Method Article

Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego

DOI:

10.3791/60003

⸱

June 4th, 2020

 ,  , 
1Imaging Facility, Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych za pomocą komercyjnie dostępnego barwnika żelowego DNA, akwizycję serii poklatkowych żywych znakowanych komórek za pomocą super-rozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SR-SIM) oraz automatyczne śledzenie ruchu nukleoidów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nukleoidy mitochondrialne to zwarte cząstki utworzone przez cząsteczki mitochondrialnego DNA pokryte białkami. Mitochondrialne DNA koduje tRNA, rRNA i kilka niezbędnych polipeptydów mitochondrialnych. Nukleoidy mitochondrialne dzielą się i rozprowadzają w dynamicznej sieci mitochondrialnej, która ulega rozszczepieniu/fuzji i innym zmianom morfologicznym. Mikroskopia fluorescencyjna na żywo o wysokiej rozdzielczości jest prostą techniką charakteryzowania położenia i ruchu nukleoidu. W tej technice nukleoidy są zwykle znakowane za pomocą znaczników fluorescencyjnych ich składników białkowych, a mianowicie czynnika transkrypcyjnego a (TFAM). Jednak strategia ta wymaga nadekspresji konstruktu znakowanego białkiem fluorescencyjnym, co może powodować artefakty (zgłaszane dla TFAM) i w wielu przypadkach nie jest wykonalne. Organiczne barwniki wiążące DNA nie mają tych wad. Jednak zawsze wykazują barwienie zarówno jądrowego, jak i mitochondrialnego DNA, przez co brakuje im swoistości dla nukleoidów mitochondrialnych. Biorąc pod uwagę właściwości fizykochemiczne takich barwników, wybraliśmy barwnik żelowy z kwasem nukleinowym (SYBR Gold) i uzyskaliśmy preferencyjne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych w żywych komórkach. Właściwości barwnika, w szczególności jego wysoka jasność po związaniu się z DNA, pozwalają na późniejszą kwantyfikację ruchu mitochondrialnego nukleoidu przy użyciu szeregów czasowych obrazów oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Okrągłe cząsteczki DNA o wielkości 16,5 kbp stanowią materiał genetyczny mitochondriów, kodując 22 tRNA, 2 rRNA i 13 polipeptydów potrzebnych do mitochondrialnych kompleksów fosforylacji oksydacyjnej. Mitochondrialne DNA związane z mitochondrialnym czynnikiem transkrypcyjnym A (TFAM) i kilkoma innymi białkami tworzy mitochondrialne nukleoidy1,2,3,4. Nukleoidy mitochondrialne przemieszczają się i redystrybuują między składnikami sieci mitochondrialnej5,6 podczas jej morfologicznej przebudowy, rozszczepienia lub fuzji w zależności od fazy cyklu komórkowego, stresu i innych czynników (recenzja w Pernas et al.7). Ponadto ruch nukleoidów mitochondrialnych jest związany z chorobą tocznia rumieniowatego układowego8 i może odgrywać rolę w innych chorobach. Mikroskopia fluorescencyjna jest prostą techniką do badań żywych komórek organelli, ale technika ta ma rozdzielczość >200 nm, która jest większa niż rozmiar nukleoidów mitochondrialnych (~100 nm9,10,11,12). Limit ten został ominięty przez tak zwane techniki "super-rozdzielczości", takie jak wymuszone zubożenie emisji (STED) i mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM)13,14. Do tej pory mutocyondrium i inne DNA obrazowano w żywych komórkach za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)15. Drobne struktury submitochondrialne z pozycjami korelującymi z mtDNA zaobserwowano za pomocą STED w żywych komórkach16. Jednak te techniki super-rozdzielczości wymagają dużej intensywności oświetlenia, co powoduje efekty fototoksyczne na żywe komórki17. Dlatego obrazowanie poklatkowe nukleoidów mitochondrialnych z rozdzielczością przekraczającą granicę dyfrakcji jest wyzwaniem. Aby rozwiązać ten problem, użyliśmy mikroskopii oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości (SR-SIM)18. SIM wymaga znacznie niższej dawki oświetlenia niż STED i SMLM19. Ponadto, w przeciwieństwie do technik STED i SMLM, SIM pozwala na proste, wielokolorowe, trójwymiarowe obrazowanie (3D) i nie wymaga szczególnych właściwości fotofizycznych fluoroforów ani składu bufora obrazowania19.

