Stymulacja przedsionkowa galwaniczna u ludzi wykazuje poprawę funkcji przedsionkowej. Nie wiadomo jednak, w jaki sposób występują te efekty. W tym miejscu opisujemy, jak zastosować sinusoidalny i stochastyczny szum elektryczny oraz ocenić odpowiednie amplitudy bodźców w poszczególnych neuronach przyśrodkowego jądra przedsionkowego u myszy C57BL/6.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie szumu stochastycznego do oceny wrażliwości neuronu jądra przedsionkowego przyśrodkowego in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykazano, że stymulacja przedsionkowa (GVS) poprawia wskaźniki równowagi u osób z zaburzeniami równowagi lub przedsionkowymi. Sugeruje się, że jest to spowodowane zjawiskiem rezonansu stochastycznego (SR), które definiuje się jako zastosowanie bodźca niskopoziomowego/podprogowego do systemu nieliniowego w celu zwiększenia wykrywalności słabszych sygnałów. Jednak nadal nie wiadomo, w jaki sposób SR wykazuje swój pozytywny wpływ na równowagę człowieka. Jest to jedna z pierwszych demonstracji wpływu szumu sinusoidalnego i stochastycznego na poszczególne neurony. Korzystając z elektrofizjologii klamry krosowej całej komórki, szum sinusoidalny i stochastyczny można zastosować bezpośrednio do pojedynczych neuronów w przyśrodkowym jądrze przedsionkowym (MVN) myszy C57BL / 6. Tutaj pokazujemy, jak określić próg neuronów MVN, aby upewnić się, że bodźce sinusoidalne i stochastyczne są podprogowe, a następnie określić wpływ, jaki każdy rodzaj szumu ma na wzmocnienie neuronów MVN. Pokazujemy, że podprogowy szum sinusoidalny i stochastyczny może modulować czułość poszczególnych neuronów w MVN bez wpływu na podstawowe szybkości wypalania.
Wprowadzenie
System przedsionkowy (lub równowagi) kontroluje nasz zmysł równowagi, integrując informacje słuchowe, proprioceptywne, somatosensoryczne i wzrokowe. Wykazano, że degradacja układu przedsionkowego zachodzi w funkcji wieku i może powodować deficyty równowagi1,2. Brakuje jednak terapii ukierunkowanych na funkcjonowanie układu przedsionkowego.
Wykazano, żeWykazano, że stymulacja przedsionkowa galwaniczna (GVS) poprawia wskaźniki równowagi, funkcjonowanie autonomiczne i inne modalności sensoryczne u ludzi3,4,5,6. Mówi się, że ulepszenia te wynikają ze zjawiska rezonansu stochastycznego (SR), które polega na wzroście wykrywania słabszych sygnałów w systemach nieliniowych poprzez zastosowanie szumu podprogowego7,8. Badania te wykazały poprawę w zakresie równowagi static9,10 i dynamic11,12 oraz przedsionkowych testów wyjściowych, takich jak Ocular Counter Roll (OCR)13. Jednak w wielu z tych badań wykorzystano różne kombinacje parametrów bodźca, takie jak biały szum9, kolorowy szum13, różne zakresy częstotliwości bodźców i techniki progowania. W związku z tym optymalne parametry bodźca pozostają nieznane, a protokół ten może pomóc w określeniu najskuteczniejszych parametrów. Oprócz parametrów bodźca, rodzaj bodźca ma również znaczenie dla skuteczności terapeutycznej i eksperymentalnej. Powyższa praca na ludziach została wykonana przy użyciu bodźców szumu elektrycznego, podczas gdy większość badań na zwierzętach in vivo wykorzystywała bodźce dźwiękowe mechaniczne14,15 lub optogenetic16 bodźców akustycznych. Protokół ten wykorzysta szum elektryczny do zbadania wpływu na jądra przedsionkowe.
Poprzednio, zastosowanie GVS do stymulacji pierwotnych przedsionkowych aferentów było wykonywane in vivo u małp wiewiórczych17, szynszyli18, chicken embryos15 i świnki morskie14. Jednak tylko w dwóch z tych badań analizowano wpływ GVS na przyrost pierwotnych przedsionkowych aferentów14,15. Eksperymenty te przeprowadzono in vivo, co oznacza, że nie można określić dokładnych wzorców stymulacji nałożonej na jądra przedsionkowe. O ile nam wiadomo, tylko w jednym innym badaniu zastosowano szum stochastyczny do pojedynczych enzymatycznie zdysocjowanych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym19. Nie przeprowadzono jednak żadnych eksperymentów w centralnych jądrach przedsionkowych w celu oceny odpowiednich parametrów bodźca i technik progowania, co czyni ten protokół bardziej precyzyjnym w określaniu wpływu bodźca na poszczególne neurony w jądrach przedsionkowych.
