Z naszego doświadczenia wynika, że opisana tutaj platforma doskonale nadaje się do wytwarzania produktów o wydajności do kilkuset mg olefin diterpenowych i alkoholi, co nadaje się do wielu dalszych zastosowań, w tym tych proponowanych tutaj. Chociaż opisana tutaj platforma produkcyjna nie spełnia wymogów skali przemysłowej, może służyć jako podstawa do dalszej optymalizacji szlaku, gospodarza i fermentacji, co z powodzeniem wykazano w przypadku pokrewnych diterpenoidów, takich jak taksadien i sclareol33,34. Nadmierna ekspresja ograniczających szybkość genów szlaku MVA lub MEP została z powodzeniem ustalona, aby przezwyciężyć czynniki ograniczające wydajność biosyntezy diterpenoidów, takie jak niewystarczająca podaż prekursorów i przepływ prekursorów do konkurencyjnych szlaków 13,32,33,39. Chociaż udowodniono sukces w kilku badaniach, słaba ekspresja i aktywność katalityczna terpenoidowo-metabolicznych eukariotycznych P450 i innych enzymów związanych z błoną w E. coli jest prawdopodobnym czynnikiem ograniczającym 33,39,48,49,50,51,52. Zastosowanie sekwencji zoptymalizowanych pod kątem kodonów i modyfikacji białek, takich jak usunięcie peptydu sygnałowego retikulum endoplazmatycznego lub wprowadzenie plastydialnego peptydu sygnałowego, okazało się przydatne w zwiększaniu rozpuszczalnej ekspresji P450 14,38,49,50,53. Takie modyfikacje zastosowano również do koekspresji mikrobiologicznej kukurydzyCYP71Z18 39 wykorzystanej jako przykładowa ścieżka w tym badaniu. Opisane protokoły opierają się na wykorzystaniu plazmidów przenoszących jeden lub dwa geny na konstrukt, wszystkie pod tym samym indukowalnym promotorem. Tam, gdzie pożądane są kombinacje genów na większą skalę, zaleca się stosowanie różnych dostępnych kaset wielogenowych lub systemów układania genów w celu złagodzenia zmniejszonej wydajności transformacji i wzrostu kultur z powodu stosowania wielu plazmidów i antybiotyków13.

Wraz z szerszą dostępnością zasobów genetycznych i genomicznych, systemy gospodarzy roślin stają się również coraz bardziej odpowiednie do wytwarzania produktów naturalnych. Do zalet należy zdolność roślin do wytwarzania wymaganych naturalnych prekursorów zasilanych przez fotosyntezę, umożliwiając w ten sposób tworzenie produktu bez konieczności uzupełniania cząsteczek prekursorowych54,55. N. benthamiana jest już szeroko stosowana do charakterystyki funkcjonalnej in vivo i kombinatorycznej ekspresji terpenoidów i innych naturalnych szlaków produktów 14,35,36,40. Godne uwagi zalety stosowania N. benthamiana jako systemu gospodarza obejmują endogenną produkcję prekursorów diterpenoidów, wykorzystanie natywnych sekwencji genów, uproszczoną ekspresję eukariotycznych P450, łatwość kombinatorycznej transformacji genów (ponieważ oddzielne antybiotyki nie są wymagane do przejściowej kotransformacji) oraz prostą ekstrakcję produktów docelowych z materiału liściowego. W razie potrzeby produkcja diterpenoidów może zostać zwiększona poprzez koekspresję kluczowych genów szlaku MEP w celu zwiększenia podaży prekursorów36,41. Ograniczenia dla skalowalnej produkcji diterpenoidów u N. benthamiana są bardziej złożone w porównaniu z płynnymi kulturami drobnoustrojów ze względu na potrzebę wytworzenia wystarczającej ilości biomasy roślinnej, bardziej pracochłonne oczyszczanie produktu z chemicznie złożonej tkanki roślinnej oraz możliwe niepożądane metabolizowanie produktów docelowych poprzez na przykład utlenianie, glikozylację lub defosforylację przez enzymy endogenne 36,43,44,45Rozdział 46,47. Procedurę tę można jednak zwiększyć do ilości mg produktu poprzez zwiększenie liczby roślin wykorzystywanych do agroinfiltracji56.