Konwencjonalną strategią oznaczania nukleoidów mitochondrialnych w żywych komórkach jest fluorescencyjne znakowanie mitochondrialnego białka nukleoidowego, takie jak TFAM20. Jednak w wielu przypadkach ta strategia nie jest odpowiednia. Co więcej, nadekspresja TFAM znakowanego białkiem fluorescencyjnym powoduje powstanie poważnego artefaktu21. Znakowanie DNA barwnikami organicznymi ma przewagę nad strategią opartą na białkach fluorescencyjnych (FP). Barwniki organiczne są wolne od ograniczeń związanych ze znakowaniem FP: mogą być stosowane do każdego rodzaju komórek lub tkanek i mogą być stosowane w dowolnym momencie eksperymentu. Obrazowanie żywych komórek nukleoidów mitochondrialnych zostało opisane za pomocą kilku barwników wiążących DNA: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24 i picoGreen15,25,26. Istotną wadą większości barwników wiążących DNA do znakowania nukleoidów jest to, że barwią one całe DNA w komórce. Ukierunkowanie barwnika wyłącznie na mitochondrialne DNA jest wysoce pożądane. Aby to osiągnąć, konieczny jest staranny dobór barwnika o odpowiednich właściwościach fizykochemicznych. Wiadomo, że barwniki lipofilowe posiadające zdelokalizowany ładunek dodatni, takie jak rodamina 123, gromadzą się w żywych mitochondriach, które zachowują swój ujemny potencjał błonowy. Ponadto idealny barwnik do specyficznego znakowania nukleoidów mitochondrialnych powinien wiązać DNA z wysokim powinowactwem i emitować jasną fluorescencję po związaniu DNA. Biorąc pod uwagę te wymagania, niektóre cyjaniny są obiecujące (np. picoGreen), ale DNA jądrowe jest obficie barwione tymi barwnikami jednocześnie z DNA mitochondrialnym15,25,26. Niniejszy protokół opisuje specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych w żywych komórkach innym barwnikiem cyjaninowym, SYBR Gold (SG), oraz śledzenie nukleoidów w poklatkowych filmach SIM o superrozdzielczości. Co więcej, żywe komórki barwione SG mogą być obrazowane za pomocą dowolnego rodzaju odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (konfokalny, wirujący dysk, epifluorescencja itp.) odpowiedniego dla żywych komórek i wyposażonego w źródło światła 488 nm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie wymienione tutaj linie komórkowe były hodowane w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) o wysokim poziomie glukozy, uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), glutaminą, penicyliną/streptomycyną i pirogronianem. Zrównoważyć wszystkie pożywki i suplementy, które mają być użyte w dniu etykietowania i obrazowania, ogrzewając je do 37 °C w inkubatorze nastawionym na 5% CO2 . Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową, w tym znakowanie, odbywają się w sterylnych warunkach pod okapem z przepływem laminarnym.

1. Etykietowanie komórek na żywo

  1. Dzień przed procedurą znakowania należy wyhodować 4 x 105 komórek HeLa w 2 ml pożywki na szalce Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem #1,5. Można stosować szkiełka wielostudzienkowe, ale objętości należy regulować proporcjonalnie do objętości studni. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do około 50 000 komórek/ml i zasiać 2 ml zawiesiny komórkowej na szalce Petriego o średnicy 35 mm.
  2. Przygotować następujące rozcieńczenia komercyjnego roztworu podstawowego SYBR Gold (SG): 1:5 000. Przygotować Mitotracker Deep Red (dalekie czerwone barwienie) lub Mitotracker CMXRos Red (czerwone barwienie) (tabela materiałów; materiał handlowy rozcieńczony 1:2,000) w pożywce hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej. Przygotować taki sam zestaw rozcieńczeń picoGreen, jak dla SG.
    nuta: Rozwiązania opisane w kroku 1.2 to 2x rozwiązania do etykietowania. W miarę możliwości należy chronić wszystkie roztwory zawierające barwniki fluorescencyjne przed światłem.
  3. Umyj przylegające komórki 2 ml PBS raz. Dodać 1 ml pożywki hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej do szalki Petriego o średnicy 35 mm. W przypadku szkiełka z 8-dołkową komorą należy użyć objętości równej 1/2 całkowitej pojemności studzienki (np. dodać 125 μl, jeśli całkowita pojemność studzienki wynosi 250 μl).
  4. Dodać 1 ml 2x roztworu do etykietowania przygotowanego na etapie od 1,2 do 35 mm na szalce Petriego. W przypadku szkiełka z 8-dołkową komorą należy użyć objętości równej 1/2 całkowitej pojemności studni. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2,
    nuta: Nie inkubuj komórek z roztworem znakującym SG dłużej niż 1 godzinę, ponieważ dłuższa inkubacja spowoduje znakowanie jądrowego DNA.
  5. Ostrożnie odessać pożywkę zawierającą barwniki fluorescencyjne i raz przemyć komórki PBS.
  6. Dodać pożywkę do hodowli komórkowych bez czerwieni fenolowej i trzymać komórki w ciemności w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C do czasu obrazowania.
  7. Obrazowanie żywych komórek na mikroskopie SR-SIM wyposażonym w jednostkę inkubacyjną (patrz poniżej).

