Artykuł metodologiczny

Metody transferu energii rezonansu Förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza Hollidaya przez GEN1

DOI:

10.3791/60045

⸱

18 września 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of DNA Replication and Recombination, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest protokół do wykonywania transferu energii rezonansu Förstera dla pojedynczej cząsteczki w celu zbadania rozdzielczości HJ. Dwukolorowe wzbudzenie przemienne służy do wyznaczania stałych dysocjacji. Jednokolorowy smFRET poklatkowy jest następnie stosowany w testach rozszczepienia w czasie rzeczywistym w celu uzyskania rozkładu czasu przebywania przed rozdzielczością HJ.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody masowe mierzą zespołowe zachowanie molekuł, w których poszczególne szybkości reakcji podstawowych etapów są uśredniane w całej populacji. Jednocząsteczkowy rezonansowy transfer energii Förstera (smFRET) zapewnia zapis zmian konformacyjnych zachodzących przez poszczególne cząsteczki w czasie rzeczywistym. Dlatego smFRET jest skuteczny w pomiarze zmian strukturalnych w enzymie lub substracie podczas wiązania i katalizy. W pracy przedstawiono protokół obrazowania pojedynczych cząsteczek oddziaływania czterokierunkowego połączenia Hollidaya (HJ) i endonukleazy szczelinowej I (GEN1), cytozolowego enzymu rekombinacji homologicznej. Zaprezentowano również jednokolorowe i dwukolorowe protokoły eksperymentalne smFRET z naprzemiennym wzbudzeniem (ALEX), które śledzą rozdzielczość HJ przez GEN1 w czasie rzeczywistym. Kinetyka dimeryzacji GEN1 jest określana w HJ, co sugeruje się, że odgrywa kluczową rolę w rozdzielczości HJ i do tej pory pozostawało nieuchwytne. Opisane tutaj techniki mogą być szeroko stosowane w celu uzyskania cennych mechanistycznych wglądów w wiele układów enzymatycznych DNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody jednocząsteczkowe oparte na detekcji fluorescencyjnej zapewniają wysoki stosunek sygnału do szumu1. FRET to technika spektroskopowa, która może mierzyć odległości w zakresie 1–10 nm, co daje tę technikę jako molekularną linijkę do pomiaru odległości w zakresie nanometrów2,3. Widmo absorpcyjne akceptora częściowo pokrywa się widmowo z widmem emisyjnym dawcy na krótszym końcu fali. FRET odbywa się za pośrednictwem bezpromieniowego transferu energii między parą donora i akceptora, podczas gdy efektywność transferu energii zależy od odległości i orientacji akceptora4.

Zastosowano kilka podejść mających na celu zminimalizowanie tła i poprawę skuteczności wykrywania sygnału fluorescencji5,6. Jednym z podejść jest mikroskopia konfokalna, w której otwór otworkowy ogranicza miejsce wzbudzenia do rozmiaru poniżej limitu dyfrakcji7. Innym podejściem jest fluorescencja całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), która jest techniką oświetlenia o szerokim polu, w której światło jest kierowane poza oś powyżej kąta krytycznego8. Światło jest następnie całkowicie wewnętrznie odbijane na granicy faz między szkłem a roztworem wodnym, generując ulotną falę, która oświetla tylko fluorofory przyczepione do powierzchni szkła i zapobiega powstawaniu tła dla fluoroforów w pozostałej części roztworu.

W mikroskopii konfokalnej cząsteczki mogą być albo swobodnie dyfukowalne, albo unieruchomione powierzchniowo. Osiągnięta rozdzielczość czasowa może wynosić od mikrosekund do kilku milisekund9. Detekcja konfokalna pojedynczej cząsteczki jest wykonywana za pomocą jednofotonowej diody lawinowej () i skanowania punkt po punkcie obszaru zainteresowania10. W TIRF szereg czasowy kilkuset cząsteczek unieruchomionych na powierzchni jest rejestrowany przez czuły na położenie dwuwymiarowy detektor sprzężony z ładunkiem (CCD). Przetwornik CCD wzmacnia sygnał fluorescencji za pomocą zintensyfikowanego ekranu fosforowego i płytki mikrokanałowej lub wbudowanego w układ zwielokrotnienia fotoelektronów (EMCCD). Rozdzielczość czasowa jest zależna od prędkości odczytu i wydajności kwantowej CCD i zwykle rzędu kilkudziesięciu milisekund6.

HJ jest centralnym produktem pośrednim w naprawie i rekombinacji DNA11,12,13,14. HJ ma dwie ciągłe i dwie przecinające się nici, które łączą się między ciągłymi pasmami bez przecinania się. HJ występuje w roztworze jako konformery X-stacked, które ulegają ciągłej izomeryzacji przez ciągłe nici, które stają się skrzyżowane, a przecinające się nici stają się ciągłe w drugim konformerze15. Preferencja izomerów HJ jest zależna od sekwencji rdzenia i środowiska jonowego i została szeroko zbadana przez FRET16,17,18,19.

GEN120 jest białkiem monomerycznym w roztworze21 i wymaga dimeryzacji w celu rozszczepienia HJ, umożliwiając w ten sposób prawidłowe rozdzielenie rekombinowanych nici22,23. Preferencja konwersantu układającego HJ wpływa na wynik rekombinacji genetycznej poprzez ustawienie orientacji rozdzielczości przez resolwazy HJ24. Zrozumienie, w jaki sposób GEN1 wiąże HJ, koordynuje dwa nacięcia i zapewnia jego pełną rozdzielczość, wszystko to było przedmiotem intensywnych badań21,22,23,25,26,27,28,29,30.

W tym badaniu użyto obiektywnej konfiguracji TIRF, jak opisano wcześniej31. Dwukolorowe wzbudzenie naprzemienne (ALEX) stosuje się w celu określenia zmian konformacyjnych po oddziaływaniu GEN1 z HJ znakowanym fluoroforem. ALEX tworzy histogramy 2D w oparciu o dwa parametry ratiometryczne: wydajność FRET E, która jest zależna od odległości donor-akceptor, oraz parametr stechiometryczny S, który mierzy stechiometrię donor-akceptor32. ALEX umożliwia sortowanie gatunków fluorescencyjnych na podstawie stechiometrii fluoroforów, w tym subpopulacji tylko dawców, tylko akceptorów i subpopulacji. ALEX może rozszerzyć zastosowanie FRET na pełny zakres i może wykrywać różnice w jasności fluoroforu i oligomeryzacji, a także monitorować interakcje makrocząsteczka-ligand33.

Stwierdzono, że GEN1 konsekwentnie udaje się rozwiązać HJ w czasie życia kompleksu GEN1-HJ. Zależne od czasu zmiany konformacyjne wyprowadza się ze śladów czasowych poszczególnych cząsteczek, podczas gdy histogramy reprezentują rozmieszczenie podstawowych populacji. Za pomocą jednokolorowego FRET w trybie poklatkowym wykazano szybkie i powolne tempo wyłączania dimeru GEN1, co zwiększa powinowactwo zmontowanego dimeru GEN1 przy pierwszym produkcie nacięcia.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych funkcjonalizowanych powierzchniowo