Tutaj opisujemy, jak zastosować szum sinusoidalny i stochastyczny (elektryczny) bezpośrednio do poszczególnych neuronów w przyśrodkowym jądrze przedsionkowym (MVN), określić próg neuronalny i zmierzyć zmiany w wzmocnieniu/wrażliwości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu w Sydney (numer zatwierdzonego protokołu: 2018/1308).
1. Zwierzęta
UWAGA: Myszy zostały pozyskane z Australian Rodent Centre (ARC; Perth, Australia) i utrzymywane w Medical Foundation Building Animal Facility na Uniwersytecie w Sydney.
- Utrzymywać myszy w standardowym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z wzbogaceniem środowiskowym.
- Do wszystkich eksperymentów wykorzystać samców i samice myszy C57BL/6 (w wieku 3–5 tygodni).
2. Przygotowanie roztworów
- Przygotować 1 L sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) składającego się z 29 mM NaHCO3, 11 mM glukozy, 120 mM NaCl, 3.3 mM KCl, 1.4 mM NaH2PO4, 2.2 mM MgCl2, 2.77 mM CaCl2.
- Przygotować 200 mL sACSF (ACSF z sacharozą) zawierającego 29 mM NaHCO3, 11 mM glukozy, 241.5 mM sacharozy, 3.3 mM KCl, 1.4 mM NaH2PO4, 2.2 mM MgCl2, 2.77 mM CaCl2. Przed dodaniem CaCl2 do ACSF i sACSF należy nasycić roztwory karbogenem (95 % O2 i 5 % CO2), aby uzyskać pH 7.4 i zapobiec wytrącaniu się wapnia (zmętnieniu).
- Przygotować wewnątrzkomórkowy roztwór oparty na K+ składający się z 70 mM glukonianu potasu, 70 mM KCl, 2 mM NaCl, 10 mM HEPES, 4 mM EGTA, 4 mM Mg2-ATP, 0.3 mM Na3-GTP; z końcowym pH 7.3 (skorygowanym za pomocą KOH).
UWAGA: Zaleca się filtrowanie roztworów wewnątrzkomórkowych przez filtry 0.22 µm i przechowywanie alikwotów roztworu o objętości 0.5 mL w temperaturze -20 °C.
3. Przygotowanie pnia mózgu
- Przed wyjęciem pnia mózgu nasyć sACSF karbogenem i schłódź do temperatury -80 °C przez 25 min, aż do utworzenia zawiesiny lodowej.
- Zanurz mysz w narkozie przy użyciu izofluranu (3–5 %) nasyconego tlenem (3 ml/min). Po zaniku odruchów kończyn tylnych dokonaj dekapitacji myszy za pomocą ostrych nożyczek ze stali nierdzewnej.
- Odsłoń czaszkę, wykonując nacięcie strzałkowe skóry za pomocą ostrza do skalpela (nr 22, zaokrąglone).
- Za pomocą ostrego końca standardowych nożyczek wykonać małe nacięcie w okolicy lambda, a następnie przeciąć wzdłuż szczeliny podłużnej.
- Ostrożnie odsunąć sprzężone kości ciemieniowe i kości potyliczne, używając kleszczy kostnych Pearsona o płytkim wygięciu.
UWAGA: Podczas całej tej procedury mózg jest stale obmywany in situ przy użyciu wcześniej przygotowanej lodowatej zawiesiny sACSF. - Oddziel pień mózgu od przedmózgowia i jego kostnej osłony, używając ostrza do skalpela (proste, nr 11), aby przeciąć wzdłuż bruzdy ciemieniowo-potylicznej oraz w obrębie tylnej części rdzenia przedłużonego.
- Zamocuj wyizolowany pień mózgu końcem brzusznym skierowanym w dół na wcześniej dociętym trapezoidalnym bloku polistyrenowym. Usuń nadmiar płynu wokół wypreparowanej tkanki za pomocą knotka z ręcznika papierowego, aby zapewnić dobrą adhezję tkanki do stołu tnącego.
UWAGA: Blok polistyrenowy jest wycinany w kształcie trapezu, aby zapewnić odpowiednie dopasowanie i zwężenie rostralnego końca śródmózgowia w kierunku rdzenia kręgowego. - Użyj kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować blok polistyrenowy z przytwierdzonym pniem mózgu końcem rostralnym skierowanym w dół do stołu sekcyjnego.
