Ten protokół ma na celu ocenę żywotności Drosophila na każdym etapie rozwoju, od zarodka do dorosłego osobnika. Metoda ta może być stosowana do określania i porównywania żywotności różnych genotypów lub warunków wzrostu.
Artykuł metodologiczny
Bezpośrednia i prosta metoda oceny żywotności Drosophila melanogaster od zarodka do dorosłego osobnika
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
U Drosophila melanogaster testy żywotności są używane do określenia dopasowania pewnych genetycznych środowisk. Zmiany alleli mogą powodować częściową lub całkowitą utratę żywotności na różnych etapach rozwoju. Nasze laboratorium opracowało metodę oceny żywotności Drosophila od zarodka do w pełni dojrzałego dorosłego osobnika. Metoda opiera się na ilościowym określeniu liczby potomstwa obecnego na różnych etapach rozwoju, począwszy od wyklutych zarodków. Po ilościowym określeniu zarodków zlicza się dodatkowe etapy, w tym L1/L2, poczwarki i dojrzałe osobniki dorosłe. Po zbadaniu wszystkich stadiów stosuje się analizę statystyczną, taką jak test chi-kwadrat, w celu określenia, czy istnieje znacząca różnica między początkową liczbą potomstwa (wyklutych zarodków) a późniejszymi etapami, których kulminacją jest obserwowana liczba dorosłych osobników, odrzucając w ten sposób lub przyjmując hipotezę zerową (że liczba wyklutych zarodków będzie równa liczbie larw, poczwarki i dorosłe osobniki rejestrowane na wszystkich etapach rozwoju). Podstawową zaletą tego testu jest jego prostota i dokładność, ponieważ nie wymaga płukania zarodków w celu przeniesienia ich do fiolki z żywnością, co pozwala uniknąć strat spowodowanych błędami technicznymi. Chociaż opisany tutaj protokół nie bada bezpośrednio larw L2/L3, można dodać dodatkowe kroki, aby je uwzględnić. Porównanie liczby wyklutych zarodków, L1, poczwarek i dorosłych osobników może pomóc w ustaleniu, czy żywotność była zagrożona na etapach L2/L3 w celu dalszych badań (stosowanie kolorowej żywności pomaga w wizualnej identyfikacji larw). Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może pomóc badaczom i edukatorom Drosophila określić, kiedy żywotność jest zagrożona podczas cyklu życia muchy. Rutynowa ocena stad przy użyciu tego testu może zapobiec akumulacji mutacji wtórnych, które mogą wpływać na fenotyp pierwotnie wyizolowanego mutanta, zwłaszcza jeśli pierwotne mutacje wpływają na przystosowanie. Z tego powodu nasze laboratorium utrzymuje wiele kopii każdego z naszych alleli Dm ime4 i rutynowo sprawdza czystość każdego stada za pomocą tej metody, a także innych analiz molekularnych.
Wprowadzenie
Na długość życia wpływają czynniki genetyczne i niegenetyczne. W standardowych warunkach wzrostu laboratoryjnego w temperaturze pokojowej, nasze laboratorium zaobserwowało znaczną zmienność dopasowania i żywotności między różnymi allelami Dm ime4 hodowanymi w identycznych warunkach (Rysunek 1 i rysunki uzupełniające). Badania żywotności są często wykonywane w celu zbadania wpływu określonej kombinacji alleli lub warunku wzrostu w badaniach genetycznych populacji1,2,3,4. Jednak w literaturze naukowej trudno jest znaleźć szczegółowe analizy żywotności w obrębie niekomplementarnej grupy mutacji. Allel jest zwykle oznaczany jako "nieistotny", jeśli badacz znajdzie kilka osobników homozygotycznych pod względem tego allelu w fiolce z żywnością, w której znajduje się zbilansowany zapas5,6. Jednak dokładne analizy chi-kwadrat mające na celu ocenę, czy te homozygoty powstają w oczekiwanych proporcjach mendlowskich, nie są podawane5,6. Najbardziej dopuszczalną temperaturą dla każdego stada Drosophila jest temperatura pokojowa (22-23 °C), a przy odpowiednich składnikach odżywczych cykl życiowy much dzikich trwa około dwunastu dni7,8. Ponieważ czas trwania każdego stadium rozwojowego Drosophila typu dzikiego jest znany7,8, metoda opisana w tym raporcie może być wykorzystana do zbadania, czy badany szczep Drosophila jest odpowiedni na każdym etapie w porównaniu z kontrolą odpowiednią dla badanego tła genetycznego. W przeciwieństwie do badań, które koncentrują się na jednym konkretnym aspekcie rozwoju9, ten protokół zapewnia praktyczny sposób oceny żywotności na różnych etapach rozwoju.