  1. czyszczenie
    1. Umieść pięć szkiełek nakrywkowych (24 mm x 60 mm) w etanolu w słoiku z kopliny. Sonikować w etanolu, a następnie w 1 M wodorotlenku potasu przez 30 minut przez 3x. Umyć w acetonie 3x, a następnie zdekantować.
  2. Silanizacja
    1. Przygotować roztwór 2,8% 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES) w acetonie. Szczelnie zamknąć butelkę APTES folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Używaj okularów ochronnych i pracuj pod wyciągiem. Pojemnik z roztworem silanu należy całkowicie wysuszyć i przepłukać acetonem bezpośrednio przed i po wlaniu roztworu silanu do słoika.
    2. Wlać 70 ml 2,8% roztworu APTES do słoika Coplin zawierającego szkiełka nakrywkowe. Potrząsaj słoikiem przez 4 minuty w wytrząsarce orbitalnej.
    3. Pozostaw słoik na ławce na 5 minut, sonikuj przez 1 minutę, a na koniec trzymaj słoik na ławce przez kolejne 10 minut, aby silan zareagował z grupami hydroksylowymi na powierzchni szkła.
    4. Ugasić reakcję przez dodanie 1 litra wody dejonizowanej, wlewając wodę bezpośrednio do słoika w celu szybkiej wymiany rozpuszczalnika. Opłucz szkiełka 3x w wodzie, potrząsając słoikiem na boki na płaskiej powierzchni.
    5. Wyjmij szkiełka nakrywkowe ze słoika i umieść je na tacy z folii aluminiowej. Piecz szkiełka nakrywkowe w piekarniku w temperaturze 110 °C przez 30 minut, aby wysuszyć szkiełka nakrywkowe i utwardzić silan. Pozostaw tacę na stole, aby szkiełka nakrywkowe ostygły do temperatury pokojowej.
  3. PEGylacja
    1. Rozgrzej biotynylowany PEG i PEG, przechowywane w temperaturze -20 °C do temperatury pokojowej (RT), aby zapobiec kondensacji wilgoci po otwarciu pojemnika.
    2. Umieść pięć szkiełek nakrywkowych silanizowaną powierzchnią skierowaną do góry na pudełku. Umieść dwa szkiełka nakrywkowe (22 mm x 22 mm) jako przekładki wzdłuż krawędzi silanizowanych szkiełek nakrywkowych.
    3. Po podgrzaniu przygotuj biotynylowane roztwory PEG i PEG w stosunku ~1:100 w 1 ml świeżego, 0,1 M roztworu wodorowęglanu sodu, dodając 1,5 mg biotynylowanego PEG i 150 mg PEG do probówki o pojemności 1,5 ml.
    4. Obracaj rurkę, aby rozpuścić PEG i odwiruj w dół, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
      UWAGA: Idąc dalej od tego kroku, bądź szybki, ponieważ PEG hydrolizuje w roztworze w ciągu min.
    5. Szybko nałóż 100 μl roztworu PEG na każde szkiełko nakrywkowe. Weź kolejne upieczone szkiełko nakrywkowe i umieść jego górną silanizowaną powierzchnię zadrukowaną do dołu na wierzchu szkiełka nakrywkowego z roztworem PEG, tworząc w ten sposób kanapkę z roztworem szkła i szkła, w której niesilanizowane szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm umożliwiają łatwe oddzielenie dwóch funkcjonalnych szkiełek nakrywkowych.
    6. Szkiełka nakrywkowe należy inkubować przez noc (16 godzin) w ciemności i w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji rozłóż szkiełka nakrywkowe, a następnie spłucz 10 razy wodą dejonizowaną, myjąc z boku butelką ze spryskiwaczem.
    7. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe pod strumieniem suchego azotu. Suche szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w próżni.
      UWAGA: Szkiełka mogą być używane przez 1 miesiąc bez pogorszenia jakości.

2. Przygotowanie komory przepływowej

  1. Jednokanałowa komora przepływowa
    1. Wywierć dwa otwory o średnicy 1,22 mm w środkowej części szkiełka kwarcowego (50 mm x 20 mm) ze środkami umieszczonymi w odległości 37 mm od siebie i 6,5 mm od krawędzi szkiełka (Rysunek 1A).
    2. Wytnij kanał o wymiarach 41 mm x 2,25 mm na kawałek podwójnego arkusza kleju o wymiarach 50 mm x 20 mm za pomocą noża elektronicznego.
    3. Zdejmij plastikową stronę osłony ochronnej i wyrównaj krawędzie elementu z krawędziami szkiełka kwarcowego. Usuń uwięzione pęcherzyki powietrza, delikatnie naciskając pęsetą z politetrafluoroetylenu.
    4. Odklej papierową stronę kawałka kleju. Zamontuj element na funkcjonalizowanej powierzchni szkiełka nakrywkowego.
    5. Przyciąć rurkę polietylenową (ID 1,22 mm) na długość 11 cm dla wlotu i 25 cm dla wylotu. Włóż rurkę do wcześniej wywierconych otworów jako wlot i wylot komory przepływowej.
    6. Użyj 5-minutowego kleju epoksydowego, aby uszczelnić wokół krawędzi powierzchni styku kwarcu i szkiełka nakrywkowego oraz wokół rurek wlotowych i wylotowych.
    7. Użyj komory przepływowej natychmiast po wyschnięciu lub przechowuj w suchym odkurzaczu do późniejszego użycia.
    8. Rozpuścić awidynę w PBS do stężenia 0,03 mg/ml. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm.
    9. Wlać awidynę do komory przepływowej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Użyć innej strzykawki wypełnionej buforem, aby wypłukać nadmiar awidyny. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza podczas wymiany strzykawek.
  2. Wielokanałowa komórka przepływowa
    1. Wywierć sześć otworów o średnicy 1,22 mm na każdym z dłuższych boków zjeżdżalni kwarcowej (76 mm x 25 mm) (Rysunek 1B). Wykonaj otwory w odległości 4.5 mm od krawędzi prowadnicy i 9.3 mm od siebie. Upewnij się, że odległość między środkami każdej pary otworów wynosi 15 mm.
    2. Wytnij sześć kanałów (20 mm x 2,25 mm) w kawałku podwójnej taśmy klejącej o wymiarach 76 mm x 25 mm za pomocą elektronicznego obcinaka.
    3. Odklej plastikową stronę osłony ochronnej i wyrównaj krawędzie kleju z krawędziami szkiełka kwarcowego. Usuń wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza, delikatnie naciskając za pomocą pęsety z politetrafluoroetylenu.
    4. Odklej papierową stronę kleju i zamontuj na funkcjonalnej powierzchni szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: Czasami odklejanie strony papieru i mocowanie do szkiełka kwarcowego dobrze sprawdza się w wielokanałowej komorze przepływowej.
    5. Wytnij rurki wlotowe (11 cm) i rurki wylotowe (25 cm) dla sześciu kanałów. Przygotować komorę przepływową zgodnie z opisem w krokach 2.1.6–2.1.9.
    6. Podłącz wylot pierwszego kanału do pompy. Umieść wlot w probówce 0.5 ml z OSS.
      UWAGA: Długość rurki wlotowej jest dobrana tak, aby zmaksymalizować liczbę zdarzeń w eksperymentach rozszczepienia przeprowadzanych przy ciągłym przepływie poprzez synchronizację czasu wejścia enzymu do komórki przepływowej i rozpoczęcia obrazowania, zmniejszając w ten sposób przedwczesne fotowybielanie fluoroforów.
    7. Przejdź do nowego kanału, odłączając wylot używanego kanału. Zamknij wylot korkiem wykonanym z igły strzykawkowej uszczelnionej klejem w plastikowej części. Zamknij wlot używanego kanału.

3. Przygotowanie systemu oczyszczania tlenu (OSS)

  1. Rozpuścić 0,2 g kwasu (±)-6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowego (wygaszacz stanu trypletowego, który minimalizuje mruganie fluoroforów) w 800 μl metanolu.
  2. Dodać 6 ml dejonizowanegoH2Oi dodawać kroplami 1 N NaOH, aż się rozpuści. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy, przygotować na 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C. Stężenie zapasu wynosi ~100 μM.
  3. Przygotować świeży roztwór kwasu 3,4-dihroksybenzoesowego (PCA), rozpuszczając 61 mg proszku PCA w 4 ml ddH2O. Stężenie zapasu wynosi ~100 nM.
  4. Dodawać kroplami 58 μl 10 N NaOH, upewniając się, że po każdej kropli wirujesz, aż PCA całkowicie się rozpuści (pH = 9).
  5. Rozpuścić 5,3 mg protokatechuatu 3,4-dioksygenazy (3,4-PCD) w 7 ml buforu do przechowywania PCD (Tabela 1). 3,4-PCD usuwa tlen z wiążących/rozszczepiających poprzez katalizowanie utleniania kwasu protokatechowego34.
  6. Podzielić roztwór PCD na 1 ml porcji. Stężenie wyjściowe wynosi ~1 μM. Podwielokrotności należy zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania lub w temperaturze -20 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania.
  7. Przygotować świeży bufor wiążący (Tabela 1). Zastąp 2 mM CaCl2 2 2 mM MgCl2 do eksperymentów z rozszczepieniem smFRET.
  8. Przygotować 1 ml buforu do obrazowania (Tabela 1). Utrzymuj bufor obrazowania na lodzie, dopóki nie zostanie wprowadzony do komory przepływowej w celu utrzymania aktywności systemu oczyszczania tlenu.

4. Przygotowanie fluorescencyjnie znakowanych HJ

  1. Rozpuść liofilizowane oligonukleotydy (tabela 2) w buforze tris-EDTA (tabela 1) do stężenia 100 μM.
  2. Przygotować syntetyczne złącze, mieszając równomolowe porcje ~ 3 μl każdego z oligonukleotydów X0 wymienionych w tabeli 1.
  3. Wyżarzanie poprzez ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie powolne chłodzenie do temperatury rzeczywistej z szybkością 1 °C/min. Aby osiągnąć pożądaną szybkość chłodzenia, należy użyć bloku grzewczego lub termocyklera PCR.
  4. Załaduj mieszaninę na 8 cm x 8 cm żelu poliakryloamidowego 10% Tris-boran-EDTA. Zastosować 100 V i uruchomić żel przez ~2 godziny. Paski są wyraźnie widoczne gołym okiem, a ich kolor jest fioletowy.
  5. Wyciąć pasmo wyżarzonego podłoża czystym ostrzem. Przenieś kawałek żelu do autoklawowanej probówki o pojemności 1,5 ml.
  6. Rozdrobnić kawałek żelu wewnątrz probówki za pomocą czystego tłoka, a następnie dodać 100 μl buforu TE100 (Tabela 1).
  7. Ekstrahować HJ przez wytrząsanie probówki w temperaturze 20 °C przy 1 500 obr./min w termomikserze przez ~ 2 godziny lub inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  8. Przeprowadzić wytrącanie etanolu na roztworze zawierającym substrat35.
  9. Zawiesić substrat w 20 μl buforu TE100 (Tabela 1). Końcowe stężenie wynosi 1–3 μM. Podwielokrotność 2 μl w każdej probówce i przechowywać w temperaturze -20 °C.

