Rozróżnianie i mapowanie pierwotnych i przetworzonych transkryptów w mitochondrium kukurydzy przy użyciu cyrkularnej strategii opartej na RT-PCR

Summary

Prezentujemy strategię opartą na cyrkularnym RT-PCR, łączącą cyrkularny RT-PCR, ilościowy RT-PCR, leczenie polifosfatazą 5' RNA i Northern blot. Protokół ten obejmuje etap normalizacji w celu zminimalizowania wpływu niestabilnego trifosforanu 5' i nadaje się do rozróżniania i mapowania pierwotnych i przetworzonych transkryptów stabilnie zgromadzonych w mitochondrium kukurydzy.

Abstract

W mitochondriach roślinnych, niektóre transkrypty w stanie ustalonym zawierają 5' trifosforan pochodzący z inicjacji transkrypcji (transkrypty pierwotne), podczas gdy inne zawierają 5' monofosforan generowany po transkrypcji (przetworzone transkrypty). Aby rozróżnić te dwa typy transkryptów, opracowano kilka strategii, a większość z nich zależy od obecności/braku trifosforanu 5'. Jednak trifosforan na pierwotnych końcach 5' jest niestabilny, co utrudnia wyraźną dyskryminację tych dwóch typów transkryptów. Aby systematycznie różnicować i mapować pierwotne i przetworzone transkrypty stabilnie zgromadzone w mitochondrium kukurydzy, opracowaliśmy strategię opartą na cyrkulacyjnym RT-PCR (cRT-PCR), łącząc cRT-PCR, leczenie polifospatazą RNA 5', ilościowy RT-PCR (RT-qPCR) i Northern blot. Jako ulepszenie, strategia ta obejmuje etap normalizacji RNA w celu zminimalizowania wpływu niestabilnego 5' trifosforanu.

W tym protokole, wzbogacone mitochondrialne RNA jest wstępnie traktowane przez polifosfatazę 5' RNA, która przekształca trifosfatat 5' w monofosforan. Po cyrkularyzacji i odwrotnej transkrypcji dwa cDNA pochodzące z RNA traktowanych i nietraktowanych polifosfatazą 5' są normalizowane przez dojrzałe rRNA kukurydzy 26S, które ma przetworzony koniec 5' i jest niewrażliwe na polifosfatazę 5'. Po normalizacji pierwotne i przetworzone transkrypty są rozróżniane poprzez porównanie produktów cRT-PCR i RT-qPCR uzyskanych z traktowanych i nietraktowanych RNA. Końce transkryptu są oznaczane przez klonowanie i sekwencjonowanie produktów cRT-PCR, a następnie weryfikowane za pomocą Northern blot.

Korzystając z tej strategii, udało się określić większość transkryptów w mitochondriach kukurydzy. Ze względu na skomplikowany wzorzec transkryptów niektórych genów mitochondrialnych, kilka transkryptów w stanie stacjonarnym nie zostało zróżnicowanych i/lub zmapowanych, chociaż wykryto je w Northern blot. Nie jesteśmy pewni, czy ta strategia jest odpowiednia do rozróżniania i mapowania transkryptów w stanie ustalonym w innych mitochondriach roślinnych lub w plastydach.

Introduction

W mitochondriach roślinnych wiele dojrzałych i prekursorowych RNA jest akumulowanych jako wiele izoform, a transkrypty w stanie ustalonym można podzielić na dwie grupy na podstawie różnicy na ich końcach 5'1^,2,3,4. Pierwotne transkrypty mają końce 5' trifosforanowe, które pochodzą z inicjacji transkrypcji. Natomiast przetworzone transkrypty zawierają monofosforan 5' generowany przez przetwarzanie potranskrypcyjne. Dyskryminacja i mapowanie tych dwóch typów transkryptów są ważne dla rozwikłania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tra....

Protocol

1. Projekt podkładu

1. Projektowanie starterów specyficznych dla genów do odwrotnej transkrypcji (RT) za pomocą oprogramowania do projektowania starterów PCR (tabela materiałów) w oparciu o ogólne zasady projektowania starterów¹⁷.
   nuta: Startery RT są wysoce specyficzne dla docelowych transkryptów i są na ogół zakotwiczone w części 5' sekwencji kodujących (dojrzałe mRNA i prekursorowe RNA) lub ~500-600 nt poniżej przewidywanego końca 5' (18S i 26S rRNA).
2. Zaprojektuj pary rozbieżnych starterów w celu amplifikacji kolistych transkryptów przez cRT-PCR.
   UWAGA: Sparowane rozbieżne st....

Results

Oszacowanie efektywności cyrkularyzacji mitochondrialnego RNA

W poprzednim badaniu, zarówno całkowite, jak i mitochondrialne RNA zostały użyte do mapowania cRT-PCR końców transkryptu mitochondrialnego u Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), a dwa typy RNA dały podobne wyniki mapowania¹². Początkowo wykorzystaliśmy również całkowite RNA do mapowania cRT-PCR końców transkryp.......

