Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

W ciągu ostatnich kilku dekad, znaczenie właściwości mechanicznych środowiska komórki zyskało coraz większe uznanie w biologii komórki. Różne tkanki i macierze zewnątrzkomórkowe mają różną względną sztywność, a gdy komórki migrują w całym ciele, poruszają się po tych zmianach, wykorzystując te właściwości mechaniczne, aby nimi kierować^{1,2,3,4,5,6,7}. Komórki wykorzystują sztywność danej tkanki, aby informować o swoim ruchliwym zachowaniu podczas procesów takich jak rozwój, gojenie się ran i przerzuty raka. Jednak mechanizmy molekularne, które umożliwiają odczuwanie i reagowanie na te mechaniczne bodźce, pozostają w dużej mierze nieznane^{1,2,3,4,5,6,7}.

Aby zbadać mechanizmy, za pomocą których komórki reagują na fizyczne sygnały środowiskowe, należy manipulować sztywnością lub sztywnością podłoża leżącego pod przylegającymi komórkami. W 2000 roku Chun-Min Lo, Yu-Li Wang i współpracownicy opracowali test⁸, dzięki któremu ruchliwa reakcja pojedynczej komórki na zmieniające się sygnały mechaniczne może być bezpośrednio testowana poprzez rozciąganie odkształcalnych hydrożeli poliakrylamidowych pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), na których komórki zostały platerowane. Komórki wykazują znaczną preferencję do migracji w kierunku sztywniejszych substratów, zjawisko, które nazwały "durotaksją".

Od czasu pierwszego raportu z 2000 roku, wiele innych technik zostało wykorzystanych do badania durotaksji. Strome gradienty sztywności zostały wytworzone przez odlewanie żeli na sztywne elementy, takie jak kulki polistyrenu⁹ lub sztywne słupki polimerowe¹⁰ lub poprzez polimeryzację podłoża wokół krawędzi szklanego szkiełka nakrywkowego¹¹ w celu stworzenia mechanicznych "granic stopniowych". Alternatywnie, hydrożele o płytszych, ale stałych gradientach sztywności zostały wytworzone różnymi metodami, takimi jak gradienty środka sieciującego utworzone przez urządzenia mikroprzepływowe^12,13 lub równoległe kropelki roztworu hydrożelu o różnej sztywności⁸, lub hydrożele z fotoreaktywnym środkiem sieciującym poddane stopniowanej ekspozycji na światło UV w celu utworzenia liniowego gradientu sztywności^14,15. Techniki te były wykorzystywane z dużym skutkiem do masowego badania durotaktycznego ruchu komórkowego na przestrzeni czasu. Jednak zazwyczaj cechy te są wytwarzane przed posiewem komórek, a ich właściwości pozostają spójne w trakcie eksperymentu, opierając się na losowym ruchu komórki do próbkowania gradientów mechanicznych. Żadna z tych technik nie jest podatna na obserwację szybkich zmian w zachowaniu komórek w odpowiedzi na ostry bodziec mechaniczny.

Aby zaobserwować reakcje komórek na ostre zmiany w środowisku mechanicznym, testy durotaxii jednokomórkowej oferują kilka zalet. W tych testach poszczególnym komórkom podaje się ostry, mechaniczny bodziec poprzez odciągnięcie leżącego poniżej substratu od komórki za pomocą szklanej mikropipety, wprowadzając w ten sposób kierunkowy gradient napięcia komórka-matryca. Zmiany w zachowaniu ruchliwym, takie jak prędkość lub kierunek migracji, są następnie obserwowane za pomocą mikroskopii kontrastowej w fazie żywej komórki. Takie podejście ułatwia bezpośrednią obserwację związków przyczynowo-skutkowych między bodźcami mechanicznymi a migracją komórek, ponieważ umożliwia szybką, iteracyjną manipulację kierunkiem i wielkością gradientu napięcia oraz ocenę wynikających z niego odpowiedzi komórkowych w czasie rzeczywistym. Co więcej, metoda ta może być również stosowana do mechanicznej stymulacji komórek wyrażających fluorescencyjne białka fuzyjne lub bioczujników do wizualizacji zmian w ilości, aktywności lub lokalizacji subkomórkowej białek podejrzewanych o udział w mechanowykrywaniu i durotaksji.

