Artykuł metodologiczny

Projektowanie, synteza i właściwości fotochemiczne klikalnych związków w klatkach

15.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60021

⸱

15 października 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomolecular Science, Faculty of Science, Toho University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół syntezy i pomiaru właściwości fotochemicznych modułowych związków zamkniętych w klatkach z klikalnymi cząstkami.

Streszczenie

Związki zamknięte w klatkach umożliwiają manipulację fizjologią komórki za pośrednictwem światła z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Jednak ograniczona różnorodność strukturalna obecnie dostępnych grup umieszczanych w sadzach oraz trudności w modyfikacji syntetycznej bez poświęcania ich skuteczności fotolizy stanowią przeszkodę w rozszerzaniu repertuaru związków trzymanych w klatkach do zastosowań w żywych komórkach. Ponieważ chemiczna modyfikacja grup fotoklatkowania typu kumarynowego jest obiecującym podejściem do otrzymywania związków w klatkach o różnych właściwościach fizycznych i chemicznych, przedstawiamy metodę syntezy klikalnych związków w klatkach, które można łatwo modyfikować za pomocą różnych jednostek funkcjonalnych za pomocą katalizowanej miedzią(I) cyklizacji Huisgena. Cząsteczka platformy modułowej zawiera grupę (6-bromo-7-hydroksykumaryno-4-ylo)metylową (Bhc) jako grupę fotoklatkową, która wykazuje wysoką wydajność fotolizy w porównaniu z konwencjonalnymi 2-nitrobenzylami. Przedstawiono ogólne procedury przygotowania klikalnych związków klatkowych zawierających aminy, alkohole i karboksylany. Dodatkowe właściwości, takie jak rozpuszczalność w wodzie i zdolność do celowania w komórki, można łatwo włączyć do klikalnych związków klatkowych. Ponadto zmierzono właściwości fizyczne i fotochemiczne, w tym wydajność kwantową fotolizy, i stwierdzono, że są one lepsze niż w przypadku odpowiednich związków Bhc zamkniętych w klatkach. Opisany protokół można zatem uznać za potencjalne rozwiązanie problemu braku różnorodności strukturalnej w dostępnych związkach trzymanych w klatkach.

Wprowadzenie

Związki w klatce to syntetyczne cząsteczki, których pierwotne funkcje są czasowo maskowane przez kowalencyjnie dołączone fotousuwalne grupy ochronne. Co ciekawe, związki biologicznie istotnych cząsteczek w klatkach stanowią nieodzowną metodę czasoprzestrzennej kontroli fizjologii komórki1,2,3,4,5,6. W 1977 roku Engels i Schlaeger opisali ester 2-nitrobenzylowy cAMP jako przepuszczalną dla membrany i fotolabilną pochodną cAMP7. W następnym roku Kaplan opisał ester 1-(2-nitrofenylo)etylowy ATP (NPE-ATP) i nazwał ten związek "w klatce" ATP8. Od tego czasu istnieje szereg fotochemicznie usuwalnych grup ochronnych, takich jak 2-nitrobenzyle, p-hydroksyfenacyle9, 2-(2-nitrofenylo)etylo10,11, 7-nitroindolin-1-yls12,13, and (kumaryno-4-ylo)metylowe14,15,16 zostały użyte do przygotowania związków zamkniętych w sadzach.

Synteza związków zamkniętych w klatkach o pożądanych dodatkowych właściwościach, takich jak przepuszczalność błony, rozpuszczalność w wodzie i zdolność do celowania komórkowego, powinna ułatwić biologiczne zastosowania komórek. Ponieważ właściwości fizyczne i fotochemiczne tych cząsteczek zależą przede wszystkim od struktury chemicznej fotochemicznie usuwalnych grup ochronnych użytych do ich przygotowania, wymagany jest zróżnicowany repertuar grup foto-klatkowych. Jednak różnorodność strukturalna obecnie dostępnych grup umieszczanych w sadzach, które wykazują wysoką wydajność fotolizy, jest ograniczona. Może to stanowić przeszkodę w zwiększeniu wykorzystania związków trzymanych w klatkach.

Aby rozwiązać ten problem, repertuar grup foto-klatkowych został rozszerzony poprzez chemiczną modyfikację istniejących fotousuwalnych grup ochronnych lub zaprojektowanie nowych fotolabilnych chromoforów o doskonałych właściwościach fotofizycznych i fotochemicznych. Przykłady obejmują nitrodibenzofuran (NDBF)17, [3-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl)-2-butyl] (DMNPB)18,19, wrażliwa na wapń fotoklatka 2-nitrobenzylowa20, podstawione kumarylometyle (DEAC45021, DEAdcCM22, 7-azetidinyl-4-methylcoumarin23, oraz styryl coumarins24), pochodne cyjaniny (CyEt-pan)25, oraz pochodne BODIPY26,27.

Ponadto, wcześniej opracowaliśmy grupę (6-bromo-7-hydroksykumaryno-4-ylo)metylową (Bhc) i z powodzeniem zsyntetyzowaliśmy różne związki neuroprzekaźników w klatkach28, second messengers29,30, and oligonukleotydy31,32,33 wykazujące duże przekroje wzbudzenia jedno- i dwufotonowego. Jeśli dodatkowe właściwości mogą być łatwo zainstalowane w grupach umieszczanych w klatkach bez uszczerbku dla ich wrażliwości na światło, wówczas repertuar związków zamkniętych w klatkach może zostać rozszerzony34,35,36,37,38,39. W związku z tym zaprojektowaliśmy modułowe związki w klatkach, które składają się z trzech części, a mianowicie grupy Bhc jako rdzenia reagującego na światło, uchwytów chemicznych do instalacji dodatkowych funkcji oraz cząsteczek, które mają być maskowane40,41.

Tak więc, ten artykuł dostarcza praktycznej metody przygotowania związków biologicznie istotnych cząsteczek. Niniejszy protokół opisuje metody przygotowania klikalnej platformy dla grup foto-klatkowych, wprowadzenia dodatkowych funkcjonalności w celu poszerzenia repertuaru związków umieszczanych w klatkach, pomiaru ich właściwości fizycznych i fotochemicznych oraz selektywnego kierowania typu komórkowego klikalnego związku klatkowego do dalszego zastosowania komórkowego.

