Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60056

⸱

16 września 2019

 ,  , 
1Institute for Integrative Biology of the Cell, UMR9198, CNRS CEA Univ Paris-Sud, Université Paris-Saclay

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Streszczenie

Badanie małych RNA (sRNA) za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS) napotyka na problemy z błędami podczas przygotowywania biblioteki. Kilka typów sRNA, takich jak mikroRNA roślinne (miRNA), przenosi modyfikację 2'-O-metylu (2'-OMe) w swoim końcowym nukleotydzie 3'. Ta modyfikacja dodaje kolejną trudność, ponieważ hamuje podwiązanie adaptera 3'. Wcześniej wykazaliśmy, że zmodyfikowane wersje protokołu "TruSeq (TS)" mają mniejsze odchylenie i lepszą detekcję 2'-OMe RNA. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół "TS5", który wykazał się najlepszą ogólną wydajnością. TS5 można stosować przy użyciu odczynników domowej roboty lub odczynników z zestawu TS, z równą wydajnością.

Wprowadzenie

Małe RNA (sRNA) biorą udział w kontroli różnorodnych procesów biologicznych1. Eukariotyczne regulatorowe sRNA mają zwykle wielkość od 20 do 30 nt; trzy główne typy to mikroRNA (miRNA), RNA oddziałujące z piwi (piRNA) i małe interferujące RNA (siRNA). Nieprawidłowe poziomy ekspresji miRNA są związane z różnymi chorobami2. Podkreśla to znaczenie miRNA w zdrowiu i chorobie oraz zapotrzebowanie na dokładne, ilościowe narzędzia badawcze do wykrywania sRNA w ogóle.

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest powszechnie stosowaną metodą badania sRNA. Główne zalety NGS w porównaniu z innymi podejściami, takimi jak ilościowy PCR lub techniki mikromacierzy (qPCR), polegają na tym, że nie wymaga on a priori wiedzy na temat sekwencji sRNA, a zatem może być wykorzystany do odkrywania nowych RNA, a ponadto w mniejszym stopniu cierpi z powodu efektów sygnału tła i nasycenia. Co więcej, może wykrywać różnice między pojedynczymi nukleotydami i ma wyższą przepustowość niż mikromacierze. Jednak NGS ma również pewne wady; Koszt sekwencjonowania pozostaje stosunkowo wysoki, a wieloetapowy proces wymagany do przekształcenia próbki w bibliotekę do sekwencjonowania może powodować błędy systematyczne. W typowym procesie przygotowania biblioteki sRNA, adapter 3' jest najpierw ligowany do sRNA (często oczyszczony żelem z całkowitego RNA) przy użyciu skróconej wersji ligazy RNA 2 (RNL2) i predenylowanego adaptera 3' (Rysunek 1) przy braku ATP. Zwiększa to skuteczność ligacji adaptera sRNA i ogranicza powstawanie reakcji ubocznych, takich jak cyrkularyzacja lub konkategoryzacja sRNA. Następnie adapter 5' jest ligowany przez ligazę RNA 1 (RNL1), a następnie odwrotną transkrypcję (RT) i amplifikację PCR. Wszystkie te kroki mogą wprowadzić bias3,4. W związku z tym odczytane liczby mogą nie odzwierciedlać rzeczywistych poziomów ekspresji sRNA, co prowadzi do sztucznych, zależnych od metody wzorców ekspresji. Określone sRNA mogą być nadreprezentowane lub niedostatecznie reprezentowane w bibliotece, a silnie niedostatecznie reprezentowane sRNA mogą uniknąć wykrycia. Sytuacja jest szczególnie skomplikowana w przypadku roślinnych miRNA, siRNA u owadów i roślin oraz piRNA u owadów, nicieni i ssaków, w których końcowy nukleotyd 3' ma modyfikację 2'-O-metylu (2'-OMe)1. Modyfikacja ta silnie hamuje ligację adaptera 3'5, co sprawia, że przygotowanie biblioteki dla tego typu RNA jest trudnym zadaniem.