Ta technika została zastosowana przez grupy badające durotaxis^8,16 i jest opisana tutaj, ponieważ została zaadaptowana przez Laboratorium Howe'a do badania durotaktycznego zachowania komórek raka jajnika SKOV-3 i mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw durotaxis¹⁷. Dodatkowo opisano zmodyfikowaną metodę wytwarzania hydrożeli z pojedynczą, równą warstwą mikrosfer fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej; Ułatwia to wizualizację i optymalizację gradientów odkształceń generowanych przez mikropipety i może umożliwić ocenę kurczliwości komórek za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych.

1. Wytwarzanie odkształcalnych hydrożeli poliakrylamidowych z wbudowanymi mikrosferami fluorescencyjnymi

UWAGA: Wskazówki opisują polimeryzację hydrożelu o natężeniu 25 kPa o średnicy 22 μm i grubości około 66 μm. Każdy lub wszystkie z tych parametrów można zmodyfikować, a wskazówki, jak to zrobić, można znaleźć w tabeli 1 oraz w notes¹⁷.

1. Aktywacja naczyń ze szklanym dnem lub szkiełek nakrywkowych
   1. Przygotować roztwór roboczy silanu wiążącego do aktywacji naczynia do obrazowania ze szklanym dnem lub szkiełka nakrywkowego, które pasuje do komory obrazowania żywych komórek. Zmieszaj 950 μl 95% etanolu, 50 μl lodowatego kwasu octowego i 5 μl silanu wiążącego (y-metakrylokypropylotrimetoksysilanu).
      nuta: Użycie większego dolnego szkiełka nakrywkowego w porównaniu do górnego szkiełka nakrywkowego da dodatkowe miejsce do pracy podczas przygotowywania żelu i ułatwi ustawienie szklanej mikropipety w późniejszych krokach. Ponadto, jeśli używasz szkiełka nakrywkowego, a nie naczynia do obrazowania ze szklanym dnem, wyczyść szkiełko nakrywkowe zgodnie z opisem w następnej sekcji.
   2. Aktywuj powierzchnię szkła na 20 s za pomocą różdżki koronowej i natychmiast nałóż 50 μl wiążącego silanu roztworu roboczego. Pozostaw roztwór do wyschnięcia na 10 minut.
   3. Spłucz dwa razy 95% etanolem, a następnie dwa razy izopropanolem, a następnie pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu przez około 20 minut.
      UWAGA: Aktywowane szkło można przechowywać w eksykatorze do jednego tygodnia.
2. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
   1. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 22 mm należy oczyścić przez inkubację w 2% HCl w temperaturze 70 °C przez 30 minut, a następnie dwukrotnie przemyć w ddH₂O przez 10 minut.
   2. Szkiełka nakrywkowe inkubować w roztworze 2% koncentratu do czyszczenia kuwet w ddH₂O w temperaturze 50 °C przez 30 minut, a następnie dwukrotnie przemywać w ddH₂O przez 10 minut.