5. Ekspresja białka i oczyszczanie GEN1

  1. Skonstruuj plazmid do ekspresji obciętego ludzkiego GEN11,2,3,4,5 ze znacznikiem hexa histydyny na C-końcu20 przez PCR wektora wejściowego.
    UWAGA: Znakowanie N-terminala skutkowałoby dezaktywacją GEN1. Niestrukturalny ogon C sprawia, że oczyszczanie GEN1 na całej długości jest znacznie trudniejsze. Ponadto zgłoszono, że GEN1 o pełnej długości wykazuje mniejszą aktywność niż wersja skrócona23.
  2. Przekształć wektor ekspresyjny w szczep E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL.
  3. Przekształcone komórki zaszczepić w dwóch kolbach o pojemności 6 l, z których każda zawiera 2 litry pożywki bulionowej Luria w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy prędkości 180 obr./min, aż do osiągnięcia OD600 równej 0,8.
  4. Schłodzić kulturę do temperatury 16 °C i indukować ekspresję GEN1 za pomocą 0,1 mM izopropylo-β-d-tiogalaktopiranozydu (IPTG) przez 48 godzin.
  5. Zebrać komórki, obracając je w temperaturze 4 °C i 1000 x g w wirówce. Z każdego litra kultury daje 5–6 g osadu.
  6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w buforze do lizy (Tabela 1) przy użyciu 4 ml/g komórek.
  7. Przeprowadzić lizę komórek za pomocą urządzenia do zaburzania komórek przy ciśnieniu 30 kPsi, a następnie wirować w dół przy 10 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przefiltrować go na lodzie za pomocą filtrów 0,45 μm.
  8. Przeprowadzić oczyszczanie białka za pomocą FPLC, przepuszczając filtrat przez kolumnę Ni-NTA o pojemności 5 ml przy natężeniu przepływu 2,5 ml/min przy użyciu buforu A (Tabela 1).
  9. Mycie z 15 objętościami kolumn (CV). Elute z gradientem liniowym buforu A i 500 mM imidazolu przez 20 CV we frakcjach 5 ml. GEN1 wymywa się z kolumny przy około 100 mM imidazolu.
  10. Odpipetować 10 μL podwielokrotności z zebranych frakcji, dodać równą objętość 2x barwnika ładującego SDS do każdej podwielokrotności. Próbki poddać denaturacji przez ogrzewanie w temperaturze 90 °C przez 5 minut, schłodzić i odwirować.
  11. Załaduj próbki do 10% żelu Bis-Tris. Uruchom żel przez 30–45 minut przy napięciu 200 V. Plamić za pomocą Coomassie Brilliant Blue, a następnie odbarwić. Zbierz frakcje zawierające oczyszczony GEN1.
  12. Zmniejszyć stężenie soli w połączonych frakcjach do 100 mM przez rozcieńczenie przy użyciu buforu C (tabela 1).
  13. Przepuścić białko o niskiej zawartości soli przez kolumnę z heparyną o pojemności 5 ml przy natężeniu przepływu 3 ml / min przy użyciu buforu B (Tabela 1).
  14. Przemyć 10 CV. Eluować przy użyciu gradientu 20 CV z buforem B i 1 M NaCl. Zbierz 5 ml frakcji, w których GEN1 eluuje około 360 mM NaCl.
  15. Sprawdź eluowane frakcje pod kątem oczyszczonych frakcji GEN1 zgodnie z opisem w kroku 5.8. Połączyć te frakcje i rozcieńczyć do 100 mM NaCl za pomocą buforu C.
  16. Załaduj dolne białko soli do kolumny kationitowej przy natężeniu przepływu 1 ml / min za pomocą buforu B.
  17. Eluować o nachyleniu 40 CV przy użyciu buforu B i 1 M NaCl. Zbierz frakcje o objętości 1,7 ml, w których GEN1 eluuje około 300 mM NaCl.
  18. Sprawdź czystość GEN1 we eluowanych frakcjach, jak opisano w kroku 5.8.
  19. Połączyć najczystsze frakcje i dializować w temperaturze 4 °C w stosunku do buforu do przechowywania (tabela 1). Wykonać co najmniej jedną wymianę buforu podczas dializy.
  20. Zmierz stężenie białka ~0,5–1 mg/ml. Podwielokrotność dializowanego białka w objętości 10–15 μl umieścić w małych probówkach, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. Eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami FRET

UWAGA: Eksperymenty smFRET są przeprowadzane na specjalnie zbudowanym systemie TIRF opartym na celach (Rysunek 1C) opisanym wcześniej31.