- Przy prędkości posuwu 0,16 mm/s i amplitudzie drgań 3,00 mm przygotować 200 µm przekroje poprzeczne MVN.
UWAGA: Lokalizację MVN określa się przy użyciu atlasu mózgu myszy Paxinos i Franklin (ryciny 79–89)20MVN (oznaczony jako MVe w atlasie) znajduje się bezpośrednio brzuszznobocznie w stosunku do 4th komora i jest największa tuż przed przyczepem móżdżku (między kolliculami inferiorami a obexem). - Za pomocą pipety z plastikową końcówką przenieść skrawki na krążek z papieru filtracyjnego umieszczony w napowietrzonym karbogenem ACSF o temperaturze 25 °C przez co najmniej 30 min przed rozpoczęciem pomiaru.
4. Instrumenty
- W celu przeprowadzenia technik patch clamp w konfiguracji whole-cell należy wykorzystać standardowy zestaw elektrofizjologiczny21.
- Mikropipety należy przygotować, stosując dwuetapowy protokół (etap grzania 1: 70; etap grzania 2: 45) w wyciągaczu mikropipet (patrz Tabela materiałów). Po umieszczeniu w kąpieli mikropipety wypełnione roztworem wewnętrznym powinny wykazywać oporność końcową w zakresie 3–5 MΩ.
UWAGA: Stosowane ustawienia mogą się różnić w zależności od temperatury w pomieszczeniu i mogą ulegać dość częstym zmianom.
5. Elektrofizjologia metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell
- W celu przeprowadzenia rejestracji metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell z pojedynczych neuronów w MVN, w pipecie rejestrującej stosuje się roztwór wewnętrzny oparty na K+.
- Przenieś pojedynczy skrawek tkanki z komory inkubacyjnej do komory rejestracyjnej i przymocuj go za pomocą nylonowej nici do obciążnika w kształcie litery U. Komorę rejestracyjną należy stale perfundować nasyconym karbogenem ACSF w temperaturze 25 °C z przepływem 3 mL/min.
- Po napełnieniu mikropipety roztworem wewnętrznym zlokalizuj MVN, korzystając z obiektywu o niskim powiększeniu (10x). Pojedyncze neurony w obrębie MVN można zlokalizować za pomocą obiektywu o dużym powiększeniu (40x).
UWAGA: Jakość komórki jest kluczowa dla zapewnienia wysokiej jakości rejestracji oraz trwałości komórki podczas próby uzyskania konfiguracji whole-cell. Dobra komórka będzie miała kształt sferyczny, odblaskową błonę komórkową i niewidoczne jądro. Komórka niskiej jakości będzie miała duże, widoczne jądro (przypominające jajko) oraz wygląd obrzęknięty lub skurczony. - Przed przebiciem tkanki pipetą przyłóż niewielkie dodatnie ciśnienie, aby odsunąć zanieczyszczenia od końcówki pipety.
- Przesuń pipetę za pomocą mikromanipulatora w stronę wybranego neuronu, aż na błonie neuronalnej pojawi się niewielkie wgłębienie. Zwolnij dodatnie ciśnienie i przyłóż niewielkie ciśnienie ujemne.
- Po uzyskaniu uszczelnienia rzędu 1 GΩ przyłóż do uchwytu pipety przez port ssący delikatny, krótki i gwałtowny impuls dodatniego ciśnienia, aby przerwać błonę i uzyskać konfigurację whole-cell.
- Wykonaj rejestracje prądowe w konfiguracji whole-cell (current clamp), stosując standardowe techniki21,22.
6. Przykładanie szumu sinusoidalnego i stochastycznego do pojedynczych neuronów jądra przedsionka przyśrodkowego
- Zastosuj szum stochastyczny i sinusoidalny w zakresie amplitud od 3 do 24 pA, aby wyznaczyć próg neuronalny oraz częstotliwość wyładowań.
- Wyznacz próg sensoryczny poprzez pogrupowanie niższych i wyższych intensywności bodźców, a następnie przeprowadź analizę ANOVA w celu zaobserwowania różnic (jak pokazano na Rysunku uzupełniającym 1).
- Oblicz średnią częstotliwość wyładowań w okresie 10 s, w którym wstrzyknięto lub zostanie wstrzyknięty skokowy prąd depolaryzujący dla każdego poziomu natężenia prądu (łącznie 7 epizodów; Rysunek 1).
