Tutaj opisany jest protokół do przeprowadzenia testów labiryntu wodnego Morrisa w celu oceny zdolności uczenia się i pamięci myszy modelowych z chorobą Alzheimera oraz oceny wpływu akupunktury manualnej na ich leczenie.
Artykuł metodologiczny
Analiza zdolności uczenia się i zapamiętywania w mysim modelu choroby Alzheimera przy użyciu labiryntu wodnego Morrisa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Eksperyment z labiryntem wodnym Morrisa (MWM) zmusza zwierzęta doświadczalne do pływania i nauki znajdowania platformy ukrytej w wodzie. Jest szeroko stosowany w badaniach naukowych do oceny uczenia się i pamięci zwierząt. Ze względu na szerokie zastosowanie testu MWM, wizualne protokoły eksperymentalne są niezbędne dla badaczy. W niniejszym manuskrypcie wykorzystano najnowsze badania w celu wprowadzenia protokołu testu MWM. Choroba Alzheimera (AD) charakteryzuje się postępującą utratą pamięci i funkcji poznawczych. Alternatywnym i uzupełniającym leczeniem stosowanym w chorobie Alzheimera jest akupunktura manualna (MA). Aby ocenić zdolność uczenia się i zapamiętywania myszy modelowych AD, przeprowadzono test MWM. Do oceny zdolności uczenia się przestrzennego i zdolności zapamiętywania wykorzystano próbę platformy widzialnej, próbę platformy ukrytej, próbę sondy i próbę odwrócenia MWM. W badaniu z widoczną platformą prędkość pływania i opóźnienie ucieczki myszy w różnych grupach nie różniły się istotnie. W próbach z ukrytą platformą i odwróceniem grupa AD wykazała długie opóźnienie ucieczki. Latencja ucieczki zmniejszyła się znacznie po leczeniu MA. Niska liczba zwrotnicy platformy i proporcja czasu w kwadrancie SW w próbie sondy wzrosły po leczeniu MA (p < 0,05 lub p < 0,01). Wyniki testów MWM sugerują, że MA może skutecznie poprawić zdolności uczenia się przestrzennego i pamięci myszy modelowych AD. Rygorystyczne operacje eksperymentalne dały pewność wiarygodności wyników.
Wprowadzenie
Obecnie, eksperyment MWM stał się najczęściej używanym i standardowym eksperymentem behawioralnym do oceny uczenia się przestrzennego i pamięci zwierząt1. Początkowo został zaprojektowany przez brytyjskiego psychologa Richarda G. Morrisa i jest stale ulepszany. Wiele zalet, takich jak minimalny trening, użyteczność międzygatunkowa, niewrażliwość na różnice w masie ciała i zdolność wielokrotnego testowania MWM sprawia, że jest to najlepsza metoda oceny funkcji poznawczych2. Choroba Alzheimera (AD) jest poważnym problemem medycznym, charakteryzującym się przede wszystkim spadkiem przetwarzania pamięci i funkcji poznawczych3. MWM jest niezastąpionym środkiem eksperymentalnym do oceny zdolności uczenia się i zapamiętywania zwierząt modelowych AD oraz skuteczności metod interwencji. Eksperymenty MWM są na ogół czasochłonne (6–11 dni) i obejmują wiele zmiennych czynników4. Chociaż istnieje wiele artykułów na temat eksperymentów z labiryntem wodnym, w praktyce badaczom brakuje spójnego protokołu. Dlatego szczególnie ważne jest intuicyjne i rygorystyczne wideo z procesu protokołu. Na przykładzie poprzedniego eksperymentu5, opisano wszystkie kroki MWM. Korzystając z MWM, poprzednie badania sugerowały, że akupunktura może złagodzić objawy myszy modelowej AD5,6,7.
Tutaj, protokół MWM użyty w niedawnym badaniu5 jest opisany jako prosta i widoczna metoda dla badaczy do oceny przestrzennego uczenia się i pamięci zwierząt modelowych AD.