   3. Inkubować szkiełka nakrywkowe w ddH₂O w temperaturze 90 °C przez 30 minut, następnie w 70% etanolu w temperaturze 70 °C przez 10 minut, a następnie suszyć na powietrzu w temperaturze 60 °C przez minimum 2 godziny
      nuta: Oczyszczone szkiełka nakrywkowe można przechowywać przez czas nieokreślony w czystym eksykatorze.
3. Osadzanie fluorescencyjnej mikrosfery/kulek na górnych szkiełkach nakrywkowych
   1. Sonikować roztwór podstawowy mikrosfer fluorescencyjnych przez 1 godzinę w ultradźwiękowej łaźni wodnej. Przygotuj roztwór roboczej kulki, rozcieńczając bulion 1:200 w 100% etanolu i ponownie sonikuj przez 1 godzinę.
   2. Na 15 minut przed zakończeniem sonikacji roztworu perełek, należy dokładnie oczyścić szkiełka nakrywkowe, umieszczając je pionowo w ceramicznym uchwycie szkiełka nakrywkowego i traktując plazmą powietrzną przez 3 minuty w stołowym urządzeniu do czyszczenia plazmowego.
   3. Aby ułatwić obsługę i zapobiec przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego podczas kolejnych etapów, umieść kawałek parafilmu w pokrywie z szalki Petriego o średnicy 60 mm lub podobnym pojemniku. Umieść szkiełko nakrywkowe w stabilizatorze i lekko postukaj, zapewniając dobry kontakt między parafilmem a szkiełkiem nakrywkowym.
   4. W przypadku szkiełka nakrywkowego o średnicy 22 mm dodać 150 μl roztworu roboczego do górnej części szkiełka nakrywkowego. Natychmiast odessać roztwór etanolu z boku szkiełka nakrywkowego, pozostawiając kulki na szkiełku nakrywkowym. Pozostaw szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu.
      UWAGA: Ilość dodanego roztworu roboczego ściegu powinna wynosić ~ 4 μl / cm² i może być skalowana w celu dopasowania do dowolnego rozmiaru szkiełka nakrywkowego.
4. Hydrożele odlewnicze z zatopionymi kulkami fluorescencyjnymi
   1. Przygotować hydrożelowy roztwór akrylamidu i bis-akrylamidu. Wymieszać roztwór zgodnie z tabelą 1, a następnie dodać 2,5 μl 10% APS i 0,5 μl TEMED. Dobrze wymieszaj. Natychmiast przejdź do następnego kroku.
      UWAGA: Mieszaninę roztworu hydrożelu można zmienić w celu zmiany modułu Younga lub sztywności hydrożelu poprzez zmianę stosunku akrylamidu do bis-akrylamidu, jak pokazano w tabeli 1. Wartości te zostały zweryfikowane do użytku w laboratorium Howe'a przy użyciu mikroskopii sił atomowych, ale powinny zostać potwierdzone w swojej instytucji.
   2. Natychmiast po przygotowaniu roztworu hydrożelu dodaj kroplę o objętości 25 μl na aktywowaną stronę naczynia ze szklanym dnem lub dolnego szkiełka nakrywkowego, a następnie natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe pokryte kulkami na roztworze, perełką do dołu. Zetknięcie kropli z drugą stroną szkiełka nakrywkowego, a następnie powolne opuszczanie pomaga uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w hydrożelu.