Protokół

1. Synteza modułowej grupy klatkowania paBhc dla klikalnych związków klatkowych28,41

  1. Otrzymywanie chlorku metylu (6-bromo-7-hydroksykumaryno-4-ylo)metylu (Bhc-CH2Cl)
    1. Umieścić 4-bromoresorcynol (9,742 g, 51,5 mmol) w kolbie okrągłodennej o pojemności 100 ml wyposażonej w mieszadło.
    2. Dodać stężenieH2SO4 (98%, 30 ml) do kolby i wymieszać mieszaninę do rozpuszczenia.
    3. Dodawać kroplami 4-chloroacetooctan etylu (10 ml, 74 mmol).
    4. Kontynuuj mieszanie mieszaniny w temperaturze otoczenia przez 5 dni.
    5. Oddzielnie umieść pokruszone kostki lodu (~200 ml) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml.
    6. Wlać mieszaninę reakcyjną do lodu i energicznie mieszać przez 30 minut, aż do uzyskania drobno sproszkowanego osadu.
    7. Zebrać osad przez filtrację próżniową. Umyj jasnobrązowy osad wodą pięć razy.
    8. Wysuszyć osad w próżni przez noc, aby uzyskać BhcCH2Cl w postaci jasnobrązowego proszku (13,57 g, 46,9 mmol).
  2. Przygotowanie (6-bromo-7-hydroksykumaryno-4-ylo)metanolu (BhcCH2OH)
    1. Umieścić przygotowany BhcCH2Cl (1,1440 g, 3,95 mmol) i 1 M HCl (300 mL) w kolbie okrągłodennej o pojemności 1 l wyposażonej w kondensator Dimroth. Mieszać mieszaninę w temperaturze 140 °C przez 5 dni. Po tym czasie schłodzić mieszaninę do temperatury otoczenia.
    2. Usuń wodę z reakcji przez obrotowe odparowanie w próżni, aby otrzymać BhcCH2OH (1) w postaci jasnobrązowego proszku (1,0359 g, 3,82 mmol, 97% wydajności).
      UWAGA: Użycie 250 ml 1 M HCl na 1 g BhcCH2Cl daje zadowalający wynik.
  3. OtrzymywaniepaBhcCH2OH (2) w reakcji Mannicha
    1. Umieścić paraformaldehyd (446,4 mg, 14,9 mmol) w kolbie okrągłodennej o pojemności 50 ml. Dodać bezwodny etanol (5 ml) i N-metylopropargyloaminę (1,25 ml, 14,8 mmol) do kolby.
    2. Mieszać mieszaninę w temperaturze otoczenia przez 1 godzinę w atmosferze Ar.
    3. DodaćBhcCH2OH (1) (1.367 g, 5.04 mmol) do kolby. Podgrzać mieszaninę do temperatury 80 °C za pomocą aparatu do podgrzewania bloku i kontynuować mieszanie mieszaniny w temperaturze 80 °C przez 2 godziny w atmosferze Ar.
    4. Zatrzymać grzałkę bloku i schłodzić mieszaninę reakcyjną do temperatury pokojowej.
    5. Zebrać powstały jasnobrązowo-żółty osad przez filtrację próżniową. Przepłukać osad dwukrotnie niewielką ilością bezwodnego etanolu (za każdym razem 1 ml).
    6. Usunąć nadmiar etanolu w próżni, aby uzyskać paBhcCH2OH (2) (1.393 g, 3.96 mmol).

2. Przygotowanie klikalnych związków w klatkach

UWAGA: Następujące procedury mogą być stosowane do przygotowania innych klikalnych związków w klatkach zawierających hydroksylowe, aminowe i karboksylowe grupy funkcyjne.

  1. Ogólna procedura 1: Przygotowanie klikalnej aminy w sadzu
    1. UmieścićpaBhcCH2OH (2) (709,6 mg, 2,02 mmol) i N,N'-karbonylodimidazol (CDI, 397,6 mg, 2,45 mmol) w kolbie okrągłodennej o pojemności 30 ml. Dodać suchy CH2Cl2 (6 ml) i mieszać roztwór w temperaturze otoczenia przez 1 godzinę.
    2. Dodać 4-dimetyloaminopirydynę (4-DMAP, 324,8 mg, 2,66 mmol) i tert-butyl (6-aminoheksyl)karbaminian (533,1 mg, 2,46 mmol). Mieszać roztwór w temperaturze otoczenia przez 3 godziny.
    3. Usunąć rozpuszczalnik i inne lotne substancje za pomocą wyparki obrotowej pod próżnią. Oczyścić pozostałość bezpośrednio za pomocą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym
      4. .
  2. Ogólna procedura 2: Przygotowanie alkoholu w klatce, który można kliknąć,
    1. Umieścić paklitaksel (PTX, 48,7 mg, 0,057 mmol) w kolbie okrągłodennej o pojemności 30 ml wyposażonej w zawór odcinający trójdrożny i balon Ar. Dodaj suchy CH2Cl2 (1 ml), 4-DMAP (17,1 mg, 0,14 mmol) i chloromrówczan 4-nitrofenylu (26,0 mg, 0,13 mmol).
    2. Mieszać roztwór w temperaturze otoczenia przez 2,5 godziny w atmosferze Ar.
    3. Dodać 4-DMAP (15,7 mg, 0,13 mmol) i paBhcCH2 OH (2) (39,1 mg, 0,111 mmol) do roztworu. Kontynuuj mieszanie mieszaniny w temperaturze otoczenia przez 17 godzin.
    4. Do mieszaniny dodaćCHCl 3 (10 ml) i 15% wodnego roztworu NaHCO3 (5 ml). Mieszaj energicznie mieszaninę przez około 3 minuty. Usunąć warstwę wodną za pomocą pipety.
    5. Dodać 0,5 M kwasu cytrynowego (5 ml) do kolby zawierającej warstwę organiczną. Wymieszaj mieszaninę i usuń warstwę wodną jak powyżej.
    6. Oddzielić warstwę organiczną za pomocą kolumny separacji faz. Usunąć rozpuszczalniki za pomocą wyparki obrotowej w próżni. Oczyścić produkt za pomocą standardowej chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym.
  3. Ogólna procedura 3: Przygotowanie kwasu karboksylowego z klatką, który można kliknąć
    1. Rozpuść kwas arachidonowy (33,0 μl, 0,100 mmol), paBhcCH2OH (2) (39,6 mg, 0,112 mmol) i 4-DMAP (14,1 mg, 0,115 mmol) w suchym CH2Cl2 (2 ml). Dodać N,Nʹ-diizopropylokarbodimid (DIPC, 17,0 μl, 0,110 mmol) i mieszać roztwór w temperaturze otoczenia przez 140 minut.
    2. Usunąć rozpuszczalnik w próżni. Oczyścić pozostałość bezpośrednio za pomocą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym
      3. .

