Analiza zdolności uczenia się i zapamiętywania w mysim modelu choroby Alzheimera przy użyciu labiryntu wodnego Morrisa

Podsumowanie

Tutaj opisany jest protokół do przeprowadzenia testów labiryntu wodnego Morrisa w celu oceny zdolności uczenia się i pamięci myszy modelowych z chorobą Alzheimera oraz oceny wpływu akupunktury manualnej na ich leczenie.

Streszczenie

Eksperyment z labiryntem wodnym Morrisa (MWM) zmusza zwierzęta doświadczalne do pływania i nauki znajdowania platformy ukrytej w wodzie. Jest szeroko stosowany w badaniach naukowych do oceny uczenia się i pamięci zwierząt. Ze względu na szerokie zastosowanie testu MWM, wizualne protokoły eksperymentalne są niezbędne dla badaczy. W niniejszym manuskrypcie wykorzystano najnowsze badania w celu wprowadzenia protokołu testu MWM. Choroba Alzheimera (AD) charakteryzuje się postępującą utratą pamięci i funkcji poznawczych. Alternatywnym i uzupełniającym leczeniem stosowanym w chorobie Alzheimera jest akupunktura manualna (MA). Aby ocenić zdolność uczenia się i zapamiętywania myszy modelowych AD, przeprowadzono test MWM. Do oceny zdolności uczenia się przestrzennego i zdolności zapamiętywania wykorzystano próbę platformy widzialnej, próbę platformy ukrytej, próbę sondy i próbę odwrócenia MWM. W badaniu z widoczną platformą prędkość pływania i opóźnienie ucieczki myszy w różnych grupach nie różniły się istotnie. W próbach z ukrytą platformą i odwróceniem grupa AD wykazała długie opóźnienie ucieczki. Latencja ucieczki zmniejszyła się znacznie po leczeniu MA. Niska liczba zwrotnicy platformy i proporcja czasu w kwadrancie SW w próbie sondy wzrosły po leczeniu MA (p < 0,05 lub p < 0,01). Wyniki testów MWM sugerują, że MA może skutecznie poprawić zdolności uczenia się przestrzennego i pamięci myszy modelowych AD. Rygorystyczne operacje eksperymentalne dały pewność wiarygodności wyników.

Wprowadzenie

Obecnie, eksperyment MWM stał się najczęściej używanym i standardowym eksperymentem behawioralnym do oceny uczenia się przestrzennego i pamięci zwierząt¹. Początkowo został zaprojektowany przez brytyjskiego psychologa Richarda G. Morrisa i jest stale ulepszany. Wiele zalet, takich jak minimalny trening, użyteczność międzygatunkowa, niewrażliwość na różnice w masie ciała i zdolność wielokrotnego testowania MWM sprawia, że jest to najlepsza metoda oceny funkcji poznawczych². Choroba Alzheimera (AD) jest poważnym problemem medycznym, charakteryzującym się przede wszystkim spadkiem przetwarzania pamięci i funkcji poznawczych³. MWM jest niezastąpionym środkiem eksperymentalnym do oceny zdolności uczenia się i zapamiętywania zwierząt modelowych AD oraz skuteczności metod interwencji. Eksperymenty MWM są na ogół czasochłonne (6–11 dni) i obejmują wiele zmiennych czynników⁴. Chociaż istnieje wiele artykułów na temat eksperymentów z labiryntem wodnym, w praktyce badaczom brakuje spójnego protokołu. Dlatego szczególnie ważne jest intuicyjne i rygorystyczne wideo z procesu protokołu. Na przykładzie poprzedniego eksperymentu⁵, opisano wszystkie kroki MWM. Korzystając z MWM, poprzednie badania sugerowały, że akupunktura może złagodzić objawy myszy modelowej AD^5,6,7.

Tutaj, protokół MWM użyty w niedawnym badaniu⁵ jest opisany jako prosta i widoczna metoda dla badaczy do oceny przestrzennego uczenia się i pamięci zwierząt modelowych AD.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Chińskiej w Pekinie i był zgodny ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych w Chinach. Podczas procedury eksperymentalnej nie doszło do przypadkowej śmierci i żadne zwierzę nie musiało zostać poddane eutanazji w tym badaniu.