  1. Eksperymenty z jednokolorowymi fretami
    1. Nałóż jedną kroplę olejku immersyjnego na obiektyw TIRF 100x. Ustaw EMCCD na odpowiednie wzmocnienie, aby zoptymalizować sygnał do tła i zapobiec nasyceniu.
      UWAGA: Nie patrz bezpośrednio w wiązkę lasera i nie noś okularów ochronnych podczas ustawiania lasera.
    2. Ostrożnie umieścić celę przepływową na uchwycie próbki. Stopniowo podnoś obiektyw, dokonując zgrubnej regulacji, aż olej dotknie szkiełka nakrywkowego.
    3. Włącz zielony laser (532 nm). Przełącz na tryb precyzyjnej regulacji obiektywu. Skieruj emisję do portu kamery, aby obserwować obraz na monitorze.
    4. Dostosuj wysokość obiektywu, aż funkcjonalizowana powierzchnia szkiełka nakrywkowego zostanie ostra i będzie można ją obserwować na monitorze.
      UWAGA: Akwizycja obrazu przez EMCCD wyzwala wzbudzenie laserowe za pomocą przestrajalnego filtra akustyczno-optycznego (AOTF), aby zapobiec fotowybielaniu próbki, gdy obrazy nie są rejestrowane.
    5. Sprawdź, czy tło z funkcjonalizowanej powierzchni szkiełek nakrywkowych nie przekracza kilku punktów przed spływającym fluorescencyjnie oznakowanym HJ.
    6. Rozcieńczyć substrat podstawowy około 1000 razy w buforze TE100 (Tabela 1) do końcowego stężenia 1–5 nM. Odpipetować 0,2–0,5 μl rozcieńczonego substratu do 120 μl bufora obrazowego z OSS do probówki o pojemności 0,5 ml.
    7. Podłączyć wylot komory przepływowej do pompy strzykawkowej. Włóż rurkę wlotową komory przepływowej do probówki o pojemności 1,5 ml i uruchom pompę strzykawkową z natężeniem przepływu 30–50 μl/min, aby pobrać roztwór z probówki.
    8. Często sprawdzaj powierzchnię pod kątem dobrego pokrycia (100–300 jednorodnie rozłożonych, dobrze rozmieszczonych substratów), obrazując krótko za pomocą zielonego lasera.
    9. Jeśli pokrycie powierzchni nadal nie jest wystarczające, odczekaj kilka minut, aż znakowany fluorescencyjnie HJ z roztworu osiądzie na powierzchni lub powtórz krok przepływu.
    10. Przelej kolejne 120 μl buforu obrazującego (Tabela 1) z prędkością 30–50 μl/min, aby przepłukać niezwiązany, znakowany fluorescencyjnie HJ. Następnie pozostaw komórkę przepływową na 5 minut, aby OSS mogła zubożyć rozpuszczony tlen. Fotowybielanie fluoroforów powinno być minimalne na początku obrazowania.
    11. Ustaw czas naświetlania (~60 ms), czas cyklu zostanie automatycznie ustawiony przez oprogramowanie na podstawie prędkości przesyłania danych (~104 ms) i określ żądaną liczbę cykli lub klatek (~400). Emisja z donora (Cy3) i akceptora (Alexa Fluor 647) jest dzielona na dwa kanały kolorów przez urządzenie rozdzielające obraz.
    12. Znajdź odpowiedni obszar na powierzchni, ustaw ostrość obrazu, dostosowując wysokość obiektywu, a następnie nagraj i zapisz film w 16-bitowym formacie TIFF.
    13. Przejście do nowego obszaru.
      UWAGA: Zawsze poruszaj się tylko w jednym kierunku (tj. od wylotu do wlotu), aby uniknąć dwukrotnego obrazowania tego samego obszaru.
    14. Przygotuj pojedynczo 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 i 100 nM GEN1 w 120 μl bufora obrazowania. Przepływ roztworu z natężeniem przepływu 30-50 μl/min.
      UWAGA: Jeśli wymagany pomiar jest wykonywany w stanie ustalonym, jak w przypadku wiązania HJ przez GEN1 lub izomeryzacji wolnego HJ, odczekaj 3–5 minut po ustaniu przepływu, aby nagrać film. Zdobądź od trzech do czterech filmów z nowych obszarów dla każdego stężenia GEN1.
    15. Jeśli pomiar jest wykonywany przy ciągłym przepływie, jak w przypadku rozszczepienia HJ przez GEN1, rozpocznij rejestrację 5–10 s przed wejściem GEN1 do celi przepływowej. Powtórz pomiar, przechodząc do nowego kanału w sześciokanałowej komorze przepływowej.
    16. Na koniec użyj stałego szkiełka fluorescencyjnego, aby zmapować cząstki donora i akceptora względem siebie w urządzeniu do dzielenia obrazu.
    17. Dodaj 0,2 μl kulek fluorescencyjnych o średnicy 1 μm do 500 μl 1 M Tris (pH = 8,0), aby kulki przykleiły się do powierzchni.
    18. Wytnij kwadrat (18 mm x 18 mm) wewnątrz kawałka dwustronnej uszczelki samoprzylepnej o wymiarach 22 mm x 22 mm. Odklej i przyklej kawałek do środka szkiełka kwarcowego o wymiarach 76 mm x 25 mm.
    19. Umieść 50 μl rozcieńczonego roztworu kulek i pozostaw na 5–10 minut, aby osiadały. Przymocuj szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm na wierzchu kwadratowego elementu. Osusz nadmiar kulek roztworem chusteczką, a następnie uszczelnij komorę klejem epoksydowym.
    20. Zrób 100 klatek slajdu z koralikami przy czasie naświetlania 60 ms.
      UWAGA: Zmniejsz moc lasera i wzmocnienie EMCCD do minimum, aby uniknąć nasycenia detektora.
    21. Zainstaluj pakiet oprogramowania (np. TwoTones) i otwórz znajdujące się w nim filmy, jak wskazano w instrukcji obsługi36. Wybierz pozycje poszczególnych koralików w kanałach dawczym i akceptującym. Wygeneruj macierz transformacji zgodnie z opisem w podręczniku.
      UWAGA: To oprogramowanie wykorzystuje matrycę transformacyjną do dopasowania pozycji cząstek w kanałach donorowych i akceptorowych oraz skorygowania wszelkich niewielkich niewspółosiowości w urządzeniu do dzielenia obrazu.
    22. Przejdź do Plik, naciśnij Załaduj film, a następnie wybierz plik filmowy i naciśnij Otwórz. W menu pliku naciśnij Załaduj TFORM i wybierz macierz transformacji wygenerowaną ze slajdu z koralikami. Dostosuj próg dla kanałów dawcy i akceptora, aż nie zostaną uwzględnione żadne wyniki fałszywie dodatnie.
    23. W menu Filtr kanałów wybierz opcję D&A, aby wybrać cząstki oznaczone zarówno donorem, jak i akceptorem. Zaznacz pole Limit najbliższego sąsiada, aby wykluczyć cząsteczki, które znajdują się bardzo blisko siebie. Sprawdź maksymalną eliptyczność, aby wykluczyć bardzo ekscentryczne cząsteczki i sprawdź Granice szerokości, aby wykluczyć bardzo szerokie lub bardzo wąskie cząsteczki.
    24. Wpisz plotHistCW zgodnie z instrukcją w podręczniku Twotones, aby skonstruować histogramy.
      UWAGA: "Pozorna" wydajność FRET jest obliczana przez program, dzieląc emisję akceptora przez całkowitą emisję z dawcy i akceptora. Twotones wykorzystuje 100 interwałów do kosza rozkładu stanów cząsteczek w stosunku do wydajności FRET.
    25. Wpisz plotTimetraceCW zgodnie z instrukcją w instrukcji Twotones, aby wygenerować ślady czasowe dla każdej cząsteczki.
      UWAGA: Ślady czasowe mogą być dalej analizowane przez vbFRET37 w celu zidentyfikowania różnych stanów FRET, ich odpowiednich czasów przebywania i szybkości przejścia między różnymi stanami.
  2. Eksperymenty z dwukolorowym naprzemiennym wzbudzeniem FRET (ALEX)
    1. Nagraj film złożony z następujących po sobie klatek emisji donorowej i akceptorowej przez bezpośrednie wzbudzenia odpowiednio zielonym i czerwonym laserem, każdy o czasie trwania ~80 ms.
    2. Otwórz zdobyte filmy ALEX w Twotones. Ustaw odpowiedni próg wykrywania na ~300 dla trzech kanałów: emisja dawcy z powodu wzbudzenia dawcy (DexDem); emisja akceptora spowodowana wzbudzeniem dawcy (DexAem); i emisja akceptorowa spowodowana wzbudzeniem bezpośrednim (AexAem).
    3. Zastosuj filtr kanałów DexDem&&DexAem&&AexAem, aby wybrać cząstki, które mają zarówno donor, jak i akceptor. Połącz cząstki ~200–300 w trzech kanałach.
    4. Użyj kodu plotHistALEX MATLAB, aby wygenerować histogramy ALEX. Dopasuj różne piki na histogramach do funkcji gaussowskich i określ procent powierzchni pod krzywą dla każdej populacji za pomocą oprogramowania Origin38.
      UWAGA: Piki w teście wiązania odpowiadają związanemu kompleksowi GEN1-HJ, podczas gdy w wolnym HJ piki reprezentują wymienne izomery.
    5. Użyj kodu plotTimetraceALEX MATLAB, aby wygenerować ślad czasowy dla każdej cząsteczki pokazującej emisję donora przez bezpośrednie wzbudzenie oraz emisje akceptorowe spowodowane FRET i bezpośrednim wzbudzeniem.
      UWAGA: ALEX śledzi czas niezależnie, aby pokazać emisje zarówno dawcy, jak i akceptora, ale w niższej rozdzielczości czasowej niż jednokolorowy FRET. Podobnie jak w przypadku jednokolorowego FRET, ślady czasowe ALEX mogą być dalej analizowane przez vbFRET w celu identyfikacji różnych stanów FRET i odpowiadających im czasów przebywania.
    6. Określ stałą dysocjacji, dopasowując wartości procentowe populacji związanej w funkcji GEN1 do funkcji hiperbolicznej.
  3. Jednokolorowy fret poklatkowy
    1. Ustaw czas naświetlania zielonego lasera na 60 ms i czas cyklu na 624 ms lub mniej, w zależności od prędkości obserwowanej dynamiki.
    2. Ustaw natężenie przepływu na 110 μl/min w jednym kanale sześciokanałowej celi przepływowej. Rozpocznij nagrywanie na krótko przed wejściem GEN1 do komory przepływowej.
      UWAGA: Ciągły przepływ prowadzi do szybkiego fotowybielania fluoroforów, dlatego synchronizacja rozpoczęcia obrazowania i wprowadzania białka maksymalizuje liczbę wychwyconych zdarzeń. Optymalny odczyt pompy strzykawkowej zależy od objętości martwej i dokładnej rurki użytej do montażu celi przepływowej; w naszym przypadku jest to ~25 μL.
    3. Uzyskaj film składający się z ~125 klatek, co daje łączny czas akwizycji 78 s. Pod koniec nagrania naświetl próbkę czerwonemu laserowi przez 50 klatek, z których każda ma czas naświetlania 25 ms, aby sondować akceptor.
      UWAGA: Ta metoda wydłuża okno obserwacyjne w eksperymencie rozszczepienia poprzez zmniejszenie liczby cykli wzbudzenia. Parametry kinetyczne, takie jak kon i koff dimeryzacji, są uzyskiwane przez dopasowanie rozkładu do modelu dwuwykładniczego30,38.