3. Instalacja jednostki funkcjonalnej w klikalnych klatkach

  1. Rozpuścić pięciowodny siarczan miedzi(II) (249 mg) w wodzie jonowymiennej (IEW, 10 ml), aby uzyskać 0,1 M roztwórCuSO4.
  2. Rozpuścić 2ʹ-paBhcmoc-PTX (8,0 mg, 6,5 μmol), tris(3-hydroksypropylotriazolylometylometylo)aminę (THPTA, 17,5 mg, 40,3 μmol), l-askorbinian sodu (162,4 mg, 0,825 mmol) i azydek 15-chloro-3,6,9-trioksapentadecylu (3,1 mg, 11 μmol) w mieszaninie rozpuszczalnika 0,1 M buforu fosforanowego (2,5 ml, pH 7,2) i dimetylosulfotlenku (DMSO, 0,5 ml).
  3. Dodać 0,1 M roztwór CuSO4 (81,2 μl, 8,1 μmol) do mieszaniny reakcyjnej. Mieszaj mieszaninę w temperaturze otoczenia przez 80 minut. Monitorować postęp reakcji za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
  4. Rozpuścić osady, dodając 75% roztwór acetonitrylu i wody (3,5 ml). Otrzymany roztwór nanieść bezpośrednio na półpreparatywny system HPLC w celu oczyszczenia pożądanego produktu.
    UWAGA: Solubilizacja mieszaniny reakcyjnej przez dodanie tert-butanolu może przyspieszyć postęp reakcji.

4. Fotolityczna reakcja rozpakowywania związków w klatkach

  1. Przygotowanie roztworów podstawowych
    1. Rozpuścić żądany związek umieszczony w sadzu (5 μmol) w DMSO (500 μl), aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM. Dozować porcję każdego roztworu (10 μl) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w zamrażarce (−20 °C) do momentu tuż przed użyciem.
    2. 6 mM K3[Fe(C2O4)3] (100 ml): Rozpuścić rekrystalizowany ferrioksalan potasu (0,295 g, 0,675 mmol) w 80 ml wody. Dodać 0,5 M H2SO4 (10 ml) i odpowiednią ilość IEW, aby uzupełnić objętość do 100 ml.
      UWAGA: Żelazionoksalan potasu należy oczyścić przez rekrystalizację z gorącej wody i przechowywać w ciemności. Rekrystalizowany ferrioksalan potasu otrzymuje się w postaci trójwodzianu; dlatego jego wzór toK3[Fe(C, 2O,4)3]·3H2O, a podczas przygotowywania roztworu podstawowego należy wziąć pod uwagę masę wzoru wynoszącą 491,24. Sprawdzić czystość roztworu o stężeniu 6 mM, mierząc jego absorpcję przy długości fali 510 nm. Jeśli absorbancja wynosi <0,02, nadaje się do użycia w doświadczeniu.
    3. 0,1% bufor-fen (30 ml): Rozpuścić NaOAc·3H2O (7,35 g), 1,10-fenantrolinę (phen)·H2O (30 mg) i skonc. H2SO4 (0,9 ml) w IEW (20 ml). Dodać IEW, aby uzupełnić objętość do 30 ml.
      UWAGA: Roztwór zawiera 1,8 M NaOAc, 0,54 M H2SO4 i 0,1% 1,10-fenantroliny.
  2. Pomiar liczby fotonów za pomocą aktynometrii ferrioksalanowej
    1. Umieścić 6 mM K3[Fe(C2O4)3] (V1 L) w kuwecie kwarcowej. Naświetlać roztwór światłem o długości fali 350 nm przez 5 sekund.
    2. Przenieść napromieniowany roztwór do kuwety Pyrex o długości drogi l [cm].
    3. Dodać 0,1% bufor-fen (V2 l) do napromienionego roztworu próbki i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Zmierzyć absorbancję próbki przy długości fali 510 nm. Obliczyć średnią zmianę absorpcji w jednostce czasu (ΔA510 [s−1]).
    4. Oblicz liczbę moli generowanych jonów Fe2+ w jednostce czasu zgodnie z następującym równaniem:
      nFe2+ [mol s−1] = ((V1 + V2) [L] × ΔA510 [s−1])/(l [cm] × ε 510 [L mol−1 cm−1]),
      gdzie (V1 + V2) jest objętością próbki do pomiaru absorpcji, l jest długością drogi optycznej kuwety, a ε510 jest absorpcją molową kompleksu Fe2+-phen przy 510 nm.
      UWAGA: W typowych warunkach doświadczalnych przyjęto wartości V1 = 2,0 × 10−3 L, V2 = 0,33 × 10−3 L, l = 1,0 cm, a ε510 = 1,1 × 104 L mol−1 cm−1.
    5. Obliczyć liczbę moli fotonów, które docierają do próbki (I0), korzystając z następującego wzoru:
      I0 [einstein cm−2 s−1] = nFe2+/Φ350
      gdzie Φ 350 jest sprawnością kwantową fotoredukcji ferrioksalanu przy 350 nm.
      UWAGA: Chociaż wydajność kwantowa aktynometru ferrioksalanu potasu przy 350 nm nie została podana, zastosowano podaną wartość 1,2542 przy 358 nm.
  3. Pomiary wydajności kwantowej przy 350 nm
    1. Rozcieńczyć roztwór podstawowy próbki (w DMSO, 10 μl) buforem K-MOPS (pH 7,2, 10 ml) w celu uzyskania 10 μM roztworu w K-MOPS zawierającego 0,1% DMSO.
      UWAGA: Bufor K-MOPS składał się ze 100 mM KCl i 10 mM kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (Mops) miareczkowanego do pH 7,2 za pomocą KOH.
    2. Przenieść podwielokrotność roztworu (V1 l) do tej samej kuwety, która jest używana w fotoreakcji aktynometru chemicznego. Napromienić roztwór próbki, stosując tę samą konfigurację, która została opisana w kroku 4.2.1.
    3. Okresowo usuwać podwielokrotność (50 μl) z napromienianego roztworu i analizować przy użyciu HPLC.
    4. Określić czas napromieniania w sekundach, w którym 90% materiału wyjściowego zareagowało (t90%), dopasowując wykresy zależnego od czasu zaniku materiału wyjściowego.
      UWAGA: Absorbancja napromienianej próbki musi być utrzymywana na poziomie <0,1, tak aby można było pominąć wewnętrzne filtrowanie promieniowania. Pożądane jest, aby zużycie fotolityczne materiału wyjściowego można było przybliżyć za pomocą rozpadu jednowykładniczego, tak aby nie wystąpił niepożądany efekt wtórny, który zakłócałby proces fotolizy.
    5. Oblicz kwantową wydajność zaniku (Φdis) za pomocą następującego równania28:
      Φdis = 1/(t90% × I0 × σ350)
      gdzie t90% [s] jest czasem napromieniowania, w którym zużyto 90% materiału wyjściowego, I0 [einstein cm−2 s−1] jest liczbą moli fotonów, a σ350 [cm2 mol−1] jest dziesięcioletnim współczynnikiem ekstynkcji próbki przy 350 nm.
      UWAGA: σ350 [cm2 mol−1] = 103ε350 [M−1 cm−1].

