Mysi model kontrolowanego wpływu na korę mózgową w celu indukcji urazowego uszkodzenia mózgu

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół indukcji mysiego urazowego uszkodzenia mózgu poprzez kontrolowane uderzenie w korę mózgową z otwartą głową.

Streszczenie

Centra Kontroli Chorób i Zapobiegania Urazom szacują, że prawie 2 miliony ludzi doznaje urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) każdego roku w Stanach Zjednoczonych. W rzeczywistości TBI jest czynnikiem przyczyniającym się do ponad jednej trzeciej wszystkich zgonów związanych z urazami. Niemniej jednak mechanizmy komórkowe i molekularne leżące u podstaw patofizjologii TBI są słabo poznane. W związku z tym przedkliniczne modele TBI zdolne do replikacji mechanizmów uszkodzeń związanych z TBI u ludzi są krytyczną potrzebą badawczą. Model kontrolowanego uderzenia korowego (CCI) TBI wykorzystuje urządzenie mechaniczne do bezpośredniego oddziaływania na odsłoniętą korę. Chociaż żaden model nie jest w stanie w pełni odtworzyć rozbieżnych wzorców urazów i niejednorodnego charakteru TBI u ludzi, CCI jest w stanie wywołać szeroki zakres klinicznie stosowanych TBI. Co więcej, CCI można łatwo ustandaryzować, co pozwala badaczom porównywać wyniki z różnych eksperymentów, a także z różnych grup badawczych. Poniższy protokół jest szczegółowym opisem stosowania ciężkiej CCI za pomocą dostępnego na rynku urządzenia udarowego w mysim modelu TBI.

Wprowadzenie

Centra Kontroli Chorób i Zapobiegania Urazom szacują, że około 2 miliony Amerykanów doznaje urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) każdego roku^1,2. W rzeczywistości TBI przyczynia się do ponad 30% wszystkich zgonów związanych z urazami w Stanach Zjednoczonych, przy kosztach opieki zdrowotnej zbliżających się do 80 miliardów dolarów rocznie i prawie 4 milionach dolarów na osobę przeżywającą ciężkie TBI^3,4,5. Wpływ TBI jest podkreślony przez znaczące, długoterminowe powikłania neurokognitywne i neuropsychiatryczne, na które cierpią osoby, które przeżyły TBI z podstępnym początkiem zaburzeń behawioralnych, poznawczych i motorycznych określanych jako przewlekła encefalopatia pourazowa (CTE)^6,7,8,9,10. Nawet subkliniczne wstrząsy mózgu – te skutki, które nie powodują objawów klinicznych – mogą prowadzić do długotrwałej dysfunkcji neurologicznej^11,12.

Modele zwierzęce do badania TBI są używane od końca XIX wieku¹³. W latach osiemdziesiątych XX wieku opracowano impaktor pneumatyczny do modelowania TBI. Ta metoda jest obecnie określana jako kontrolowane uderzenie korowe (CCI)¹⁴. Kontrola i odtwarzalność CCI skłoniły naukowców do dostosowania modelu do stosowania u gryzoni¹⁵. Nasze laboratorium wykorzystuje ten model do indukcji TBI za pomocą dostępnego na rynku impaktora i elektronicznego urządzenia uruchamiającego^16,17. Model ten jest w stanie wytworzyć szeroki zakres klinicznie stosowanych stanów TBI w zależności od zastosowanych parametrów biomechanicznych. Ocena histologiczna mózgów z TBI po ciężkim urazie wywołanym w naszym laboratorium wykazuje znaczny ubytek ipsilateralnej kory mózgowej i hipokampa, a także obrzęk i zniekształcenia przeciwległe. Dodatkowo, CCI powoduje stałe upośledzenie funkcji motorycznych i poznawczych, mierzone za pomocą testów behawioralnych¹⁸. Ograniczenia CCI obejmują konieczność kraniotomii oraz koszty zakupu impaktora i urządzenia uruchamiającego.