- Wykorzystaj wartości średniej częstotliwości wyładowań do wygenerowania wykresu zależności częstotliwości wyładowań od natężenia prądu i przeprowadź analizę regresji liniowej, aby wyznaczyć nachylenie linii dopasowania. Nachylenie linii dopasowania jest wskaźnikiem wzmocnienia neuronalnego22.
Rysunek 1: Profile schematyczne protokołów kontrolnych, sinusoidalnych i szumu stochastycznego. (A) Protokoły kontrolne (bez szumu) zastosowane do neuronów MVN. (B) Protokół szumu sinusoidalnego o częstotliwości 2 Hz. (C) Protokoły szumu stochastycznego, w których większość widma mocy wynosi ≤2 Hz. Każdy przedstawiony tutaj protokół ma amplitudę ±6 pA z 10 s prądem depolaryzującym zwiększanym o 10 pA aż do 50 pA. Prawdziwy bodziec nie posiada skoku prądu depolaryzującego i jest zatem pierwszym epizodem tych protokołów służącym do określenia zmian wzmocnienia neuronalnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wstępne pomiary mogą dostarczyć informacji o wpływie szumu sinusoidalnego i stochastycznego na podstawowe częstości wyładowań poszczególnych neuronów MVN oraz o tym, jak bodźce wpływają na wzmocnienie neuronów. Rycina 2 pokazuje, że ani szum sinusoidalny, ani stochastyczny nie zmieniają podstawowych częstości wyładowań neuronów MVN w porównaniu z pomiarami kontrolnymi (bez szumu). Informacja ta jest kluczowa dla określenia progu poszczególnych neuronów. Podczas stosowania...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wpływ galwanicznej stymulacji przedsionkowej (GVS) na układ przedsionkowy został podkreślony in vivo u ludzi 3,13,23, świnek morskich14, gryzoni18 i naczelnych innych niż ludzie24. Jednak w żadnym z tych badań nie oceniano bezpośredniego wpływu szumu elektrycznego na wrażliwość poszczególnych neuronów w układzie przedsionkowym. W tym artykule zademonstrujemy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
SPS był wspierany przez stypendium badawcze Uniwersytetu w Sydney.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| CaCl | Scharlau | CA01951000 | Używany do ACSF i sACSF |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | Używany do ACSF i sACSF |
| EGTA | Sigma | E0396-25G | Używany do wewnątrzkomórkowego roztworu opartego na K |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | Używany do wewnątrzkomórkowego roztworu na bazie K |
| KCl | Chem-supply | PA054-500G | Stosowany do ACSF, sACSF i roztworu wewnątrzkomórkowego |
| K-glukonian | Sigma | P1847-100G | Używany do roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K |
| Mg-ATP | Sigma | A9187-500MG | Używany do roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie |
| K MgCl | Chem dostarczany | MA00360500 Używany do ACSF i sACSF | |
| Na3-GTP | Sigma | G8877-100MG | Używany do roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K |
| Chem do dostarczania | NaCl | SO02270500 | Zastosowanie do ACSF i roztworu wewnątrzkomórkowego |
| NaH2PO4• 2H2O | Ajax | AJA471-500G | Używany do ACSF i sACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761-1KG | Używany do ACSF i sACSF |
| Sacharoza | Chem-supply | SA030-500G | Używany do sACSF |
| Izofluran | Henry Schein | 1169567762 | Używany do znieczulania myszy |
| EKWIPUNEK | |||
| Kapilary ze szkła borokrzemianowego Instrumenty | Warner | GC150T-7.5 | 1,5 mm OD, 1,16 mm ID, 7,5 cm długości |
| Oprogramowanie do akskopii | Axograph | Używany do elektrofizjologii i analizy | |
| Friedmen-Pearson Rongeurs | World instrumenty precyzyjne | 14089 | Używany do rozwarstwiania |
| Ściągacz do mikropipet | Narishige | PP-830 | Używany do mikropipet |
| Wzmacniacz wielocęgowy | Axon instruments | 700B | Używany do elektrofizjologii |
| pH-metr | Sper scientific | 860033 | Używany do roztworu wewnętrznego |
| Nożyczki standardowe | FST | 14028-10 | Używany do preparacji |
| Mikromanipulator Sutter | MP-225/M | Używany do elektrofizjologii | |
| Mikroskop pionowy | Olympus | BX51WI | Używany do elektrofizjologii |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Używany do krojenia tkanki mózgowej |
Bibliografia
- Amiridis, I. G., Hatzitaki, V., Arabatzi, F. Age-induced modifications of static postural control in humans. Neuroscience Letters. 350 (3), 137-140 (2003).