      UWAGA: Wysokość hydrożelu powinna mieścić się w odległości roboczej soczewki obiektywu, która ma być użyta w późniejszym eksperymencie. Wysokość hydrożelu wynosząca 66 μm sprawdza się w przypadku większości systemów. Wielkość hydrożelu można zwiększyć, dodając mniej lub więcej roztworu hydrożelu w zależności od wielkości szkiełka nakrywkowego. Aby obliczyć odpowiednią objętość roztworu hydrożelu, użyj równania dla objętości cylindra, V = πr²h, gdzie r jest promieniem szkiełka nakrywkowego, a h jest pożądaną wysokością hydrożelu. Zazwyczaj obliczenia te przewidują z dość dużą dokładnością rzeczywistą wysokość hydrożelu, mierzoną poprzez przygotowanie żelu z szkiełkami nakrywkowymi pokrytymi perełkami zarówno na górze, jak i na dole oraz przy użyciu mikroskopu konfokalnego do pomiaru odległości między dwiema płaszczyznami kulek. Zaobserwowano jednak, że rzeczywista wysokość hydrożelu może odbiegać od tych obliczeń o ± 20 μm (np. w zależności od grubości i producenta szkiełka nakrywkowego z górnej półki). Zalecany jest bezpośredni pomiar wysokości żelu metodą opisaną powyżej.
   3. Pozostaw żel do polimeryzacji przez 30 minut, a następnie delikatnie usuń górne szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszków. Dodanie 50 mM HEPES pH 8,5 do naczynia może ułatwić usunięcie. Prać przez 5 minut w 50 mM HEPES pH 8,5 trzy razy.
5. Aktywacja hydrożelu i powłoka macierzy zewnątrzkomórkowej
   1. Aktywować powierzchnię hydrożelu przez inkubację w 0,4 mM Sulfo-SANPAH (heksanian 6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino) sulfosukcynimidylu) w 50 mM HEPES pH 8,5. Natychmiast wystawić na działanie lampy UV w zamkniętym pomieszczeniu.
      UWAGA: Chronić Sulfo-SANPAH przed światłem przed aktywacją. W przypadku lampy o mocy 400 W umieść żel w odległości 10 cm od żarówki w kasecie i świec przez 100 s. Roztwór Sulfo-SANPAH zmieni kolor z jasnopomarańczowego na ciemnobrązowy.
   2. Prać przez 5 minut w 50 mM HEPES pH 8,5 trzy razy.
      UWAGA: Uwodnione żele można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
   3. Inkubować aktywowany hydrożel w 20 μg/ml fibronektyny w 50 mM HEPES pH 8,5 przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   4. Odessać roztwór fibronektyny i trzykrotnie przemyć przez 5 minut w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Sterylizuj hydrożel i pokrywkę naczynia przez 15 minut w świetle UV w kapturze do hodowli tkankowych z małą objętością PBS. Umyć raz w sterylnym PBS.
      UWAGA: Do powlekania hydrożelu można użyć innych rodzajów białka ECM, w tym kolagenu i lamininy.