Protokół
Ten protokół został zatwierdzony przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Chińskiej w Pekinie i był zgodny ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych w Chinach. Podczas procedury eksperymentalnej nie doszło do przypadkowej śmierci i żadne zwierzę nie musiało zostać poddane eutanazji w tym badaniu.
1. Przygotowanie
- Zakup 30 samców myszy SAMP8 i 10 samców myszy SAMR1 (wiek: 8 miesięcy).
- Myszy należy trzymać pojedynczo w oddzielnych klatkach wentylacyjnych w temperaturze 24 ±2 °C i 12-godzinnym cyklu ciemności/światła.
- Karm myszy standardową dietą granulowaną dostępną ad libitum i zapewnij sterylną wodę pitną.
- Przyzwyczaj wszystkie myszy do środowiska przez 5 dni przed eksperymentami.
2. Grupowanie zwierząt
- Losowo podziel 30 myszy SAMP8 na trzy grupy (n = 10 / grupę): grupę AD, grupę akupunktury manualnej (MA) i grupę medycyny (M).
- Użyj 10 myszy SAMR1 jako normalnej grupy kontrolnej (N) class6.
3. Podawanie tabletek chlorowodorku donepezilu
- Rozdrobnić tabletkę chlorowodorku donepezylu (5 mg/tabletkę) i rozpuścić ją w 50 ml wody destylowanej.
- Lek przygotowany w kroku 3.1 należy podawać myszom w dawkach 1 mg/kg mc. za pomocą zgłębnika doustnego raz dziennie8 podczas całego eksperymentu, w tym w dniach, w których wykonywane jest leczenie MA i testy MWM.
4. Stosowanie akupunktury manualnej
- Unieruchomij myszy z grupy MA w torbach na myszy.
- Użyj jednorazowych sterylnych igieł do akupunktury (0,25 mm x 13 mm) i zastosuj metodę płaskiego ciernia MA na Baihui (GV20) i Yintang (GV29)5 w kierunku nosa przez 20 minut. Upewnij się, że głębokość igły wynosi 0,2–0,3 cm.
- Dwukierunkowo obracaj manipulację w zakresie 90° z prędkością około 180 obr/min co 5 minut przez ~15 s za każdym razem podczas całego eksperymentu, w tym dni, w których wykonywane jest leczenie MA i testy MWM.
5. Test MWM
UWAGA: Po 24 godzinach od 15 kolejnych dni leczenia, poddaj myszy z czterech grup testowi MWM. Przeprowadź kolejno próbę widocznej platformy, próbę ukrytej platformy, próbę sondy i próbę odwrócenia.
- Przygotuj się do testu MWM.
- Umieść urządzenie MWM oraz system akwizycji i przetwarzania sygnału w pomieszczeniu doświadczalnym zaprojektowanym w celu utrzymania izolacji akustycznej.
- Umieść okrągły biały zbiornik (średnica = 90 cm, wysokość = 50 cm) otoczony nieprzezroczystą szmatką na środku urządzenia MWM.
- Przymocuj kamerę wideo do sufitu urządzenia MWM i podłącz ją do magnetowidu z automatycznym systemem śledzenia, aby zbierać dane.
- Podziel zbiornik labiryntu wodnego równo na cztery równe regiony za pomocą dwóch wzajemnie prostopadłych linii, oznaczonych północą (N), południem (S), wschodem (E) i zachodem (W). Podziel obszar basenu koncepcyjnie na cztery ćwiartki o tej samej wielkości (NE, NW, SW i SE).
- W zasięgu wzroku myszy umieść wskazówki wizualne o różnych kształtach na ścianie każdego kwadrantu jako odniesienia wizualne (np. kwadraty, trójkąty i koła).