W naszym laboratorium ten protokół jest używany do oceny żywotności zasobów, które są niewystarczające dla Drosophila Inducer of Meiosis 4 (Dm ime4). Dm ime4 jest niezbędnym genem10, który koduje metylotransferazę RNA odgrywającą kluczową rolę w metabolizmie RNA u Drosophila i innych organizmów wielokomórkowych5,6,10,11,12,13,14. Aby szybko ocenić nowe allele Dm ime4 wygenerowane za pomocą CRISPR/Cas9 (rysunki uzupełniające), przeprowadzono test żywotności punktu końcowego, który liczył tylko dorosłe potomstwo wyprodukowane w fiolkach o zrównoważonych stadach (Rysunek 1). Niektóre z użytych zapasów zostały opisane w poprzednich raportach Dm ime45,6. Homozygotyczne mutanty pojawiły się na poziomie sub-mendlowskim, jak określono za pomocą analiz chi-kwadrat (Rysunek 1 i materiały uzupełniające). Aby ocenić, czy te niższe niż oczekiwano liczby były spowodowane mniejszą liczbą składanych zarodków, mniejszą liczbą wyklutych zarodków, czy też utratą żywotności L1/L2 lub poczwarek, rozszerzyliśmy śledzenie o liczbę na każdym z tych etapów rozwoju (Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 5, Rysunek 6, Rysunek 7, Rysunek 8 i Rysunek 9).
Tutaj opisujemy metodę z użyciem much typu dzikiego (OreR). Aby empirycznie przetestować tę metodę pod kątem stosowania z innymi tłami genetycznymi lub gatunkami Drosophila, zalecamy użycie OreR jako odniesienia i dostosowanie punktów czasowych zgodnie z organizmem eksperymentalnym. Protokół został poddany dalszej ocenie w celu oceny żywotności potomstwa powstałego przez skrzyżowanie dziewiczych samic typu dzikiego z samcami z heterozygotycznego zmutowanego stada Dm ime45, 6 (Rysunek 4).
Protokół
1. Przygotowanie mediów
- Przygotuj agar winogronowy zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów) i wlej do szalki Petriego o średnicy 35 mm do połowy (Rysunek 5). Pozostaw do zestalenia na około 1 godzinę. Po zestaleniu się agaru winogronowego należy go natychmiast użyć lub przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Delikatnie wykonaj rysy na płytce agarowej za pomocą małego plastikowego noża (muchy lubią leżeć na nierównych powierzchniach), pozostawiając środek płytki bez zadrapań (Rysunek 5). Umieść niewielką ilość pasty drożdżowej (świeżej; patrz Tabela Materiałów) na środku talerza (Rysunek 5).
2. Konfiguracja mini klatki do pobierania zarodków
- Ustaw krzyżówkę, używając dwóch dziewiczych samic i jednego młodego samca w klatce do pobierania zarodków zawierającej płytkę z agarem winogronowym uzupełnioną pastą drożdżową (Ryc. 5).