1. Przygotowanie

1. Zakup 30 samców myszy SAMP8 i 10 samców myszy SAMR1 (wiek: 8 miesięcy).
2. Myszy należy trzymać pojedynczo w oddzielnych klatkach wentylacyjnych w temperaturze 24 ±2 °C i 12-godzinnym cyklu ciemności/światła.
3. Karm myszy standardową dietą granulowaną dostępną ad libitum i zapewnij sterylną wodę pitną.
4. Przyzwyczaj wszystkie myszy do środowiska przez 5 dni przed eksperymentami.

2. Grupowanie zwierząt

1. Losowo podziel 30 myszy SAMP8 na trzy grupy (n = 10 / grupę): grupę AD, grupę akupunktury manualnej (MA) i grupę medycyny (M).
2. Użyj 10 myszy SAMR1 jako normalnej grupy kontrolnej (N) class⁶.

3. Podawanie tabletek chlorowodorku donepezilu

1. Rozdrobnić tabletkę chlorowodorku donepezylu (5 mg/tabletkę) i rozpuścić ją w 50 ml wody destylowanej.
2. Lek przygotowany w kroku 3.1 należy podawać myszom w dawkach 1 mg/kg mc. za pomocą zgłębnika doustnego raz dziennie⁸ podczas całego eksperymentu, w tym w dniach, w których wykonywane jest leczenie MA i testy MWM.

4. Stosowanie akupunktury manualnej

1. Unieruchomij myszy z grupy MA w torbach na myszy.
2. Użyj jednorazowych sterylnych igieł do akupunktury (0,25 mm x 13 mm) i zastosuj metodę płaskiego ciernia MA na Baihui (GV20) i Yintang (GV29)⁵ w kierunku nosa przez 20 minut. Upewnij się, że głębokość igły wynosi 0,2–0,3 cm.
3. Dwukierunkowo obracaj manipulację w zakresie 90° z prędkością około 180 obr/min co 5 minut przez ~15 s za każdym razem podczas całego eksperymentu, w tym dni, w których wykonywane jest leczenie MA i testy MWM.

5. Test MWM

UWAGA: Po 24 godzinach od 15 kolejnych dni leczenia, poddaj myszy z czterech grup testowi MWM. Przeprowadź kolejno próbę widocznej platformy, próbę ukrytej platformy, próbę sondy i próbę odwrócenia.