UWAGA: Wskazówki dystalne są nawigacyjnymi punktami odniesienia zwierzęcia do lokalizowania platformy. Dlatego nie przesuwaj ich podczas testu. Pozycja badacza jest potencjalną wskazówką dystalną i może wpływać na MWM. Dlatego badacz powinien trzymać się z dala od oczu myszy w oczekiwaniu, aż zwierzę wykona test. - Napełnić okrągły zbiornik wodą na głębokość 30 cm i utrzymywać w temperaturze 22 ± 2 °C za pomocą grzałki elektrycznej.
- Zmiękcz wodę nieprzezroczystą za pomocą około 150 g mleka w proszku.
- Wykonaj widoczną wersję próbną platformy.
- Umieść plastikową okrągłą platformę (średnica = 9.5 cm; wysokość = 28 cm) 1 cm nad powierzchnią wody w dowolnym kwadrancie losowo.
- Umieść czarną flagę na platformie.
- Delikatnie wpuść każdą mysz do wody na poziomie wody z jednego z czterech miejsc startowych skierowanych w stronę ściany zbiornika. Nie wrzucaj myszy do wody.
- Aktywuj komputerowy program śledzący, gdy tylko mysz zostanie wypuszczona do wody.
- Daj każdej myszy 60 s na wyszukanie platformy. Pod koniec każdej próby umieść każdą mysz na platformie i pozwól jej pozostać na niej przez 10–30 sekund.
- Obserwuj trajektorie pływania myszy na komputerze, rejestruj czas potrzebny myszy na znalezienie platformy jako opóźnienie ucieczki i analizuj prędkość pływania.
- Osusz każdą mysz ręcznikami i ogrzej ją grzejnikiem elektrycznym. Upewnij się, że używasz odpowiedniego źródła ciepła, aby zapobiec przegrzaniu zwierzęcia.
UWAGA: Umieść każdą mysz w puli w każdym z czterech różnych kwadrantów początkowych na cztery próby, przesuwając platformę w inne miejsce przy każdej kolejnej próbie. Odstęp między dwiema próbami z użyciem każdej myszy wynosi 15–20 minut.
- Przeprowadź próbę ukrytej platformy/test nawigacji po miejscu.
- Umieść tę samą platformę bez flagi w kwadrancie SE.
- Losowo umieść mysz w basenie z każdej z czterech ćwiartek (NE, NW, SW, N) twarzą do ściany basenu na cztery próby. Użyj odstępu czasu 15–20 minut między dwiema próbami.
- Daj każdej myszy 60 s na wyszukanie ukrytej platformy.
- Rejestruj opóźnienie ucieczki każdej próby po tym, jak mysz wspina się na platformę w celu późniejszej analizy.
- Osusz każdą mysz ręcznikami i ogrzej ją grzejnikiem elektrycznym.
UWAGA: Przeprowadź próbę ukrytej platformy od 2 do 6 dni. Jeśli mysz nie może znaleźć platformy w ciągu 60 sekund, poprowadź mysz do wspinania się na platformę i pozwól jej pozostać tam przez 10–30 s pod koniec każdej próby. Wykonuj cztery próby dziennie dla każdej myszy przez 5 kolejnych dni, z platformą i wskazówkami wizualnymi w stałych pozycjach.
- Wykonaj próbę sondy.
UWAGA: Umieść każdą mysz w basenie w nowej pozycji początkowej, aby obserwować zdolność myszy do eksploracji przestrzennej.- Usuń platformę.
- Umieść każdą mysz zwróconą w stronę ściany zbiornika w basenie raz na 60 s. Upewnij się, że miejscem początkowym jest kwadrant północno-zachodni, który jest kwadrantem najbardziej oddalonym od kwadrantu SE.
- Zapisz dystans pływania, prędkość pływania i numer skrzyżowania platformy w labiryncie.
- Osusz każdą mysz ręcznikami i zapewnij ciepło po próbie.
- Wykonaj próbę odwrócenia.
UWAGA: Wykonaj próbę odwrócenia od 8 do 11 dni.- Umieść platformę na środku kwadrantu NW (zamiast kwadrantu SE).