5. Celowanie w klikalny związek w klatce za pomocą liganda HaloTag

UWAGA: Przed użyciem utrzymuj komórki HeLa w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco (DMEM, niska glukoza, pirogronian sodu, l-glutamina) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) zawierającą 1% antybiotyków (siarczan streptomycyny, penicylinę G i amfoterycynę) w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

  1. Usunąć pożywkę i trypsynizować komórki, poddając je działaniu kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, 1 ml) w temperaturze 37 °C przez 1 minutę. Dodać DMEM (4 ml) do komórek i ponownie zawiesić komórki przez delikatne pipetowanie. Wysiewać około 5 × 105 komórek na talerz do naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm w DMEM (2 ml) 24 godziny przed transfekcją.
  2. Na cztery szalki, w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, rozcieńczyć plazmidowe DNA (pcDNA3-Halo-EGFR, 14 μg) w zredukowanej pożywce surowicy (700 μl). Oddzielnie rozcieńczyć odczynnik do lipofekcji (5 μl) w zredukowanym podłożu surowicy (150 μl) do każdej z czterech probówek i pozostawić w temperaturze otoczenia na 5 minut.
  3. Dodać porcję rozcieńczonego plazmidowego DNA (150 μl) do każdej z rozcieńczonych próbek odczynnika do lipofekcji. Inkubować w temperaturze otoczenia przez 5 minut.
  4. Po utrzymaniu komórek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny, odessać DMEM i przepłukać komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, 2 ml). Dodać zredukowaną pożywkę surowicy (1,5 ml).
  5. Dodać kompleks odczynnika plazmid-lipofekcja (150 μl) do każdej potrawy. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.
  6. Odessać pożywkę, dodać porcję świeżo przygotowanego DMEM (1 ml) zawierającego 2 μM paBhc-hex-FITC/Halo i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.
  7. Odessać pożywkę zawierającą związek umieszczony w sadzkach i dwukrotnie przepłukać komórki PBS+ (1 ml na płukanie) w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych związków. Dodać zredukowaną pożywkę surowicy (500 μl) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut w celu usunięcia związków, które dostały się do komórek.
    UWAGA: PBS+ to sól fizjologiczna buforowana fosforanami uzupełniona 2 mM CaCl2 i 1 mM MgCl2.
  8. Usuń pożywkę i dwukrotnie przepłucz komórki PBS+ (1 ml). Dodać porcję podłoża (1 ml), które nie zawiera czerwieni fenolowej. Rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą skaningowej laserowej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.

6. Modulacja lokalizacji kinazy za pośrednictwem fotomediamentu za pomocą klikalnego związku w klatce

UWAGA: Przed użyciem utrzymuj komórki CHO-K1 w pożywce F-12 firmy Ham, uzupełnione 10% FBS w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

  1. Przygotować 100× roztwór roboczy (1 mM) paBhc-AA (5) w DMSO.
    UWAGA: Roztwór podstawowy związku o stężeniu 10 mM przygotowuje się i przechowuje w zamrażarce (-20 °C).
  2. Wysiewać około 5 × 105 komórek na talerz do naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm w DMEM (2 ml) 24 godziny przed transfekcją.
  3. Transfekcja komórek CHO-K1 z plazmidowym kodowaniem GFP-DGKγ 48 godzin przed eksperymentami z odtworzeniem klatek.
    UWAGA: Transfekcja odbywa się zgodnie z krokami 5.2–5.5.
  4. Zastąp pożywkę zredukowaną pożywką surowicy (2 ml). Dodać 100× roztworu roboczego paBhc-AA (20 μl) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez okres od 5 minut do 1 godziny < br /> UWAGA: Czas ładowania zależy od zastosowanej mieszanki.
  5. Umieść komórki na stoliku obiektywowym odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w oświetlacz fluorescencyjny z podwójnym źródłem światła.
  6. Wykonuj obraz fluorescencyjny co 10 s. Naświetlaj komórki światłem o długości fali 330–385 nm przez obiektyw mikroskopu przez odpowiedni czas. Alternatywnie, naświetlić komórki światłem o długości fali 405 nm za pomocą lampy Xe przez elastyczne włókna kwarcowe.
  7. Kontynuuj nagrywanie obrazów fluorescencyjnych przez 10 minut.

Wyniki

Udało się pomyślnie zsyntezować aktywowane światłem „zablokowane” związki biologicznie interesujących cząsteczek, w tym kwasu arachidonowego i paklitakselu, wyposażone w grupy reaktywne do tzw. reakcji klika (Rycina 1)28,41. Dodatkowe właściwości, takie jak rozpuszczalność w wodzie i zdolność do kierowania się do komórek, wprowadzono do paBhcmoc-PTX za pomocą cyklizacji Huisgena katalizowanej przez miedź(I) (tzw. reakcja „klik”) (Rycina 2). Następnie te aktywowane światłem „zablokowane” formy PTX poddano fotolizie, uzyskując w ten sposób aktywne, macierzyste PTX po naświetleniu falą o długości 350 nm (Rycina 3), a właściwości fizyczne i fotochemiczne tych związków ze strukturą „klik” zebrano w Tabeli 1. Wydajności kwantowe aktywowanych światłem „zablokowanych” związków 2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX (Φdis 0,14) i paBhc-AA (Φdis 0,083) były ponad dwukrotnie większe niż konwencjonalnych związków „zablokowanych” z grupą Bhc, tj. 2ʹ-Bhcmoc-PTX (Φdis 0,040) i Bhc-AA (Φdis 0,038)43. Ponadto zaobserwowano poprawę rozpuszczalności w wodzie dla 2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX, który zawiera resztę glukozy.

