Artykuł metodologiczny

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

DOI:

10.3791/59995

⸱

27 sierpnia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Vermont Larner College of Medicine, 2University of Vermont Cancer Center, 3Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Vermont Larner College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durotaxis to proces, w którym komórki wyczuwają i reagują na gradienty napięcia. Aby zbadać ten proces in vitro, należy manipulować sztywnością podłoża leżącego pod komórką. Podczas gdy hydrożele o stopniowanej sztywności i długoterminowych testach migracji okazały się przydatne w badaniach durotaksji, natychmiastowe, ostre reakcje na lokalne zmiany napięcia substratu pozwalają na ukierunkowane badanie ruchów poszczególnych komórek i subkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych. W celu powtarzalnego przetestowania zdolności komórek do wyczuwania i reagowania na sztywność podłoża leżącego pod spodem, stosuje się zmodyfikowaną metodę stosowania ostrych gradientów zwiększonego napięcia do pojedynczych komórek hodowanych na odkształcalnych hydrożelach, co pozwala na manipulowanie w czasie rzeczywistym siłą i kierunkiem gradientów sztywności nadawanych danym komórkom. Dodatkowo, dzięki precyzyjnemu dostrojeniu szczegółów i parametrów testu, takich jak kształt i wymiary mikropipety lub względne położenie, rozmieszczenie i kierunek zastosowanego gradientu, test można zoptymalizować pod kątem badania dowolnego typu i systemu wrażliwego mechanicznie. Parametry te można zmieniać, aby niezawodnie zmieniać zastosowany bodziec oraz rozszerzać funkcjonalność i wszechstronność testu. Metoda ta pozwala na badanie zarówno długotrwałych ruchów durotaktycznych, jak i bardziej natychmiastowych zmian w sygnalizacji komórkowej i dynamice morfologicznej w odpowiedzi na zmieniającą się sztywność.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku dekad, znaczenie właściwości mechanicznych środowiska komórki zyskało coraz większe uznanie w biologii komórki. Różne tkanki i macierze zewnątrzkomórkowe mają różną względną sztywność, a gdy komórki migrują w całym ciele, poruszają się po tych zmianach, wykorzystując te właściwości mechaniczne, aby nimi kierować1,2,3,4,5,6,7. Komórki wykorzystują sztywność danej tkanki, aby informować o swoim ruchliwym zachowaniu podczas procesów takich jak rozwój, gojenie się ran i przerzuty raka. Jednak mechanizmy molekularne, które umożliwiają odczuwanie i reagowanie na te mechaniczne bodźce, pozostają w dużej mierze nieznane1,2,3,4,5,6,7.

Aby zbadać mechanizmy, za pomocą których komórki reagują na fizyczne sygnały środowiskowe, należy manipulować sztywnością lub sztywnością podłoża leżącego pod przylegającymi komórkami. W 2000 roku Chun-Min Lo, Yu-Li Wang i współpracownicy opracowali test8, dzięki któremu ruchliwa reakcja pojedynczej komórki na zmieniające się sygnały mechaniczne może być bezpośrednio testowana poprzez rozciąganie odkształcalnych hydrożeli poliakrylamidowych pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), na których komórki zostały platerowane. Komórki wykazują znaczną preferencję do migracji w kierunku sztywniejszych substratów, zjawisko, które nazwały "durotaksją".

Od czasu pierwszego raportu z 2000 roku, wiele innych technik zostało wykorzystanych do badania durotaksji. Strome gradienty sztywności zostały wytworzone przez odlewanie żeli na sztywne elementy, takie jak kulki polistyrenu9 lub sztywne słupki polimerowe10 lub poprzez polimeryzację podłoża wokół krawędzi szklanego szkiełka nakrywkowego11 w celu stworzenia mechanicznych "granic stopniowych". Alternatywnie, hydrożele o płytszych, ale stałych gradientach sztywności zostały wytworzone różnymi metodami, takimi jak gradienty środka sieciującego utworzone przez urządzenia mikroprzepływowe12,13 lub równoległe kropelki roztworu hydrożelu o różnej sztywności8, lub hydrożele z fotoreaktywnym środkiem sieciującym poddane stopniowanej ekspozycji na światło UV w celu utworzenia liniowego gradientu sztywności14,15. Techniki te były wykorzystywane z dużym skutkiem do masowego badania durotaktycznego ruchu komórkowego na przestrzeni czasu. Jednak zazwyczaj cechy te są wytwarzane przed posiewem komórek, a ich właściwości pozostają spójne w trakcie eksperymentu, opierając się na losowym ruchu komórki do próbkowania gradientów mechanicznych. Żadna z tych technik nie jest podatna na obserwację szybkich zmian w zachowaniu komórek w odpowiedzi na ostry bodziec mechaniczny.