Discussion

W poprzednim badaniu całkowite i mitochondrialne RNA z hodowli zawiesinowej rzodkiewnika wykorzystano do mapowania mitochondrialnych końców transkryptu za pomocą cRT-PCR i uzyskano podobne wyniki¹². Jednak tylko wzbogacony mitochondrialny RNA został użyty do mapowania mitochondrialnych końców transkryptu w wielu innych badaniach 1,2,3,9. Odkryliśmy, że wzbogacen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kwas octowy	Aladdin, Chiny	A112880	Do przygotowania 1x bufor TAE
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific, USA	4359659	Termocykler do amplifikacji PCR
Kwas askorbinowy	Sigma-aldrich, USA	V900134	Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego
Biowest Agaroza	Biowest, Hiszpania	9012-36-6	Aby rozwiązać PCR Produkty i RNA
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-aldrich, USA	A1933	Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego
Błękit bromofenolowy	Sigma-aldrich, USA	B8026	Do przygotowania buforu ładującego do elektroforezy w żelu agarozowym i Northern blot
DEPC	Sigma-aldrich, Stany Zjednoczone	V900882	Dezaktywacja RNazy
DIG Północny zestaw startowy	Roche, USA	12039672910	Do znakowania DIG-RNA i Northern blot. Ten zestaw zawiera odczynniki do znakowania transkrypcji RNA polimerazą DIG i T7 RNA, hybrydyzacji i detekcji chemiluminescencyjnej.
EDTA	Sigma-aldrich, Stany Zjednoczone	V900106	Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego i 1x buforu TAE
	EGTA Sigma-aldrich, USA	E3889	Do przygotowania buforu płuczącego
System dokumentacji żelu	Bio-Rad, USA	Gel Doc XR+	Do obrazowania żelu agarozowego
Glycerol	Sigma-aldrich, USA	G5516	Do przygotowania buforu ładującego do elektroforezy w żelu agarozowym
GoldView II (5,000x)	Solarbio,. Chiny	G8142	barwienie DNA
Hybond-N +, membrana nylonowa	Amersham Biosciences, USA	RPN119	Dla Northern blot
Image Lab	Bio-Rad, USA	Image Lab 3.0	Żel do obrazowania i porównaj obfitość produktów PCR.
KH2PO4	Sigma-aldrich, Stany Zjednoczone	V900041	Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego
KOH	Aladdin, Chiny	P112284	Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego
L-cysteina	Sigma-aldrich, USA	V900399	Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego
Millex	Millipore, USA	SLHP033RB	Do sterylnej ekstrakcji i myjące przez filtrację
Miracloth	Calbiochem, USA	475855-1R	Do filtrowania zmielonych tkanek ziarna
MOPS	Sigma-aldrich, USA	V900306	Do przygotowania buforu biegowego dla Northern blot
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, USA	2000C	Do oznaczania stężenia i czystości
RNA NaOH	Sigma-aldrich, USA	V900797	Dla przygotowanie buforu płuczącego
pEASY-Blunt prosty wektor klonowania	TransGen Biotech, Chiny	CB111	Klonowanie pasma odzyskanego w żelu. Zawiera promotor T7 kilka punktów bazowych przed miejscem insercji.
Polimeraza DNA Phanta max super-fidelity	Vazyme, Chiny	Polimeraza DNA P505	do amplifikacji PCR
Poliwinylopirolidon 40	Sigma-aldrich, Stany Zjednoczone	V900008	Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, USA	Primer Premier 6.24	Do projektowania starterów do odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR
Odwrotna transkryptaza PrimeScript II	Takara, Japonia	2690	Do syntezy pierwszej nici cDNA
PureLink RNA Mini kit	Thermo Fisher Scientific, USA	12183025	Do oczyszczania
RNA RNA 5' polifosfatazy	Epicentrum, USA	RP8092H	Aby przekształcić 5' trifosforan w monofosforanowy
inhibitor RNazy	New England Biolabs, Wielka Brytania	M0314	Składnik reakcji samoligatacji RNA i leczenia polifosfatazą 5' i służy do hamowania aktywności RNazy.
Octan sodu	Sigma-aldrich, Stany Zjednoczone	V900212	Do przygotowania buforu biegowego dla Northern blot
Chlorek sodu	Sigma-aldrich, USA	V900058	Do przygotowania 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes	Bio-Rad, USA	1725202	Do RT-qPCR
T4 RNA Ligaza 1	New England Biolabs, Wielka Brytania	M0437	Do cyrkularyzacji RNA
Tetrasodowy pirofosforan	Sigma-aldrich, USA	221368	Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego
TIANgel midi zestaw do oczyszczania	Tiangen Biotech, Chiny	DP209	Do oczyszczania fragmentów DNA z żelu agarozowego
Tris	Aladdin, Chiny	T110601	Do przygotowania 1x bufor TAE
Odczynnik TRIzol	Invitrogen, USA	15596026	Do ekstrakcji mitochondrialnego RNA.
Uniwersalny zestaw do oczyszczania DNA	Tiangen Biotech, Chiny	DP214	Do odzyskiwania zlinearyzowanych plastmidów z reakcji trawienia enzymu restrykcyjnego
Cyjanol ksylenu FF	Sigma-aldrich, USA	X4126	Do przygotowania buforu ładującego do elektroforezy w żelu agarozowym