W eksperymentach z żywymi komórkami udało się skutecznie dostarczyć paBhc-hex-FITC/Halo do hodowanych komórek ssaczych tymczasowo eksprymujących białko fuzję składające się z białka HaloTag i receptora czynnika wzrostu nabłonka (EGFR). Zielone fluorescencje pochodzące od reszty fluoresceiny w paBhc-hex-FITC/Halo zaobserwowano na błonie komórkowej (Rycina 4). Zmodyfikowanie lokalizacji podkomórkowej kinazy za pomocą związku chemicznego zablokowanego przez paBhc uzyskano przy udziale światła. Przeniesienie diacyloglicerolokinazy γ (DGKγ) aktywuje się w obecności kwasu arachidonowego (AA)44. Komórki CHO-K1 tymczasowo eksprymujące GFP-DGKγ poddano działaniu albo AA, albo paBhc-AA (5). Dodanie AA spowodowało zmianę lokalizacji podkomórkowej DGKγ (Rycina 5A,B). Podobne zmiany w lokalizacji DGKγ zaobserwowano w komórkach traktowanych paBhc-AA po naświetleniu światłem UV (Rycina 5C,D).

Schemat drogi syntezy chemicznej z etapami reakcji, wydajnościami i procedurami dla związków 1–5.
Rycina 1: Otrzymywanie aktywowalnych chemicznie związków zabezpieczonych.
(A) Odczynniki i warunki: a. etyl 4-chloroacetoacetan/konc. H2SO4/rt/7 dni/91% wydajność, b. 1 M HCl/reflux/3 dni/97% wydajność. c. N-metylopropargylamina /HCHO/EtOH, następnie dodać (1) i ogrzewać w warunkach wrzenia z powrotem przez 17 h/79% wydajność. (B) Syntezy aktywowalnego chemicznie aminy zabezpieczonej oraz PTX i kwasu arachidonowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Synteza reakcji chemicznej, diagram katalizy przez CuSO₄; chemia klika, reakcja azotku z alkinem.
Rycina 2: Wprowadzanie jednostek funkcyjnych do związków klatkowych z grupami reaktywnymi.
(A) Synteza rozpuszczalnego w wodzie klatkowego PTX za pomocą cykloaddycji Huisgena katalizowanej przez miedź(I). (B) Struktury klatkowych związków z grupami reaktywnymi zawierających ligand HaloTag do celowania komórkowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki chromatografii i wykres kinetyczny pokazujący rozdział związków i ich degradację w czasie.
Rycina 3: Fotoliza 2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX (6).
Próbki (10 μM) w roztworze K-MOPS (pH 7,2) napromieniowano światłem o długości fali 350 nm. (A) Typowe chromatogramy HPLC dla fotolizy związku 6 (rejestrowane przy 254 nm). Próbki analizowano po określonym czasie napromieniowania. (B) Zależność ilości związku 6 od czasu fotolizy. Niebieskie kółka przedstawiają ubytek związku 6. Cienka linia ciągła to dopasowanie krzywej metodą najmniejszych kwadratów do prostego wykładniczego modelu rozpadu dla związku 6. Czerwone kwadraty pokazują wydajność PTX. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (±SD). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wizualizacja komórek, analiza mikroskopii fluorescencyjnej, wizualizacja struktur komórkowych, badania biologiczne.
Rycina 4: Obrazy fluorescencyjne hodowanych komórek ssaczych inkubowanych z paBhc-hex-FITC/Halo (8).
Komórki transfekowane plazmidem pcDNA3-Halo-EGFR inkubowano z roztworem związku 8 o stężeniu 2 μM w temperaturze 37 °C przez 30 min. Obrazy uzyskano po wielokrotnym przemywaniu buforem PBS+. Komórki HEK293T poddane fałszywemu zabiegowi (A: obraz kontrastowo-interferencyjny (DIC) i D: obraz fluorescencyjny). Komórki HEK293T (B i E) oraz komórki HeLa (C i F) tymczasowo eksprymujące białko Halo-EGFR (B i C: obrazy DIC oraz E i F: obrazy fluorescencyjne). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego obrazu.

Porównanie morfologii komórek, obrazy mikroskopii fluorescencyjnej, analiza struktur komórkowych, skala 20 μm.
Rysunek 5: Obrazy fluorescencyjne po napromieniowaniu UV komórek CHO-K1 inkubowanych z zakleszczonym kwasem arachidonowym Bhc. Komórki CHO-K1 zostały transfekowane białkiem fuzji DGKγ-EGFP.
(A) Obraz fluorescencyjny transfekowanych komórek. (B) 100 s po dodaniu roztworu kwasu arachidonowego o stężeniu 10 μM. (C) Komórki inkubowano z roztworem paBhc-AA (5) o stężeniu 10 μM w 37 °C przez 5 min. (D) 100 s po 20-sekundowym napromieniowaniu UV (330–385 nm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

związkiλmax (nm)aεmax (M-1 cm-1)bϕdiscεϕdisdRozpuszczalność (μM)e
PTX1,0
2'-Bhcmoc-PTX340105000,04040055
2'-paBhcmoc-PTX35993000,0596708,3
2'-glc-Bhcmoc-PTX373123000,141280650
Bhc-AA341108000,038390
paBhc-AA366103000,083750

Tabela 1: Właściwości fizyczne i fotochemiczne związków cufkowanych o aktywności „klik”.
a. Maksimum absorpcji (nm), b. Molarny współczynnik absorpcji przy λmax (M−1 cm−1), c. Wydajność kwantowa zaniku substratów przy 350 nm, d. Iloczyn molarnego współczynnika absorpcji i wydajności kwantowej zaniku przy 350 nm, e. Stężenie roztworu nasyconego w K-MOPS (pH 7,2) (μg mL−1).