2. Komórki poszycia

1. Dodaj 3 ml pożywki zawierającej 21 000 komórek, aby wypełnić naczynie o średnicy 60 mm, aby uzyskać końcową gęstość komórek ~1000 komórek/cm². Dostosuj gęstość wysiewu zgodnie z potrzebami, aby zapobiec stłoczeniu i umożliwić swobodny ruch poszczególnych komórek.
2. Pozostawić komórki do odzyskania sprawności w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny, a przed obrazowaniem do 18 godzin. Przygotuj się do obrazowania, dwukrotnie spłukując go nośnikiem obrazowym przed dodaniem nośnika do obrazowania. Pozwól komórkom zrównoważyć się przez co najmniej 30 minut przed obrazowaniem.
   UWAGA: Monitoruj warunki nośnika z wyprzedzeniem, aby określić warunki, które zoptymalizują migrację w używanej linii komórkowej. W przypadku komórek SKOV-3 największą migrację stymuluje DMEM bez czerwieni fenolowej, zawierający 20 mM HEPES i 12,5 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu. Optymalnymi warunkami dla komórek Ref52 jest bufor Ringera z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i płytkopochodnym czynnikiem wzrostu o stężeniu 25 ng/mL.

3. Przygotowanie mikropipety szklanej: wyciąganie i kucie pipet

1. Wyciągnij mikropipety ze szkła borokrzemianowego o długości 100 mm z zewnętrzną średnicą 1,0 mm i średnicą wewnętrzną 0,58 mm w dwuetapowym procesie, aby uzyskać stożek powyżej 2 mm, który zmniejsza się do ~50 μm w pierwszym milimetrze i rozciąga się do długiej, równoległej rurki o średnicy 10 μm w ostatnim milimetrze.
2. Załaduj wciągniętą pipetę do mikrokuźni. Uformuj pipetę tak, aby miała końcówkę o grubości 15 μm, która jest zamknięta na samym końcu odcinka o długości 250 μm, wygiętej pod kątem ~35° od reszty pipety. Przybliżona średnica na zagięciu powinna wynosić około 30 μm, aby nadać wytrzymałość końcówce.
   UWAGA: Wymiary stożka i końcówki można dostosować, aby prawidłowo przyłożyć żądaną siłę (patrz krok 5). Ciągnięcie mikropipet w temperaturze 65 °C w pierwszym etapie dla 3 mm i 60 °C w drugim etapie daje wymiary opisane w kroku 3.1. Wyniki uzyskane przy użyciu różnych ściągaczy do pipet mogą się różnić.
3. Przed użyciem wysterylizuj mikropipetę w 70% etanolu.

4. Umiejscowienie mikromanipulatora i mikropipety

1. Zdejmij pokrywkę naczynia i załaduj naczynie na mikroskop stage i środek. Użyj obiektywu o 10-krotnym powiększeniu lub podobnie małym powiększeniu. Przykryj podłoże olejem mineralnym, aby zapobiec parowaniu mediów.
2. Wkładanie ciągniętej pipety
   1. Włóż wyciągniętą pipetę do osłony mikropipety, kierując haczyk w dół w kierunku naczynia. Końcówka haczyka będzie najniższym punktem po opuszczeniu do żelu.
   2. Włóż osłonę do mikromanipulatora i wyreguluj, aż końcówka pipety zostanie wyśrodkowana nad soczewką obiektywu w obu kierunkach X i Y.
   3. Opuść pipetę za pomocą zgrubnego manipulatora, aż dotknie powierzchni cieczy.
3. Używając kontrastu fazowego lub jasnego pola, skoncentruj mikroskop na warstwie kulek w górnej części żelu. Będzie to płaszczyzna odniesienia.
4. Upewniając się, że obiektywowi nie grozi uderzenie w próbkę lub stolik, ustaw ostrość nad żelem, aby znaleźć końcówkę mikropipety, dokonując niewielkich regulacji zgrubnego manipulatora w kierunkach X i Y, aby rzucić cienie na płaszczyznę ogniskowej. Mikropipetę należy opuszczać tylko wtedy, gdy upewni się, że sama końcówka pipety znajduje się w polu view.
5. Upewnij się, że końcówka mikropipety jest skierowana w dół, obracając pipetę w osłonie lub obracając osłonę w mikromanipulatorze, aż końcówka będzie prostopadła do płaszczyzny ogniskowej. W razie potrzeby powtórz kroki 4.4 i 4.5. Skoncentruj się na końcówce pipety.
6. Skoncentruj się z powrotem na górnej warstwie kulki żelu, aby ocenić, jak daleko pipeta znajduje się od powierzchni żelu. Ustawić ostrość z powrotem na płaszczyźnie, która znajduje się w połowie odległości między żelem a końcówką pipety. Powoli opuść pipetę, aby osiągnąć pośrednią płaszczyznę ogniskowej.
7. Powtarzaj krok 4.6 do momentu, gdy po ustawieniu ostrości na hydrożelu będzie można dostrzec bardzo słabe cienie na końcówce mikropipety. Zwiększ do następnego najwyższego powiększenia.
8. Opuścić mikromanipulator do momentu, gdy cienie i załamania na samej końcówce mikropipety będą widoczne w płaszczyźnie ogniskowej warstwy kulki.
9. Zwiększ powiększenie do tego, które zostanie użyte w eksperymencie. Opuścić pipetę, aż będzie unosić się tuż nad powierzchnią hydrożelu.