- Wykonaj kroki 5.3.2 −5.3.5 zgodnie z opisem w sekcji wersji próbnej ukrytej platformy.
6. Analiza statystyczna
- Do przeprowadzenia analizy statystycznej należy użyć oprogramowania statystycznego (np. SPSS 20.0).
Wyniki
Schemat osi czasu dla tego protokołu przedstawiono na Rysunku 1.
Rysunek 1: Schemat osi czasu protokołu badania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Oś czasu wskazuje, że eksperyment ten trwał łącznie 21 dni. Zabieg był stosowany u myszy przez cały czas trwania badania, a testy MWM rozpoczęto po 15 dniach zabiegu. Próby z widoczną platformą, ukrytą platformą, próbę sondowania oraz próbę odwrócenia przeprowadzono w kolejności.
Wcześniej opublikowane wyniki Ding i wsp.5 zostały przedstawione jako typowe wyniki testu MWM na Rysunku 2.
Rycina 2: Typowe wyniki testu labiryntu wodnego Morrisa (n = 10). (A) Zmiany czasu opóźnienia ucieczki i prędkości pływania szczurów w różnych grupach podczas próby z widoczną platformą. (B) Zmiany w czasie latencji ucieczki szczurów w różnych grupach podczas prób z ukrytą platformą oraz prób odwrócenia. Wartości p wynoszą *p < 0,05 i **p < 0,01 w porównaniu z grupą kontrolną. Symbol ## oznacza p < 0,01 w porównaniu z grupą AD. (C) Zmiany w liczbie przejść przez miejsce platformy oraz procent czasu spędzonego przez szczury w północno-zachodnim kwadrancie w różnych grupach eksperymentalnych podczas próby sondującej. Przedstawiono wyniki próby z widoczną platformą, ukrytą platformą oraz próby odwrócenia dla każdej grupy (n = 10, średnia ± SD). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Ding i wsp.5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 2A przedstawia wyniki próby z widoczną platformą. W pierwszym dniu testu MWM nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic w czasie dotarcia do platformy (escape latency) ani w prędkości pływania pomiędzy grupami. Rysunek 2B przedstawia wyniki prób z ukrytą platformą oraz prób odwrócenia (reversal trial) z dni 2–6 oraz 8–1. Czas dotarcia do platformy w grupie AD utrzymywał się na wysokim poziomie w każdym dniu testu. Czas dotarcia do platformy w trzech pozostałych grupach stopniowo spadał. W dniach 3–6 oraz 8–11 czas dotarcia do platformy był dłuższy w grupie AD niż w grupie kontrolnej (p < 0,01). Czas dotarcia do platformy u myszy w grupach MA i grupach leczonych był odpowiednio krótszy niż u myszy w grupie AD w dniach 2–6 oraz 8–1 (p < 0,01). Rysunek 2C przedstawia wyniki próby sondy (probe trial). Liczba przejść nad platformą u myszy z grupy AD była statystycznie niższa niż w grupie kontrolnej (p < 0,01). Liczba przejść nad platformą w grupie MA była wyższa niż w grupie AD (p < 0,05). Procent czasu spędzonego w kwadrancie SW przez myszy z grupy AD był znacząco niższy niż w grupie kontrolnej (p < 0,01). Procent czasu spędzonego w kwadrancie SW w grupie MA był wyższy niż w grupie AD (p < 0,01).
Dyskusja
Chociaż wiele labiryntów wodnych, w tym labirynt wodny Biel i labirynt wodny Cincinnati, istnieje od co najmniej wieku, tylko MWM jest szeroko stosowany do skutecznej i obiektywnej oceny zdolności uczenia się przestrzennego i zapamiętywania, ponieważ ma wiele zalet. Pomimo szerokiego stosowania MWM, procedura ta nie zawsze była stosowana optymalnie. Eksperymenty MWM zazwyczaj trwają długo i ma na nie wpływ wiele zmiennych czynników. Istnieje kilka skutecznych i niezawodnych aspektów, które pomagają wykryć zmiany w uczeniu się przestrzennym i zdolności zapamiętywania, które należy wziąć pod uwagę.