Dyskusja

Wcześniej opracowaliśmy związki w klatkach Bhc różnych biologicznie aktywnych cząsteczek, które wykazują wysoką wydajność fotolityczną 28,45,46,47. W celu poszerzenia repertuaru grup klatkowych Bhc, opisaliśmy również platformy modułowych związków klatkowych, które można łatwo modyfikować poprzez wprowadzenie różnych jednostek funkcjonalnych 32,40,41. Niniejszy protokół stanowi zatem metodę syntezy klikalnego prekursora grup klatkowych Bhc, który może być modyfikowany poprzez katalizowaną miedzią(I) cyklizację Huisgena. Syntezę klikalnego prekursora, paBhcCH2OH (2), osiągnięto za pomocą czteroetapowej sekwencji reakcji, rozpoczynającej się od dostępnego na rynku 4-bromoresorcynolu (Figura 1A). Zaletą obecnego protokołu jest to, że nie są wymagane żadne pracochłonne etapy oczyszczania (np. rozdzielanie chromatograficzne kolumnowe).

Ponieważ klikalny prekursor paBhcCH2OH (2) może być używany do maskowania różnych grup funkcyjnych, zsyntetyzowano klikalne związki w klatkach amin, alkoholi i kwasów karboksylowych przy użyciu 2 jako prekursora (Figura 1B). Aminy zostały zmodyfikowane jako ich karbaminiany, podczas gdy alkohole zostały zmodyfikowane jako ich węglany. W procedurach ogólnych 1 i 2 CDI stosowano do otrzymywania klikalnych karbaminianów, natomiast chloromrówczan 4-nitrofenylu do otrzymywania węglanów. Jak wskazuje mechanizm reakcji, oba odczynniki mogą być używane do otrzymywania karbaminianów i węglanów. Należy również zauważyć, że wydajność pożądanego związku w klatce zależy od struktury chemicznej cząsteczki, która ma być umieszczona w klatce. Inne przykłady można zobaczyć w naszych poprzednich raportach 28,30,33,48.

Modyfikacja kliknięcia została następnie przeprowadzona przy użyciu niewielkiej modyfikacji zgłoszonej procedury49. Dodanie ligandów na bazie tris(triazolylmetylo)aminy jest niezbędne do uzyskania pożądanych produktów z dobrą lub wysoką wydajnością. Ponieważ różnorodne azydki są łatwo dostępne zarówno ze źródeł komercyjnych, jak i z procedur literaturowych, możemy przygotować różne modułowe związki w klatkach o dodatkowych właściwościach, takich jak rozpuszczalność w wodzie i zdolność celowania komórkowego (ryc. 2).

Wydajność kwantową fotolizy zmierzono następnie zgodnie z opisaną procedurą 28,50. Rysunek 3 pokazuje, że zużycie fotolityczne 2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX i uwalnianie PTX były przybliżone odpowiednio przez pojedynczy rozkład wykładniczy i wzrost, co sugeruje brak wewnętrznego filtrowania promieniowania lub niepożądanych efektów wtórnych. Zaobserwowano poprawę wydajności kwantowej fotolizy (Φ) i wydajności fotolizy (εΦ) dla klikalnych związków umieszczonych w klatkach paBhc w porównaniu z wcześniej opisanymi związkami w klatkach Bhc (Tabela 1)41,43. Ponieważ wydajność fotolizy (εΦ) związków zamkniętych w klatkach Bhc jest ponad sto razy wyższa niż w przypadku związków klatkowych typu 2-nitrobenzylowego48, wyraźna poprawa wynikająca z obecności grup klatkowania paBhc jest wyraźnie korzystna dla tego systemu.

W ramach eksperymentu potwierdzającego słuszność koncepcji do 2ʹ-paBhcmoc-PTX (4) wprowadzono ugrupowanie hydrofilowe, a do związku 3 wprowadzono ligand celujący w komórkę (ryc. 2). Rozpuszczalność w wodzie 2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX była 650 razy wyższa niż w przypadku macierzystego PTX (Tabela 1). Selektywne celowanie komórkowe osiągnięto za pomocą systemu tag-sonda, a paBhcmoc-hex-FITC / Halo (8) zawierający ligand HaloTag został z powodzeniem skierowany na błonę komórkową hodowanych komórek ssaków wykazujących ekspresję białka fuzyjnego HaloTag / EGFR (Figura 4). Modulację subkomórkowej lokalizacji kinazy za pośrednictwem światła osiągnięto również przy użyciu klikalnego związku w klatce 5 (ryc. 5).

Podsumowując, z powodzeniem zademonstrowaliśmy metodę przygotowania klikalnych platform dla fotoklatkowanych związków biologicznie interesujących cząsteczek, które można łatwo modyfikować za pomocą dodatkowych właściwości, takich jak rozpuszczalność w wodzie i zdolność do celowania komórkowego. Ponieważ grupa klatkowa paBhc może być używana do przygotowania dowolnych cząsteczek z modyfikowalnymi grupami funkcyjnymi, zastosowanie niniejszego protokołu nie jest ograniczone do cząsteczek opisanych w niniejszym dokumencie. Korzystając z modułowej platformy, a mianowicie grupy klatkowej paBhc, można łatwo przygotować pożądane związki w koszykach, a ich właściwości fizyczne i chemiczne można modulować za pomocą modyfikacji zatrzaskowej.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez grant JSPS KAKENHI numer JP16H01282 (TF), Grant-in-Aid na badania naukowe w innowacyjnych obszarach "Dynamika pamięci" oraz JP19H05778 (TF), "MolMovies."

