Zaburzanie biomechaniki śródbłonka poprzez zakłócenie strukturalne Connexin 43

Summary

Tutaj prezentujemy protokół oparty na mechanice, który ma na celu zakłócenie połączenia szczelinowego 43 i zmierzenie późniejszego wpływu, jaki ma to na biomechanikę śródbłonka poprzez obserwację trakcji i naprężeń międzykomórkowych.

Abstract

Komórki śródbłonka zostały stworzone do generowania międzykomórkowych naprężeń i trakcji, ale rola, jaką odgrywają połączenia szczelinowe w śródbłonkowym stresie międzykomórkowym i generowaniu trakcji, jest obecnie nieznana. Dlatego przedstawiamy tutaj oparty na mechanice protokół do badania wpływu koneksyny 43 (Cx43) na biomechanikę śródbłonka poprzez wystawienie zlewających się monowarstw śródbłonka na działanie znanego inhibitora Cx43 2,5-dihydroksychalkonu (chalkonu) i pomiar wpływu tego inhibitora na trakcje i stresy międzykomórkowe. Przedstawiamy reprezentatywne wyniki, które wskazują na spadek zarówno trakcji, jak i stresów międzykomórkowych przy wysokiej dawce chalkonu (2 μg/ml) w porównaniu z kontrolą. Protokół ten można zastosować nie tylko do Cx43, ale także do innych połączeń szczelinowych, zakładając, że stosowany jest odpowiedni inhibitor. Wierzymy, że ten protokół będzie przydatny w dziedzinie badań sercowo-naczyniowych i mechanobiologicznych.

Introduction

Dziedzina, która odnosi się do badania wpływu sił fizycznych i właściwości mechanicznych na fizjologię i patologię komórek i tkanek, znana jest jako mechanobiologia¹. Kilka przydatnych technik, które zostały wykorzystane w mechanobiologii, to jednowarstwowa mikroskopia naprężeń i mikroskopia sił trakcyjnych. Mikroskopia sił trakcyjnych pozwala na obliczenie trakcji generowanych na granicy komórka-podłoże, podczas gdy jednowarstwowa mikroskopia naprężeń pozwala na obliczenie naprężeń międzykomórkowych generowanych między sąsiednimi komórkami w obrębie monowarstwy^2,3^,

Protocol

1. Wytwarzanie żeli z poliakrylamidu (PA)

1. Przygotowanie szalki Petriego
   1. Przygotować wiążący roztwór silanu, mieszając 200 ml ultraczystej wody z 80 μl kwasu octowego i 50 μl metakrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu. Silan Bind to roztwór stosowany do funkcjonalizacji powierzchni płytki Petriego ze szklanym dnem do mocowania hydrożelu.
   2. Mieszać roztwór silanu na płytce mieszającej przez co najmniej 1 godzinę.
   3. Potraktuj środkową studzienkę szalki Petriego roztworem silanu wiążącego przez 45 minut.
   4. Usuń wiążący roztwór silanu i opłucz szalkę Petriego ultra czystą wodą 2x-3x.
   5. Wysuszyć powie....

Results

Obrazy kontrastu fazowego kontrolnej, 0,2 μg/ml i 2 μg/ml monowarstwy chalkonu zostały wykonane 30 minut przed leczeniem chalkonem (Rysunek 1A-C) i 2 godziny po leczeniu chalkonem (Rysunek 1D-F). Zaobserwowano, że przemieszczenia kulek indukowane komórkami (μm) zmniejszają się zarówno w warunkach chalkonu o niskiej dawce, jak i w warunkach wysokiej dawki chalkonu (Rysunek 2E,F) w.......

Discussion

Nasza grupa, podobnie jak inne, z powodzeniem wykorzystuje TFM i MSM do badania wpływu połączeń komórka-komórka w różnych patologicznych i fizjologicznych procesach komórkowych in vitro 7,15,18,27. Na przykład Hardin i in. przedstawili bardzo wnikliwe badanie, które sugeruje, że międzykomórkowe przenoszenie stresu kieruje tworzeniem się luk parakomórkowych w komórkach śródbłonka

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szkiełko nakrywkowe 18 mm	ThermoFisher	18CIR-1	Niezbędne do spłaszczania żeli poliakrylamidowych
2% bis-akrylamid	BIO-RAD	1610143	Składnik żelu poliakryloamidowego
2′,5′-Dihydroxychalcone	SIGMA	IDF00046	Do rozbijania struktury Cx43
Metakrylan 3-(trimetoksysililo)propylu	SIGMA	2530-85-0	Roztwór podstawowy do przygotowania mieszaniny silanów wiążących z kwasem octowym i ultraczystą wodą
40% Akrylamid	BIO-RAD	1610140	Składnik żelu poliakrylamidowego
Kwas octowy	Fisher-Sceintific	64-19-7	Niezbędny do przygotowania wiążącego roztworu soli
Alexa Fluro 488 kozi anty-mysi IgG;	ThermoFisher	Katalog # A-11001	Przeciwciało wtórne
Nadsiarczan amonu	BIO-RAD	1610700	Środek polimeryzujący żel poliakrylamidowy
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	SIGMA	9048-46-8	Do przygotowania roztworu blokującego
Bydlęcy roztwór Atelo-kolagenu typu I, 3 mg / ml, 100 ml	Advance Biomatrix	5005-100ML	Stosować jako macierz
zewnątrzkomórkowąCorning Cell Culture Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)	Fisher-Sceintific	21040CV	Bufor soli fizjologicznej potrzebny do hodowli komórkowej
Dimetylosulfotlenek, Fisher BioReagents	Fisher-Sceintific	67-68-5	Do rozpuszczenia chalkonu i przygotowania roztworu podstawowego
Fluoromount-G z DAPI	ThermoFisher	00-4959-52	Pożywka montażowa do immunostaingu używana do barwienia DAPI
Mikrosfera flurocyjna Kulki modyfikowane karboksylanem	ThermoFisher	F8812	Kulki modyfikowane karboksylanem 0,5 mikrona (czerwone), 2% substancji stałych
Roztwór buforowy HEPES 1 M	SIGMA	7365-45-9	Niezbędny dla
LVES	ThermoFisher	A1460801	Essential HUEVC media 200 suplement
Medium 200	ThermoFisher	M200500	Niezbędne podłoża do hodowli
komórkowych HUVECMysie przeciwciało monoklonalne Cx43 (CX - 1B1)	ThermoFisher	Katalog #13-8300	Przeciwciało pierwszorzędowe dla Cx43
Szalka Petriego (średnica 35 mm)	CellVis	D35-20-1.5H	35 mm szalka Petriego z dołkiem środkowym 20 mm
Środek sieciujący Sulfo-SANPAH 100 mg	Proteochem	102568-43-4	Niezbędny do funkcjonalizacji powierzchni żelu poliakrylamidowego
SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych	DOW corning	2646340	Elastomer silikonowy z utwardzaczem do produkcji PDMS
TEMED	BIO-RAD		Środek polimeryzujący żel poliakrylamidowy
Triton-X 100	SIGMA	9002-93-1	Do przepuszczalności komórek
Trypsyna -EDTA	ThermoFisher	25300054	Służy do odłączania komórek