Aby zaobserwować reakcje komórek na ostre zmiany w środowisku mechanicznym, testy durotaxii jednokomórkowej oferują kilka zalet. W tych testach poszczególnym komórkom podaje się ostry, mechaniczny bodziec poprzez odciągnięcie leżącego poniżej substratu od komórki za pomocą szklanej mikropipety, wprowadzając w ten sposób kierunkowy gradient napięcia komórka-matryca. Zmiany w zachowaniu ruchliwym, takie jak prędkość lub kierunek migracji, są następnie obserwowane za pomocą mikroskopii kontrastowej w fazie żywej komórki. Takie podejście ułatwia bezpośrednią obserwację związków przyczynowo-skutkowych między bodźcami mechanicznymi a migracją komórek, ponieważ umożliwia szybką, iteracyjną manipulację kierunkiem i wielkością gradientu napięcia oraz ocenę wynikających z niego odpowiedzi komórkowych w czasie rzeczywistym. Co więcej, metoda ta może być również stosowana do mechanicznej stymulacji komórek wyrażających fluorescencyjne białka fuzyjne lub bioczujników do wizualizacji zmian w ilości, aktywności lub lokalizacji subkomórkowej białek podejrzewanych o udział w mechanowykrywaniu i durotaksji.

Ta technika została zastosowana przez grupy badające durotaxis8,16 i jest opisana tutaj, ponieważ została zaadaptowana przez Laboratorium Howe'a do badania durotaktycznego zachowania komórek raka jajnika SKOV-3 i mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw durotaxis17. Dodatkowo opisano zmodyfikowaną metodę wytwarzania hydrożeli z pojedynczą, równą warstwą mikrosfer fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej; Ułatwia to wizualizację i optymalizację gradientów odkształceń generowanych przez mikropipety i może umożliwić ocenę kurczliwości komórek za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wytwarzanie odkształcalnych hydrożeli poliakrylamidowych z wbudowanymi mikrosferami fluorescencyjnymi

UWAGA: Wskazówki opisują polimeryzację hydrożelu o natężeniu 25 kPa o średnicy 22 μm i grubości około 66 μm. Każdy lub wszystkie z tych parametrów można zmodyfikować, a wskazówki, jak to zrobić, można znaleźć w tabeli 1 oraz w notes17.