7. Testy przesunięcia elektroforetycznego (EMSA)

  1. W całkowitej objętości 50 μl inkubować pożądane stężenie GEN1 z 50 pM znakowanym Cy5 HJ w temperaturze RT przez 30 minut w buforze wiążącym EMSA (Tabela 1).
  2. Załaduj próbki na 8 cm x 8 cm żelu 6% Tris-boran-EDTA. Uruchom żel przy użyciu 100 V przez 1 h + 20 min w 1x buforze TBE przy RT.
  3. Określić procentową zawartość związanego substratu przy stężeniu GEN1 na podstawie jego względnego udziału w całkowitej intensywności fluorescencji odpowiedniego pasa.
    UWAGA: Monomer GEN1-HJ (pasmo I) jest identyfikowany na podstawie zgodności jego rozmiaru z pikomolarnym wiązaniem monomeru GEN1 z naciętym HJ21,30. GEN1-dimer-HJ jest przypisany do pasma II ze względu na stopniowe wiązanie monomeru GEN1 z klasą HJ21,23.
  4. Oblicz pozorne stałe wiązania Kd-monomer-app-EMSA i Kd-dimer-app-EMSA, korzystając z równania:
    figure-protocol-1
    gdzie: Maksimum oznacza stężenie, przy którym dane gatunki osiągnęły maksymalne wiązanie (monomer lub dimer); n jest współczynnikiem Hilla; Kd-app-EMSA jest pozorną stałą wiązania odpowiednich gatunków, oznaczającą stężenie GEN1, przy którym występuje połowa maksimum monomeru lub dimeru.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odchylenie konformera i izomeryzacja HJ

Izomeryzacja HJ została dokładnie zbadana przez FRET poprzez oznaczenie dwóch sąsiadujących ramion skrzyżowania17,18,39. Dawca (Cy3) i akceptor (Alexa Fluor 647) są umieszczone w dwóch sąsiednich ramionach, odpowiednio R (nić 2) i X (nić 3) (Rysunek 2A). Ułożone w stos izomery X zostały przypisane przez ich dwie ciągłe nici [tj. Iso(1,3) lub Iso(2,4)]. Histogram ALEX FRET sąsiedniej etykiety X0 pokazuje dwa szczyty, które odpowiadają zamianie bardziej obfitego Iso(1,3) (E ~ 0,75) i mniej obfitego Iso(2,4) (E ~ 0,40) (Rysunek 2B).

Jednokolorowy FRET jest używany do pozyskiwania śladów czasowych do rejestrowania szybkich zmian konformacyjnych w swobodnym HJ z wysoką rozdzielczością czasową ~10 ms poprzez zmniejszenie używanego obszaru kamery EMCCD2. Reprezentatywny jednokolorowy ślad czasowy FRET złącza X0 pokazuje przejścia między izomerami o wysokim i niskim FRET ( Rysunek 2B). Współczynniki izomeryzacji kIso(1,3)-Iso(2,4) i kIso(2,4)-Iso(1,3) uzyskane z histogramów czasu przebywania Iso(1,3) i Iso(2,4) (Rysunek 2C) są zgodne z tymi zgłoszonymi wcześniej17.

SMFRET demonstruje aktywne zniekształcenie HJ przez GEN1

HJ ulega przegrupowaniu strukturalnemu po powiązaniu z GEN122. Zatem odstęp między donorem a akceptorem jest podobny zarówno w Iso(1,3), jak i Iso(2,4) (Rysunek 3A). Testy wiązania smFRET przeprowadzono w obecności Ca2+, aby zapobiec rozszczepieniu HJ. Histogramy FRET przyległego złącza X0 o różnych stężeniach GEN1 zostały uzyskane przez ALEX (Rysunek 3B). Histogram jest dopasowany do dwóch funkcji Gaussa: jednej odpowiadającej swobodnej wysokiej wartości FRET ISO (1,3), a drugiej odpowiadającej związanej populacji GEN1-HJ po odjęciu udziału Iso(2,4) od niskiego piku FRET.

Przy nasyceniu stężenia GEN1, histogram FRET X0 ma tylko jeden niski pik FRET odpowiadający GEN1 związany z dowolnym izomerem HJ, zgodnie z przewidywaniami modelu22. Pozorna stała dysocjacji monomeru (Kd-monomer-app) jest wyznaczana na podstawie dopasowania hiperbolicznego procentów populacji związanej z GEN1 w funkcji stężenia GEN1 (Rysunek 3C). Sąsiednia etykieta nk-X0 reprezentuje pojedynczo naciętą wersję HJ, która naśladuje produkt po pierwszej reakcji nacięcia. Ze względu na odciążenie odkształcenia układającego się w stos przez symulowane nacięcie, nk-X0 jest strukturą nieizomeryzującą 40, jak wynika z piku pojedynczego substratu przy E ~ 0,40, w przeciwieństwie do X0 (Rysunek 3D vs. Rysunek 3B). Struktura kompleksu GEN1-nk-X0 jest podobna do struktury kompleksu GEN1-X0, na co wskazuje podobieństwo w wydajności FRET (E ~0,25 dla nk-X0 i 0,32 dla X0) (Rysunek 3D vs. Rysunek 3B). Silne wiązanie monomeru GEN1 z nk-X0 jest pokazane przez 40-krotnie niższą wartość Kd-monomer-app niż w przypadku X0 (Rysunek 3E w porównaniu z Rysunek 3C). To ścisłe wiązanie może działać jako mechanizm zabezpieczający przed niepełną rozdzielczością HJ w mało prawdopodobnym przypadku dysocjacji dimeru GEN1 lub jednego z jego monomerów.

Stopniowe wiązanie monomeru GEN1 z HJ

Wiązanie monomeru GEN1 z HJ, a następnie tworzenie dimerów jest unikalną cechą eukariotycznej resolwazy HJ GEN1 w porównaniu do resolwaz prokariotycznych, które występują w formie dimerycznej w solution21,23,41. EMSA GEN1 przy 50 pM X0 pokazuje stopniowe powiązanie GEN1 w kompleksy wyższego rzędu, jak wskazują cyfry rzymskie w górnym panelu (Rysunek 4A). Stała dysocjacji monomeru GEN1 określona przez EMSA (Kd-monomer-EMSA) pokrywa się ze stałą dysocjacji z testu wiązania smFRET Kd-monomer-app (Rysunek 4A i Rysunek 3C, odpowiednio). Kwantyfikacja pasma II służy do obliczenia równowagowej stałej dysocjacji dimeru GEN1 (Kd-dimer-EMSA). EMSA GEN1 przy 50 pM nk-X0 wykazuje wyraźne wiązanie monomeru, na co wskazuje bardzo niski Kd-monomer-app-EMSA, który jest 30-krotnie niższy niż w przypadku X0, podczas gdy jego Kd-dimer-EMSA jest porównywalny z X0 (Figura 4B).

Kolejnym dowodem na to, że monomer GEN1 wiąże i zniekształca HJ, jest obserwacja znacznej liczby śladów nieuregulowanych cząstek o stabilnym niskim stanie FRET (Rysunek 4C) w obecności Mg2+ przy niskich stężeniach GEN1. Liczba tych śladów zmniejszała się wraz ze wzrostem stężenia GEN1. Rozdzielczość HJ jest napędzana przez ścisłe wiązanie monomeru GEN1, który wspomaga tworzenie dimerów. Wiązanie monomeru obserwuje się w śladach czasowych nierozszczepionego nk-X0 w Mg2+, który rozciąga się do kilku stężeń nanomolowych (Rysunek 4D). Monomer GEN1 ściśle wiąże się, aby chronić nk-X0, ostatecznie zapewniając pełną rozdzielczość poprzez tworzenie dimerów.

Test rozdzielczości SMFRET HJ

Termin "rozszczepienie" w testach smFRET jest używany zamiennie z "rozdzielczość" HJ, ponieważ w tym teście wykrywane jest tylko uwolnienie produktu, które następuje po drugim zdarzeniu rozszczepienia. Zdarzenia są rejestrowane przez poklatkowe wzbudzenie jednokolorowe, aby zminimalizować fotowybielanie akceptora światłoczułego w czasie akwizycji ~1,3 min.

Schemat w Rysunek 5A ilustruje nacięcia pasm 1 i 3 X0 Iso(1,3) po związaniu i zniekształceniu przez GEN1 X0 przymocowanego do funkcjonalizowanego szkła. Zarówno donor, jak i akceptor przechodzą do roztworu, co powoduje utratę ich sygnałów po rozwiązaniu HJ. Pierwsze i drugie nacięcie są rozprzęgnięte w nk-X0, co jest przykładem prototypu częściowo rozdzielczego HJ. Po związaniu GEN1, nk-X0 przyjmuje podobną strukturę do X0. Rozdzielczość przebiega przez pojedyncze nacięcie w nici 1, jak pokazano na rysunku Rysunek 5B.

Jednoczesne odejście dawcy i akceptora po ustabilizowaniu się stanu niskiego FRET w śladach rozdzielczości X0 nastąpiło bez pojawienia się pośredniego FRET (E = ~0,40) wskazuje, że pełna rozdzielczość następuje w czasie życia kompleksu GEN1-HJ (Rysunek 5C). Dlatego wyniki te sugerują, że rozdzielczość HJ występuje w okresie życia kompleksu GEN1-HJ. Rozdzielczość nk-X0 również przebiega po przegrupowaniu strukturalnym i kończy się odejściem dupleksu przenoszącego dwa fluorofory (Rysunek 5D) podobne do X0.

Kinetyka dimeryzacji GEN1 na monomerze związanym z GEN1 HJ

Time-lapse smFRET mierzy τprzed rozszczepieniem, które głównie obejmuje czas potrzebny do powstania dimeru i rozdzielczości HJ po zniekształceniu przez monomer GEN1. Stosując tę technikę, przedstawiono bezpośrednie dowody na poparcie twierdzenia, że tworzenie dimerów jest wymagane do rozdzielczości zarówno X0, jak i nk-X0, ponieważ rozkład τprzed rozszczepieniem jest zależny od stężenia GEN1.