2. Akwizycja obrazu SR-SIM

  1. Zainstaluj inkubator typu stage top na stoliku mikroskopu. Ustaw żądaną temperaturę i stężenie CO2 (np. 37 °C i 5% dla komórek ssaków) i utrzymuj ciepło przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem akwizycji obrazu.
  2. Włącz wszystkie elementy mikroskopu SR-SIM, w tym lasery, i pozostaw je do rozgrzania na co najmniej 1 godzinę.
  3. Wybierz obiektyw zanurzeniowy o dużym powiększeniu i dużej aperturze numerycznej (NA) (np. olej 100x 1,46 NA) zalecany do SR-SIM przez producenta mikroskopu.
  4. Zainstalować szkiełko z komorą lub szalkę 35 mm z oznaczonymi komórkami (od kroku 1.6) na stoliku mikroskopu inkubowanego.
  5. Zlokalizuj obszar zainteresowania na próbce, najlepiej za pomocą okularów. Aby uzyskać najlepszą jakość obrazowania SR-SIM, wybierz ogniwa, które są dobrze przymocowane do szkła.
  6. Użyj wysokiej klasy kamery EM-CCD z urządzeniem do namnażania elektronów (EM-SIM), aby uzyskać obrazy SR-SIM.
  7. Korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu, ustaw wysokie wzmocnienie EM zalecane dla używanego aparatu (np. 300).
  8. Przed uzyskaniem serii poklatkowej do śledzenia nukleoidów, uzyskaj dwukolorowy obraz SR-SIM o tym samym polu widzenia: jeden kanał do barwienia mitochondriów, a drugi do SG. Ustaw pierwszy kanał koloru odpowiedni dla użytego barwnika mitochondrialnego (np. dla dalekiego czerwonego barwienia mitochondrialnego ustaw wzbudzenie na 633 nm lub więcej i filtr emisyjny długoprzepustowy 650 nm). Dla sygnału SG ustaw wzbudzenie na 488 nm i filtr emisyjny pasmowo-przepustowy 500–550 nm.
  9. Korzystając z oprogramowania, ustaw najniższą możliwą moc lasera zarówno dla linii barwienia 488 nm, jak i dalekiej czerwieni.
    nuta: Typowe ustawienie to 1% mocy wyjściowej lasera regulowanej przez przestrajalny filtr akustyczno-optyczny (AOTF).
  10. Jeśli mikroskop SIM rejestruje kanały tylko sekwencyjnie (konfiguracja z jedną kamerą), wyłącz kanał wykrywania dalekiej czerwonej plamy.
  11. Ustaw akwizycję pojedynczej płaszczyzny ogniskowej, wyłączając akwizycję Z-stack, odznaczając pole Z-stack w oprogramowaniu.
  12. Ustaw najkrótszy możliwy czas naświetlania kamery EM-CCD.
  13. Ustaw trzy obroty siatki zamiast pięciu.
  14. Aby zwiększyć liczbę klatek na sekundę, w zakładce Pobieranie oprogramowania ustaw kamerę tak, aby odczytywała dane tylko z centralnego obszaru czujnika kamery zamiast "Full Chip".
    nuta: Na przykład przełączenie z odczytu obszaru 1 000 x 1 000 pikseli z pełnym czujnikiem na odczyt tylko 256 x 256 pikseli pozwala skrócić czas ekspozycji aparatu z 50 ms do 13,4 ms i całkowity czas wyświetlania klatki z 1,8 s do 1,2 s. Jeśli odczytywana jest tylko środkowa część matrycy aparatu, pole widzenia będzie bardzo małe dla obiektywu 63x lub 100x zwykle używanego w SR-SIM. Krótszy czas naświetlania zmniejszy stosunek sygnału do szumu obrazów.
  15. Zoptymalizuj moc lasera i czas ekspozycji kamery: uzyskaj dwuwymiarowe (2D) obrazy SR-SIM znakowanych komórek przy kilku wartościach mocy lasera (np. 0,5%, 1%, 1,5%, 2%) i kilku czasach naświetlania (np. 13,4 ms, 25 ms, 50 ms).
  16. Przetwórz nieprzetworzone zestawy danych SIM (patrz krok 3.1).
  17. Wybierz moc lasera i czasy naświetlania kamery, które dają obrazy SIM z jasnymi punktami w mitochondriach (tj. nukleoidami) z niewielkimi lub żadnymi artefaktami generowanymi przez przetwarzanie SIM. Sprawdź obszary poza mitochondriami (np. 1% mocy lasera na ciele stałym 488 nm i 25 ms ekspozycji kamery EM-CCD).
  18. Rozpocznij rejestrację serii poklatkowej, korzystając z ustawień zoptymalizowanych w krokach 2.15–2.17.

