Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60043

⸱

25 września 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Streszczenie

Zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) jest globalnym problemem zdrowotnym. Zakażenie HBV jest obecnie jedną z głównych przyczyn raka wątroby, której dotyczy ponad 350 milionów ludzi na całym świecie. Jest to poważny problem, zwłaszcza w krajach rozwijających się. Niezdolność układu odpornościowego do wytworzenia skutecznej odpowiedzi na HBV prowadzi do przewlekłego zakażenia. Chociaż szczepionka przeciwko HBV jest już obecna i opracowywane są nowe leki przeciwwirusowe, eradykacja komórek rezerwuarów wirusa pozostaje głównym tematem zdrowotnym. Opisano tutaj metodę wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) CD8 + specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) (tj. iPSC-CTL), które mają zdolność tłumienia replikacji HBV. Replikacja HBV jest skutecznie indukowana u myszy poprzez hydrodynamiczne wstrzyknięcie plazmidu ekspresji HBV, pAAV / HBV1.2, do wątroby. Następnie adoptywnie przenoszone są mysie iPSC-CTL specyficzne dla powierzchni HBV, co znacznie hamuje replikację HBV w wątrobie i krwi, a także zapobiega ekspresji powierzchniowego Ag HBV w hepatocytach. Metoda ta demonstruje replikację HBV u myszy po wstrzyknięciu hydrodynamicznym oraz to, że wirusowe CTL specyficzne dla Ag pochodzące z komórek macierzystych mogą hamować replikację HBV. Protokół ten stanowi użyteczną metodę immunoterapii HBV.

Wprowadzenie

Po ostrym zakażeniu, adaptacyjny układ odpornościowy (tj. odporność humoralna i komórkowa) kontroluje większość ostrego zapalenia wątroby związanego z HBV. Mimo to wiele osób w regionach endemicznych HBV nie jest w stanie wyeliminować wirusa, a następnie przekształcić się w osoby przewlekłe. U ponad 25% pacjentów przewlekle chorych (>250 milionów ludzi) na całym świecie rozwija się postępująca choroba wątroby, skutkująca marskością wątroby i/lub rakiem wątrobowokomórkowym (HCC)1. W rezultacie, eradykacja uporczywie zakażonych komórek pozostaje ogólnym problemem zdrowotnym, mimo że dostępna jest szczepionka2 i wiele leków przeciwwirusowych jest w fazie rozwoju. Standardowe leczenie zakażenia HBV obejmuje IFN-α, nukleozydy i analogi nukleotydów. Środki te mają bezpośrednią aktywność przeciwwirusową i zdolności modulacji immunologicznej. Niemniej jednak serokonwersja nosicieli antygenu HBe (Ag)+ z przeciwciałem anty-HBe (Ab) i utrata kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) HBV w surowicy występują indywidualnie u około 20% leczonych pacjentów, a pełna kontrola immunologiczna wirusa zweryfikowana przez pozbawienie HBsAg wynosi nie więcej niż 5%3. Co więcej, odpowiedź na leczenie często nie jest trwała. Szczepienie profilaktyczne rekombinowanym HBs Ag jest wysoce skuteczne w zapobieganiu zakażeniu, ale terapeutyczne szczepienie HBs Ag nie jest skuteczne. Oczywiste jest, że odpowiedzi immunologiczne za pośrednictwem limfocytów T odgrywają kluczową rolę w kontrolowaniu zakażenia HBV i zaburzeń czynności wątroby; jednak u pacjentów z przewlekłym zapaleniem wątroby limfocyty T reagujące na HBV są często usuwane, dysfunkcyjne lub przekształcają się w wyczerpanie4,5,6. W związku z tym u osób z przetrwałym zakażeniem HBV nie podjęto żadnych prób przywrócenia odporności swoistej dla HBV (tj. odporności opartej na limfocytach T) za pomocą leków przeciwwirusowych, cytokin immunomodulujących lub immunizacji leczniczej.