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
acetonitryl, EPNacalai00404-75
acetonitryl, super odwodnionyFUJIFILM Wako010-22905
Antybiotyk-Antybiotyk, 100XThermo Fisher15240062
4-bromoresorcynolTCI ChemicalsB0654
N,N'-karbonylodimidazolFUJIFILM Wako034-10491
chloroformKanto07278-71
Pięciowodny siarczan miedzi (II), 99,9%FUJIFILM Wako032-12511
dichlorometan, odwodnionyKanto11338-05
N,N'-diizopropylokarbodimid (DIPC)TCI ChemicalsD0254
4-dimetyloaminopirydynaTCI ChemicalsD1450
dimetylosulfotlenek, odwodniony -super-Kanto10380-05
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumSigmaD6046-500ML
podwójny oświetlacz fluorescencyjny źródła światła, IX2-RFAWOlympus
Etanol (99,5)FUJIFILM Wako054-07225
4-chloroacetooctan etyluTCI ChemicalsC0911
Szynka F-12 z L-glutaminą i fenolem CzerwieńFUJIFILM Wako087-08335
kwas solnyFUJIFILM Wako087-01076
odwrócony mikroskop fluorescencyjny IX-71Olympus
ISOLUTE Separator faz, 15 mlBiotage120-1906-D
Sól sodowa kwasu L-(+)-askorbinowegoFUJIFILM Wako196-01252
skaningowa mikroskopia konfokalna ze skaningiem laserowym, FLUOVIEW FV1200/IX-81Olympus
Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcjiThermo Fisher11668027odczynnik do lipofekcji
Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowyDojindo345-01804MOPS
4-nitrofenylochloromrówczan (4-NPC)TCI ChemicalsC1400
Opti-MEM I Zredukowana pożywka surowicy, bez czerwieni fenolowejThermo Fisher11058021zredukowana pożywka surowicy nie zawiera czerwieni fenolowej
1,10-fenantroliny monohydratNacalai26707-02
Reaktor fotochemiczny z lampami RPR 350 nmRayonet
Trioksalatożelazian potasu (III) trójwodnyFUJIFILM WakoW01SRM19-5000
Octan sodu TrójwodzianNacalai31115-05
Wodorowęglan soduFUJIFILM Wako199-05985
Kwas siarkowy, 96-98%FUJIFILM Wako190-04675
Tris(3-hydroksypropylotriazolylo)amina (THPTA)ALDRICH762342-100MG
dwuwodny cytrynian trisoduNacalai31404-15
Światło ksenonowe źródło, MAX-303Asahi Spectra