3. Przetwarzanie i analiza danych

  1. Przetwarzaj surowe zestawy danych SIM za pomocą modułu oświetlenia strukturalnego odpowiedniego oprogramowania (tabela materiałów): zaznacz pole wyboru Auto dla parametrów przetwarzania karty SIM. Aby automatycznie przetwarzać wiele plików, użyj narzędzia do przetwarzania wsadowego, usuń zaznaczenie opcji Użyj bieżącego dla wsadu, kliknij przycisk Uruchom wsadowo i wybierz wiele plików do przetwarzania na karcie SIM.
  2. Konwertuj zestawy danych szeregów czasowych przetwarzanych przez kartę SIM do formatu IMS za pomocą oprogramowania do konwersji plików Imaris (tj. wersji odpowiadającej wersji oprogramowania Imaris).
  3. Otwórz przekonwertowany plik w oprogramowaniu (wersja 8.4.1 lub nowsza), które ma licencję na moduł Lineage (lub Track).
  4. Uruchom kreatora tworzenia "Spoty", klikając ikonę Dodaj nowe miejsca. Zostanie uruchomiony kreator tworzenia.
  5. Wybierz kartę Utwórz kreatora.
  6. W pierwszym kroku kreatora kliknij opcję Śledź miejsca (w czasie) i przejdź do drugiego kroku kreatora.
  7. Ustaw Szacowana średnica XY na 0,1-0,15 μm, kliknij Odejmowanie tła i przejdź do trzeciego kroku.
  8. Dostosuj próg w filtrze "Jakość", przeciągając pionową linię na histogramie tak, aby większość nukleoidów była wykrywana jako "plamy", podczas gdy artefakty nie były wykrywane (tj. wykryte miejsca były oznaczone jako kulki nałożone na obraz). Sprawdź, czy tak jest w przypadku każdej klatki i w razie potrzeby ponownie dostosuj próg. Przejdź do czwartego, a następnie do piątego kroku kreatora.
  9. Wybierz algorytm ruchu autoregresyjnego. Ustaw maksymalną odległość na 0,5 μm. Ustaw maksymalny rozmiar odstępu na 0.
  10. Przyjrzyj się każdej klatce w szeregach czasowych i sprawdź, czy nie są rysowane fałszywe ścieżki i czy nie są wprowadzone przerwy między ścieżkami (ścieżki zbudowane przez kreatora z bieżącymi ustawieniami są natychmiast oznaczane jako linie nałożone na obraz). W razie potrzeby dostosuj "Maksymalną odległość". Przejdź do szóstego kroku kreatora. Wybierz filtr Czas trwania ścieżki i ustaw próg 3–5 s.
  11. Jeśli aktualnie wykryte miejsca lub ścieżki nie są optymalne, wróć do poprzednich kroków kreatora za pomocą przycisków nawigacyjnych (w dolnej części okna kreatora) potrzebnych do precyzyjnego dostrojenia dowolnego parametru tworzenia spotów lub ścieżek.
  12. Gdy precyzyjnie dostrojone parametry pozwolą oprogramowaniu wykryć wszystkie miejsca i poprawnie zbudować ścieżki, kliknij przycisk nawigacyjny z zieloną strzałką w kreatorze, aby potwierdzić utworzenie ścieżek.
  13. Wyodrębnij statystyki ścieżek, klikając okno z ikoną Statystyki. Wybierz potrzebne parametry statystyk (zakładki Szczegółowe i Wartości średnie w obszarze Statystyki) i wyeksportuj wartości jako pliki csv, klikając ikonę stacji dyskietek w celu kwantyfikacji i wizualizacji.
    nuta: Przykładami ważnych parametrów są maksymalna prędkość toru, średnia prędkość toru, długość toru i przemieszczenie toru.
  14. Jeśli zestaw danych obrazów musi zostać zaprezentowany lub opublikowany, utwórz migawki i/lub pliki wideo reprezentujące serię poklatkową z opcjonalnie nałożonymi ścieżkami za pomocą narzędzi Migawka lub Animacja.