Adoptywny transfer komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla HBV Ag jest skutecznym leczeniem ukierunkowanym na ostateczne wyeliminowanie pozostałych hepatocytów za pomocą HBV7,8. Wykazano, że ACT CTL specyficznych dla HBV u myszy zakażonych HBV powoduje przejściowe, łagodne zapalenie wątroby i dramatyczny spadek transkryptów kwasu rybonukleinowego (RNA) HBV w hepatocytach. W tych badaniach CTL nie hamowały transkrypcji genów HBV, ale nasilały degradację transkryptów HBV9. CTL specyficzne dla HBV są ważne dla zapobiegania infekcji wirusowej i pośredniczą w klirensie HBV10,11. W przypadku środków opartych na ACT, ekspansja in vitro limfocytów T specyficznych dla HBV o wysokiej reaktywności w celu przesiedlenia in vivo została uznana za idealną metodę12,13,14; niemniej jednak obecne podejścia są ograniczone pod względem ich zdolności do generowania, oddzielania i hodowania odpowiednich ilości i jakości limfocytów T specyficznych dla HBV od pacjentów do potencjalnych terapii.

Chociaż badania kliniczne prezentują bezpieczeństwo, praktyczność i perspektywiczną aktywność terapeutyczną terapii komórkowych za pomocą zmodyfikowanych limfocytów T, które są specyficzne dla hepatocytów zakażonych wirusem HBV, istnieją obawy o niekorzystne skutki wynikające z reakcji autoimmunologicznych z powodu reaktywności krzyżowej z nieprawidłowego parowania receptora limfocytów T (TCR)15,16, rozpoznawanie Ag poza celem przez niespecyficzny TCR17 i toksyczność chimerycznego receptora Ag (CAR) na cel18,19 ze zdrowymi tkankami. Obecnie genetycznie zmodyfikowane limfocyty T, które utrzymują się tylko przez krótki czas in vivo, są zwykle pośrednimi lub późniejszymi efektorowymi limfocytami T. Do tej pory pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) są jedynym dostępnym źródłem generującym dużą liczbę naiwnych limfocytów T specyficznych dla Ag jednego typu20,21,22,23. Indukowane PSC (iPSC) są po prostu przekształcane z komórek somatycznych pacjenta poprzez zastosowanie transdukcji genów kilku czynników transkrypcyjnych. W rezultacie, iPSC mają podobne cechy jak embrionalne komórki macierzyste (ESC)24. Ze względu na elastyczność i możliwość nieskończonej zdolności do samoodnawiania, oprócz wymiany tkanek, terapie oparte na iPSC mogą być szeroko stosowane w medycynie regeneracyjnej. Co więcej, pułki leżące u podstaw iPSC mogą znacznie poprawić obecne terapie komórkowe.

Ogólnym celem tej metody jest wygenerowanie dużej ilości specyficznych dla HBV CTL z iPSC (tj. iPSC-CTLs) do immunoterapii opartej na ACT. Zaletą w porównaniu z alternatywnymi technikami jest to, że specyficzne dla HBV iPSC-CTL mają pojedynczy typ TCR i naiwny fenotyp, co skutkuje większym rozwojem komórek T pamięci po ACT. Wykazano, że ACT iPSC-CTL specyficznych dla HBV zwiększa migrację funkcjonalnych limfocytów T CD8 + w wątrobie i zmniejsza replikację HBV zarówno w wątrobie, jak i we krwi podawanych myszy. Metoda ta ujawnia potencjalne zastosowanie wirusowych iPSC-CTL specyficznych dla Ag w immunoterapii HBV i może być przystosowana do generowania innych wirusowych komórek iPSC-T specyficznych dla Ag do immunoterapii wirusowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Texas A&M (IACUC; #2018-0006) i są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi. Myszy stosuje się w wieku 6–9 tygodni.