  1. Aktywacja naczyń ze szklanym dnem lub szkiełek nakrywkowych
    1. Przygotować roztwór roboczy silanu wiążącego do aktywacji naczynia do obrazowania ze szklanym dnem lub szkiełka nakrywkowego, które pasuje do komory obrazowania żywych komórek. Zmieszaj 950 μl 95% etanolu, 50 μl lodowatego kwasu octowego i 5 μl silanu wiążącego (y-metakrylokypropylotrimetoksysilanu).
      nuta: Użycie większego dolnego szkiełka nakrywkowego w porównaniu do górnego szkiełka nakrywkowego da dodatkowe miejsce do pracy podczas przygotowywania żelu i ułatwi ustawienie szklanej mikropipety w późniejszych krokach. Ponadto, jeśli używasz szkiełka nakrywkowego, a nie naczynia do obrazowania ze szklanym dnem, wyczyść szkiełko nakrywkowe zgodnie z opisem w następnej sekcji.
    2. Aktywuj powierzchnię szkła na 20 s za pomocą różdżki koronowej i natychmiast nałóż 50 μl wiążącego silanu roztworu roboczego. Pozostaw roztwór do wyschnięcia na 10 minut.
    3. Spłucz dwa razy 95% etanolem, a następnie dwa razy izopropanolem, a następnie pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu przez około 20 minut.
      UWAGA: Aktywowane szkło można przechowywać w eksykatorze do jednego tygodnia.
  2. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
    1. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 22 mm należy oczyścić przez inkubację w 2% HCl w temperaturze 70 °C przez 30 minut, a następnie dwukrotnie przemyć w ddH2O przez 10 minut.
    2. Szkiełka nakrywkowe inkubować w roztworze 2% koncentratu do czyszczenia kuwet w ddH2O w temperaturze 50 °C przez 30 minut, a następnie dwukrotnie przemywać w ddH2O przez 10 minut.
    3. Inkubować szkiełka nakrywkowe w ddH2O w temperaturze 90 °C przez 30 minut, następnie w 70% etanolu w temperaturze 70 °C przez 10 minut, a następnie suszyć na powietrzu w temperaturze 60 °C przez minimum 2 godziny
      nuta: Oczyszczone szkiełka nakrywkowe można przechowywać przez czas nieokreślony w czystym eksykatorze.
  3. Osadzanie fluorescencyjnej mikrosfery/kulek na górnych szkiełkach nakrywkowych
    1. Sonikować roztwór podstawowy mikrosfer fluorescencyjnych przez 1 godzinę w ultradźwiękowej łaźni wodnej. Przygotuj roztwór roboczej kulki, rozcieńczając bulion 1:200 w 100% etanolu i ponownie sonikuj przez 1 godzinę.
    2. Na 15 minut przed zakończeniem sonikacji roztworu perełek, należy dokładnie oczyścić szkiełka nakrywkowe, umieszczając je pionowo w ceramicznym uchwycie szkiełka nakrywkowego i traktując plazmą powietrzną przez 3 minuty w stołowym urządzeniu do czyszczenia plazmowego.
    3. Aby ułatwić obsługę i zapobiec przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego podczas kolejnych etapów, umieść kawałek parafilmu w pokrywie z szalki Petriego o średnicy 60 mm lub podobnym pojemniku. Umieść szkiełko nakrywkowe w stabilizatorze i lekko postukaj, zapewniając dobry kontakt między parafilmem a szkiełkiem nakrywkowym.
    4. W przypadku szkiełka nakrywkowego o średnicy 22 mm dodać 150 μl roztworu roboczego do górnej części szkiełka nakrywkowego. Natychmiast odessać roztwór etanolu z boku szkiełka nakrywkowego, pozostawiając kulki na szkiełku nakrywkowym. Pozostaw szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu.
      UWAGA: Ilość dodanego roztworu roboczego ściegu powinna wynosić ~ 4 μl / cm2 i może być skalowana w celu dopasowania do dowolnego rozmiaru szkiełka nakrywkowego.
  4. Hydrożele odlewnicze z zatopionymi kulkami fluorescencyjnymi
    1. Przygotować hydrożelowy roztwór akrylamidu i bis-akrylamidu. Wymieszać roztwór zgodnie z tabelą 1, a następnie dodać 2,5 μl 10% APS i 0,5 μl TEMED. Dobrze wymieszaj. Natychmiast przejdź do następnego kroku.
      UWAGA: Mieszaninę roztworu hydrożelu można zmienić w celu zmiany modułu Younga lub sztywności hydrożelu poprzez zmianę stosunku akrylamidu do bis-akrylamidu, jak pokazano w tabeli 1. Wartości te zostały zweryfikowane do użytku w laboratorium Howe'a przy użyciu mikroskopii sił atomowych, ale powinny zostać potwierdzone w swojej instytucji.
    2. Natychmiast po przygotowaniu roztworu hydrożelu dodaj kroplę o objętości 25 μl na aktywowaną stronę naczynia ze szklanym dnem lub dolnego szkiełka nakrywkowego, a następnie natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe pokryte kulkami na roztworze, perełką do dołu. Zetknięcie kropli z drugą stroną szkiełka nakrywkowego, a następnie powolne opuszczanie pomaga uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w hydrożelu.
      UWAGA: Wysokość hydrożelu powinna mieścić się w odległości roboczej soczewki obiektywu, która ma być użyta w późniejszym eksperymencie. Wysokość hydrożelu wynosząca 66 μm sprawdza się w przypadku większości systemów. Wielkość hydrożelu można zwiększyć, dodając mniej lub więcej roztworu hydrożelu w zależności od wielkości szkiełka nakrywkowego. Aby obliczyć odpowiednią objętość roztworu hydrożelu, użyj równania dla objętości cylindra, V = πr2h, gdzie r jest promieniem szkiełka nakrywkowego, a h jest pożądaną wysokością hydrożelu. Zazwyczaj obliczenia te przewidują z dość dużą dokładnością rzeczywistą wysokość hydrożelu, mierzoną poprzez przygotowanie żelu z szkiełkami nakrywkowymi pokrytymi perełkami zarówno na górze, jak i na dole oraz przy użyciu mikroskopu konfokalnego do pomiaru odległości między dwiema płaszczyznami kulek. Zaobserwowano jednak, że rzeczywista wysokość hydrożelu może odbiegać od tych obliczeń o ± 20 μm (np. w zależności od grubości i producenta szkiełka nakrywkowego z górnej półki). Zalecany jest bezpośredni pomiar wysokości żelu metodą opisaną powyżej.
    3. Pozostaw żel do polimeryzacji przez 30 minut, a następnie delikatnie usuń górne szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszków. Dodanie 50 mM HEPES pH 8,5 do naczynia może ułatwić usunięcie. Prać przez 5 minut w 50 mM HEPES pH 8,5 trzy razy.
  5. Aktywacja hydrożelu i powłoka macierzy zewnątrzkomórkowej
    1. Aktywować powierzchnię hydrożelu przez inkubację w 0,4 mM Sulfo-SANPAH (heksanian 6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino) sulfosukcynimidylu) w 50 mM HEPES pH 8,5. Natychmiast wystawić na działanie lampy UV w zamkniętym pomieszczeniu.
      UWAGA: Chronić Sulfo-SANPAH przed światłem przed aktywacją. W przypadku lampy o mocy 400 W umieść żel w odległości 10 cm od żarówki w kasecie i świec przez 100 s. Roztwór Sulfo-SANPAH zmieni kolor z jasnopomarańczowego na ciemnobrązowy.
    2. Prać przez 5 minut w 50 mM HEPES pH 8,5 trzy razy.
      UWAGA: Uwodnione żele można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
    3. Inkubować aktywowany hydrożel w 20 μg/ml fibronektyny w 50 mM HEPES pH 8,5 przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    4. Odessać roztwór fibronektyny i trzykrotnie przemyć przez 5 minut w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Sterylizuj hydrożel i pokrywkę naczynia przez 15 minut w świetle UV w kapturze do hodowli tkankowych z małą objętością PBS. Umyć raz w sterylnym PBS.
      UWAGA: Do powlekania hydrożelu można użyć innych rodzajów białka ECM, w tym kolagenu i lamininy.