5. Kalibracja mikromanipulatora i generowanie siły

1. W fazie lub jasnym polu opuść unoszącą się mikropipetę tak, aby dotykała powierzchni hydrożelu. Obserwuj, jak pipeta wygląda w kontakcie z hydrożelem. Kontynuuj obniżanie mikropipety w pozycji Z, aż regulacje w X i Y spowodują ciągnięcie i ugięcie hydrożelu w tych kierunkach. Użyj mikrosfer lub pobliskich komórek jako znaków powierniczych.
   UWAGA: Jeśli mikromanipulator jest przymocowany do ramienia kondensatora faz lub stołu, a nie do samego stolika na próbkę, zawsze odłącz żel przed przesunięciem stolika, aby uniknąć pęknięcia pipety lub zakłócenia komórek. Jeśli pipeta pęknie, wróć do kroku 3 i kroku 4.
2. Znajdź obszar pozbawiony komórek, aby zaangażować żel. Pociągnij go we wszystkich kierunkach i poczuj się komfortowo ze sposobem, w jaki mikromanipulacja przekłada się na deformację żelu.
3. Wykonaj fluorescencyjne obrazy pola kulek bez manipulacji, z pipetą stykającą się z żelem i z zaangażowaną pipetą ciągnącą żel. Powtórz to kilka razy, robiąc dobre notatki dotyczące znaczników na mikromanipulatorze, sposobu, w jaki końcówka pipety wygląda w fazie lub jasnego pola na każdym etapie ciągnięcia, a także odległości, na jaką porusza się końcówka przy użyciu tej manipulacji.
4. Użyj ImageJ, jak opisano wcześniej^16,17, aby obliczyć względne przemieszczenia ściegu i siłę przyłożoną do koralików, porównując pole ściegu zerowego z polem ściegu bez zazębienia pipety, polem ściegu z włączonym żelem i wyciągniętym żelem.
5. Aby precyzyjnie dostroić bodziec napięciowy, porównaj przyłożenie siły przy użyciu różnych wymiarów końcówki mikropipety, odległości od ogniwa lub odległości pobieranej przez mikromanipulator od początkowego punktu przyziemienia. Wpływ wymiaru końcówki mikropipety na przyłożenie siły zapewnia użytkownikowi dużą elastyczność, ale także wskazuje na potrzebę generowania map sił dla nowych mikropipet, nawet jeśli wymiary i kształt bardzo przypominają poprzednio skalibrowane końcówki.

6. Przeprowadzanie testu durotaxsji

1. Przed wykonaniem eksperymentu przećwicz angażowanie żelu w pobliżu komórki i obserwuj deformację ogniwa po zmianie położenia mikromanipulatora.
2. Monitoruj grupę komórek, które mają wyraźną polaryzację i wydają się poruszać przez 30 minut, aby zidentyfikować komórki, które poruszają się w sposób skierowany.
3. Wybierz komórkę, która porusza się w jednym, wyraźnym kierunku i monitoruj ją z żądaną liczbą klatek na sekundę przez dodatkowe 30 minut.
4. Jeśli pożądane jest określenie sił wywieranych na ogniwo lub napięcia wywieranego przez ogniwo, należy rejestrować obrazy pola koralików przy każdym akwizycji. Jeśli komórka zmieni swój kierunek podczas monitorowania, wybierz inną komórkę do monitorowania, ponieważ utrudni to określenie efektu stymulacji.
5. Zaangażować hydrożel w odległości około 50 μm od ogniwa. Umieścić pipetę przed bliższą stroną krawędzi natarcia i przesunąć mikromanipulator tak, aby żel był odkształcony prostopadle do kierunku ruchu ogniwa. Obserwuj komórkę w czasie, gdy reaguje na ostry, lokalny gradient sztywności.
   UWAGA: Podany tutaj czas jest skuteczny podczas monitorowania fibroblastów SKOV3 lub Ref52, jednak interwał i ogólny przebieg czasu powinny być dostosowane do typu komórki i obserwowanego zdarzenia biologicznego. W przypadku parowania z mikroskopią fluorescencyjną należy wstrzymać akwizycję fluorescencyjną bezpośrednio przed krokiem 6.5., użyć kontrastu fazowego lub jasnego pola, aby ustawić mikropipetę i pociągnąć, a następnie wznowić akwizycję fluorescencyjną natychmiast po tym.
6. Jeśli pipeta się ślizga lub jeśli gradient zostanie w inny sposób złagodzony lub zwolniony, znajdź nową komórkę, powtarzając kroki 6.2 i 6.3.