Poprzednie prace wykazały, że ligacja adaptera wprowadza poważne odchylenia, ze względu na efekty sekwencji/struktury RNA6,7,8,9,10,11. Etapy następujące po podwiązaniu adaptera, takie jak odwrotna transkrypcja i PCR, nie przyczyniają się znacząco do stronniczości6,11,12. Błąd ligacji jest prawdopodobny ze względu na fakt, że cząsteczki adaptera o danej sekwencji będą oddziaływać z cząsteczkami sRNA w mieszaninie reakcyjnej, tworząc fałdy, co może prowadzić do korzystnych lub niekorzystnych konfiguracji ligacji (Rysunek 2). Dane z Sorefan et al7 sugerują, że RNL1 preferuje kontekst jednoniciowy, podczas gdy RNL2 preferuje dwuniciowy do ligacji. Fakt, że struktury współfałdowania adaptera/sRNA są determinowane przez określone sekwencje adaptera i sRNA, wyjaśnia, dlaczego określone sRNA są nadreprezentowane lub niedostatecznie reprezentowane w danym zestawie adapterów. Ważne jest również, aby pamiętać, że w serii bibliotek sRNA, które mają być porównywane, należy używać tych samych sekwencji adapterów. Rzeczywiście, wcześniej zaobserwowano, że zmiana adapterów poprzez wprowadzenie różnych sekwencji kodów kreskowych zmienia profile miRNA w bibliotekach sekwencjonowania9,13.

Randomizacja sekwencji adaptera w pobliżu złącza ligacji prawdopodobnie zmniejsza te odchylenia. Sorefan i współpracownicy7 użyli adapterów z 4 losowymi nukleotydami na ich końcach, oznaczonych jako adaptery "High Definition" (HD) i wykazali, że użycie tych adapterów prowadzi do bibliotek, które lepiej odzwierciedlają prawdziwe poziomy ekspresji sRNA. Nowsze prace potwierdziły te obserwacje i ujawniły, że randomizowany region nie musi przylegać do złącza ligacji11. Ten nowatorski typ adapterów został nazwany adapterami "MidRand". Łącznie wyniki te pokazują, że ulepszona konstrukcja adaptera może zmniejszyć odchylenia.

Zamiast modyfikować adaptery, stronniczość może być tłumiona poprzez optymalizację warunków reakcji. Wykazano, że glikol polietylenowy (PEG), makromolekularny środek tłumiący, o którym wiadomo, że zwiększa skuteczność ligacji14, znacznie zmniejsza odchylenie15,16. Na podstawie tych wyników na rynku pojawiło się kilka zestawów "low bias". Należą do nich zestawy, które wykorzystują PEG w reakcjach podwiązywania, w połączeniu z klasycznymi adapterami lub adapterami HD. Inne zestawy całkowicie unikają ligacji i używają poliadenylacji 3' i przełączania szablonów odpowiednio do dodawania adaptera 3' i 5'12. W jeszcze innej strategii, po podwiązaniu adaptera 3' następuje etap cyrkularyzacji, pomijając w ten sposób podwiązanie adaptera 5'17.

W poprzednim badaniu szukaliśmy protokołu przygotowania biblioteki sRNA o najniższym możliwym poziomie odchylenia i najlepszej detekcji 2'-OMe RNAs12. Przetestowaliśmy niektóre z wyżej wymienionych zestawów o "niskim odchyleniu", które miały lepszą detekcję 2'-OMe RNA niż standardowy protokół (TS). Co zaskakujące, po modyfikacji (zastosowanie randomizowanych adapterów, PEG w reakcjach ligacji i usunięcie nadmiaru adaptera 3' przez oczyszczanie) te ostatnie przewyższyły inne protokoły wykrywania RNA 2'-OMe. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół oparty na protokole TS "TS5", który miał najlepszą ogólną detekcję 2'-OMe RNA. Protokół można stosować przy użyciu odczynników z zestawu TS i jednego odczynnika z zestawu "Nf" lub, aby zaoszczędzić pieniądze, przy użyciu odczynników domowej roboty, o jednakowej wydajności. Zapewniamy również szczegółowy protokół oczyszczania sRNA z całkowitego RNA i przygotowania preadenylowanego adaptera 3'.  