Istnieje kilka dodatkowych modeli TBI, które są dobrze ugruntowane w literaturze, w tym model bocznego uderzenia płynem, model spadku ciężaru i model obrażeń spowodowanych wybuchem^19,20,21. Chociaż każdy z tych modeli ma swoje odrębne zalety, ich głównymi wadami są odpowiednio mieszane obrażenia, wysoka śmiertelność i brak standaryzacji²². Co więcej, żaden z tych modeli nie oferuje dokładności, precyzji i odtwarzalności CCI. Dostosowując parametry biomechaniczne wprowadzane do urządzenia uruchamiającego, model CCI umożliwia badaczowi precyzyjną kontrolę nad rozmiarem urazu, głębokością urazu i energią kinetyczną przyłożoną do mózgu. Daje to badaczom możliwość zastosowania całego spektrum TBI do określonych obszarów mózgu. Pozwala również na największą powtarzalność z eksperymentu na eksperyment

.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Northwestern. Myszy C57BL/6 zakupiono w Jackson Laboratory i umieszczono w ośrodku barierowym w Centrum Medycyny Porównawczej na Uniwersytecie Northwestern (Chicago, IL). Wszystkie zwierzęta były trzymane w 12/12 godzinnym cyklu światło/ciemność ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody.

1. Wywołać znieczulenie

1. Znieczulić mysz ketaminą (125 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) wstrzykiwanymi dootrzewnowo.

2. Monitorowanie parametrów życiowych co 15 minut

1. Monitoruj temperaturę, częstość oddechów i kolor skóry. Mysz powinna być ciepła w dotyku. Skóra powinna wydawać się różowa i dobrze ukrwiona. Częstość oddechów powinna wynosić od 50 do 70 oddechów na minutę.

3. Zabiegi przedoperacyjne

1. Zważ wszystkie myszy w dniu poprzedzającym indukcję urazu.
2. Wysterylizuj jeden zestaw narzędzi chirurgicznych przez autoklawowanie dla każdego uczestnika eksperymentu. Wysterylizuj urządzenie udarowe przed użyciem.
3. Przygotuj klatkę regeneracyjną, umieszczając czystą klatkę na elektrycznej poduszce grzewczej ustawionej na "niskie" ustawienie i ustawionej w taki sposób, aby myszy mogły odsunąć się od ciepła po poruszaniu się.
4. Ustaw salę operacyjną w wysterylizowanym okapie z przepływem laminarnym.
   1. Ustaw stereotaktyczną ramę operacyjną.
   2. Przymocuj urządzenie udarowe do ramy stereotaktycznej.
   3. Ustaw urządzenie uruchamiające z żądanymi parametrami biomechanicznymi dla prędkości i czasu przebywania.
      UWAGA: W tym protokole opisano ciężkie uszkodzenie mózgu przy użyciu końcówki udarowej o średnicy 3 mm za pomocą kraniektomii o średnicy 5 mm z prędkością ustawioną na 2,5 m/s i czasem przebywania 0,1 s. Szeroki zakres parametrów biomechanicznych może być wykorzystany do indukcji pełnego spektrum TBI.
5. Załóż nowe środki ochrony osobistej i sterylne rękawice.
6. Ogol sierść z miejsca operacji za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia.
7. Nałóż ochronną maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec uszkodzeniom i wysuszeniu rogówki.
8. Umieść mysz na sali operacyjnej.
9. Przygotuj skórę za pomocą peelingu chirurgicznego na bazie jodu na przemian z alkoholem trzy razy.

4. Zastosowanie kontrolowanego wpływu kory mózgowej

1. Naciąć skórę głowy na 1 cm w linii środkowej skalpelem, odsłaniając czaszkę.
2. Umieść mysz w stereotaktycznej ramie operacyjnej, zabezpieczając obustronne kości skroniowe między miniaturowymi nausznikami i blokując siekacze w zacisku siekacza, tworząc stabilne trzypunktowe trzymanie na głowie myszy.
3. Odsuń skórę głowy od miejsca operacji za pomocą hemostatu lub kleszczy blokujących, aby upewnić się, że skóra głowy nie styka się z wiertłem podczas kraniektomii.
4. Zidentyfikuj szwy strzałkowe i koronowe na odsłoniętej czaszce.
   UWAGA: Protokół ten centruje kraniektomię 2 mm na lewo od szwu strzałkowego i 2 mm rostralnie do szwu koronalnego.
5. Wykonaj kraniektomię za pomocą wiertła z wiertłem trepanacyjnym.
   1. Aby wykonać kraniektomię, należy najpierw uruchomić wiertło z maksymalną prędkością, a następnie przyłożyć wiertło trepanacyjne prostopadle do czaszki w miejscu kraniektomii.
   2. Wywieraj delikatny, równomierny nacisk na wiertło po nawiązaniu kontaktu z czaszką. Lekkie "ugięcie" będzie odczuwalne, gdy wiertło przebije się przez czaszkę. Nie wnikać w oponę twardą znajdującą się pod spodem.
      UWAGA: W tym protokole do wykonania kraniektomii wykorzystuje się wiertło trepanacyjne 5 mm.
6. Użyj kleszczy i igły podskórnej o małej średnicy, aby usunąć płat kostny, całkowicie odsłaniając leżącą pod spodem oponę twardą.
7. Obróć końcówkę impaktora w pole operacyjne i opuść ją, aż zetknie się z odsłoniętą oponą twardą. Po nawiązaniu kontaktu czujnik kontaktowy instrumentu wyda sygnał dźwiękowy, aby ostrzec chirurga, że kontakt został nawiązany. Spowoduje to wyznaczenie punktu zerowego, od którego ustawiana jest głębokość odkształcenia.
   UWAGA: Ten protokół wykorzystuje końcówkę udarową o średnicy 3 mm, aby spowodować poważne obrażenia. Końcówki o wielkości zaledwie 1 mm mogą być używane do stosowania bardziej zlokalizowanych urazów.
8. Cofnij końcówkę udarową i ustaw żądaną głębokość uderzenia, obniżając pozycję impaktora na ramie stereotaktycznej.
   UWAGA: W tym protokole opisujemy ciężkie obrażenia, ustawiając głębokość odkształcenia na 2 mm.
9. Zadać obrażenia, aktywując impaktor na urządzeniu uruchamiającym.
10. Obróć urządzenie udarowe poza pole i usuń zwierzę z ramy stereotaktycznej.