1. Wytwarzanie wirusowych limfocytów T CD8+ specyficznych dla Ag z iPSC (limfocyty T iPSC-CD8+)

  1. Tworzenie konstruktów retrowirusowych
    UWAGA: Geny TCR α i β są połączone z sekwencją samorozszczepiającą 2A. Wektor retrowirusowy MSCV-IRES-DsRed (MiDR) to DsRed+ 23.
    1. Subklonowanie specyficznych dla HBs183-191 (FLLTRILTI) genów TCR (s183 TCR) ludzko-mysiej hybrydy ludzko-mysiej (s183 TCR) do MiDR w celu stworzenia konstruktu MiDR s183 (Rysunek 1A)25.
  2. Transdukcja retrowirusowa
    UWAGA: Komórki Platinum-E (Plat-E) są używane do pakowania retrowirusów (przenoszących geny s183 TCR), które będą używane do transdukcji retrowirusowej. Komórki Plat-E są skutecznymi komórkami pakującymi retrowirusa leżącymi u podstaw komórek 293T, które zostały opracowane za pomocą unikalnych konstruktów pakowania za pośrednictwem promotora EF1α do ekspresji białka struktury retrowirusowej, w tym GAG, Pol i ekotropowego env.
    1. Na naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm wysiać 3 x 106 komórek Plat-E w 8 ml pożywki hodowlanej DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 1 dzień przed transfekcją.
    2. W dniu 0 transfekuj konstrukt MiDR s183 do komórek Plat-E za pomocą odczynnika do transfekcji DNA25.
    3. W dniu 1 wysiewaj 1 x 106 iPSC (GFP+) na wstępnie pokrytą żelatyną płytkę hodowlaną.
    4. W dniach 2–3 należy pobrać supernatant zawierający retrowirusy z hodowli komórkowej Plat-E w celu transdukcji iPSC z TCR s183 w obecności roztworu 1,6-dibromoheksanu25.
    5. W dniu 4 trypsynizuj iPSC transdukowane genem s183 TCR, wiruj przy 400 x g przez 5 minut i wysiewaj 3 × 105 iPSC w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm wstępnie pokrytym 3 x 106 napromieniowanymi komórkami zasilającymi SNL76/7 (irSNL76/7)25.
    6. W 5 lub 6 dniu konfluencji trypsynizować komórki, wirować przy 400 x g przez 5 minut i przetwarzać w celu sortowania komórek. Bramkowanie na żywych komórkach sortuje podwójnie dodatnie komórki GFP i DsRED (iPSC transdukowane genem s183 TCR) za pomocą szybkiego sortownika komórek. Podobnie jak w kroku 1.2.5, przeprowadź wspólną hodowlę posortowanych komórek na komórkach zasilających irSNL76/7 do wykorzystania w przyszłości25.
  3. Różnicowanie limfocytów T iPSC-CD8 + specyficznych dla HBV
    UWAGA: Komórki zrębu OP9-DL1 / DL4 nadmiernie eksprymują zarówno ligandy Notch DL1, jak i DL4, a współhodowla iPSC z iPSC może promować różnicowanie limfocytów T za pośrednictwem sygnalizacji Notch26.
    1. Hoduj transdukowane genem s183 TCR iPSC (s183 / iPSC) w monowarstwie komórek OP9-DL1-DL4 w pożywce o minimalnej α niezbędnej pożywce (MEM) zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)27. Włączyć mysi ligand Flt3 (mFlt-3L; stężenie końcowe = 5 ng/ml) do hodowli.
    2. W dniu 0 wysiewaj 0,5–1,0 x 105 S183/iPSC w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym wcześniej wyhodowanym z komórkami OP9-DL1-DL4. Sprawdź, czy komórki OP9-DL1-DL4 są w stanie konfluencji 80%–90%.