4. Akwizycja obrazu konfokalnego

  1. Zainstalować inkubator typu stage top na stoliku mikroskopowym, ustawić żądaną temperaturę i stężenie CO2 (tj. 37 °C i 5% dla komórek ssaków) i utrzymywać w cieple przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem akwizycji obrazu.
  2. Włącz wszystkie elementy konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, w tym lasery, i pozostaw je do rozgrzania na co najmniej 1 godzinę.
  3. Wybierz żądany obiektyw o średnim lub dużym powiększeniu i próbkowaniu przestrzennym zgodnie z kryteriami Nyquista.
  4. Dla kanału SG ustaw wzbudzenie na 488 nm i zakres wykrywania 500–550 nm. W przypadku mitochondrialnego kanału barwienia ustaw na 561 nm i emisję 570–630 nm dla barwnika czerwonego lub wzbudzenie 633 nm i emisję >650 nm dla barwnika dalekiej czerwieni.
  5. Ustaw najniższą możliwą moc lasera (zwykle 1% lub mniej), która pozwala na akwizycję sygnałów o wzmocnieniu detektora PMT wynoszącym 700 mV.
  6. Uzyskaj dwukolorowe obrazy konfokalne komórek, w których nukleoidy mitochondrialne są wykrywane w "kanale SG", a mitochondria są wykrywane w kanale "czerwonym" lub "dalekim czerwonym".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka etykietowania żywych komórek za pomocą SG
Po pierwsze, rozkład SG w komórkach po inkubacji z barwnikiem w różnych rozcieńczeniach scharakteryzowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Po inkubacji z wysokimi stężeniami SG lub picoGreen, oba barwniki w większości znakowały jądra i wykazywały punktowe barwienie w cytoplazmie (Rysunek 1), podobnie jak w przypadku opublikowanych danych dla innego dodatnio naładowanego barwnika cyjaninowe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół składa się z kilku krytycznych elementów: Aby osiągnąć preferencyjne znakowanie mitochondrialnego DNA, stężenie barwnika wiążącego DNA podczas inkubacji powinno być utrzymywane na bardzo niskim poziomie (np. rozcieńczenie 1:10 000 typowego komercyjnego stada), a czas inkubacji powinien wynosić 30 minut. Czas inkubacji nigdy nie powinien przekraczać 1 godziny. Należy użyć barwnika SYBR Gold; inne barwniki wiążące DNA nie są wystarczająco jasne, aby wygenerować silny sygnał po znakowaniu w niskim stężeniu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Asifie Akhtar i Angelice Rambold (obie z Instytutu Immunobiologii i Epigenetyki im. Maxa Plancka) za dostarczenie komórek HeLa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Elyra PS1Carl Zeisszawierający moduł do superrozdzielczej strukturalnej mikroskopii świetlnej (SR-SIM)
Wysokoglukozowa DMEMGIBCO/ThermoFisher31966021
miska ibidi 35 mm, szklane dnoIbidi Gmbh81158
ibidi 8-dołkowy microSlide, szklane dnoIbidi Gmbh80827
Pakiet oprogramowania do przetwarzania i wizualizacji obrazuImaris 8.4.1Bitplane/Oxford Instruments
Kamera iXon 885Andor TechnologiesEMCCD z czujnikiem podświetlanym
LSM880 AiryscanLaserowy skaningowy mikroskop konfokalnyCarl Zeiss
Mitotracker CMXRos RedThermoFischerM7512czerwony mitochondrialny z żywymi komórkami barwienie
Mitotracker Deep Red FMThermoFischerM22426daleka czerwień żywe barwienie mitochondrialne
picoGreenThermoFischerP7581barwnik DNA permeant DNA
Plan Apochromat 100x/1.46 Obiektyw olejowyCarl Zeiss
SYBR GoldThermoFischerS11494barwnik DNA permeant cell
Zen Black 2012 oprogramowanieCarl Zeissoprogramowanie do akwizycji i przetwarzania obrazów
multimodalny mikroskop superrozdzielczy z detektorem matrycowym

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
  2. Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013(2012).
  3. Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
  4. Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
  5. Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
  6. Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
  7. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
  8. Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
  9. Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35(2014).
  10. Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
  11. Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
  12. Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
  13. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  14. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  15. Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
  16. Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
  17. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348(2015).
  18. Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  19. Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
  20. Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
  21. Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549(2016).
  22. Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
  23. Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
  24. Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
  25. He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
  26. Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
  27. Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial NucleoidsSYBR GoldStructured Illumination MicroscopyLive Cell ImagingTime lapse ImagingFluorescent DyeMitochondrial DNASuper resolution MicroscopyNucleoid TrackingCell Culture

Related Articles