Pozorna szybkość rozdzielczości HJ (kapp) jest zdefiniowana jako odwrotność średniejτ przed rozszczepieniem przy odpowiednim stężeniu GEN1. Termin "pozorny" jest używany do opisania szybkości rozdzielczości HJ, ponieważ nie można wykluczyć możliwości, że GEN1 pozostaje związany z produktem po rozdzielczości HJ.

Funkcje gęstości prawdopodobieństwa (PDF) rozkładów τprzed rozszczepieniem X0 (Rysunek 6A) odzwierciedlają czas powstawania dimerów, który jest dłuższy przy niskich stężeniach GEN1, a następnie krótszy przy wyższych stężeniach GEN1. Współczynniki asocjacji i dysocjacji odpowiednio dla dimeru, kon-dimera i koff-dimera są określane na podstawie modelu dwuwykładniczego30. Również pliki PDF nk-X0 (Rysunek 6B) pokazują podobny rozkład do X0, co wskazuje na wymóg tworzenia dimerów.

Wykres stężenia kapp w porównaniu z GEN1 został dopasowany do funkcji hiperbolicznej. Pozorne stałe szybkości katalizy (kMax-app) X0 i nk-X0 wynoszą odpowiednio 0,107 ± 0,011 s-1 i 0,231 ± 0,036 s-1 (Rysunek 6C). Wykresy kapp dla węzłów X0 i nk-X0 przecinają się przy stężeniu GEN1 ~ 5,6 nM ze względu na szybszy kMax-app i wolniejszy kon-dimer naciętego w porównaniu z nienaruszonym skrzyżowaniem.

Podsumowując, względnie szybkie kon-dimer i wolne koff-dimer prowadzą do postępu reakcji naprzód w kierunku rozdzielczości HJ, gdy dimer zostanie utworzony. Silne wiązanie monomeru GEN1 ze złączem nk-X0 stanowi mechanizm zabezpieczający przed nieprawdopodobnym przerwaniem drugiego rozszczepienia lub pomaga wychwycić wszelkie niecałkowicie nierozwiązane HJ pozostawione przez pierwotne szlaki rozdzielcze w komórce.

figure-results-1
Ilustracja 1: jedno- i wielokanałowe komory przepływowe oraz układ optyczny.
(A) Schemat jednokanałowej komory przepływowej. (B) Schemat sześciokanałowej komory przepływowej. (C) Układ optyczny przedstawiający źródła wzbudzenia, obiektyw TIRF, zwierciadło dichroiczne zainstalowane wewnątrz kostki filtrującej oraz filtry emisyjne stosowane w urządzeniu rozdzielającym obraz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Odchylenie konformera i izomeryzacja HJ obserwowane przez FRET.
(A) Izomeryzacja przylegających do siebie konformerów HJ ze stosem X, nazwanych na cześć dwóch ciągłych nici. Pasma są ponumerowane, natomiast ramiona oznaczone są literami. Miejsca nacięć są oznaczone strzałkami. Wskazane są pozycje dawcy (kolor zielony) i akceptora (kolor czerwony) oraz zmiana FRET po izomeryzacji. (B) Prawy panel: ślad czasowy FRET () i wyidealizowany ślad FRET (czerwony) X0 przy 50 mM Mg2+. Lewy panel: histogram FRET X0 przy 50 mM Mg2+. Intensywności fluorescencji dawcy (zielony) i akceptora (czerwony) pokazano poniżej. (C) Histogramy czasu przebywania sąsiedniej etykiety X0 Iso (1,3) i Iso(2,4) dopasowano do funkcji jednowykładniczych w celu określenia szybkości izomeryzacji. Niepewności wskazują na 95% przedział ufności dopasowania. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanej literatury30.

figure-results-3
Ilustracja 3: Aktywne zniekształcenia HJ przez GEN1.
(A) Modyfikacja strukturalna sąsiedniej etykiety HJ w oparciu o proponowany model22. (B) Histogram ALEX FRET sąsiedniej etykiety X0 ma główny wysoki pik FRET (E = ~ 0,6) odpowiadający ISO (1,3) i niższy pik FRET (E = ~ 0,4) dla ISO (2,4). Cały histogram jest dopasowany do dwóch funkcji Gaussa: jednej odpowiadającej swobodnej wysokiej wartości FRET Iso(1,3), a drugiej odpowiadającej populacji związanej minus początkowy wkład Iso(2,4) w całą populację. (C) Pozorną stałą dysocjacji monomeru (Kd-monomer-app) wyznacza się na podstawie dopasowania hiperbolicznego procentów populacji związanych z GEN1 w funkcji stężenia GEN1. (D) Histogramy FRET przyległego znacznika nk-X0 przy różnych stężeniach GEN1. Obszar pod niskim FRET (E = ~0,25) Gaussa odpowiada procentowi populacji uwiązanej. (E) K d-monomer-app nk-X0 jest wyznaczany na podstawie dopasowania hiperbolicznego populacji związanej z GEN1. Słupki błędów reprezentują odchylenia standardowe z co najmniej dwóch eksperymentów. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanej literatury30. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Stopniowe wiązanie GEN1 z HJ.
(A) Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) GEN1 przy 50 pM X0. Górny panel: cyfry rzymskie wskazują liczbę monomerów GEN1 w kompleksie. Dolny panel: wiązanie monomeru GEN1 z X0. Pozorne stałe dysocjacji uzyskano z esicznego dopasowania odpowiednich gatunków i reprezentują średnią z dwóch eksperymentów. (B) EMSA GEN1 przy 50 pM nk-X0 wykazuje wyraźne wiązanie monomeru, na co wskazuje bardzo niski Kd-monomer-app-EMSA. (C) Ślad czasowy FRET związanej, ale nienaruszonej przyległej etykiety X0 w Mg2+. Przeprowadzono wzbudzenie dawcy przez ~1,3 min, a następnie bezpośrednie wzbudzenie akceptora (zacieniony różowy obszar). (D) Ślad czasowy FRET związanego, ale nienaruszonego sąsiedniego znaku nk-X0 w Mg2+. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanej literatury30. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Test rozdzielczości SMFRET HJ.
(A) Schemat sąsiedniej etykiety X0 Iso(1,3) po zniekształceniu przez GEN1. Podłoże jest przymocowane do funkcjonalizowanej powierzchni za pomocą połączenia biotyna/awidyna. Dysocjacja GEN1 po dwóch nacięciach powoduje utratę zarówno dawcy, jak i akceptora, które przechodzą do roztworu. (B) Schemat rozdzielczości przyległej etykiety nk-X0 poprzez rozszczepienie nici 1. (C) Ślad czasowy () w 2 mM Mg2+ rozszczepienia Iso(1,3). Początek wiązania GEN1 tworzy stabilny stan niskiego FRET, dopóki sygnał FRET nie zostanie nagle utracony z powodu rozszczepienia. Odpowiednio, po wzroście donora i spadku intensywności fluorescencji akceptora po związaniu GEN1 następuje jednoczesny zanik fluorescencji z obu barwników po rozszczepieniu. (D) Podobnie, ślad czasowy nk-X0 pokazuje stabilny stan niskiego FRET po związaniu GEN1, który kończy się nagłą utratą sygnału FRET. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanej literatury30. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Kinetyka dimeryzacji GEN1 na HJ związanym z monomerem GEN1.
(A) Wykres funkcji gęstości prawdopodobieństwa (PDF) rozkładu τprzed rozszczepieniem X0 ilustruje jego zależność od stężenia GEN1. Czasy przebywania w stanie niskiego FRET (τprzed rozszczepieniem) przy odpowiednim stężeniu GEN1 uzyskano z dwóch lub więcej eksperymentów i wykorzystano do uzyskania średnich wskaźników (kapp). Podane dawki kapp są wyznaczane na podstawie odwrotności średniej τprzed rozszczepieniem przy odpowiednim stężeniu GEN1. Współczynniki asocjacji (kna dimerze) i dysocjacji (kpoza dimerem) dla tworzenia dimerów są obliczane na podstawie modelu dwuwykładniczego38. Błędy reprezentują SEM kapp. (B) Wykres PDF rozkładów τprzed rozszczepieniem nk-X0 i odpowiednich współczynników kapp. (C) Wykres stężenia kapp w funkcji GEN1 dopasowany do funkcji hiperbolicznej w celu wyznaczenia pozornej szybkości katalitycznej (kMax-app). Wykres kapp dla X0 i nk-X0 ilustruje szybszą początkową aplikację k X0, która jest następnie przewyższana przez nk-X0 powyżej [GEN1] ~5,6 nM. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie wcześniej opublikowanej literatury30. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