    3. W 5 dniu przepłucz iPSC 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), odessaj PBS, dodaj ją do 4 ml 0,25% trypsyny i inkubuj w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 10 minut. Następnie dodaj dodatkowe 8 ml pożywki iPSC, aby zakończyć trawienie trypsyny. Zebrać wszystkie roztwory trawienne zawierające komórki i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 15–30 °C.
    4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki iPSC. Przenieść zawiesinę komórek na nową 10 cm płytkę Petriego i inkubować w inkubatorze przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Po 30 minutach zebrać pożywkę iPSC zawierającą pływające komórki. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm i obliczyć liczbę komórek.
    6. Zasiew: 5 x 105 komórek w naczyniu hodowlanym, wcześniej wyhodowane komórki OP9-DL1-DL4 w stanie zlewania 80%–90%, jak opisano w kroku 1.3.1.
      UWAGA: W celu różnicowania limfocytów T, co 2-3 dni, komórki pochodzące z iPSC muszą ponownie zasiać się świeżą warstwą komórek OP9-DL1-DL4.
  4. ocena
    1. Zmiany morfologiczne różnicujących się iPSC
      1. Obserwuj komórki pod mikroskopem w różne dni.
        UWAGA: Do 5 dnia kolonie mają cechy podobne do mezodermy, wykazując klasyczną morfologię w kształcie wrzeciona przypominającą ludzkie fibroblasty skóry i trwały wzrost in vitro. W 8 dniu zaczynają pojawiać się małe okrągłe skupiska komórek.
    2. Analiza różnicowania iPSC za pomocą cytometrii przepływowej
      1. W różnych dniach wspólnej hodowli analizuj komórki pochodzące z iPSC, jak opisano wcześniej25 (Rysunek 1B,C).
    3. Analiza funkcjonalna różnicowania iPSC
      1. W 28 dniu kohodowli należy pobrać limfocyty T iPSC-CD8 + z hodowli poprzez zebranie pływających komórek, trypsynizować pozostałe komórki 0,25% trypsyny, ponownie zawiesić w 8 ml pożywki iPSC, wirować przez 5 minut w temperaturze 400 x g w temperaturze 15–30 °C, usunąć pożywkę, a następnie ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki.
      2. Ponownie zawieszone komórki należy przechowywać w świeżym naczyniu o średnicy 10 cm w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 30 minut i zmontować pływające komórki. Następnie przepłucz komórki jeden raz zimnym PBS.
      3. Inkubować 3 x 10 6 splenocytów zubożonych w limfocyty T (CD4-CD8-) ze śledziony z nokautem H-2 klasy I, myszy transgenicznych HLA-A2.1 (HHD) z peptydem 5 μM s183 (FLLTRILTI) w 200 μL pożywki w temperaturze 4 °C przez 30 min.
      4. Wyprodukuj mieszaninę limfocytów T iPSC-CD8 + ze splenocytami pulsującymi peptydem s183 (limfocyty T: splenocyty = 1:4; użyj 0,75 x 106 limfocytów T). Mieszaninę komórek inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 przez 40 godzin. W ciągu ostatnich 7 godzin dodać 4 μl rozcieńczonej brefeldyny A do kultury (końcowe stężenie 1,000x, które zostanie rozcieńczone w 1x pożywce hodowlanej) w celu zablokowania procesów transportowych podczas aktywacji komórek.
      5. Wybarwić komórki i przeprowadzić analizę cytometryczną przepływową wewnątrzkomórkowego IFN-γ, jak opisano wcześniej (Rysunek 2).