1. Przygotuj się do testu MWM.
   1. Umieść urządzenie MWM oraz system akwizycji i przetwarzania sygnału w pomieszczeniu doświadczalnym zaprojektowanym w celu utrzymania izolacji akustycznej.
   2. Umieść okrągły biały zbiornik (średnica = 90 cm, wysokość = 50 cm) otoczony nieprzezroczystą szmatką na środku urządzenia MWM.
   3. Przymocuj kamerę wideo do sufitu urządzenia MWM i podłącz ją do magnetowidu z automatycznym systemem śledzenia, aby zbierać dane.
   4. Podziel zbiornik labiryntu wodnego równo na cztery równe regiony za pomocą dwóch wzajemnie prostopadłych linii, oznaczonych północą (N), południem (S), wschodem (E) i zachodem (W). Podziel obszar basenu koncepcyjnie na cztery ćwiartki o tej samej wielkości (NE, NW, SW i SE).
   5. W zasięgu wzroku myszy umieść wskazówki wizualne o różnych kształtach na ścianie każdego kwadrantu jako odniesienia wizualne (np. kwadraty, trójkąty i koła).
      UWAGA: Wskazówki dystalne są nawigacyjnymi punktami odniesienia zwierzęcia do lokalizowania platformy. Dlatego nie przesuwaj ich podczas testu. Pozycja badacza jest potencjalną wskazówką dystalną i może wpływać na MWM. Dlatego badacz powinien trzymać się z dala od oczu myszy w oczekiwaniu, aż zwierzę wykona test.
   6. Napełnić okrągły zbiornik wodą na głębokość 30 cm i utrzymywać w temperaturze 22 ± 2 °C za pomocą grzałki elektrycznej.
   7. Zmiękcz wodę nieprzezroczystą za pomocą około 150 g mleka w proszku.
2. Wykonaj widoczną wersję próbną platformy.
   1. Umieść plastikową okrągłą platformę (średnica = 9.5 cm; wysokość = 28 cm) 1 cm nad powierzchnią wody w dowolnym kwadrancie losowo.
   2. Umieść czarną flagę na platformie.
   3. Delikatnie wpuść każdą mysz do wody na poziomie wody z jednego z czterech miejsc startowych skierowanych w stronę ściany zbiornika. Nie wrzucaj myszy do wody.
   4. Aktywuj komputerowy program śledzący, gdy tylko mysz zostanie wypuszczona do wody.
   5. Daj każdej myszy 60 s na wyszukanie platformy. Pod koniec każdej próby umieść każdą mysz na platformie i pozwól jej pozostać na niej przez 10–30 sekund.
   6. Obserwuj trajektorie pływania myszy na komputerze, rejestruj czas potrzebny myszy na znalezienie platformy jako opóźnienie ucieczki i analizuj prędkość pływania.
   7. Osusz każdą mysz ręcznikami i ogrzej ją grzejnikiem elektrycznym. Upewnij się, że używasz odpowiedniego źródła ciepła, aby zapobiec przegrzaniu zwierzęcia.
      UWAGA: Umieść każdą mysz w puli w każdym z czterech różnych kwadrantów początkowych na cztery próby, przesuwając platformę w inne miejsce przy każdej kolejnej próbie. Odstęp między dwiema próbami z użyciem każdej myszy wynosi 15–20 minut.
3. Przeprowadź próbę ukrytej platformy/test nawigacji po miejscu.
   1. Umieść tę samą platformę bez flagi w kwadrancie SE.
   2. Losowo umieść mysz w basenie z każdej z czterech ćwiartek (NE, NW, SW, N) twarzą do ściany basenu na cztery próby. Użyj odstępu czasu 15–20 minut między dwiema próbami.
   3. Daj każdej myszy 60 s na wyszukanie ukrytej platformy.
   4. Rejestruj opóźnienie ucieczki każdej próby po tym, jak mysz wspina się na platformę w celu późniejszej analizy.
   5. Osusz każdą mysz ręcznikami i ogrzej ją grzejnikiem elektrycznym.
      UWAGA: Przeprowadź próbę ukrytej platformy od 2 do 6 dni. Jeśli mysz nie może znaleźć platformy w ciągu 60 sekund, poprowadź mysz do wspinania się na platformę i pozwól jej pozostać tam przez 10–30 s pod koniec każdej próby. Wykonuj cztery próby dziennie dla każdej myszy przez 5 kolejnych dni, z platformą i wskazówkami wizualnymi w stałych pozycjach.
4. Wykonaj próbę sondy.
   UWAGA: Umieść każdą mysz w basenie w nowej pozycji początkowej, aby obserwować zdolność myszy do eksploracji przestrzennej.
   1. Usuń platformę.
   2. Umieść każdą mysz zwróconą w stronę ściany zbiornika w basenie raz na 60 s. Upewnij się, że miejscem początkowym jest kwadrant północno-zachodni, który jest kwadrantem najbardziej oddalonym od kwadrantu SE.
   3. Zapisz dystans pływania, prędkość pływania i numer skrzyżowania platformy w labiryncie.
   4. Osusz każdą mysz ręcznikami i zapewnij ciepło po próbie.
5. Wykonaj próbę odwrócenia.
   UWAGA: Wykonaj próbę odwrócenia od 8 do 11 dni.
   1. Umieść platformę na środku kwadrantu NW (zamiast kwadrantu SE).
   2. Wykonaj kroki 5.3.2 −5.3.5 zgodnie z opisem w sekcji wersji próbnej ukrytej platformy.