- Iwasaki, S., Yamasoba, T. Dizziness and imbalance in the elderly: age-related decline in the vestibular system. Aging and disease. 6 (1), (2015).
- Fujimoto, C., et al. Noisy galvanic vestibular stimulation induces a sustained improvement in body balance in elderly adults. Scientific Reports. 6, 37575(2016).
- Breen, P. P., et al. Peripheral tactile sensory perception of older adults improved using subsensory electrical noise stimulation. Medical Engineering & Physics. 38 (8), 822-825 (2016).
- Yamamoto, Y., Struzik, Z. R., Soma, R., Ohashi, K., Kwak, S. Noisy vestibular stimulation improves autonomic and motor responsiveness in central neurodegenerative disorders. Annals of Neurology. 58 (2), 175-181 (2005).
- Soma, R., Nozaki, D., Kwak, S., Yamamoto, Y. 1/f noise outperforms white noise in sensitizing baroreflex function in the human brain. Physical Review Letters. 91 (7), 078101(2003).
- Wiesenfeld, K., Moss, F. Stochastic resonance and the benefits of noise: from ice ages to crayfish and SQUIDs. Nature. 373 (6509), 33-36 (1995).
- Moss, F., Ward, L. M., Sannita, W. G. Stochastic resonance and sensory information processing: a tutorial and review of application. Clinical Neurophysiology. 115 (2), 267-281 (2004).
- Goel, R., et al. Using low levels of stochastic vestibular stimulation to improve balance function. PloS one. 10 (8), e0136335(2015).
- Inukai, Y., et al. Effect of noisy galvanic vestibular stimulation on center of pressure sway of static standing posture. Brain Stimulation: Basic, Translational, and Clinical Research in Neuromodulation. 11 (1), 85-93 (2018).
- Mulavara, A. P., et al. Using low levels of stochastic vestibular stimulation to improve locomotor stability. Frontiers in Systems Neuroscience. 9, 117(2015).
- Iwasaki, S., et al. Noisy vestibular stimulation increases gait speed in normals and in bilateral vestibulopathy. Brain stimulation. 11 (4), 709-715 (2018).
- Serrador, J. M., Deegan, B. M., Geraghty, M. C., Wood, S. J. Enhancing vestibular function in the elderly with imperceptible electrical stimulation. Scientific Reports. 8 (1), 336(2018).
- Kim, J., Curthoys, I. S. Responses of primary vestibular neurons to galvanic vestibular stimulation (GVS) in the anaesthetised guinea pig. Brain Research Bulletin. 64 (3), 265-271 (2004).
- Flores, A., et al. Stochastic resonance in the synaptic transmission between hair cells and vestibular primary afferents in development. Neuroscience. 322, 416-429 (2016).
- Huidobro, N., et al. Brownian Optogenetic-Noise-Photostimulation on the Brain Amplifies Somatosensory-Evoked Field Potentials. Frontiers in Neuroscience. 11, 464-464 (2017).
- Goldberg, J., Ferna, C., Smith, C. Responses of vestibular-nerve afferents in the squirrel monkey to externally applied galvanic currents. Brain Research. 252 (1), 156-160 (1982).
- Baird, R., Desmadryl, G., Fernandez, C., Goldberg, J. The vestibular nerve of the chinchilla. II. Relation between afferent response properties and peripheral innervation patterns in the semicircular canals. Journal of Neurophysiology. 60 (1), 182-203 (1988).
- Remedios, L., et al. Effects of Short-Term Random Noise Electrical Stimulation on Dissociated Pyramidal Neurons from the Cerebral Cortex. Neuroscience. 404, 371-386 (2019).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Gulf professional publishing. (2004).
- Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. Journal of Neurophysiology. 95 (5), 3208-3218 (2006).
- Camp, A., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170 (1), 348-360 (2010).
- Iwasaki, S., et al. Effect of Noisy Galvanic Vestibular Stimulation on Ocular Vestibular-Evoked Myogenic Potentials to Bone-Conducted Vibration. Front in Neurology. 8, 26(2017).
- Goldberg, J., Smith, C. E., Fernandez, C. Relation between discharge regularity and responses to externally applied galvanic currents in vestibular nerve afferents of the squirrel monkey. Journal of Neurophysiology. 51 (6), 1236-1256 (1984).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