2. Indukcja replikacji HBV poprzez hydrodynamiczne dostarczanie plazmidu HBV

UWAGA: konstrukcja pAAV/HBV1.2 została wygenerowana zgodnie z wcześniejszym opisem9. Kompletne DNA HBV 1.2 jest włączone do wektora pAAV.

  1. Hydrodynamiczne dostarczanie plazmidu HBV przez żyłę ogonową
    1. Ogrzewaj myszy HHD za pomocą lampy grzewczej przez 5 minut w klatce, aby rozszerzyć żyłę ogonową.
    2. Zatrzymaj zwierzę za pomocą krępa i wyczyść ogony myszy sprayem 70% etanolu.
    3. Dostarczanie plazmidu do wątroby.
    4. Zmierz masę ciała myszy za pomocą skali pomiarowej.
    5. Rozcieńczyć 10 μg plazmidu HBV w 8% równoważniku masy ciała PBS (np. 1,6 ml na 20 g myszy). Umieść rozcieńczony plazmid w strzykawce o pojemności 3 ml za pomocą igły podskórnej o pojemności 26 G × 1⁄2" (0,45 × 12 mm).
    6. Zlokalizuj jedną z dwóch bocznych żył ogonowych w środkowej jednej trzeciej ogona i umieść igłę w dowolnej żyle bocznej. Wstrzyknięcie zawierające plazmid HBV należy podać przez żyłę ogonową w ciągu 3 - 5 sekund.
  2. Kwantyfikacja wiremii z surowicy krwi zakażonych myszy
    UWAGA: Replikacja HBV zachodzi od 3 do 35 dnia w surowicy myszy. Replikacja DNA osiąga szczyt w 7 dniu i stopniowo się zmniejsza. DNA HBV nie jest usuwane z surowicy aż do 35 dnia.
    1. Pobieranie surowicy krwi od zakażonych myszy
      1. Zebrać około 0,1 ml krwi w probówce mikrowirówkowej od każdej myszy przez 3, 5, 7 i 10 dni po zakażeniu przez krwawienie zaoczodołowe w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.
      2. Odwirować próbkę o masie 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i po odwirowaniu zebrać supernatant surowicy.
    2. Oczyść DNA z surowicy krwi za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji DNA zgodnie z zaleceniami producenta. Krótko mówiąc, poddać lizie komórki w kolumnie na bazie krzemionki, przeprowadzić płukanie i wyekstrahować DNA, dodając 100% etanolu do kolumny elucyjnej i odwirowując przy 6000 x g przez 1 min. Eluuj DNA w 50 μl wody wolnej od RNaz.
    3. Użyj 100 ng DNA HBV z elucji do analizy PCR w czasie rzeczywistym. Użyj następujących starterów i sond: forward 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'; rewers 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'; sonda 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
      1. Użyj genomu HBV zawierającego plazmid (pAAV / HBV1.2) dla krzywej wzorcowej i wykonaj PCR w czasie rzeczywistym w całkowitej objętości 10 μL (Figura 3).
    4. Ustawić reakcję PCR w całkowitej objętości 10 μl, jak pokazano w Tabeli 1.
    5. Skonfiguruj program PCR w termocyklerze, jak pokazano w Tabeli 2. Zaprogramowana szybkość zmiany temperatury wynosi 20 °C/s dla denaturacji/wyżarzania i 5 °C/s dla przedłużenia. Zmierz fluorescencję na końcu fazy wyżarzania dla każdego cyklu w celu monitorowania PCR w czasie rzeczywistym.