6. Analiza statystyczna

1. Do przeprowadzenia analizy statystycznej należy użyć oprogramowania statystycznego (np. SPSS 20.0).

Wyniki

Diagram osi czasu tego protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

Rysunek 1: Diagram osi czasowej protokołu badania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oś czasu pokazuje, że ten eksperyment trwał w sumie 21 dni. Leczenie stosowano u myszy przez cały czas trwania eksperymentu, a testy MWM rozpoczęły się po 15 dniach leczenia. Widzialna platforma, ukryta platforma, sonda i próby odwrócenia zostały przeprowadzone w kolejności.

Poprzednio opublikowane wyniki z Ding et al.⁵ są przedstawione jako typowe wyniki MWM Rysunek 2.

Rysunek 2: Typowe wyniki testu labiryntu wodnego Morrisa (n = 10). (A) Zmiany w opóźnieniu ucieczki i prędkości pływania szczurów wśród różnych grup w badaniu z widoczną platformą. (B) Zmiany w opóźnieniu ucieczki szczurów między różnymi grupami w ukrytej platformie i próbach odwrócenia. Wartości p wynoszą *p < 0,05 i **p < 0,01 w porównaniu z grupą kontrolną. Symbol ## oznacza p < 0,01 w porównaniu z grupą AD. (C) Zmiany w liczbie skrzyżowania platformy i procentowym czasie spędzonym przez szczury w północno-zachodnim kwadrancie między różnymi grupami eksperymentalnymi w próbie sondy. Przedstawiono wyniki próby platformy widzialnej, platformy ukrytej i próby odwrócenia w każdej grupie (n = 10, średnia ± SD). Ten rysunek został zmodyfikowany z Ding et al⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2A pokazuje wyniki widocznej próby platformy. Nie zaobserwowano różnic statystycznych w opóźnieniu ucieczki lub prędkości pływania między grupami w pierwszym dniu MWM. Rysunek 2B pokazuje wyniki próby ukrytej platformy i odwrócenia z dni 2−6 i dni 8−11. Opóźnienie ucieczki w grupie AD utrzymywało się na wysokim poziomie w każdym dniu testu. Opóźnienie ucieczki pozostałych trzech grup zmniejszało się stopniowo. Latencja ucieczki z dni 3−6 i dni 8−11 była dłuższa w grupie AD niż w grupie kontrolnej (p < 0,01). Opóźnienia ucieczki myszy w grupach MA i leków były krótsze niż u myszy w grupie AD odpowiednio w dniach 2-6 i dniach 8-11 (p < 0,01). Rysunek 2C pokazuje wyniki próby sondy. Liczba myszy w grupie AD była statystycznie niższa niż w grupie kontrolnej (p < 0,01). Liczba zwrotnic platform w grupie MA była wyższa niż w grupie AD (p < 0,05). Odsetek czasu spędzonego w kwadrancie SW przez myszy w grupie AD był znacznie niższy niż w grupie kontrolnej (p < 0,01). Odsetek czasu spędzonego w kwadrancie SW w grupie MA był wyższy niż w grupie AD (p < 0,01).

Dyskusja

Chociaż wiele labiryntów wodnych, w tym labirynt wodny Biel i labirynt wodny Cincinnati, istnieje od co najmniej wieku, tylko MWM jest szeroko stosowany do skutecznej i obiektywnej oceny zdolności uczenia się przestrzennego i zapamiętywania^{, ponieważ} ma wiele zalet. Pomimo szerokiego stosowania MWM, procedura ta nie zawsze była stosowana optymalnie. Eksperymenty MWM zazwyczaj trwają długo i ma na nie wpływ wiele zmiennych czynników. Istnieje kilka skutecznych i niezawodnych aspektów, które pomagają wykryć zmiany w uczeniu się przestrzennym i zdolności zapamiętywania, które należy wziąć pod uwagę.