- Po 24 godzinach należy sprawdzić klatki pod kątem złożonych zarodków bez otwierania klatki, patrząc na spód płytki agarowej. Jeśli zarodki zostały złożone, wyjmij płytkę agarową z komory i umieść ją w wilgotnej komorze w celu obserwacji mikroskopowej (Rysunek 6). Jeśli punktowane są kilkudniowe nieśności (np. testy płodności/długowieczności), zachowaj rodziców hodowlanych i zastąp szalkę świeżą przygotowaną zgodnie z opisem. Można przeprowadzić wczesne zbiory krótsze niż 24 godziny, ale w przypadku korzystania z dziewiczych samic należy pamiętać, że nie będą one składać jaj do 48 godzin po wyjściu z poczwarki.
- Przykryj płytkę agarową zawierającą zarodki pokrywką szalki Petriego, aby uniknąć odwodnienia i natychmiast umieść ją w wilgotnej komorze (Ryc. 7). Obserwuj pod mikroskopem preparacyjnym i zapisz wyklute zarodki i L1. Załóż pokrywkę i przechowuj w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze, aż wszystkie zarodki wyklują się i rozwiną w larwy L1 (Ryc. 6).
3. Liczenie zarodków i larw
- Po 48 godzinach obserwuj płytki pod mikroskopem preparacyjnym i zapisz liczby po raz ostatni przed przeniesieniem krążka agarowego do fiolki z żywnością. Zapłodnione/zdolne do życia zarodki powinny do tego czasu osiągnąć L1. Możliwe są dłuższe okresy inkubacji przed transferem, ale należy pamiętać, że płytki mogą zacząć tracić wilgoć, a agar może pękać, zagrażając czystemu transferowi do fiolek z żywnością (Rysunek 7). Aby upewnić się, że płytki pozostają nawodnione, a żywotność zarodków nie jest zagrożona podczas liczenia, należy unikać używania bezpośredniego światła na gęsiej szyi nad powierzchnią agaru (Rysunek 7E pokazuje odpowiednią odległość).
- Po odliczeniu przykryj płytkę i przechowuj ją w wilgotnej komorze, aż będzie gotowa do przeniesienia. Rejestruj wyniki.
4. Przenieś krążek z agarem winogronowym do fiolki z jedzeniem, aby monitorować żywotność podczas rozwoju.
- Po zapisaniu liczb (wyklute zarodki/L1/L2) za pomocą szpatułki ostrożnie przenieś krążek z agaru winogronowego do fiolki wystarczająco dużej, aby pomieścić krążek o średnicy 35 mm zawierający pożywkę pokarmową Drosophila przygotowaną zgodnie z instrukcjami producenta (patrz lista odczynników). Połóż krążek agaru winogronowego L1 stroną do dołu na żywności (Rysunek 7). Po przeniesieniu krążka agarowego z larwami do fiolki z jedzeniem, dokładnie sprawdź pustą szalkę Petriego pod kątem pozostawionych larw (Rysunek 7E).
- Ustal harmonogram kontroli fiolek z żywnością codziennie, mniej więcej o tej samej porze każdego dnia, aby upewnić się, że larwy L2/L3 przedostają się do żywności w fiolce (Rysunek 8).
- Zapisz liczbę poczwarek i dorosłych Drosophila (Ryc. 9). Kontynuuj liczenie, aż nie zaobserwuje się więcej dorosłych osobników i unikaj liczenia następnego pokolenia (nie licz dalej niż 9 dni po obserwacji pierwszych dorosłych osobników).
- Obserwuj i zapisuj wyniki. Dostosuj ramy czasowe pobierania, liczenia i rejestrowania zarodków odpowiednio do wykorzystywanego stada mutantów.
- Wykonaj analizę chi-kwadrat. Hipoteza zerowa zakłada 100% żywotności, tak że liczba dorosłych osobników będzie równa liczbie wyklutych zarodków i L1 pierwotnie zarejestrowanych i przeniesionych do fiolek z żywnością
Wyniki
Metoda ta, w połączeniu z analizą chi-kwadrat, pozwala na dokładne i powtarzalne określenie przeżywalności od stadium embrionalnego aż do wyklutych osobników dorosłych.