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja małych RNA

  1. Ekstrahować całkowite RNA za pomocą odczynników na bazie fenolu lub dowolnej innej metody. Sprawdź, czy RNA jest dobrej jakości.
  2. Uruchom wstępnie 15% żel mocznikowy TBE (patrz tabela materiałów) przez 15 minut przy napięciu 200 V.
  3. Podczas przygotowywania żelu wymieszaj 5-20 μg całkowitego RNA w objętości 5-15 μl z równą objętością barwnika ładującego formamid (patrz Tabela materiałów; 95% dejonizowany formamid, 0,025% błękit bromofenolowy, 0,025% cyjanol ksylenowy, 5 mM EDTA pH 8) w probówce PCR o pojemności 200 μl. Podobnie, zmieszaj 10 μl (200 ng) drabinki z małym RNA (patrz Tabela materiałów) z równą objętością barwnika obciążającego formamid. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 65 °C w termocyklerze z podgrzewaną pokrywą, a następnie natychmiast umieścić probówki na lodzie.
  4. Załadować drabinkę i próbkę do tego samego żelu z co najmniej jednym pasem między nimi i pracować pod napięciem 200 V, aż błękit bromofenolowy (ciemnoniebieski) przemieści się na około dwie trzecie długości żelu (około 40 minut).
  5. Przygotuj układ do elucji RNA z żelu w następujący sposób: przekłuć dno wolnej od nukleaz mikroprobówki wirówkowej o pojemności 0,5 ml igłą o rozmiarze 21. Umieść przebitą probówkę o pojemności 0,5 ml w beznukleazowej, okrągłodennej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml.
  6. Usuń żel i inkubuj w temperaturze pokojowej z 3 μl barwnika z żelu kwasu nukleinowego (10 000 x koncentrat; patrz Tabela Materiałów) w 30 ml wody przez 10-15 minut.
  7. Obejrzyj żel na iluminatorze trans "Dark Reader" (zdecydowanie zaleca się unikanie promieniowania UV, ponieważ może to uszkodzić RNA) i wyciąć próbkę RNA między pasmami drabinkowymi 17 nt i 29 nt. Przenieś kawałek żelu do probówki o pojemności 0,5 ml z kroku 1.5.
  8. Odwirować probówkę o pojemności 0,5 ml w probówce o pojemności 2 ml w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 2 minuty. Wyjmij probówkę o pojemności 0,5 ml, która powinna być teraz pusta.
  9. Dodać 300 μl 0,3 M NaCl bez nukleaz do probówki o pojemności 2 ml zawierającej rozdrobniony żel i obracać przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc (16 godzin).
  10. Przenieść zawiesinę rozdrobnionych kawałków żelu do kolumny wirowej (patrz tabela materiałów) i wirować przez 2 minuty z maksymalną prędkością w mikrowirówce.
  11. Dodać 1 μl (20 μg/μl) glikogenu (patrz tabela materiałów) i 950 μl 100% etanolu o temperaturze pokojowej. Inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze -80 °C.
  12. Wirować przez 20 minut z maksymalną prędkością w mikrowirówce w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant, przemyć osad 800 μl zimnego 80 % etanolu. Ponownie odwirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć cały sklarowany sklarowany stan. Zawiesić osad RNA w 15 μl wody wolnej od nukleaz. Zazwyczaj należy odzyskać ~5-20 ng małego RNA, w zależności od ilości wejściowego całkowitego RNA (~1 ng małego RNA na 1 μg wejściowego całkowitego RNA).
  13. Zalecany dodatkowy krok: Sprawdź ilość i jakość odzyskanego sRNA (np. za pomocą elektroforezy w żelu kapilarnym przy użyciu małego zestawu RNA; patrz Tabela materiałów).

2. Przygotowanie adaptera 3' HD z predenylacją

UWAGA: Preadenylacja adaptera HD 3' została przeprowadzona w sposób podobny do protokołu opisanego przez Chen et al18. Zwróć uwagę, że adapter preadenylowany można zamówić bezpośrednio (modyfikacja /5rApp/), ale jest to dość drogie.