Opisane tutaj protokoły ekstrakcji i oczyszczania produktu są kompatybilne z E. coli i N. benthamiana, a także S. cerevisiae i innymi roślinnymi lub mikrobiologicznymi systemami gospodarza i zapewniają ekonomiczne podejście, które jest łatwe do skonfigurowania zarówno w laboratoriach biologicznych, jak i chemicznych i nie wymaga drogiego sprzętu do oczyszczania. Ekstrakcja metabolitów za pomocą lejka separacyjnego doskonale nadaje się do wydajnej ekstrakcji i separacji faz przed oczyszczaniem chromatograficznym. Rozmiary lejków można łatwo dostosować, aby umożliwić większe objętości hodowli i skrócić czas eksperymentu potrzebny do ekstrakcji z dużych kultur. Stwierdziliśmy, że zastosowanie gradientu heksanu/octanu etylu jest idealne do ekstrakcji diterpenoidów o różnej polarności, jak pokazano tutaj dla grupy dolabraleksyn, które obejmują zarówno związki węglowodorowe, jak i utlenione (ryc. 3). W zależności od właściwości produktów docelowych korzystne mogą być inne mieszaniny rozpuszczalników. Rozpuszczalniki nie mogą jednak mieszać się z wodą, aby zapewnić pomyślną ekstrakcję i separację faz przy użyciu techniki rozdzielacza rozdzielającego. Ponadto przy stosowaniu tego podejścia do wytwarzania lotnych związków organicznych (LZO), takich jak mono- i seskwiterpenoidy o niższej masie cząsteczkowej oraz inne LZO, należy wziąć pod uwagę straty produktu w wyniku parowania. Chromatograficzne rozdzielanie diterpenoidów o różnym stopniu natlenienia przy użyciu kolumny krzemionkowej na większą skalę (~ 2 l) było korzystne z naszego doświadczenia, ponieważ zapewnia lepszą separację produktów i minimalizuje potrzebę iteracyjnych etapów oczyszczania przy użyciu mniejszych objętości kolumn. Objętości kolumn i matryce można dostosować w zależności od potrzeb do żądanej objętości kultury i rodzaju produktu naturalnego. Czystość produktów docelowych, którą można osiągnąć za pomocą tego protokołu, jest odpowiednia dla wielu dalszych zastosowań, takich jak testy bioaktywności lub do wykorzystania w analizach aktywności enzymów. Jednak tam, gdzie wymagane są wyższe poziomy czystości, takie jak analizy strukturalne za pomocą NMR, czystość produktu można skutecznie zwiększyć poprzez dodatkowe oczyszczanie za pomocą (pół)preparatywnej HPLC.

Ten opisany tutaj protokół został zoptymalizowany pod kątem produkcji naturalnych produktów diterpenoidowych, ale można go również łatwo dostosować do pokrewnych mono-, sesqui- i tri-terpenoidów, a także innych naturalnych klas produktów po prostu poprzez wygenerowanie pożądanych modułów enzymatycznych do ekspresji kombinatorycznej14,57. Należy jednak wziąć pod uwagę modyfikacje procedur ekstrakcji i oczyszczania produktów w przypadku związków o wyższej lotności, takich jak mono- i seskwiterpenoidy, lub o wyższej polarności i modyfikacji funkcjonalnej, czego przykładem jest glikozylacja wielu triterpenoidów, fenylopropanoidów i innych klas produktów naturalnych.

Chociaż dostępne są platformy na skalę przemysłową do wytwarzania produktów naturalnych, opisane tutaj protokoły oferują niedrogie, konfigurowalne narzędzie, które można łatwo skonfigurować w większości laboratoriów. Jak wykazano na przykładzie produkcji dolabraleksyn kukurydzianych w tym kraju i gdzie indziej39 , ilości i czystość produktu, które można osiągnąć przy zastosowaniu tego podejścia, są zazwyczaj wystarczające, aby ułatwić różne dalsze analizy i zastosowania, w tym między innymi różne badania bioaktywności, analizę interakcji między organizmami, a także do wykorzystania jako substraty enzymatyczne lub jako materiał wyjściowy w metodach półsyntezy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy Dr. Reubenowi Petersowi (Iowa State University, USA) za dostarczenie konstruktów pIRS i pGGxZmAN2. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe dla tej pracy przez NSF Plant-Biotic Interactions Program (grant # 1758976 dla P.Z.), DOE Early Career Research Program (grant# DE-SC0019178 dla P.Z.), DOE Joint Genome Institute Community Science Program (grant# CSP2568 dla P.Z.), NSF Graduate Research Fellowship Program (dla K.M.M.) oraz stypendium UC Davis Dean's Mentorship Award (dla K.M.M.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1020 tacekSzklarnia MegastoreCN-FLHD
Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowySigmaM8250-500gMES
4 "Tech Square PotMcConkey Hurtownia dostaw dla hodowcówJMCTS4
5977 Ekstraktor XL MS
GCAgilent-Acetonitryl
Sigma271004
AgarFisherBP1423-2
Ekstrakt z drożdży bakteryjnychFisherBP9727-2
ZlewkaCTechGlassBK-2001-015B
Nasadka, śruba niebieska 9 mm, PFTEAgilent5185-5820GC Nasadka na fiolkę
KarbenicylinaGenesee25-532Carb
ChloramfenikolFisher50247423Kolumna
chromatografiiCTechGlassCL-0015-022
Przezroczysta kopuła wilgotnościSzklarnia MegastoreCN-DOME
ColiRollers Koraliki galwaniczneSigma71013Koraliki szklane
CoorsTek Moździerze porcelanoweZaprawa Fisher12-961A
CoorsTek Porcelana TłuczkiFisher12-961-5ATłuczek
Chlorowodorek kwasu delta-aminolewulinowegoSigma50981039Kwas aminoleuwolinowy
EtanolFisherA962-4EtOH
Octan etyluFisherE1454
Falcon 50 ml stożkowe probówki wirówkoweFisher14-432-22Probówki Falcon
Fisherbrand Jednorazowe Kuwety KuwetyFisher14-955-127
Szalki Petriego Fisherbrand z przezroczystą pokrywkąFB0875713szalka PetriegoFisherbrand
Polipropylenowe stojaki do przechowywania mikroprobówek Fisher05-541mikroprobówki
GlukozaSigmaG7021
GlicerolFisherG33-500
HeksanyFisherH292-4 (CS)
HP-5MSAgilent19091S-433GC kolumna
Adapter wlotowyCTechGlassAD-0006-003szklany adapter wlotowy
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozydFisherBP1755-100IPTG
KanamycynaFisher BP9065Kan
KIM-KAP Czapki, jednorazowe, polipropylen, Kimble ChaseVWR60825-798oddychające pokrywki do probówek
Chlorek magnezuAcros223210010MgCl2
Siarczan magnezuSigmaM7506-500gMgSO4
Miracle-Gro Rozpuszczalny w wodzie uniwersalny pokarm roślinnyMiracle-Gro2756810
Młyn mieszający MM 200Retsch20.746.0001tkanka młyn
Kolba hodowlana Nalgene Fernbach KolbaSigmaZ3602362,8 l
New Brunswick I26EppendorfM1324-0000Inkubator z wytrząsaniem
Nicotiana benthamiana seedUSDA Repozytorium plazmy zarodkowejAkcesja TW16N. benthamiana
OverExpress C41(DE3) Chemicznie kompetentne komórkiLucigen60442Ogniwa C41-DE3
Folia do owijania Parafilm MFisherS37440Parafilm
Chlorek potasuSigmaP-9541KCl
Fosforan potasu dwuzasadowy bezwodnyFisherP288-3Fosforan dipotasowy
Fosforan potasu jednozasadowyFosforan monopotasowy
Jednorazowe probówki hodowlane Pyrex, bez oprawkiSigmaCLS9944516probówki
Kwas pirogroniany Sól sodowaFisher501368477pirogronianu sodu
CTechGlassST00stojak na pierścienie
RyboflawinaAmresco0744-250g
RyfampicynaSigmaR7382Rif
Rotovap
Sand, rozmiar cząstek oczek 50-70Sigma274739-1KG
KrzemionkaFisherAC241660010żel krzemionkowy
Chlorek soduFisher5271-3NaCl
Wodorotlenek soduFisherSS266-1
NaOH SpectinomycinFisher501368607Spec
Squibb Lejek separatorowyCTechGlassFN-1060-006Lejek separacyjny
Sunshine Mix #1Sungro HorticultureZiemia doniczkowa
Thermo Scientific Snap Cap Probówki do mikrowirówek o niskiej retencjiFisher21-402-902mikroprobówka
Lejek trójkątnyCTechGlassFN-0035
TryptoneFisherBP14212
Fiolka, śruba, 2 mL, bursztynowa, WrtOnAgilent5182-0716GC fiolka
widoczna spektrofotometr, spektrofotometr V-1200VWR634-6000P
Kolumna HPLC ZORBAX Eclipse XDB-C18Agilent990967-202Kolumna HPLC
ZORBAX Eclipse XDB-CNAgilent990967-905Kolumna HPLC
Agilent-7890B chlorowej Fisher stojak na Stojaki na pierścienie retortowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peters, R. J. Two rings in them all: the labdane-related diterpenoids. Natural Product Reports. 27 (11), 1521-1530 (2010).
  2. Zerbe, P., Bohlmann, J. Plant diterpene synthases: exploring modularity and metabolic diversity for bioengineering. Trends in Biotechnology. 33 (7), 419-428 (2015).