buforKompostowanie
Bufor powiązania40 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM DTT, 0,1% BSA i 5% (v/v) glicerolu
Bufor A20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT i 300 mM NaCl
Bufor B20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT i 100 mM NaCl
Bufor C20 mM Tris-HCl pH 8,0 i 1 mM naziemna telewizja cyfrowa
Bufor rozszczepienia40 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1% BSA i 5% (v/v) glicerolu
Bufor wiążący EMSA40 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 1 mM DTT, 2 mM CaCl2, 0,1 mg/ml BSA, 5% (v/v) glicerolu i 5 ng/μl Poly-dI-dC
Bufor obrazowania (wiązanie)40 μL (±)-6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowego kwasu (4 μM), 60 μL PCA (6 nM), 60 μL PCD (60 nM) i 840 μL buforu wiążącego
Bufor obrazowania (rozszczepienie)40 μL (±)-6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowego kwasu (4 μM), 60 μL PCA (6 nM), 60 μL PCD (60 nM) i 840 μL buforu rozszczepienia
Bufor do lizy20 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM β-merkaptoetanolu, 300 mM NaCl i 2 mM PMSF
Bufor pamięci masowej PCD100 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 50 mM KCl i 50% glicerolu
bufor magazynowy20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 100 mM NaCl i 10% glicerolu
Bufor TBE89 mM Tris-HCl, 89 mM kwas borowy i 2 mM EDTA
Bufor programu TE10010 mM Tris.HCl pH 8,0 i 100 mM NaCl
Bufor Tris-EDTA50 mM Tris-HCl pH 8,0 i 1 mM EDTA pH 8,0

Tabela 1: Lista i ich składów użytych w tym badaniu.

Oligo (Oligo)Sekwencja
X0-st1ACGCTGCCGAATTCTACCAGTGCCTTGCTAGGACATCTTTGCCCACCTGCAGGTTCACCC
X0-st2GGGTGAACCTGCAGGTGGG/iCy3/AAAGATGTCCATCTGTTGTAATCGTCAAGCTTTATGCCGTGT
X0-st3ACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATCATGGAGCTCTCTCTAGAGGATCCGACTATCG
X0-st45'BiotynaCGATAGTCGGATCCTCTAGACAGCTCCATGTAGCAAGGCACTGGTAGAATTCGGCAGCGT
X0-AdjX0-st1, X0-st2, X0-st3 & X0-st4
X0In_st2GGGTTGCAGGTGGGCAAAGATGTCCATCTCTTGTAATCGTCAAGCTTTATGCCGTGT
X0In_st45'BiotynaCGATAGTCGGATCCTCTAGACAGCTCCATGTAGCAAGGCA/iCy3/TGGTAGAATTCGGCAGCGT
Nk-X0X0-st1, X0-st2, X 0-nk3a, X 0-nk3b & X0-st4
X 0-nk3aACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATC
X 0-nk3bATGGAGCTGTCTAGAGGATCCGACTATCG

Tabela 2: Substraty SMFRET i EMSA HJ. Wykaz oligonukleotydów stosowanych do otrzymywania znakowanych fluorescencyjnie HJ dla smFRET i EMSA. Oligonukleotydy zostały pozyskane komercyjnie. Znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydy oczyszczono metodą HPLC, a jeśli to możliwe, oligonukleotyde o stężeniu ≥60 pz oczyszczono metodą PAGE.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu zastosowano różne techniki smFRET w celu określenia kinetyki rozdzielczości HJ przez GEN130. Podobne podejścia smFRET zastosowano do śledzenia wymogu konformacyjnego i rozszczepienia DNA z podwójną płatową endonukleazą płatową replikacji i naprawy DNA 1 42,43,44. W tym miejscu omówiono krytyczne kroki w tym protokole. Reakcja silanizacji powinna być wolna od jakichkolwiek śladów wilgoci. Roztwór pegylacyjny należy szybko nałożyć na szkło silanizowane po rozpuszczeniu PEG, aby uniknąć hydrolizy. W wielokanałowej komorze przepływowej należy usunąć powietrze uwięzione w arkuszu kleju, aby uniknąć wycieków między sąsiednimi kanałami. Roztwór PCA powinien być świeżo przygotowany, ponieważ z czasem utlenia się. Dodawanie 10 N NaOH powinno odbywać się kroplami, z wirowaniem pomiędzy nimi. Tło fluorescencyjne w szkiełku nakrywkowym powinno być minimalne przed wypłynięciem znakowanego fluorescencyjnie HJ. Obrazowanie w komorze przepływowej powinno być wykonywane w jednym kierunku, aby uniknąć obrazowania wybielonych obszarów. W eksperymentach ALEX moc czerwonego lasera powinna być zmniejszona, aby uniknąć szybkiego bielenia akceptora. W eksperymentach poklatkowych czas cyklu musi być krótszy niż najszybsze zdarzenie.

smFRET to czuła technika, która może dostarczyć cennych informacji w czasie rzeczywistym na temat reakcji biomolekularnych. Metoda ta wiąże się jednak z kilkoma wyzwaniami technicznymi, wśród których jest osiągnięcie mierzalnej zmiany FRET podczas reakcji biochemicznej. Jest to konieczne do uzyskania dobrze rozdzielonych cech na histogramach i możliwych do rozróżnienia stanów w śladach czasowych. W wielu przypadkach smFRET wymaga starannego zaprojektowania substratów, doboru par fluoroforów i ich pozycji oraz amplifikacji zmian FRET w substracie DNA ze względu na niewielkie zmiany strukturalne w podłożu45. Innym podejściem do wykonywania FRET jest użycie znakowanych białek46. Okno obserwacyjne w FRET jest ograniczone przez stabilność akceptora, takiego jak Cy5 lub Alexa Fluor 647, który ma tendencję do wybielania się szybciej niż dawca (w tym przypadku Cy3). W związku z tym FRET wymaga ciągłych poszukiwań stabilnych fluoroforów, aby przedłużyć czas trwania eksperymentu oraz wysiłków na rzecz opracowania systemów oczyszczania tlenu w celu przedłużenia sygnału fluorescencji i maksymalizacji stosunku sygnału do szumu47,48.

Wśród wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów w smFRET jest zrównoważenie kilku parametrów związanych z obrazowaniem, takich jak moc lasera, czas ekspozycji, czas cyklu i liczba cykli, aby zmaksymalizować emisję fluorescencji, wydłużyć czas trwania eksperymentu i osiągnąć odpowiednie odstępy próbkowania dla dynamiki enzymu. Dłuższe czasy obserwacji i minimalne efekty fotowybielania są niezbędne do uzyskania rozkładów czasu przebywania o wysokiej wierności, które reprezentują dynamikę enzymu. ALEX generuje lepsze histogramy, ponieważ ta metoda jest poddawana mniejszemu udziałowi cząstek fotobielonych w porównaniu z jednokolorowym FRET. Jednak rozdzielczość czasowa w ALEX jest niższa niż w jednokolorowym FRET.