  1. Zamów 5' fosforylowany, 3' zablokowany oligonukleotyd adaptera 3' HD. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z kolejnością i modyfikacjami. Należy pamiętać, że "3AmMO" jest grupą modyfikatorów 3' aminokwasów, większość dostawców może produkować oligonukleotyd z tą modyfikacją. Rozcieńczyć w wodzie wolnej od nukleaz do 100 μM.
  2. Przygotuj 100 μl reakcji zawierającej następujące odczynniki: 10 μl oligo (100 μM), 10 μl buforu ligazy RNA T4 (10x), 10 μl ATP (10 mM), 40 μl 50% PEG8000, 5 μl ligazy T4 RNA 1 (50 jednostek), 25 μl wody wolnej od nukleaz. Inkubować przez noc w temperaturze 20 °C.
  3. Przeprowadzić klasyczną ekstrakcję fenolowo-chloroformową preadenylowanego oligonukleotydu, a następnie wytrącić etanol. Dodać 100 μl kwasu (pH 4,5) fenolu:chloroform i wirować. Wirować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, maksymalna prędkość. Ostrożnie przenieść 90 μl górnej fazy do nowej probówki; dodać 10 μL 3 M octanu sodu o pH 5,2, 1 μL ultraczystego glikogenu i 250 μL zimnego 100% etanolu.
  4. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 minut. Wirować przez 30 minut przy maksymalnej prędkości 4 °C. Usunąć supernatant, przemyć osad raz 500 μl zimnego 80% etanolu. Jako alternatywę dla ekstrakcji fenolowo-chloroformowej i wytrącania etanolu można zastosować zestaw do usuwania nukleotydów (patrz tabela materiałów). Zawiesić w 25 μl wody.
  5. Zmierz stężenie łącznika za pomocą zestawu do specyficznego wykrywania jednoniciowego DNA (patrz Tabela materiałów). Rozcieńczyć do 80 ng/μL (10 μM).
  6. Zalecany dodatkowy krok: Sprawdź skuteczność preadenylacji poprzez migrację 1 μl adaptera 10 μM na 15% żelu TBE-mocznik (tabela materiałów) wraz z nieleczonym oligonukleotydem. Preadenylowany adapter powinien migrować nieco wolniej niż nieleczony oligonukleotyd. W razie potrzeby wstępnie przygotowany adapter można oczyścić żelem; Postępuj zgodnie z powyższym opisem (kroki 1.2-1.12).

3. Przygotowanie biblioteki - Protokół TS5

UWAGA: Prezentujemy tutaj zmodyfikowany protokół TS 'TS5', który opisaliśmy wcześniej12 i który może być wykonany zarówno z odczynnikami z zestawu, jak i z odczynnikami dostarczonymi przez siebie. Należy zauważyć, że podobne lub nawet nieco lepsze wyniki uzyskaliśmy przy użyciu innego protokołu, 'TS7'. Jednak w przypadku TS7 trudniej jest wyeliminować ściemniacze adapterów. Dlatego woleliśmy szczegółowo opisać TS5, ale po TS7 można po prostu wymienić adaptery. W przypadku TS7 należy użyć sekwencji adaptera "MidRand-Like (MRL)" (tabela 1). Zauważ, że tutaj losowe regiony znajdują się w środku adapterów. Startery do odwrotnej transkrypcji i PCR będą hybrydyzować z sekwencjami poniżej randomizowanego regionu w adapterze 3' i przed randomizowanym regionem w adapterze 5'. Sekwencjonowanie rozpocznie się od pierwszego randomizowanego nukleotydu w adapterze 5'.