  3. Toyomasu, T. Recent advances regarding diterpene cyclase genes in higher plants and fungi. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 72 (5), 1168-1175 (2008).
  4. Smanski, M. J., Peterson, R. M., Huang, S. X., Shen, B. Bacterial diterpene synthases: new opportunities for mechanistic enzymology and engineered biosynthesis. Current Opinion in Chemical Biology. 16 (1-2), 132-141 (2012).
  5. Salazar-Cerezo, S., Martinez-Montiel, N., Garcia-Sanchez, J., Perez, Y. T. R., Martinez-Contreras, R. D. Gibberellin biosynthesis and metabolism: A convergent route for plants, fungi and bacteria. Microbiological Research. 208, 85-98 (2018).
  6. Keeling, C. I., Bohlmann, J. Diterpene resin acids in conifers. Phytochemistry. 67 (22), 2415-2423 (2006).
  7. Schmelz, E. A., et al. Biosynthesis, elicitation and roles of monocot terpenoid phytoalexins. Plant Journal. 79 (4), 659-678 (2014).
  8. Bohlmann, J., Keeling, C. I. Terpenoid biomaterials. Plant Journal. 54 (4), 656-669 (2008).
  9. Mafu, S., Zerbe, P. Plant diterpenoid metabolism for manufacturing the biopharmaceuticals of tomorrow: prospects and challenges. Phytochemistry Reviews. 17 (1), 113-130 (2017).
  10. Hillwig, M. L., Mann, F. M., Peters, R. J. Diterpenoid biopolymers: new directions for renewable materials engineering. Biopolymers. 95 (2), 71-76 (2011).
  11. Jorgensen, L., et al. 14-step synthesis of (+)-ingenol from (+)-3-carene. Science. 341 (6148), 878-882 (2013).
  12. Line, N. J., Burns, A. C., Butler, S. C., Casbohm, J., Forsyth, C. J. Total Synthesis of (-)-Salvinorin A. Chemistry. 22 (50), 17983-17986 (2016).
  13. Morrone, D., et al. Increasing diterpene yield with a modular metabolic engineering system in E. coli: comparison of MEV and MEP isoprenoid precursor pathway engineering. Applied Microbioly and Biotechnology. 85 (6), 1893-1906 (2010).
  14. Kitaoka, N., Lu, X., Yang, B., Peters, R. J. The application of synthetic biology to elucidation of plant mono-, sesqui-, and diterpenoid metabolism. Molecular Plant. 8 (1), 6-16 (2015).
  15. George, K. W., et al. Metabolic engineering for the high-yield production of isoprenoid-based C(5) alcohols in E. coli. Scientific Reports. 5, 11128(2015).
  16. Paddon, C. J., Keasling, J. D. Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development. Nature Reviews Microbiology. 12 (5), 355-367 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology and the development of tools for metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (3), 189-195 (2012).
  18. Kampranis, S. C., Makris, A. M. Developing a yeast cell factory for the production of terpenoids. Computational and Structural Biotechnology Journal. 3 (4), e201210006(2012).
  19. Tholl, D. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 63-106 (2015).
  20. McGarvey, D. J., Croteau, R. Terpenoid metabolism. The Plant Cell. 7 (7), 1015-1026 (1995).
  21. Chen, F., Tholl, D., Bohlmann, J., Pichersky, E. The family of terpene synthases in plants: a mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom. The Plant Journal. 66 (1), 212-229 (2011).
  22. Pateraki, I., Heskes, A. M., Hamberger, B. Cytochromes P450 for terpene functionalisation and metabolic engineering. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 148, 107-139 (2015).
  23. Cao, R., et al. Diterpene cyclases and the nature of the isoprene fold. Proteins. 78 (11), 2417-2432 (2010).
  24. Reiling, K. K., et al. Mono and diterpene production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 87 (2), 200-212 (2004).
  25. Hamberger, B., Plant Bak, S. P450s as versatile drivers for evolution of species-specific chemical diversity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1612), 20120426(2013).
  26. Jia, M., Potter, K. C., Peters, R. J. Extreme promiscuity of a bacterial and a plant diterpene synthase enables combinatorial biosynthesis. Metabolic Engineering. 37, 24-34 (2016).
  27. Paddon, C. J., et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature. 496 (7446), 528-532 (2013).
  28. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
  29. Pateraki, I., et al. Total biosynthesis of the cyclic AMP booster forskolin from Coleus forskohlii. Elife. 6, e23001(2017).
  30. Ignea, C., et al. Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (13), 3681-3686 (2016).
  31. Ignea, C., et al. Reconstructing the chemical diversity of labdane-type diterpene biosynthesis in yeast. Metabolic Engineering. 28, 91-103 (2015).