7. Określanie odpowiedzi na migrację durotaktyczną

1. Korzystając z ImageJ¹⁹ lub innego programu do analizy obrazu, oblicz kąt skrętu, rysując linię między środkiem krawędzi natarcia komórki w 0 min a 30 min po monitorze (odzwierciedlającą oryginalną trajektorię komórki) a inną linię między środkiem krawędzi natarcia tuż przed i 80 min po stymulacji i mierząc kąt między tymi dwiema liniami.

Poprzez przygotowanie mikropipet (Rysunek 1) i normalizację siły generowania przez ciągnięcia (Rysunek 2 i Rysunek 3), jak opisano powyżej, zidentyfikowano optymalne warunki durotaktyczne dla wielu linii komórkowych. Korzystając z tej techniki, jak opisano na Rysunek 4, zarówno komórki raka jajnika SKOV-317, jak i Ref52 fibroblasty embrionalne szczurów (Rysunek 5) zmierzają w kierunku zwiększonej sztywności gradientów naniesionych szklaną mikropipetą. Oprócz durotaksji metoda ta może być stosowana do badania dynamicznych zdarzeń sygnalizacyjnych za pomocą fluorescencyjnych biosensorów i markerów. Na przykład strukturę i sygnalizację w ogniskowych strukturach adhezyjnych można zaobserwować po stymulacji durotaktycznej. Czujnik naprężenia winkuliny (VinTS) to biosensor oparty na FRET, który lokalizuje zrosty ogniskowe, umożliwiając fluorescencyjną obserwację dynamiki adhezji ogniskowej i pomiar zmian napięcia w tych strukturach19. Komórki Ref52 przejściowo eksprymujące VinTS na żelach poliakrylamidowych o masie 125 kPa wykazują tworzenie się zrostów ogniskowych w kierunku rozciągania w czasie 40 minut (Figura 6A). Analiza FRET20 ujawnia, że winkulina zlokalizowana w zrostach ogniskowych doświadcza natychmiastowej zmiany napięcia, gdy jest prezentowana z ostrą stymulacją durotaktyczną (Rysunek 6B), rozszerzając użyteczność tego testu na obserwację subkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych w odpowiedzi na stymulację durotaktyczną.