2. Komórki poszycia

  1. Dodaj 3 ml pożywki zawierającej 21 000 komórek, aby wypełnić naczynie o średnicy 60 mm, aby uzyskać końcową gęstość komórek ~1000 komórek/cm2. Dostosuj gęstość wysiewu zgodnie z potrzebami, aby zapobiec stłoczeniu i umożliwić swobodny ruch poszczególnych komórek.
  2. Pozostawić komórki do odzyskania sprawności w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny, a przed obrazowaniem do 18 godzin. Przygotuj się do obrazowania, dwukrotnie spłukując go nośnikiem obrazowym przed dodaniem nośnika do obrazowania. Pozwól komórkom zrównoważyć się przez co najmniej 30 minut przed obrazowaniem.
    UWAGA: Monitoruj warunki nośnika z wyprzedzeniem, aby określić warunki, które zoptymalizują migrację w używanej linii komórkowej. W przypadku komórek SKOV-3 największą migrację stymuluje DMEM bez czerwieni fenolowej, zawierający 20 mM HEPES i 12,5 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu. Optymalnymi warunkami dla komórek Ref52 jest bufor Ringera z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i płytkopochodnym czynnikiem wzrostu o stężeniu 25 ng/mL.

3. Przygotowanie mikropipety szklanej: wyciąganie i kucie pipet

  1. Wyciągnij mikropipety ze szkła borokrzemianowego o długości 100 mm z zewnętrzną średnicą 1,0 mm i średnicą wewnętrzną 0,58 mm w dwuetapowym procesie, aby uzyskać stożek powyżej 2 mm, który zmniejsza się do ~50 μm w pierwszym milimetrze i rozciąga się do długiej, równoległej rurki o średnicy 10 μm w ostatnim milimetrze.
  2. Załaduj wciągniętą pipetę do mikrokuźni. Uformuj pipetę tak, aby miała końcówkę o grubości 15 μm, która jest zamknięta na samym końcu odcinka o długości 250 μm, wygiętej pod kątem ~35° od reszty pipety. Przybliżona średnica na zagięciu powinna wynosić około 30 μm, aby nadać wytrzymałość końcówce.
    UWAGA: Wymiary stożka i końcówki można dostosować, aby prawidłowo przyłożyć żądaną siłę (patrz krok 5). Ciągnięcie mikropipet w temperaturze 65 °C w pierwszym etapie dla 3 mm i 60 °C w drugim etapie daje wymiary opisane w kroku 3.1. Wyniki uzyskane przy użyciu różnych ściągaczy do pipet mogą się różnić.
  3. Przed użyciem wysterylizuj mikropipetę w 70% etanolu.