W badaniach wstępnych, po przeliczeniu embrionów i larw, agar winogronowy umieszczano w fiolce w pozycji pionowej, opierając go o ściankę naczynia. Niestety, gdy agar znajdował się przy ściance fiolki, wiele embrionów i larw nie osiągnęło stadium dorosłego osobnika. Było to prawdopodobnie spowodowane wysychaniem krążka agaru winogronowego (Rysunek 3). Taki sposób rozmieszczenia wprowadził zmienną środowiskową (nawodnienie krążka agaru), która mogła zakłócić wyniki. Około 39% potomstwa utracono na etapie od embrionu do stadium dorosłego, ponieważ wykluło się jedynie 61% osobników dorosłych. Największe straty wystąpiły pomiędzy liczbą larw L1 (liczonych na powierzchni płytek z agarem winogronowym) a liczbą poczwarek (liczonych na ściankach fiolek z pożywką). Jednakże, gdy agar winogronowy umieszczono w fiolce stroną skierowaną w dół, w bezpośrednim kontakcie z powierzchnią pożywki, utracono mniej niż 6% potomstwa (Rysunek 2). Agar pozostał nawodniony, ponieważ cały krążek agaru winogronowego pozostawał w kontakcie z wilgocią gotowej pożywki wewnątrz fiolki (Rysunek 7, Rysunek 8). Wyniki te wskazują, że położenie agaru wewnątrz fiolki jest istotne dla uzyskania wiarygodnych danych i minimalizacji wpływu zmiennych środowiskowych. Dalsze dane potwierdzające skuteczność metody zebrano poprzez porównanie potomstwa typu dzikiego użytego w początkowej walidacji metody z potomstwem uzyskanym z krzyżowania dziewiczych samic typu dzikiego z samcami z zbalansowanej linii mutantów Dm ime4 (Rysunek dodatkowy 2, ime4Δnull/TM3sb). Około 91% potomstwa osiągnęło stadium dorosłe w porównaniu do 94% potomstwa typu dzikiego (Rysunek 4). Różnica ta nie była istotna statystycznie.
W celu dalszej walidacji metody wykorzystano również homozygotyczne samce mutantów Dm ime45. Jednakże mutanty homozygotyczne były w zbyt złym stanie, aby się rozmnażać, i ginęły przed złożeniem embrionów. Zatem jednym z ograniczeń eksperymentu jest konieczność zachowania wystarczającego stanu zdrowia samców, aby umożliwić im reprodukcję w celu wygenerowania początkowej populacji embrionów do śledzenia.
Rycina 1: Linie mutantów Dm ime4 pojawiają się na poziomach poniżej mendlowskich. Przedstawiono linie, w których zmutowano fragmenty domeny katalitycznej lub domeny wiążącej Ado-Met (szczegóły znajdują się w Rycini uzupełniającej 1). W niektórych liniach fragmenty jednej z domen zastąpiono Ala (mutageneza skanująca alaniną), natomiast w innych usunięto jedną lub obie domeny. Stosunek zaobserwowanej liczby homozygot do liczby oczekiwanych przedstawiono w procentach (w porównaniu do kontrolnych rodzeństwa heterozygotycznych, schemat sortowania i analiza chi-kwadrat znajdują się w Rycinie uzupełniającej 3). Analizy chi-kwadrat przeprowadzono w celu ustalenia, czy różnica między wartością zaobserwowaną a oczekiwaną była istotna statystycznie i nie wynikała z samego przypadku (wartości p < 0,01). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej (wskazano minimum trzy próby na krzyżówkę). Arkusz kalkulacyjny ze wszystkimi danymi znajduje się w Materiałach uzupełniających. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Pozycja agaru wewnątrz fiolki może wprowadzać niezamierzone zmienne środowiskowe. Histogram liczby osobników na różnych etapach rozwoju, policzonych z krążka agaru winogronowego stroną zarodkową do dołu w fiolce z pożywką lub z agarem umieszczonym z boku fiolki z pożywką. Umieszczenie krążka agaru stroną zarodkową do dołu w fiolce spowodowało, że 94% (SD ± 0.02) początkowych zarodków przeżyło do stadium dorosłego. Umieszczenie agaru z boku fiolki z pożywką spowodowało, że tylko 61% (SD ± 0.07) pierwotnie policzonych zarodków osiągnęło stadium dorosłe. Arkusz kalkulacyjny ze wszystkimi danymi znajduje się w Materiałach uzupełniających. Liczby oczekiwane dla każdego stadium zostały określone jako początkowa liczba zarodków/L1 policzonych na krążku agaru winogronowego przed przeniesieniem do fiolki z pożywką (hipoteza zerowa: 100% wyklutych zarodków się rozwija). Liczby obserwowane to rzeczywista liczba osobników policzonych dla wskazanego stadium rozwojowego. Zatem każde stadium jest porównywane z początkową liczbą wyklutych zarodków policzonych na płytce z agarem winogronowym. Przeprowadzono analizy chi-kwadrat, aby określić, czy różnica między wartościami obserwowanymi a oczekiwanymi była istotna statystycznie i nie wynikała z przypadku, przyjmując próg wartości p = 0.05. Różnica była istotna dla zarodków hodowanych z agarem z boku fiolki z pożywką, ale nie dla tych hodowanych w krążku stroną zarodkową do dołu. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy (wskazano minimum trzy powtórzenia na krzyżówkę). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Schemat przedstawiający dwa sposoby umieszczania dysków z agaru winogronowego z zarodkami/L1 wewnątrz fiolki z pożywką. Odnotowano istotną różnicę w całkowitej liczbie zarodków i potomstwa w stadium dorosłym w zależności od położenia agaru w fiolce z pożywką. Różnica ta wynika ze zmiennej środowiskowej (nawodnienia) spowodowanej odmiennym rozmieszczeniem dysku wewnątrz fiolki z pożywką: występuje statystycznie istotna różnica między liczbą oczekiwaną a obserwowaną w zliczeniach larw i poczwarek, gdy dysk agaru został umieszczony z boku fiolki, podczas gdy nie stwierdzono istotnej różnicy między liczbami oczekiwanymi a obserwowanymi, gdy dysk agaru stykał się z pożywką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Histogram przedstawiający liczbę osobników na różnych etapach rozwoju samców typu dzikiego w porównaniu z samcami z zbalansowanej linii mutantów Dm ime4. Zbalansowane samce skrzyżowano z dziewiczymi samicami typu dzikiego, zgodnie z opisem w punkcie 2.1. Agar przeniesiono stroną z zarodkami do fiolek z pożywką. Średni stosunek osobników dorosłych wyklutych z pierwotnych zarodków policzonych w agarowych krążkach winogronowych dla krzyżówki typ dziki x typ dziki wynosił 94%, SD ± 0,02, natomiast stosunek ten dla krzyżówki mutant Dm ime4/+ x typ dziki wynosił 91%, SD ± 0,01. Analizę statystyczną przeprowadzono zgodnie z opisem dla Rysunku 2; różnice nie były istotne dla żadnej z grup. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Układ eksperymentalny. (A) Mini-klatki do zbierania embrionów i mini-szalki Petriego z agarem winogronowym. Płytki umieszczono w komorze wilgotnościowej (standardowa szalka Petriego z nasączoną wodą dyskiem z papieru absorpcyjnego), aby zapobiec odwodnieniu. W centrum każdej płytki z agarem winogronowym umieszczono niewielką ilość pasty drożdżowej. (B) Zdejmij pokrywkę uchwytu płytki do zbierania embrionów (czerwona) i włóż przygotowaną płytkę stroną z drożdżami do góry. (C) Przenieś krzyż do klatki z embrionami i natychmiast załóż pokrywkę szalki Petriego, aby zatrzymać muchy w środku. (D) Szybko zdejmij osłonę i obróć klatkę z embrionami tak, aby otwór