  32. Cyr, A., Wilderman, P. R., Determan, M., Peters, R. J. A modular approach for facile biosynthesis of labdane-related diterpenes. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6684-6685 (2007).
  33. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  34. Schalk, M., et al. Toward a biosynthetic route to sclareol and amber odorants. Journal of the American Chemical Society. 134 (46), 18900-18903 (2012).
  35. Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition in English. 55 (6), 2142-2146 (2016).
  36. Bruckner, K., Tissier, A. High-level diterpene production by transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Methods. 9 (1), 46(2013).
  37. Emanuelsson, O., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature Protocols. 2 (4), 953-971 (2007).
  38. Hausjell, J., Halbwirth, H., Spadiut, O. Recombinant production of eukaryotic cytochrome P450s in microbial cell factories. Bioscience Reports. 38 (2), BSR20171290(2018).
  39. Mafu, S., et al. Discovery, biosynthesis and stress-related accumulation of dolabradiene-derived defenses in maize. Plant Physiology. 176 (4), 2677-2690 (2018).
  40. Zerbe, P., et al. Gene discovery of modular diterpene metabolism in nonmodel systems. Plant Physiology. 162 (2), 1073-1091 (2013).
  41. Bach, S. S., et al. High-throughput testing of terpenoid biosynthesis candidate genes using transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods in Molecular Biology. , 245-255 (2014).
  42. Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
  43. Wang, B., et al. Transient production of artemisinin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
  44. Reed, J., Osbourn, A. Engineering terpenoid production through transient expression in Nicotiana benthamiana. Plant Cell Reports. 37 (10), 1431-1441 (2018).
  45. Dong, L., Jongedijk, E., Bouwmeester, H., Der Krol, A. V. an Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209 (2), 679-690 (2016).
  46. Liu, Q., et al. Reconstitution of the costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana. PLoS One. 6 (8), e23255(2011).
  47. Karunanithi, P. S., et al. Functional characterization of the cytochrome P450 monooxygenase CYP71AU87 indicates a role in marrubiin biosynthesis in the medicinal plant Marrubium vulgare. BMC Plant Biology. 19 (1), 114(2019).
  48. Pelot, K., et al. Functional diversity of diterpene synthases in the biofuel crop switchgrass. Plant Physiology. 178 (1), 54-71 (2018).
  49. Wang, Q., Hillwig, M. L., Wu, Y., Peters, R. J. CYP701A8: a rice ent-kaurene oxidase paralog diverted to more specialized diterpenoid metabolism. Plant Physiology. 158 (3), 1418-1425 (2012).
  50. Wang, Q., Hillwig, M. L., Peters, R. J. CYP99A3: functional identification of a diterpene oxidase from the momilactone biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Journal. 65 (1), 87-95 (2011).
  51. Morrone, D., Chen, X., Coates, R. M., Peters, R. J. Characterization of the kaurene oxidase CYP701A3, a multifunctional cytochrome P450 from gibberellin biosynthesis. Biochemical Journal. 431 (3), 337-344 (2010).
  52. Swaminathan, S., Morrone, D., Wang, Q., Fulton, D. B., Peters, R. J. CYP76M7 is an ent-cassadiene C11alpha-hydroxylase defining a second multifunctional diterpenoid biosynthetic gene cluster in rice. The Plant Cell. 21 (10), 3315-3325 (2009).
  53. Gnanasekaran, T., et al. Heterologous expression of the isopimaric acid pathway in Nicotiana benthamiana and the effect of N-terminal modifications of the involved cytochrome P450 enzyme. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 24(2015).
  54. De Luca, V., Salim, V., Atsumi, S. M., Yu, F. Mining the biodiversity of plants: a revolution in the making. Science. 336 (6089), 1658-1661 (2012).
  55. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
  56. Menon, A., et al. Mobile-based insulin dose adjustment for type 2 diabetes in community and rural populations: study protocol for a pilot randomized controlled trial. Therapeutic Advances in Endocrinology and Metabolism. 10, 2042018819836647(2019).
  57. Moses, T., et al. OSC2 and CYP716A14v2 catalyze the biosynthesis of triterpenoids for the cuticle of aerial organs of Artemisia annua. The Plant Cell. 27 (1), 286-301 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Produkcja diterpenoid woczyszczanie enzymatycznechromatografia na krzemioncep preparatywna HPLCEscherichia coliNicotiana benthamianasyntaza diterpenowacytochrom P450separacja metabolit wanaliza strukturalna

Powiązane artykuły