3. Redukcja replikacji HBV przez ACT wirusowych limfocytów T iPSC-CD8+ specyficznych dla Ag

  1. Adoptywny transfer komórek (ACT)
    1. Różnicować s183/iPSC (1.3.7) na komórkach zrębu OP9-DL1-DL4 w obecności mFlt-3L i mIL-7 przez 8 dni, jak opisano w sekcji 1.3.
    2. W 22 dniu należy pobrać limfocyty T iPSC-CD8+ z 10-centymetrowej płytki za pomocą trypsyny, a następnie umyć i ponownie zawiesić każdą 10-centymetrową płytkę w 10 ml świeżej pożywki. Dodać komórki do świeżej płytki o średnicy 10 cm i powrócić do inkubatora na 30 minut, jak to opisano w sekcji 1.3. Po 30 minutach zbierz pływające komórki.
    3. Użyj nylonowego sitka o średnicy 70 μm, aby przepuścić komórki, wyeliminować skupiska komórek i policzyć liczbę komórek. Dostosuj komórki do stężenia 1,5 x 107 komórek/ml w zimnym roztworze PBS i użyj nylonowego sitka o średnicy 70 μm do przepuszczenia komórek, aby w razie potrzeby ponownie wyeliminować skupiska komórek. Utrzymuj komórki na lodzie aż do ACT.
    4. Wstrzyknij 200 μl zawiesiny komórek (3 x 106 komórek) 4-6 tygodniowym myszom HHD przez żyłę ogonową.
  2. Indukcja replikacji HBV
    1. W 14 dniu po transferze komórek należy przeprowadzić hydrodynamiczne dostarczanie plazmidu HBV przez żyłę ogonową, jak opisano w punkcie 2.1.
  3. Wykrywanie białek wirusa w zakażonej wątrobie
    1. Ofiaruj myszy w 3, 5, 7, 14 i 21 dniu po zakażeniu. Do eutanazji w każdej klatce należy użyć 1–2 litrów dwutlenku węgla (CO2 ) w pierwszym etapie. Gdy u zwierzęcia dojdzie do utraty przytomności, należy zwiększyć natężenie przepływu CO2 o około 4–5 l/min. Wykonaj eutanazję myszy za pomocą inhalacji CO2 .
    2. Oddziel wątrobę, przecinając powierzchnię skóry otrzewnej za pomocą nożyczek i kleszczy i lekko ciągnąc wątrobę do tyłu, aby odsłonić wewnętrzną skórę wyściełającą jamę otrzewnej. Zbierz i pokrój próbki wątroby (długość x szerokość x wysokość = 0,5 cm x 0,5 cm x 0,3 cm) zakażonych myszy, aby łatwo zmieściły się w kasecie do osadzania i zablokowały w 10% neutralnym buforze formaliny na 4-24 godziny.
    3. Odwapnić próbki wątroby za pomocą 2,5 M kwasu mrówkowego; płukać ksylenem przez 3 minuty, płukać 2x w 100% etanolu, płukać 2x w 95% etanolu, płukać 2x w wodzie dejonizowanej (DI) przez 2 minuty, a następnie odwapnić próbki wątroby w 1 mM odpowiednio kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Przechowywać w temperaturze poniżej wrzenia (90 °C) przez 20 minut.
    4. Schłodzić utrwalone tkanki wątroby przez 30 minut. Płukać tkanki 1x PBS przez 4 minuty i zanurzyć tkanki w parafinie. Odwodnić tkanki w serii rosnących stężeń etanolu, aby zastąpić wodę, a następnie zanurzyć w zanurzeniu w ksylenie. Osadź naciekane tkanki w blokach woskowych. Wykonaj równomierne przekroje pionowe i poziome do barwienia. Przygotować skrawki o wielkości 4 μm za pomocą przesuwnego mikrotomu.
    5. Przepuść skrawki przez deparafinowanie i ponowne uwodnienie za pomocą ksylenu i etanolu, a następnie wykonaj barwienie immunofluorescencyjne skrawków.
    6. Wybarwić skrawki 200 μl powierzchniowego przeciwciała swoistego dla Ag HBV (rozcieńczenie 1:100 w roztworze blokującym). Inkubować skrawki z przeciwciałem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnej w 75%–100% i myć 5x w 1x PBS przez 5 minut.
    7. Użyj odczynnika zapobiegającego blaknięciu zawierającego 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) do barwienia jądrowego, aby przeciwdziałać barwieniu szkiełek. Dodać szkiełko nakrywkowe z około 300 μl rozcieńczonego roztworu barwiącego DAPI (300 nM w 1x PBS) i zwalidować całe szkiełko nakrywkowe. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu kontroli pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  4. Naciek komórek zapalnych u zakażonych myszy
    1. Ofiaruj myszy zgodnie z opisem w kroku 3.3.1. Pobrać wątrobę i wykonać sekcje zgodnie z opisem w kroku 3.3.4.
    2. Wybarwić skrawek hematoksyliną i eozyną (H&E), aby ocenić naciekanie komórek zapalnych do wątroby.
    3. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu dalszej analizy pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    4. Wizualizuj preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby wykryć infiltrację komórek zapalnych do wątroby (Ryc. 4).
  5. Wykrywanie DNA HBV w zakażonej wątrobie
    1. Izolacja DNA wirusa.