4. Umiejscowienie mikromanipulatora i mikropipety

  1. Zdejmij pokrywkę naczynia i załaduj naczynie na mikroskop stage i środek. Użyj obiektywu o 10-krotnym powiększeniu lub podobnie małym powiększeniu. Przykryj podłoże olejem mineralnym, aby zapobiec parowaniu mediów.
  2. Wkładanie ciągniętej pipety
    1. Włóż wyciągniętą pipetę do osłony mikropipety, kierując haczyk w dół w kierunku naczynia. Końcówka haczyka będzie najniższym punktem po opuszczeniu do żelu.
    2. Włóż osłonę do mikromanipulatora i wyreguluj, aż końcówka pipety zostanie wyśrodkowana nad soczewką obiektywu w obu kierunkach X i Y.
    3. Opuść pipetę za pomocą zgrubnego manipulatora, aż dotknie powierzchni cieczy.
  3. Używając kontrastu fazowego lub jasnego pola, skoncentruj mikroskop na warstwie kulek w górnej części żelu. Będzie to płaszczyzna odniesienia.
  4. Upewniając się, że obiektywowi nie grozi uderzenie w próbkę lub stolik, ustaw ostrość nad żelem, aby znaleźć końcówkę mikropipety, dokonując niewielkich regulacji zgrubnego manipulatora w kierunkach X i Y, aby rzucić cienie na płaszczyznę ogniskowej. Mikropipetę należy opuszczać tylko wtedy, gdy upewni się, że sama końcówka pipety znajduje się w polu view.
  5. Upewnij się, że końcówka mikropipety jest skierowana w dół, obracając pipetę w osłonie lub obracając osłonę w mikromanipulatorze, aż końcówka będzie prostopadła do płaszczyzny ogniskowej. W razie potrzeby powtórz kroki 4.4 i 4.5. Skoncentruj się na końcówce pipety.
  6. Skoncentruj się z powrotem na górnej warstwie kulki żelu, aby ocenić, jak daleko pipeta znajduje się od powierzchni żelu. Ustawić ostrość z powrotem na płaszczyźnie, która znajduje się w połowie odległości między żelem a końcówką pipety. Powoli opuść pipetę, aby osiągnąć pośrednią płaszczyznę ogniskowej.
  7. Powtarzaj krok 4.6 do momentu, gdy po ustawieniu ostrości na hydrożelu będzie można dostrzec bardzo słabe cienie na końcówce mikropipety. Zwiększ do następnego najwyższego powiększenia.
  8. Opuścić mikromanipulator do momentu, gdy cienie i załamania na samej końcówce mikropipety będą widoczne w płaszczyźnie ogniskowej warstwy kulki.
  9. Zwiększ powiększenie do tego, które zostanie użyte w eksperymencie. Opuścić pipetę, aż będzie unosić się tuż nad powierzchnią hydrożelu.