Bibliografia

  1. Mayer, G., Heckel, A. Biologically active molecules with a "light switch". Angewandte Chemistry International Edition. 45 (30), 4900-4921 (2006).
  2. Bort, G., Gallavardin, T., Ogden, D., Dalko, P. I. From One-Photon to Two-Photon Probes: Caged” Compounds, Actuators, and Photoswitches. Angewandte Chemistry International Edition. 52 (17), 4526-4537 (2013).
  3. Klan, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113 (1), 119-191 (2013).
  4. Abe, M., et al. Design and Synthesis of Two-Photon Responsive Chromophores for Near-Infrared Light-Induced Uncaging Reactions. Synthesis-Stuttgart. 49 (15), 3337-3346 (2017).
  5. Ankenbruck, N., Courtney, T., Naro, Y., Deiters, A. Optochemical Control of Biological Processes in Cells and Animals. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (11), 2768(2018).
  6. Hou, Y., Zhou, Z., Huang, K., Yang, H., Han, G. Long Wavelength Light Activated Prodrug Conjugates for Biomedical Applications. ChemPhotoChem. 2, 1005(2018).
  7. Engels, J., Schlaeger, E. J. Synthesis, structure, and reactivity of adenosine cyclic 3',5'-phosphate benzyl triesters, Rapid photolytic release of adenosine 5'-triphosphate from a protected analogue: utilization by the Na:K pump of human red blood cell. Journal of Medicinal Chemistry. 20 (7), 907-911 (1977).
  8. Kaplan, J. H., Forbush, B., Hoffman, J. F. Rapid photolytic release of adenosine 5'-triphosphate from a protected analogue: utilization by the Na:K pump of human red blood cell ghosts. Biochemistry. 17 (10), 1929-1935 (1978).
  9. Park, C. H., Givens, R. S. New Photoactivated Protecting Groups. 6. p-Hydroxyphenacyl: A Phototrigger for Chemical and Biochemical Probes. Journal of the American Chemical Society. 119 (10), 2453-2463 (1997).
  10. Hasan, A., et al. Photolabile protecting groups for nucleosides: synthesis and photo-deprotection rates. Tetrahedron. 53 (12), 4247-4264 (1997).
  11. Heckel, A., Mayer, G. Light regulation of aptamer activity: an anti-thrombin aptamer with caged thymidine nucleobases. Journal of the American Chemical Society. 127 (3), 822-823 (2005).
  12. Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T. Effects of aromatic substituents on the photocleavage of 1-acyl-7-nitroindolines. Tetrahedron. 56 (41), 8197-8205 (2000).
  13. Matsuzaki, M., Ellis-Davies, G. C., Nemoto, T., Miyashita, Y., Iino, M., Kasai, H. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 4 (11), 1086-1092 (2001).
  14. Givens, R. S., Matuszewski, B. Photochemistry of phosphate esters: an efficient method for the generation of electrophiles. Journal of the American Chemical Society. 106 (22), 6860-6861 (1984).
  15. Furuta, T., Torigai, H., Sugimoto, M., Iwamura, M. Photochemical Properties of New Photolabile cAMP Derivatives in a Physiological Saline Solution. Journal of Organic Chemistry. 60 (13), 3953-3956 (1995).
  16. Hagen, V., Frings, S., Wiesner, B., Helm, S., Kaupp, U. B., Bendig, J. 7-(Dialkylamino)coumarin-4-yl]methyl-Caged Compounds as Ultrafast and Effective Long-Wavelength Phototriggers of 8-Bromo-Substituted Cyclic Nucleotides. ChemBioChem. 4 (5), 434-442 (2003).
  17. Momotake, A., Lindegger, N., Niggli, E., Barsotti, R. J., Ellis-Davies, G. C. The nitrodibenzofuran chromophore: a new caging group for ultra-efficient photolysis in living cells. Nature Methods. 3 (1), 35-40 (2006).
  18. Specht, A., et al. New photoremovable protecting groups for carboxylic acids with high photolytic efficiencies at near-UV irradiation. Application to the photocontrolled release of L-glutamate. ChemBioChem. 7 (11), 1690-1695 (2006).
  19. Petersen, S., Alonso, J. M., Specht, A., Duodu, P., Goeldner, M., del Campo, A. Phototriggering of cell adhesion by caged cyclic RGD peptides. Angewandte Chemistry International Edition. 47 (17), 3192-3195 (2008).
  20. Heckman, L. M., et al. Design and Synthesis of a Calcium-Sensitive Photocage. Angewandte Chemistry International Edition. 55 (29), 8363-8366 (2016).
  21. Olson, J. P., Banghart, M. R., Sabatini, B. L., Ellis-Davies, G. C. Spectral Evolution of a Photochemical Protecting Group for Orthogonal Two-Color Uncaging with Visible Light. Journal of the American Chemical Society. 135 (42), 15948-15954 (2013).
  22. Gandioso, A., et al. Sequential Uncaging with Green Light can be Achieved by Fine-Tuning the Structure of a Dicyanocoumarin Chromophore. ChemistryOpen. 6 (3), 375-384 (2017).
  23. Bassolino, G., Nancoz, C., Thiel, Z., Bois, E., Vauthey, E., Rivera-Fuentes, P. Photolabile coumarins with improved efficiency through azetidinyl substitution. Chemical Science. 9 (2), 387-391 (2018).
  24. Lin, Q. N., et al. Coumarin Photocaging Groups Modified with an Electron-Rich Styryl Moiety at the 3-Position: Long-Wavelength Excitation, Rapid Photolysis, and Photobleaching. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (14), 3722-3726 (2018).
  25. Nani, R. R., et al. In Vivo Activation of Duocarmycin-Antibody Conjugates by Near-Infrared Light. ACS Central Science. 3 (4), 329-337 (2017).
  26. Umeda, N., et al. Boron Dipyrromethene As a Fluorescent Caging Group for Single-Photon Uncaging with Long-Wavelength Visible Light. ACS Chemical Biology. 9 (10), 2242-2246 (2014).
  27. Slanina, T., et al. In Search of the Perfect Photocage: Structure–Reactivity Relationships in meso-Methyl BODIPY Photoremovable Protecting Groups. Journal of the American Chemical Society. 139 (42), 15168-15175 (2017).
  28. Furuta, T., et al. Brominated 7-hydroxycoumarin-4-ylmethyls: Photolabile protecting groups with biologically useful cross-sections for two photon photolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1193-1200 (1999).
  29. Furuta, T., et al. Bhc-cNMPs as either water-soluble or membrane-permeant photoreleasable cyclic nucleotides for both one- and two-photon excitation. ChemBioChem. 5 (8), 1119-1128 (2004).
  30. Suzuki, A. Z., et al. Coumarin-4-ylmethoxycarbonyls as phototriggers for alcohols and phenols. Organic Letters. 5 (25), 4867-4870 (2003).
  31. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  32. Teraoka, A., Murakoshi, K., Fukamauchi, K., Suzuki, A. Z., Watanabe, S., Furuta, T. Preparation and affinity-based purification of caged linear DNA for light-controlled gene expression in mammalian cells. Chemical Communications. 50 (6), 664-666 (2014).
  33. Watanabe, T., et al. Synthesis of nucleobase-caged peptide nucleic acids having improved photochemical properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 12 (28), 5089-5093 (2014).
  34. Horinouchi, T., Nakagawa, H., Suzuki, T., Fukuhara, K., Miyata, N. A novel mitochondria-localizing nitrobenzene derivative as a donor for photo-uncaging of nitric oxide. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (7), 2000-2002 (2011).
  35. Leonidova, A., et al. Photo-induced uncaging of a specific Re(I) organometallic complex in living cells. Chemical Science. 5 (10), 4044-4056 (2014).
  36. Nadler, A., et al. Exclusive photorelease of signalling lipids at the plasma membrane. Nature Communications. 6, 10056(2015).
  37. Feng, S. H., et al. Mitochondria-specific photoactivation to monitor local sphingosine metabolism and function. Elife. 7, e34555(2018).
  38. Wagner, N., Stephan, M., Hoglinger, D., Nadler, A. A Click Cage: Organelle-Specific Uncaging of Lipid Messengers. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (40), 13339-13343 (2018).
  39. Feng, S., Harayama, T., Chang, D., Hannich, J. T., Winssinger, N., Riezman, H. Lysosome-targeted photoactivation reveals local sphingosine metabolism signatures. Chemical Science. 10 (8), 2253-2258 (2019).
  40. Furuta, T., Manabe, K., Teraoka, A., Murakoshi, K., Ohtsubo, A., Suzuki, A. Design, synthesis, and photochemistry of modular caging groups for photoreleasable nucleotides. Organic Letters. 14 (24), 6182-6185 (2012).
  41. Suzuki, A. Z., et al. A clickable caging group as a new platform for modular caged compounds with improved photochemical properties. Chemical Communications. 55 (4), 451-454 (2019).
  42. Hatchard, C. G., Parker, C. A. A new sensitive chemical actinometer - II. Potassium ferrioxalate as a standard chemical actinometer. Proceedings of the Royal Society A. 235 (1203), 518-536 (1956).
  43. Furuta, T., Nishiyama, K., Manabe, A., Fukuoka, M., Iwamura, M. Design, synthesis and photochemical properties of caged compounds of lipid mediators. Proceedings of the ISBC. , 124-125 (2003).
  44. Shirai, Y., Segawa, S., Kuriyama, M., Goto, K., Sakai, N., Saito, N. Subtype-specific Translocation of Diacylglycerol Kinase ? and ? and Its Correlation with Protein Kinase C. The Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24760-24766 (2000).
  45. Furuta, T., Noguchi, K. Controlling cellular systems with Bhc-caged compounds. TrAC, Trends in Analytical Chemistry. 23 (7), 511-519 (2004).
  46. Furuta, T. Designing caged compounds for spatiotemporal control of cellular chemistry. Journal of the Synthetic Organic Chemistry Japan. 69 (11), 1164-1169 (2012).
  47. Furuta, T. Coumarin-4-ylmethyl Phototriggers. Dynamic Studies in Biology: Phototriggers, Photoswitches and Caged Biomolecules. Goeldner, M., Givens, R. S. , WILEY-VCH. 29-55 (2005).
  48. Furuta, T., Watanabe, T., Tanabe, S., Sakyo, J., Matsuba, C. Phototriggers for Nucleobases with Improved Photochemical Properties. Organic Letters. 9 (23), 4717-4720 (2007).
  49. Manova, R., van Beek, T. A., Zuilhof, H. Surface Functionalization by Strain-Promoted Alkyne–Azide Click Reactions. Angewandte Chemistry International Edition. 50 (24), 5428-5430 (2011).
  50. Adams, S. R., Kao, J. P. Y., Grynkiewicz, G., Minta, A., Tsien, R. Y. Biologically Useful Chelators That Release Ca2+ Upon Illumination. Journal of the American Chemical Society. 110 (10), 3212-3220 (1988).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

zwi zki z grup fotolabilncyklizacja katalizowana miedzigrupa fotolabilna Bhckwantowa wydajno fotolizyrozpuszczalno w wodziecelowanie kom rkowemikroskopia konfokalnaoczyszczanie metod HPLCligand HaloTag
Projektowanie, synteza i właściwości fotochemiczne klikalnych związków w klatkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.