Przeprowadzono cztery różne próby MWM. Próba widocznej platformy została wykorzystana w pierwszym dniu MWM. Jeśli zwierzęta potrafiły dopłynąć bezpośrednio do platformy, oznaczało to, że zdolność pływania i wzrok zwierząt były normalne10. Otnass zasugerował, że próba widocznej platformy powinna zostać przeprowadzona w pierwszejkolejności. Wyniki próby z widoczną platformą w tym badaniu oznaczały, że cztery grupy rozpoczęły naukę na tym samym poziomie. Od tego momentu można było rozpocząć kolejne eksperymenty. Próba z ukrytą platformą została wykorzystana do oceny zdolności myszy do nabywania zdolności uczenia się i zapamiętywania. Próba sondy została przeprowadzona w 7 dniu, 24 godziny po zakończeniu próby z ukrytą platformą, w celu oceny pamięci roboczej. Wreszcie, próba odwrócenia została wykorzystana do oceny pamięci roboczej2. Zmiany w czterech różnych badaniach MWM razem wskazały, że myszy modelowe AD miały niską zdolność uczenia się i zapamiętywania oraz że MA miała pozytywny wpływ na AD5.
Nie ma konkretnych norm dotyczących wymiarów basenu i platformy1. Basen o średnicy 214 cm jest używany w większości badań MWM. Vorhees i Williams wykazali, że przy identycznych protokołach szczury uczą się szybciej w basenie o długości 122 cm niż w basenie o długości 210 cm; Strome nachylenie krzywej uczenia się wskazuje, że basen o średnicy 122 cm jest niezwykle łatwy w nawigacji dla szczurów12. W obecnym protokole, biorąc pod uwagę podeszły wiek i słaby wzrost myszy z AD, zastosowano basen o średnicy 90 cm i platformę o średnicy 9,5 cm. Wyniki wstępnych eksperymentów wskazały, że myszy miały większe trudności ze znalezieniem platformy w puli o większej średnicy. W związku z tym testy w większych pulach nie reprezentują rzeczywistej różnicy między grupami. Zwierzęta doświadczalne miały trudności ze znalezieniem platformy w większej puli z mniejszą platformą4. Dlatego wielkość basenu i platformy musi być zoptymalizowana we wstępnych doświadczeniach zgodnie z wymaganiami doświadczalnymi i warunkami zwierząt doświadczalnych.
Do wykonania testu MWM4 zalecana jest woda o temperaturze 20–24 °C. Starzejące się zwierzęta doświadczalne osiągały słabe wyniki w zimnejwodzie13, co wskazuje na wyraźną zależną od wieku utratę termoregulacji14. W tym badaniu termostat został umieszczony na dnie basenu, aby utrzymać temperaturę wody na poziomie 20–24 °C. Wyniki badania nie wykazały istotnej różnicy w prędkościach pływania między czterema grupami5.
MWM jest potężną techniką oceny funkcji poznawczych i jest obecnie szeroko stosowana w badaniach. Nie ma jednak określonego, standardowego, spójnego sprzętu do wykonania testu MWM, w tym rozmiarów basenu i platformy15,16. Różne laboratoria mają różne specyfikacje dla MWM. Dlatego badacze wybierają odpowiednie urządzenie eksperymentalne zgodnie ze swoimi indywidualnymi wymaganiami eksperymentalnymi, co może powodować zamieszanie wśród badaczy. Konieczne są również wstępne eksperymenty. Należy przeprowadzić więcej badań nad podstawowymi eksperymentami, takimi jak MWM. Obecnie elastyczność MWM jako narzędzia eksperymentalnego polega jedynie na możliwości wyboru podstawowych protokołów zgodnie z celem badania. Dlatego test ten można zastosować do bardziej dogłębnej oceny funkcji poznawczych.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak potencjalnego konfliktu interesów.