    2. Poddać myszy eutanazji i pobrać próbki wątroby zgodnie z punktem 3.3.
    3. Lizować tkanki wątroby w buforze do lizy Nonindet P-40 (NP-40) (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 1% NP-40) zawierającym koktajl inhibitorów proteazy.
    4. Krótko odwirować przy 16 000 x g, aby usunąć jądra i resztki komórek.
    5. Inkubować lizat cytoplazmatyczny z nukleazą mikrokokową (nukleaza S7; 150 jednostek/ml) i CaCl2 (5 mM) w temperaturze 37 °C przez 90 minut w celu degradacji kwasu nukleinowego poza nukleokapsydami (NC).
    6. Dezaktywuj nukleazę S7 przez dodanie 10 mM EDTA.
    7. Wytrącić nukleokapsydy glikolem polietylenowym (PEG), rozbić o 0,5% dodecylosiarczan sodu (SDS) i trawić 0,6 mg/ml proteinazy K (PK) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    8. Odzyskaj wirusowe kwasy nukleinowe przez ekstrakcję chloroformem fenolowym i wytrącanie etanolu.
    9. Rozpuść wyekstrahowane DNA wirusa na 1,2% żelu agarozowym i wykryj za pomocą standardowej analizy Southern blot za pomocą sondy DNA HBV znakowanej P a32
      10. .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak pokazano tutaj, specyficzne dla antygenów wirusa HBV komórki iPSC-CD8+ T są generowane w systemie hodowli in vitro. Po ACT tych specyficznych dla antygenów wirusa komórek iPSC-CD8+ T następuje znaczne zahamowanie replikacji HBV w modelu mysim (Supplemental File 1). Mysie iPSC są transdukowane retrowirusowym konstruktem MIDR kodującym hybrydowy ludzko-mysi gen TCR HBV (specyficzny dla HBs183-191, s183）, następnie transdukowane genetycznie iPSC są hodowane wspólnie z ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten przedstawia metodę generowania wirusowych iPSC-CTL specyficznych dla Ag do wykorzystania jako ACT w celu zahamowania replikacji HBV w modelu mysim. W przewlekłym zakażeniu HBV genom wirusa tworzy stabilny mini chromosom, kowalencyjnie zamknięty kolisty DNA (cccDNA), który może utrzymywać się przez całe życie hepatocytu. Ukierunkowanie na klirens mini chromosomu wirusa może doprowadzić do wyleczenia przewlekłego zakażenia HBV. Obecna terapia przeciwwirusowa jest ukierunkowana na odwrotną transkryptazę wirusa,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. Adamowi J. Gehringowi z Instytutu Badawczego Szpitala Ogólnego w Toronto za dostarczenie cDNA dla HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) - specyficznych dla A2 genów hybrydy ludzko-mysiej TCR, oraz Dr. Pei-Jer Chen z National Taiwan University za dostarczenie konstruktu pAAV/HBV 1.2. Prace te są wspierane przez National Institute of Health Grant R01AI121180, R01CA221867 i R21AI109239 dla J. S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy HHDInstytut Pasteura, Paryż, FrancjaNokaut H-2 klasy I, myszy transgeniczne HLA-A2.1 (HHD)
IPS-MEF-NG-20D-17Bank komórek RIKENAPS0001
SNL76/7ATCCSCRC-1049
OP9ATCCCRL-2749
plazmid pAAV/HBV1.2Dr. Dr. Pei-Jer Chen (Narodowy Tajwański Szpital Uniwersytecki, Tajwan)DNA HBV konstruuje
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI) Geny TCR specyficzne dla HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)Dr Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Kanada)Specyficzne dla FLLTRILTI geny TCR hybrydy ludzko-mysiej A2 (Vα 34 oraz Vβ 28)
OVA257– 264-specyficzne geny TCRDr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA)Geny TCR specyficzne dla SIINFEKL H-2Kb
Przeciwciało anty-CD3 (17A2)Biolegend100236
Przeciwciało anty-CD44 (IM7)BD Pharmingen103012
Przeciwciało anty-CD4 (GK1.5)Biolegend100408
Przeciwciało anty-CD8 (53-6,7)Biolegend
Anty-IFN-γ (XMG1.2) przeciwciałoBiolegend505810
Przeciwciało anty-TNF-a (MP6-XT22)Biolegend506306
α-MEMInvitrogenA10490-01
Przeciwciało anty-HBsThermo FisherMA5-13059
ACK Bufor do lizyLonza10-548E
Brefeldin ASigmaB7651
DMEMInvitrogenABCD1234
FBS HycloneSH3007.01
FACSAria Fusion sorter komórekBD656700
Milipor żelatynySigmaG9391
GeneJammerAgilent204130
HLA-A201-HBs183-91-PE pentamerProimmuneF027-4A - 27
HRP Przeciw mysim przeciwciału wtórnemuInvitrogenA27025
mFlt-3LPeprotech250-31L
mIL-7Peprotech217-17
Nukleaza S7Roche10107921001
ParaformaldehydMilliporeSigmaP6148-500GUwaga: Alergiczny, rakotwórczy, toksyczny
bufor przepuszczalnościBiolegend421002
PolybreneMilliporeSigma107689
ProLong™ Złoty uchwyt Antifade z DAPIInvitrogenP36931
QIAamp MinElute Virus Spin KitQiagen57704
100732