Wreszcie, nacisk smFRET na wykrywanie zmian konformacyjnych/strukturalnych w poszczególnych cząsteczkach w czasie rzeczywistym wypełnia lukę między technikami strukturalnymi o wysokiej rozdzielczości (tj. krystalografią rentgenowską, magnetycznym rezonansem jądrowym, mikroskopią elektronową), która zapewnia szczegóły strukturalne o rozdzielczości atomowej w warunkach statycznych i metodami masowymi, które dają średnią zespołową mierzalnej właściwości. Pod wieloma względami smFRET okazał się potężną techniką badania systemów biologicznych w czasie rzeczywistym.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Nauki i Technologii Króla Abdullaha poprzez finansowanie podstawowe i Nagrodę za Konkurencyjne Badania (CRG3) dla S. M. H.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(±)Kwas -6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy (Trolox)Sigma-Aldrich238813
0,1 M bufor wodorowęglanu soduFisher144-55-8
10 % Novex Tris-Boran-EDTA żelThermo Fisher ScientificEC6275BOX
100 X obiektyw TIRFOlympusNAPO 1.49
Kwas 3,4-dihroksybenzoesowy (PCA)Sigma-AldrichP5630
3-aminopropylotrietoksysilan (APTES)Sigma-Aldrich741442
6% żel Novex Tris-Boran-EDTAThermo Fisher ScientificEC6265BOX
Arkusz samoprzylepnyGrace bio-labsSA-S-1L
Wirówka stołowa z chłodzeniemEppendorfZ605212
Biotin-PEGLaysan BioBiotyna-PEG-SVA 5000
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)New England BiolabsB9001S
Dwuwodny chlorek wapniaSigma-Aldrich31307
kolumna kationowymiennaGE healthcareMonoS (4.6/100)Dystruptor
komórekSystem stałego rozbijania komórekTS5/40/CE/GA
Coomassie Brilliant BlueMP Biomedicals808274
Filtr emisji Cy3Filtr emisji ChromaHQ600/40M-25
Cy5/Alexa Fluor 647ChromaHQ700/40M-25
Dichroik do kostki filtra DV2Fotometria630dcxr-18x26
Dithiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0861
WiertarkaDremel200-1/21
Nóż elektronicznyCopamCP-2500
Kamera EMCCDHamamatsuC9100-13
Klej epoksydowyDevcon14250
FPLC Adapter UPC 10GE Healthcare28406268
GelQuant.NET oprogramowaniebiochemlabsolutions.comWersja 1.8.2
Wektor wejściowy GEN1Harvard repozytorium plazmidówHSCD00399935
GlicerolSigma Life ScienceG5516
zielony laser (emisja 532 nm)Koherentnykompas 315M-100
Kolumna heparynyGE healthcareHiTrap Kolumna
HEPESBDHBDH4162
Rozdzielacz obrazuFotometriaDualview (DV2)
ImidazolSigma-AldrichI2399
Mikroskop odwróconyOlympusIX81
Izopropylo-ß-D-tiogalaktozyd (IPTG)Goldbio.12481C100
Skaner laserowyGE healthcareTyphoon Trio
LB BulionFisher ScientificBP1426-500
Filtr długoprzepustowy 532nmSemrockLPD02-532RU-25
Chlorek magnezuSigma Life ScienceM8266
mPEGLaysan BiomPEG-SVA 5000
NeutrawidynaKolumna Pierce31000
Ni-NTAGE healthcareHisTrap FF
NuPAGE 10% żele Bis-TrisTechnologie Novex LifeNP0301BOX
NuPAGE 10% Bis-Tris Żele białkoweThermo Fisher ScientificNP0302PK2
OriginOprogramowanie OriginLab CorporationWersja 8.5
Phenylmethylsulfonyl fluorek (PMSF)Alexis Biochemicals270-184-G025
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiGIBCO14190
Rurki polietylenowe (ID 0,76 mm OD 1,22 mm)Fisher (Becton Dickinson)427416
Protokatechuat 3,4-dioksygenaza (3,4-PCD)Sigma-AldrichP8279-25UN
Czterozakresowy dichroicznyChroma IncZ405/ 488/532/640RPC
Czerwony laser (emisja 640 nm)Koherentnakostka 640 100C
Chlorek soduFisher ChemicalS271
Wirówka Sorvall RC-6 plusThermo Fisher Scientific46910
SpektrofotometrThermo Fisher ScientificNanodrop 2000
Pompa strzykawkowaAparat Harvard70-3007
Pęseta teflonowaRubisK35A
Tris BasePromegaH5135
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima L-90K
Membrana ultrafiltracyjnaMilliporeUFC90300
heparynowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  2. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  3. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  6. Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit. Nature Methods. 5 (6), 475-489 (2008).
  7. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
  8. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
  9. Kim, H. D., et al. Mg2+-dependent conformational change of RNA studied by fluorescence correlation and FRET on immobilized single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (7), 4284-4289 (2002).
  10. Lee, T. H., et al. Measuring the folding transition time of single RNA molecules. Biophysical Journal. 92 (9), 3275-3283 (2007).
  11. Holliday, R. Mechanism for Gene Conversion in Fungi. Genetical Research. 5 (2), 282-304 (1964).
  12. West, S. C., et al. The Formation and Resolution of Holliday Junctions during the Recombinational Repair of DNA Damages. Journal of Cellular Biochemistry. , 269-269 (1995).
  13. Cox, M. M., et al. The importance of repairing stalled replication forks. Nature. 404 (6773), 37-41 (2000).
  14. West, S. C. Molecular views of recombination proteins and their control. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (6), 435-445 (2003).
  15. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction, and its resolution. Cell. 55 (1), 79-89 (1988).
  16. Clegg, R. M., et al. Fluorescence resonance energy transfer analysis of the structure of the four-way DNA junction. Biochemistry. 31 (20), 4846-4856 (1992).
  17. McKinney, S. A., Declais, A. C., Lilley, D. M., Ha, T. Structural dynamics of individual Holliday junctions. Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2003).
  18. Joo, C., McKinney, S. A., Lilley, D. M., Ha, T. Exploring rare conformational species and ionic effects in DNA Holliday junctions using single-molecule spectroscopy. Journal of Molecular Biology. 341 (3), 739-751 (2004).
  19. Hyeon, C., Lee, J., Yoon, J., Hohng, S., Thirumalai, D. Hidden complexity in the isomerization dynamics of Holliday junctions. Nature Chemistry. 4 (11), 907-914 (2012).
  20. Ip, S. C., et al. Identification of Holliday junction resolvases from humans and yeast. Nature. 456 (7220), 357-361 (2008).
  21. Rass, U., et al. Mechanism of Holliday junction resolution by the human GEN1 protein. Genes & Development. 24 (14), 1559-1569 (2010).
  22. Liu, Y., et al. Crystal Structure of a Eukaryotic GEN1 Resolving Enzyme Bound to DNA. Cell Reports. 13 (11), 2565-2575 (2015).
  23. Chan, Y. W., West, S. GEN1 promotes Holliday junction resolution by a coordinated nick and counter-nick mechanism. Nucleic Acids Research. 43 (22), 10882-10892 (2015).
  24. van Gool, A. J., Hajibagheri, N. M., Stasiak, A., West, S. C. Assembly of the Escherichia coli RuvABC resolvasome directs the orientation of holliday junction resolution. Genes & Development. 13 (14), 1861-1870 (1999).
  25. Lee, S. H., et al. Human Holliday junction resolvase GEN1 uses a chromodomain for efficient DNA recognition and cleavage. eLife. 4, (2015).
  26. Chan, Y. W., West, S. C. Spatial control of the GEN1 Holliday junction resolvase ensures genome stability. Nature Communications. 5, 4844(2014).
  27. Liu, Y., Freeman, A. D., Declais, A. C., Lilley, D. M. J. A monovalent ion in the DNA binding interface of the eukaryotic junction-resolving enzyme GEN1. Nucleic Acids Research. 46 (20), 11089-11098 (2018).
  28. Zhou, R., et al. Junction resolving enzymes use multivalency to keep the Holliday junction dynamic. Nature Chemical Biology. 15 (3), 269-275 (2019).
  29. Bellendir, S. P., et al. Substrate preference of Gen endonucleases highlights the importance of branched structures as DNA damage repair intermediates. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5333-5348 (2017).
  30. Sobhy, M. A., et al. Resolution of the Holliday junction recombination intermediate by human GEN1 at the single-molecule level. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1935-1949 (2019).
  31. Sobhy, M. A., et al. Versatile single-molecule multi-color excitation and detection fluorescence set-up for studying biomolecular dynamics. Review of Scientific Instruments. 82 (11), 113702(2011).
  32. Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).
  33. Lee, N. K., et al. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).
  34. Rashid, F., et al. Initial state of DNA-Dye complex sets the stage for protein induced fluorescence modulation. Nature Communications. 10 (1), 2104(2019).
  35. Sambrook, J., Russell, D. W. Standard ethanol precipitation of DNA in microcentrifuge tubes. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  36. Holden, S. J., et al. Defining the limits of single-molecule FRET resolution in TIRF microscopy. Biophysical Journal. 99 (9), 3102-3111 (2010).
  37. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L. Jr, Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: a Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  38. Kou, S. C., Cherayil, B. J., Min, W., English, B. P., Xie, X. S. Single-molecule Michaelis-Menten equations. Journal of Physical Chemistry B. 109 (41), 19068-19081 (2005).
  39. Clegg, R. M., Murchie, A. I., Lilley, D. M. The solution structure of the four-way DNA junction at low-salt conditions: a fluorescence resonance energy transfer analysis. Biophysical Journal. 66 (1), 99-109 (1994).
  40. Pohler, J. R., Duckett, D. R., Lilley, D. M. Structure of four-way DNA junctions containing a nick in one strand. Journal of Molecular Biology. 238 (1), 62-74 (1994).
  41. Fogg, J. M., Lilley, D. M. Ensuring productive resolution by the junction-resolving enzyme RuvC: large enhancement of the second-strand cleavage rate. Biochemistry. 39 (51), 16125-16134 (2000).
  42. Sobhy, M. A., Joudeh, L. I., Huang, X., Takahashi, M., Hamdan, S. M. Sequential and multistep substrate interrogation provides the scaffold for specificity in human flap endonuclease 1. Cell Reports. 3 (6), 1785-1794 (2013).
  43. Rashid, F., et al. Single-molecule FRET unveils induced-fit mechanism for substrate selectivity in flap endonuclease 1. eLife. 6, e21884(2017).
  44. Zaher, M. S., et al. Missed cleavage opportunities by FEN1 lead to Okazaki fragment maturation via the long-flap pathway. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2956-2974 (2018).
  45. Didenko, V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. BioTechniques. 31 (5), 1106-1116 (2001).
  46. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  47. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  48. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

smFRETenzym GEN1naprzemienne wzbudzanieanaliza przebiegu czasowegoprzygotowanie komory przep ywowejkalibracja kulek fluorescencyjnychsystem usuwania tlenuoddzia ywanie enzym DNAobrazowanie w czasie rzeczywistym

Powiązane artykuły