Rysunek 1. Schematy typowych mikropipet ciągnionych (A) i kutych (B). (A) Mikropipety są wyciągane za pomocą dwuetapowego protokołu, aby uzyskać stożek od 1 mm do 10 μm na 2 mm. (B) Mikropipety są następnie ładowane do mikrokuźni, a ich końcówki są wyginane, zamykane i skracane tak, aby ostatnie 250 μm mikropipety było wygięte pod kątem ~35° i zwężało się od ~30 μm do zaokrąglonej końcówki który mierzy ~15 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Ulepszone pole kulek po powlekaniu etanolem w porównaniu z tradycyjną metodą z użyciem poli-L-lizyny. Reprezentatywne pola kulek hydrożelowych z metod powlekania szkiełkami nakrywkowymi z poli-L-lizyny i etanolu (EtOH) z wykorzystaniem żółto-zielonych, czerwonych i ciemnoczerwonych kulek fluorescencyjnych. Podziałka skali: 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Generowanie mapy sił dla przykładowego rozciągania durotaktycznego. (A) Położenie mikrosfer fluorescencyjnych przed i po (odpowiednio pseudo-kolorowych na zielono i czerwono) deformujących hydrożel za pomocą mikropipety (znajdującej się poza prawą krawędzią panelu). Podziałka: 25 μm. Wektory przemieszczeń (B) i mapa cieplna przemieszczeń (C) między polami ściegu zerowego i ciągniętego generowanymi przez wtyczki Traction Force Microscopy w ImageJ podkreślają gradient ugięcia ściegu i odkształcenia hydrożelowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Schemat testu durotaksji i wyznaczanie kąta odchylenia. (A) Komórkę obserwuje się przez co najmniej 30 minut w celu określenia jej pierwotnej trajektorii. (B) Mikropipetę umieszcza się prostopadle do trajektorii komórki, w odległości 50 μm od krawędzi komórki. Hydrożel jest wyczulony przez mikropipetę w taki sposób, że poruszanie mikropipetą będzie wywierać siłę na powierzchnię hydrożelu. (C) Mikropipeta jest odciągana o dodatkowe 20 μm od komórki, prostopadle do trajektorii komórki, co tworzy ostry, lokalny gradient napięcia (oznaczony kolorem niebieskim), który zwiększa się w kierunku mikropipety. (D) Komórka jest obserwowana w czasie, gdy porusza się po zastosowanym gradiencie. (E) W ImageJ lub programie do analizy obrazu oryginalna trajektoria (linia przerywana) jest oznaczona linią poprowadzoną od środka komórki przez środek krawędzi natarcia w pierwszej klatce. Końcowa trajektoria (linia ciągła) jest oznaczona linią narysowaną po tym, jak komórka może poruszać się po zastosowanym gradiencie naprężenia. Kąt między tymi dwiema liniami w kierunku bodźca jest określany jako "kąt skrętu", oznaczony tutaj przez θ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Fibroblasty embrionalne szczurów przemieszczają się w kierunku obszarów o zwiększonej sztywności substratu w durotaksji. Przebieg czasowy pokazujący ruch durotaktyczny komórki Ref52 10 minut przed pociągnięciem (panel 1), 1 minutę przed pociągnięciem (panel 2), w momencie ciągnięcia (panel 3) i 1 godzinę po pociągnięciu (panel 4). Strzałka wskazuje kierunek rozciągania. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Lokalizacja i aktywność białek podczas stymulacji duraktycznej za pomocą markerów fluorescencyjnych lub biosensorów. Komórki Ref52 przejściowo eksprymujące czujnik napięcia winkuliny (VinTS)19 migrujące na żelach poliakrylamidowych 125 kPa są prezentowane z ostrą stymulacją durotaktyczną. (A) Po stymulacji tworzą się nowe zrosty ogniskowe w kierunku rozciągania, gdy komórki zmieniają orientację wzdłuż gradientu sztywności. Przez dwa 10-minutowe okresy, rozpoczynając 20 minut przed stymulacją mechaniczną i 21 minut po stymulacji, monitorowano morfologię komórek (na górze) i tworzenie zrostów ogniskowych (na dole). Kolor czerwony oznacza pierwszy punkt czasowy w danym okresie, a kolor zielony oznacza punkt czasowy 10 minut później. Nowe zrosty ogniskowe powstałe w ciągu 10 minut są pokazane na zielono. Przed stymulacją tworzą się nowe zrosty ogniskowe w kierunku jazdy. Po stymulacji tworzą się nowe zrosty ogniskowe w kierunku rozciągania. Strzałka wskazuje kierunek rozciągania. Groty strzałek wskazują obszary z ogniskowymi zrostami powstałymi w ciągu tych 10 minut. Pasek skali: 25 μm. (B) Analiza FRET fluorescencji VinTS wskazuje na zmianę napięcia w obrębie zrostów ogniskowych proksymalnych do rozciągnięcia durotaktycznego. Zarys błony komórkowej przed i po rozciągnięciu podkreśla deformację komórki po stymulacji. Groty strzałek wskazują przykłady zrostów ogniskowych, w których występują zmiany współczynnika FRET po rozciągnięciu. Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Roztwory żelu akrylowoamidowego.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.