5. Kalibracja mikromanipulatora i generowanie siły

  1. W fazie lub jasnym polu opuść unoszącą się mikropipetę tak, aby dotykała powierzchni hydrożelu. Obserwuj, jak pipeta wygląda w kontakcie z hydrożelem. Kontynuuj obniżanie mikropipety w pozycji Z, aż regulacje w X i Y spowodują ciągnięcie i ugięcie hydrożelu w tych kierunkach. Użyj mikrosfer lub pobliskich komórek jako znaków powierniczych.
    UWAGA: Jeśli mikromanipulator jest przymocowany do ramienia kondensatora faz lub stołu, a nie do samego stolika na próbkę, zawsze odłącz żel przed przesunięciem stolika, aby uniknąć pęknięcia pipety lub zakłócenia komórek. Jeśli pipeta pęknie, wróć do kroku 3 i kroku 4.
  2. Znajdź obszar pozbawiony komórek, aby zaangażować żel. Pociągnij go we wszystkich kierunkach i poczuj się komfortowo ze sposobem, w jaki mikromanipulacja przekłada się na deformację żelu.
  3. Wykonaj fluorescencyjne obrazy pola kulek bez manipulacji, z pipetą stykającą się z żelem i z zaangażowaną pipetą ciągnącą żel. Powtórz to kilka razy, robiąc dobre notatki dotyczące znaczników na mikromanipulatorze, sposobu, w jaki końcówka pipety wygląda w fazie lub jasnego pola na każdym etapie ciągnięcia, a także odległości, na jaką porusza się końcówka przy użyciu tej manipulacji.
  4. Użyj ImageJ, jak opisano wcześniej16,17, aby obliczyć względne przemieszczenia ściegu i siłę przyłożoną do koralików, porównując pole ściegu zerowego z polem ściegu bez zazębienia pipety, polem ściegu z włączonym żelem i wyciągniętym żelem.
  5. Aby precyzyjnie dostroić bodziec napięciowy, porównaj przyłożenie siły przy użyciu różnych wymiarów końcówki mikropipety, odległości od ogniwa lub odległości pobieranej przez mikromanipulator od początkowego punktu przyziemienia. Wpływ wymiaru końcówki mikropipety na przyłożenie siły zapewnia użytkownikowi dużą elastyczność, ale także wskazuje na potrzebę generowania map sił dla nowych mikropipet, nawet jeśli wymiary i kształt bardzo przypominają poprzednio skalibrowane końcówki.

6. Przeprowadzanie testu durotaxsji

  1. Przed wykonaniem eksperymentu przećwicz angażowanie żelu w pobliżu komórki i obserwuj deformację ogniwa po zmianie położenia mikromanipulatora.
  2. Monitoruj grupę komórek, które mają wyraźną polaryzację i wydają się poruszać przez 30 minut, aby zidentyfikować komórki, które poruszają się w sposób skierowany.
  3. Wybierz komórkę, która porusza się w jednym, wyraźnym kierunku i monitoruj ją z żądaną liczbą klatek na sekundę przez dodatkowe 30 minut.
  4. Jeśli pożądane jest określenie sił wywieranych na ogniwo lub napięcia wywieranego przez ogniwo, należy rejestrować obrazy pola koralików przy każdym akwizycji. Jeśli komórka zmieni swój kierunek podczas monitorowania, wybierz inną komórkę do monitorowania, ponieważ utrudni to określenie efektu stymulacji.
  5. Zaangażować hydrożel w odległości około 50 μm od ogniwa. Umieścić pipetę przed bliższą stroną krawędzi natarcia i przesunąć mikromanipulator tak, aby żel był odkształcony prostopadle do kierunku ruchu ogniwa. Obserwuj komórkę w czasie, gdy reaguje na ostry, lokalny gradient sztywności.
    UWAGA: Podany tutaj czas jest skuteczny podczas monitorowania fibroblastów SKOV3 lub Ref52, jednak interwał i ogólny przebieg czasu powinny być dostosowane do typu komórki i obserwowanego zdarzenia biologicznego. W przypadku parowania z mikroskopią fluorescencyjną należy wstrzymać akwizycję fluorescencyjną bezpośrednio przed krokiem 6.5., użyć kontrastu fazowego lub jasnego pola, aby ustawić mikropipetę i pociągnąć, a następnie wznowić akwizycję fluorescencyjną natychmiast po tym.
  6. Jeśli pipeta się ślizga lub jeśli gradient zostanie w inny sposób złagodzony lub zwolniony, znajdź nową komórkę, powtarzając kroki 6.2 i 6.3.