5. Zamknięcie pola operacyjnego

1. Kontroluj krwawienie z czaszki i uszkodzonej powierzchni kory mózgowej za pomocą bezpośredniego nacisku sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką.
2. Osusz czaszkę sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką.
3. Zamknij skórę głowy nad kraniektomią za pomocą dostępnego w handlu kleju chirurgicznego lub szwu monofilamentowego.
   UWAGA: W tym protokole do zamknięcia skóry głowy stosuje się weterynaryjny klej chirurgiczny. Płat kostny nie jest wymieniany i jest wyrzucany.

6. Opieka pooperacyjna i monitorowanie

1. Stosować analgezję pooperacyjną (np. buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu 0,1–0,5 mg/kg mc. podawaną podskórnie, zapewniającą 72 godziny długotrwałej analgezji).
2. Umieść zwierzę w bocznej pozycji wyjściowej do odpoczynku po odleżynie w czystej, wstępnie ogrzanej klatce.
3. Obserwuj zwierzęta, dopóki się nie obudzą i nie będą mobilne, a następnie przywróć każdą mysz do jej domowej klatki.
4. Zapewnij swobodny dostęp do jedzenia i wody. Normalne przyjmowanie pokarmu i wody zwykle wznawia się w ciągu jednej do dwóch godzin po urazie.
5. Mierz masę ciała co trzy dni przez cały czas trwania eksperymentu.

Wyniki

Impaktor montowany jest bezpośrednio na ramie stereotaktycznej, co pozwala na uzyskanie rozdzielczości do 10 μm do kontroli punktu uderzenia, głębokości i penetracji. Zastosowane siły elektromagnetyczne mogą powodować prędkości uderzenia w zakresie 1,5–6 m/s. Pozwala to na niezrównaną precyzję i powtarzalność w całym zakresie klinicznie istotnych TBI. Badacze mogą przeprowadzać eksperymenty pilotażowe zmieniające parametry urazu, takie jak rozmiar końcówki udaru, prędkość uderzenia i głębokość uderzenia, aby określić par...

Dyskusja

Istnieje kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla zastosowania niezawodnego i konsekwentnego urazu. Po pierwsze, mysz musi dotrzeć do głębokiej płaszczyzny znieczulenia chirurgicznego, zapewniającej brak ruchu podczas wykonywania kraniektomii. Podczas gdy wiele schematów znieczulania może być stosowanych w celu wywołania znieczulenia ogólnego u gryzoni, środki znieczulające, które wywołują depresję oddechową, takie jak znieczulenie wziewne, mogą powodować zatrzymanie oddechu w połączeniu z ciężkim TBI. Protokół te...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AnaSed Sterylny roztwór ksylazyny do wstrzykiwań	LLOYD, Inc.
Buprenorfina SR Lab 0,5 mg / ml	Zoopharm-Wildlife Pharmaceuticals USA	BSRLAB0.5-182012
Szybki mikrosilnik obrotowy KiT0	Foredom Electric Company	K.1070
Imapact one dla Stereotaxix CCI	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39463920
Ketathesia Ketamine HCl Injection USP	Henry Schein, Inc	56344
Stereotaktyczna podstawa dla myszy	Leica Biosystems Nussloch GmbH	39462980
Trephines dla Micro Drill	Fine Science Tools, Inc	18004-50