stykał się z płytką z agarem winogronowym. Inkubuj przez 24-48 h, dokonując codziennych inspekcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Rozwój embrionów na płytkach z agarem winogronowym. (A) Embriony typu dzikiego umieszczone na mini-płytkach Petri z agarem winogronowym są liczone pod mikroskopem stereoskopowym. Płytki należy przechowywać w komorze wilgotnościowej, gdy nie są obserwowane, oraz unikać bezpośredniego światła, aby zapobiec odwodnieniu. (B) Płytki z agarem winogronowym są przechowywane w komorze wilgotnościowej, a liczba wyklutych embrionów typu dzikiego jest rejestrowana. Na zdjęciu widoczne są trzy larwy L1 typu dzikiego, które rozwinęły się z embrionów pokazanych w A. (C) Przykład zarejestrowanych liczb embrionów (dzień 1) i larw L1 (dzień 2) dla dwóch płytek pokazanych na Rysunku 5. „Liczba oczekiwana” dla hipotezy zerowej jest określona przez liczbę embrionów, które wykluły się i stały się larwami L1 w momencie przeniesienia do fiolki z pożywką (tabela poniżej). W przypadku much typu dzikiego prawie wszystkie embriony wykluwają się i rozwijają w larwy L1. Może to nie mieć miejsca w przypadku innych tłem genetycznych, a metoda ta jest stosowana w celu określenia tych różnic w przeżywalności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 7: Przenoszenie larw. (A) Po zapisaniu liczby L1, krążki z agaru winogronowego są ostrożnie usuwane z szalki Petriego za pomocą czystej (przetartej etanolem) szpatułki (B,C) i przenoszone stroną z L1 do dołu, aby miały kontakt z pożywką w fiolkach, jak pokazano w D. (E) Pustą szalkę Petriego należy dokładnie sprawdzić w celu wykrycia wszelkich pozostałych larw. Jeśli pozostałe larwy są żywe i można je przenieść do fiolki z pożywką, należy to zrobić ostrożnie i niezwłocznie (F). Jeśli pozostałe larwy są martwe lub nie można ich przenieść, należy odnotować ten fakt, aby skorygować „liczbę oczekiwaną” do późniejszych obliczeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 8: Larwy L2 przedostają się do pożywki. Widoczne są szczeliny i rowki między dyskiem z agaru winogronowego a niebieską pożywką. Należy ustalić harmonogram codziennej obserwacji fiolek, najlepiej o tej samej porze dnia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 9: Pojawienie się osobników dorosłych. (A) Larwy L3 wydostają się z pożywki, aby przejść w stadium poczwarki. (B) Osobniki dorosłe zaczynają się wykluwać w 11. dniu. Należy ustalić harmonogram codziennej obserwacji probówek, najlepiej o tej samej porze dnia, i starannie zapisywać spostrzeżenia. Liczenie należy zakończyć, gdy wszystkie poczwarki się wyklują (licząc puste łupiny poczwarek). Aby uniknąć zliczenia kolejnego pokolenia muszek, eksperyment należy przerwać w 15. dniu; należy również policzyć martwe poczwarki, jeśli takie występują (poczwarki czarne/wysuszone). Mutanty o dłuższym cyklu życiowym mogą wymagać dłuższego czasu obserwacji, co należy ustalić empirycznie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Ryciny uzupełniające. Kliknij tutaj, aby pobrać te pliki.
Materiały uzupełniające. Kliknij tutaj, aby pobrać te pliki.
Dyskusja
Podsumowując, metoda ta zapewnia dokładną i prostą ocenę żywotności Drosophila. Realizacja całego protokołu trwa około 14 dni. Procedura nie wymaga specjalistycznych umiejętności technicznych; Jednak właściwy czas, harmonogram codziennych obserwacji i staranne przenoszenie agaru są ważne dla dokładności i odtwarzalności.