7. Określanie odpowiedzi na migrację durotaktyczną

  1. Korzystając z ImageJ19 lub innego programu do analizy obrazu, oblicz kąt skrętu, rysując linię między środkiem krawędzi natarcia komórki w 0 min a 30 min po monitorze (odzwierciedlającą oryginalną trajektorię komórki) a inną linię między środkiem krawędzi natarcia tuż przed i 80 min po stymulacji i mierząc kąt między tymi dwiema liniami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprzez przygotowanie mikropipet (Rysunek 1) i normalizację siły generowania przez ciągnięcia (Rysunek 2 i Rysunek 3), jak opisano powyżej, zidentyfikowano optymalne warunki durotaktyczne dla wielu linii komórkowych. Korzystając z tej techniki, jak opisano na Rysunek 4, zarówno komórki raka jajnika SKOV-317, jak i Ref52 fibroblasty embrionalne szczurów (Rysunek 5) zmierzają w kierunku zwię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zademonstrowano tutaj powtarzalny, jednokomórkowy test durotaksji, który pozwala ocenić zdolność komórki do zmiany swojego zachowania migracyjnego w odpowiedzi na ostre sygnały mechaniczne. Technika ta może być również stosowana w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną i odpowiednimi białkami fuzyjnymi lub biosensorami w celu zbadania sygnalizacji subkomórkowej i zdarzeń cytoszkieletowych w ciągu kilku sekund od stymulacji mechanicznej lub w dłuższej skali czasu podczas ruchu durotaktycznego. Zrozumienie związku komórk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Akrylamid 40 % Krajowa diagnostykaEC-810
Nadsiarczan amonu FisherBP179-25
BD20A Generator wysokiej częstotliwościElectro Technic Products12011A115 V -  Ręczny silan wiązany przez różdżkę koronową
(y-metakrylooksypropylotrimetoksysilan) (Sigma AldrichM6514
Bis-akryloamid 2% Krajowa diagnostykaEC-820
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoŚwiat Instrumenty precyzyjne1B100-4
Myjka ultradźwiękowa Branson 2510Bransonic
Manipulator zgrubnyNarshigeMC35A
DMEMCorning10-013-CV
DMEM bez czerwieni fenolowejSigma AldrichD5030
Dwustopniowy szklany ściągacz do mikropipetNarshigePC-10
Naskórkowy czynnik wzrostuPeprotechAF-100-15
EtanolPharmco-aaper111000200
Płodowa surowica bydlęca (kwalifikowana jednorazowa próba)GibcoA31606-02
Fibronektyna EMD MilliporeFC010
Fluosfery Karboksylan 0,2 um InvitrogenF8810, F8807, F8811
Fugene 6Roche18150911.5 μ g DNA / 6 μ L fugene 6 na naczynie 35 mm
Lodowaty kwas octowyFisher ChemicalA38SI-212
Naczynie ze szklanym dnemCellVisD60-60-1.5-N
Szklane szkiełko nakrywkoweMikroskopia elektronowa Sciences72224-0122 mm, #1.5
HClJT Baker9535-03
Hellmanex III  Specjalny koncentrat czyszczącySigma AldrichZ805939Stosowany w stężeniu 2% w ddH2O do czyszczenia szkiełek nakrywkowych
HEPES w proszkuSigma AldrichH3375Make 50mM bufor HEPES, pH 8,5
Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood LightUviton InternationalUV0338
IsopropanolFisher ChemicalA417-4
MicroforgeNarshigeMF900
MikromanipulatorNarshigeMHW3
Olej mineralnySigma AldrichM5904
Nanopure Life Science UV/UF SystemBarnsteadD11931ddH2O
Nikon Eclipse TiNikon
OptiMEMInvitrogen31985062
Parafilm MBemis Company, IncPM-992
PBS139 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 28,6 mM Na2HPO4, 1,6 mM KH2PO4, pH 7,4
Czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego-BB (PDGF-BB)Sigma AldrichP4056
Ref52Linia komórkowa fibroblastów embrionalnych szczura; Hodowla w DMEM + 10% FBS
Bufor134 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2,4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glukoze, pH 7,4
SKOV-3Kolekcja kultur typu amerykańskiego Kulturaw DMEM + 10% FBS
Sulfo-SANPAH Covachem  12414-1
Stołowa myjka plazmowaHarrick PlasmaPDC-32G
TEMED Sigma AldrichT9281-50
o częstotliwości 40 kHz Ringera

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
  2. Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
  3. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  4. Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
  5. Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
  6. Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
  7. Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
  8. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  9. Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
  10. Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
  11. Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949(2015).
  12. Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
  13. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
  14. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107(2012).
  15. Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. 3rd Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
  16. Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
  17. McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228(2018).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  20. McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552(2011).
  21. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
  22. Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
  23. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mechanical MicroenvironmentHydrogel Stiffness GradientMicropipette ManipulationReal time Mechanical StimulationCell Migration BehaviorSubcellular Signaling EventsFocal Adhesion FormationVinculin Tension SensorForster Resonance Energy Transfer

Powiązane artykuły