Przeprowadzono cztery różne próby MWM. Próba widocznej platformy została wykorzystana w pierwszym dniu MWM. Jeśli zwierzęta potrafiły dopłynąć bezpośrednio do platformy, oznaczało to, że zdolność pływania i wzrok zwierząt były normalne¹⁰. Otnass zasugerował, że próba widocznej platformy powinna zostać przeprowadzona w pierwszej^kolejności. Wyniki próby z widoczną platformą w tym badaniu oznaczały, że cztery grupy rozpoczęły naukę na tym samym poziomie. Od tego momentu można było rozpocząć kolejne eksperymenty. Próba z ukrytą platformą została wykorzystana do oceny zdolności myszy do nabywania zdolności uczenia się i zapamiętywania. Próba sondy została przeprowadzona w 7 dniu, 24 godziny po zakończeniu próby z ukrytą platformą, w celu oceny pamięci roboczej. Wreszcie, próba odwrócenia została wykorzystana do oceny pamięci roboczej². Zmiany w czterech różnych badaniach MWM razem wskazały, że myszy modelowe AD miały niską zdolność uczenia się i zapamiętywania oraz że MA miała pozytywny wpływ na AD⁵.

Nie ma konkretnych norm dotyczących wymiarów basenu i platformy¹. Basen o średnicy 214 cm jest używany w większości badań MWM. Vorhees i Williams wykazali, że przy identycznych protokołach szczury uczą się szybciej w basenie o długości 122 cm niż w basenie o długości 210 cm; Strome nachylenie krzywej uczenia się wskazuje, że basen o średnicy 122 cm jest niezwykle łatwy w nawigacji dla szczurów¹². W obecnym protokole, biorąc pod uwagę podeszły wiek i słaby wzrost myszy z AD, zastosowano basen o średnicy 90 cm i platformę o średnicy 9,5 cm. Wyniki wstępnych eksperymentów wskazały, że myszy miały większe trudności ze znalezieniem platformy w puli o większej średnicy. W związku z tym testy w większych pulach nie reprezentują rzeczywistej różnicy między grupami. Zwierzęta doświadczalne miały trudności ze znalezieniem platformy w większej puli z mniejszą platformą⁴. Dlatego wielkość basenu i platformy musi być zoptymalizowana we wstępnych doświadczeniach zgodnie z wymaganiami doświadczalnymi i warunkami zwierząt doświadczalnych.

Do wykonania testu MWM⁴ zalecana jest woda o temperaturze 20–24 °C. Starzejące się zwierzęta doświadczalne osiągały słabe wyniki w zimnej^wodzie13, co wskazuje na wyraźną zależną od wieku utratę termoregulacji¹⁴. W tym badaniu termostat został umieszczony na dnie basenu, aby utrzymać temperaturę wody na poziomie 20–24 °C. Wyniki badania nie wykazały istotnej różnicy w prędkościach pływania między czterema grupami⁵.

MWM jest potężną techniką oceny funkcji poznawczych i jest obecnie szeroko stosowana w badaniach. Nie ma jednak określonego, standardowego, spójnego sprzętu do wykonania testu MWM, w tym rozmiarów basenu i platformy^15,16. Różne laboratoria mają różne specyfikacje dla MWM. Dlatego badacze wybierają odpowiednie urządzenie eksperymentalne zgodnie ze swoimi indywidualnymi wymaganiami eksperymentalnymi, co może powodować zamieszanie wśród badaczy. Konieczne są również wstępne eksperymenty. Należy przeprowadzić więcej badań nad podstawowymi eksperymentami, takimi jak MWM. Obecnie elastyczność MWM jako narzędzia eksperymentalnego polega jedynie na możliwości wyboru podstawowych protokołów zgodnie z celem badania. Dlatego test ten można zastosować do bardziej dogłębnej oceny funkcji poznawczych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
igły do akupunktury	Pekin Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company	511526
komputer stacjonarny	Chengdu Techman Software Spółka z ograniczoną odpowiedzialnością	Lenovo T4700D
Tabletka chlorowodorku donepezilu	Eisai Chiny	H20050978	myszy Aricept
	Zhi Shan (Pekin) Akademia Nauk Medycznych	SCXK2014-0003
Urządzenie do labiryntu wodnego Mirros	Chengdu Techman Software Spółka z ograniczoną odpowiedzialnością	Torby na myszy WMT-100S
	domowej roboty
System akwizycji i przetwarzania sygnałów	Chengdu Techman Software Spółka z ograniczoną odpowiedzialnością	BL-420N