Protokół opisuje specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych za pomocą komercyjnie dostępnego barwnika żelowego DNA, akwizycję serii poklatkowych żywych znakowanych komórek za pomocą super-rozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SR-SIM) oraz automatyczne śledzenie ruchu nukleoidów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nukleoidy mitochondrialne to zwarte cząstki utworzone przez cząsteczki mitochondrialnego DNA pokryte białkami. Mitochondrialne DNA koduje tRNA, rRNA i kilka niezbędnych polipeptydów mitochondrialnych. Nukleoidy mitochondrialne dzielą się i rozprowadzają w dynamicznej sieci mitochondrialnej, która ulega rozszczepieniu/fuzji i innym zmianom morfologicznym. Mikroskopia fluorescencyjna na żywo o wysokiej rozdzielczości jest prostą techniką charakteryzowania położenia i ruchu nukleoidu. W tej technice nukleoidy są zwykle znakowane za pomocą znaczników fluorescencyjnych ich składników białkowych, a mianowicie czynnika transkrypcyjnego a (TFAM). Jednak strategia ta wymaga nadekspresji konstruktu znakowanego białkiem fluorescencyjnym, co może powodować artefakty (zgłaszane dla TFAM) i w wielu przypadkach nie jest wykonalne. Organiczne barwniki wiążące DNA nie mają tych wad. Jednak zawsze wykazują barwienie zarówno jądrowego, jak i mitochondrialnego DNA, przez co brakuje im swoistości dla nukleoidów mitochondrialnych. Biorąc pod uwagę właściwości fizykochemiczne takich barwników, wybraliśmy barwnik żelowy z kwasem nukleinowym (SYBR Gold) i uzyskaliśmy preferencyjne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych w żywych komórkach. Właściwości barwnika, w szczególności jego wysoka jasność po związaniu się z DNA, pozwalają na późniejszą kwantyfikację ruchu mitochondrialnego nukleoidu przy użyciu szeregów czasowych obrazów oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości.
Wprowadzenie
Okrągłe cząsteczki DNA o wielkości 16,5 kbp stanowią materiał genetyczny mitochondriów, kodując 22 tRNA, 2 rRNA i 13 polipeptydów potrzebnych do mitochondrialnych kompleksów fosforylacji oksydacyjnej. Mitochondrialne DNA związane z mitochondrialnym czynnikiem transkrypcyjnym A (TFAM) i kilkoma innymi białkami tworzy mitochondrialne nukleoidy1,2,3,4. Nukleoidy mitochondrialne przemieszczają się i redystrybuują między składnikami sieci mitochondrialnej5,6 podczas jej morfologicznej prz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie wymienione tutaj linie komórkowe były hodowane w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) o wysokim poziomie glukozy, uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), glutaminą, penicyliną/streptomycyną i pirogronianem. Zrównoważyć wszystkie pożywki i suplementy, które mają być użyte w dniu etykietowania i obrazowania, ogrzewając je do 37 °C w inkubatorze nastawionym na 5% CO2 . Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową, w tym znakowanie, odbywają się w sterylnych warunkach pod okapem z przepływem laminarnym.
1. Etykietowanie komórek na żywo
- Dzień przed procedurą znakowania nal....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Charakteryzacja znakowania żywych komórek za pomocą SG
W pierwszej kolejności, za pomocą mikroskopii konfokalnej, scharakteryzowano rozkład SG w komórkach po inkubacji z barwnikiem w różnych rozcieńczeniach. Po inkubacji z wysokimi stężeniami SG lub picoGreen oba barwniki znakowały głównie jądra komórkowe i wykazywały punktowe barwienie w cytoplazmie (Rysunek 1), podobnie jak w opublikowanych danych dla innego dodatnio naładowanego barwni.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół składa się z kilku krytycznych elementów: Aby osiągnąć preferencyjne znakowanie mitochondrialnego DNA, stężenie barwnika wiążącego DNA podczas inkubacji powinno być utrzymywane na bardzo niskim poziomie (np. rozcieńczenie 1:10 000 typowego komercyjnego stada), a czas inkubacji powinien wynosić 30 minut. Czas inkubacji nigdy nie powinien przekraczać 1 godziny. Należy użyć barwnika SYBR Gold; inne barwniki wiążące DNA nie są wystarczająco jasne, aby wygenerować silny sygnał po znakowaniu w niskim stężeniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Asifie Akhtar i Angelice Rambold (obie z Instytutu Immunobiologii i Epigenetyki im. Maxa Plancka) za dostarczenie komórek HeLa.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | zawierający moduł do superrozdzielczej strukturalnej mikroskopii świetlnej (SR-SIM) | |
| Wysokoglukozowa DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| miska ibidi 35 mm, szklane dno | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-dołkowy microSlide, szklane dno | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Pakiet oprogramowania do przetwarzania i wizualizacji obrazu | Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | |
| Kamera iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD z czujnikiem podświetlanym | |
| LSM880 Airyscan | Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny | Carl Zeiss | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | czerwony mitochondrialny z żywymi komórkami barwienie |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | daleka czerwień żywe barwienie mitochondrialne |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | barwnik DNA permeant DNA |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Obiektyw olejowy | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | barwnik DNA permeant cell |
| Zen Black 2012 oprogramowanie | Carl Zeiss | oprogramowanie do akwizycji i przetwarzania obrazów |
Bibliografia
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