Podziękowania
Huiling Tian i Ning Ding są współautorami. Zhigang Li i Jing Jiang są współautorami korespondencji. Badania te były wspierane przez granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (granty nr 81804178, 81473774 i 81503654). Protokół i wyniki opisane w niniejszym dokumencie pochodzą z artykułu "Zaangażowanie manualnej akupunktury reguluje zachowanie i przepływ krwi w mózgowym modelu choroby Alzheimera metodą SAMP8" autorstwa dr Ning Ding i wsp.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| igły do akupunktury | Pekin Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company | 511526 | |
| komputer stacjonarny | Chengdu Techman Software Spółka z ograniczoną odpowiedzialnością | Lenovo T4700D | |
| Tabletka chlorowodorku donepezilu | Eisai Chiny | H20050978 | myszy Aricept |
| Zhi Shan (Pekin) Akademia Nauk Medycznych | SCXK2014-0003 | ||
| Urządzenie do labiryntu wodnego Mirros | Chengdu Techman Software Spółka z ograniczoną odpowiedzialnością | Torby na myszy WMT-100S | |
| domowej roboty | |||
| System akwizycji i przetwarzania sygnałów | Chengdu Techman Software Spółka z ograniczoną odpowiedzialnością | BL-420N |
Bibliografia
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Value of water mazes for assessing spatial and egocentric learning and memory in rodent basic research and regulatory studies. Neurotoxicology Teratology. 45, 75-90 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocol. 1 (2), 848-858 (2006).
- The state of the art of dementia research: New frontiers; World Alzheimer Report 2018. Alzheimer's Disease International. 9, 1-46 (2018).
- Vorhees, C. V., et al. Effects of neonatal (+)-methamphetamine on path integration and spatial learning in rats: effects of dose and rearing conditions. International Journal of Developmental Neuroscience. 26 (6), 599-610 (2008).
- Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37(2019).
- Ding, N., et al. Manual acupuncture suppresses the expression of proinflammatory proteins associated with the NLRP3 inflammasome in the hippocampus of SAMP8 mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2017, 1-8 (2017).
- Cao, J., et al. Behavioral changes and hippocampus glucose metabolism in APP/PS1 transgenic mice via electro-acupuncture at governor vessel acupoints. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 5(2017).
- Amy, E., et al. Effects of sub-chronic donepezil on brain Abeta and cognition in a mouse model of Alzheimer's disease. Psychopharmacology. 230, 279-289 (2013).
- Garthe, A., Kempermann, G. An old test for new neurons: refining the Morris water maze to study the functional relevance of adult hippocampal neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 7, 63(2013).
- Schoenfeld, R., Schiffelholz, T., Beyer, C., Leplow, B., Foreman, N. Variants of the Morris water maze task to comparatively assess human and rodent place navigation. Neurobiology of Learning and Memory. 139, 117-127 (2017).
- Otnass, M. K., Brun, V. H., Moser, M., Moser, E. I. Pretraining prevents spatial learning impairment after saturation of hippocampal long-term potentiation. Journal of Neuroscience. 19 (24), 49(1999).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. Ilar Journal. 55 (2), 310-332 (2014).
- Vorhees, C. V., Skelton, M. R., Williams, M. T. Age-dependent effects of neonatal methamphetamine exposure on spatial learning. Behavioural Pharmacology. 18 (5-6), 549-562 (2007).
- Iivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puoliväli, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behaviour Brain Research. 141 (2), 207-213 (2003).
- Lin, S. Y., et al. Ozone inhibits APP/Aβ production and improves cognition in an APP/PS1 transgenic mouse model. Neuroscience. , (2019).
- Zuo, Y., et al. Preoperative vitamin-rich carbohydrate loading alleviates postoperative cognitive dysfunction in aged rats. Behavioural Brain Research. 373, 112107(2019).
Przedruki i uprawnienia