Oprócz umieszczenia krążka z agarem winogronowym zarodkiem do dołu w fiolce z żywnością, kolejnym kluczowym krokiem w procedurze jest przeniesienie krążka agarowego do fiolki z żywnością nie później niż 48 godzin po wyjęciu płytki agarowej z winogron z mini klatek do pobierania zarodków. Przeniesienie agaru po 48 godzinach spowodowało utratę zarodków i larw, prawdopodobnie z powodu odwodnienia krążka agarowego. Aby policzyć przejścia L2/L3, płytka musi być inkubowana przez 72 godziny. Jeśli ten etap jest kluczowy, talerze agaru winogronowego należy wlać grubszą i użyć wilgotnej komory, aby zapobiec wysuszeniu. Krzyżówki umieszczono w klatkach do pobierania zarodków, w których umieszczono płytki o średnicy 35 mm; jednak procedura ta może być również wykonywana przy użyciu większych klatek do pobierania zarodków, takich jak taka, która mieści płytki Petriego o średnicy 60 mm lub 100 mm. Butelki z żywnością muszą być wtedy wystarczająco duże, aby pomieścić te rozmiary.
Istnieją kroki, które można dodać do tego protokołu. Jak wspomniano powyżej, przejścia L2/L3 są trudne do ilościowego określenia na płytkach ze względu na wymagany czas i potencjalne odwodnienie agaru. Dodatkowo larwy stają się bardzo ruchliwe na powierzchni agaru, co stanowi wyzwanie dla ich dokładnego policzenia. Umieszczenie płytek w lodówce na 30 minut lub dodanie kilku kropli łagodnego środka znieczulającego (roztworu lidokainy) na powierzchnię agaru przed policzeniem larw L2/L3 może pomóc spowolnić ich ruchy, aby dokładniej je policzyć. Zastrzeżeniem do tych modyfikacji jest to, że mogą one wprowadzać zmienne (wrażliwość na zimno, wrażliwość na znieczulenie) i zakłócać wyniki żywotności. Nawet bez tych kroków, używając kolorowego pokarmu, naukowcy mogą określić ilościowo wędrujące L3 / prepupae, gdy osiadają na boku fiolek z jedzeniem, aby zainicjować przepoczwarzanie. Ograniczeniem tej metody jest to, że wymaga ona, aby dorosłe osobniki użyte w krzyżówkach przeżyły znieczulenie CO2 w celu fenotypowania, aby ustawić krzyżówki w klatkach do pobierania zarodków. Homozygotyczne zmutowane samce Dm ime4 nie wracają dobrze do zdrowia i umierają kilka godzin po przebudzeniu po leczeniu CO2 . Można rozważyć inne metody unieruchamiania dorosłych w celu sortowania, takie jak umieszczanie fiolek w lodówce na kilka minut, a następnie przenoszenie fiolek do pokruszonego lodu, aby spowolnić ruch oraz szybko i wydajnie sortować.
Oprócz porównywania sił alleli i ich wpływu na żywotność, metoda ta może być stosowana do badania przesiewowego wrażliwości lub oporności na określone związki farmaceutyczne. W przeciwieństwie do innych metod, które badają toksyczność związków w hodowli komórkowej 15,16,17,18, ta metoda wykorzystuje całe organizmy, dzięki czemu ocena skutków rozwojowych jest łatwiejsza do analizy. Podsumowując, zastosowanie tego protokołu i jego modyfikacji pozwoli zmierzyć siłę alleli, a także wpływ czynników środowiskowych i związków chemicznych na żywotność, płodność, płodność, płodność, długość życia i czas trwania cyklu rozwojowego Drosophila.
Oświadczenia
Nie ma konfliktu interesów.