Bibliografia

  1. Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
  2. Osiowy, C. From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).
  3. Gish, R. G., et al. Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B. Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).
  4. Kurktschiev, P. D., et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction. Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).
  5. Fisicaro, P., et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).
  6. Schurich, A., et al. The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells. PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208(2013).
  7. Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
  8. Xia, Y., et al. Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).
  9. Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).
  10. Wong, P., Pamer, E. G. CD8 T cell responses to infectious pathogens. Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).
  11. Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).
  12. Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).
  13. Hinrichs, C. S., et al. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117 (3), 808-814 (2011).
  14. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).
  15. Kuball, J., et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).
  16. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).
  17. Cameron, B. J., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).
  18. Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).
  19. Maus, M. V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).
  20. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).
  21. Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
  22. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
  23. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).
  24. Kim, J. B., et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 136 (3), 411-419 (2009).
  25. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (63), e3986(2012).
  26. Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells. OncoImmunology. 6, (2017).
  27. Haque, M., et al. Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells. Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).
  28. Tan, A. T., et al. Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy. Gastroenterology. , (2019).
  29. Wu, L. L., et al. Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice. Hepatology. , (2019).
  30. Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).
  31. Chisari, F. V., et al. Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).
  32. Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice. Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

limfocyty T pochodz ce z kom rek macierzystychlimfocyty T swoiste dla antygen w wirusowychsupresja replikacji HBVlimfocyty T CD8 dodatnie pochodz ce z iPSChydrodynamiczne dostarczanie plazmidu HBVanaliza cytometrycznaznakowanie immunofluorescencyjneadoptywny transfer kom rektransdukcja receptora limfocyt w Tprodukcja interferonu gamma
Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.