Podziękowania
Nasza praca jest finansowana przez NIH 1R15GM1131-01 do CFH i NIH PA -12-149 DO CFH.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dodatek przeciw pleśni | Carolina | ||
| Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
| Benchmarkowa naukowa cyfrowa płyta grzewcza | Lab Depot | H3760H | Płyta grzewcza |
| Filtrowana przez Britta woda z kranu do przygotowania agaru winogronowego i błyskawicznego pokarmu na muchy | Dowolny system | ||
| CO2 pistolet lub FlyNap | Carolina | Anesthetic do sortowania/liczenia dorosłych much | |
| Mikroskop preparacyjny/stereoskop | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Mikroskop preparacyjny |
| Drosophila fiolki i korki do hodowli | Carolina | 173120 | Fiolki z pokarmem do uprawy Drosophila |
| Mini klatka do pobierania zarodków | Genesee Scientific | 59-105 | komora służąca do zbierać zarodki |
| Kolba Erlenmeyera | Sigma-Aldrich | 70980 | Kolba Erlenmeyera |
| Formuła 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
| Agar winogronowy | Genesee Scientific | 47-102 | Pożywka używana do płytek agarowych |
| Mucha błyskawiczna powódź | Carolina | 173210 | Niebieskie podłoże do fiolek |
| Duża szalka Petriego lub dowolny przezroczysty pojemnik do użycia jako wilgotna komora poprzez umieszczenie mokrych ręczników papierowych, aby płytki winogron były wilgotne podczas inkubacji/przed i po obserwacji mikroskopowej | |||
| Metalowa szpatułka (mała) | Carolina | ||
| Kuchenka mikrofalowa | Dowolna | Do gotowania agaru winogronowego | |
| Petriego | Kord-Valmark | 2901 | Szalka Petriego do agaru winogronowego |
| Mieszadło | Lab Depot | 58948-981-EA | Mieszadło magnetyczne |
Bibliografia
- Hartung, E. W. Some observations on the larval growth rate and viability of two tumor strains of Drosophila melanogaster. Science. 107 (2777), 296-297 (1948).
- Moree, R., King, J. R. Experimental Studies on Relative Viability in Drosophila Melanogaster. Genetics. 46 (12), 1732-1752 (1961).
- Da Costa, M. V. Viability of F1 and F2 generations of crossed Drosophila and Oregon previously adapted to 2 different nutrient media. Comptes rendus de l'Académie des Sciences. 242 (1), 177-180 (1956).
- Garcia-Dorado, A., Caballero, A. The mutational rate of Drosophila viability decline: tinkering with old data. Genome Research. 8 (2), 99-105 (2002).
- Lence, T., et al. m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature. 540 (7632), 304-318 (2016).
- Haussmann, I. U., et al. m(6)A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination. Nature. 54 (7632), 301-304 (2016).
- Stockwer, H., Gallant, P. Getting started: An overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
- Hales, K. G., et al. Genetics on the Fly: A Primer on the Drosophila Model System. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Gardner, M., et al. Genetic Variation for Preadult Viability in Drosophila melanogaster. Evolution. 55 (8), 1609-1620 (2001).
- Hongay, C. F., Orr-Weaver, T. L. Drosophila Inducer of MEiosis 4 (IME4) is required for Notch signaling during oogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14855-14860 (2011).
- Zhong, S., et al. MTA Is an Arabidopsis Messenger RNA Adenosine Methylase and Interacts with a Homolog of a Sex-Specific Splicing Factor. The Plant Cell. 5, 1278-1288 (2008).
- Wang, Y., et al. N6-methyladenosine modification destabilizes developmental regulators in embryonic stem cells. Nature Cell Biology. 16, 191-198 (2014).
- Hsu, P. J., Shi, H., He, C. Epitranscriptomics influence on development and disease. Genome Biology. 18 (197), 1-9 (2017).
- Kan, L., et al. The m6A pathway facilitates sex determination in Drosophila. Nature Communications. 8, 1-16 (2017).
- Senkowski, W., et al. Three-Dimensional Cell Culture-Based Screening Identifies the Anthelmintic Drug Nitazoxanide as a Candidate for Treatment of Colorectal Cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1504-1516 (2015).
- Ramasamy, S., Bennet, D., Kim, S. Drug and bioactive molecule screening based on a bioelectrical impedance cell culture platform. International Journal of Nanomedicine. 9, 5789-5809 (2014).
- Weltin, A., et al. Cell culture monitoring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem. Lab on a Chip. 14 (1), 138-146 (2014).
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
Przedruki i uprawnienia