  1. Podwiązanie adaptera 3'.
    1. Połącz 1 μl wstępnie adenylowanego adaptera 3' HD (10 μM) z 1 μl oczyszczonego małego RNA (~0,1-1 μM) w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 0,2 ml. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 72 °C w termocyklerze, a następnie umieścić bezpośrednio na lodzie.
    2. Dodać 4 μl 50% PEG 8000 (lepki roztwór; pipetować powoli), 1 μl buforu ligazy RNA (10x), 1 μlH2O, 1 μl ligazy T4 RNA2 skróconej i 1 μl inhibitora RNazy. Inkubować przez noc w temperaturze 16 °C.
  2. Eliminacja nieligowanego adaptera 3'
    1. Dodaj 10 μl wody bez nukleaz i dobrze wymieszaj. Dodać 6 μl 3 M NaOAc o pH 5,2 lub "roztworu do zubożenia adaptera" z zestawu Nf (tabela materiałów) i dobrze wymieszać. Dodać 40 μl magnetycznych kulek oczyszczających (tabela materiałów) i 60 μl izopropanolu i dobrze wymieszać. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Umieść próbkę w stojaku magnetycznym, aż roztwór stanie się klarowny. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
    3. Dodać 180 μl świeżo przygotowanego 80 % etanolu. Inkubować przez ~30 s, a następnie wyjąć. Uważaj, aby używać świeżo przygotowanego 80% etanolu i nie inkubować z 80% etanolem przez dłuższy czas.
    4. Krótko obróć rurkę i usuń resztki płynu, które mogły zebrać się na dnie studzienki. Pozostaw kulki do wyschnięcia na 2 minuty, a następnie ponownie zawieś w 22 μl 10 mM Tris pH 8 lub buforze do reprodukcji z zestawu Nf. Inkubować przez 2 minuty, a następnie namagnesować próbkę, aż roztwór stanie się klarowny.
    5. Dodać 6 μl 3 M NaOAc pH 5,2 lub "roztworu do zubożenia adaptera" z zestawu Nf (tabela materiałów) do nowej probówki. Przenieść 20 μl supernatantu z poprzedniego etapu do nowej probówki i wymieszać pipetując. Dodać 40 μl kulek magnetycznych i 60 μl 100% izopropanolu i dobrze wymieszać pipetując. Inkubować przez 5 minut.
    6. Namagnesuj próbkę, aż roztwór stanie się klarowny, a następnie usuń i wyrzuć supernatant.
    7. Dodać 180 μl świeżo przygotowanego 80 % etanolu. Inkubować przez ~30 s, a następnie wyjąć. Należypamiętać o używaniu świeżo przygotowanego 80% etanolu i nie inkubować z 80% etanolem przez dłuższy czas.
    8. Krótko obróć rurkę i usuń resztki płynu, które mogły zebrać się na dnie studzienki. Pozostaw kulki do wyschnięcia na 2 minuty i ponownie zamieszaj w 10 μl wody wolnej od nukleaz. Inkubować przez 2 minuty, a następnie namagnesować próbkę, aż roztwór stanie się klarowny.
    9. Przenieść 9 μl supernatantu do nowej probówki. Dodać 1 μL buforu ligazy T4 RNA (10x) i 1 μL wody. Alternatywnie dodaj 2 μl buforu ligazy z zestawu TS.
  3. Podwiązanie adaptera 5'.
    1. Dodaj 1 μl adaptera 5' HD (10 μM; Tabela 1) do probówki PCR o pojemności 200 μl w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 70 °C, a następnie umieścić probówkę bezpośrednio na lodzie.
    2. Dodać 1 μl 10 mM ATP i 1 μl ligazy T4 RNA 1. Dobrze wymieszać, delikatnie pipetując. Dodać 3 μl tej mieszaniny do 3' ligowanego RNA z kroku 3.2.9 i wymieszać pipetując. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 28 °C.
  4. Odwrotna transkrypcja (RT)
    1. Przenieś 6 μl zligowanego RNA 3' i 5' adaptera do nowej probówki PCR o pojemności 200 μl (pozostałe ~8 μl należy przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania, jeśli to konieczne). Dodać 1 μl startera RT (10 μM; Tabela 1) i wymieszać pipetując. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 70 °C, a następnie umieścić probówkę bezpośrednio na lodzie.
    2. Dodaj następujące odczynniki do RT: 2 μl 5x buforu pierwszej nici, 0,5 μl 12,5 mM mieszanki dNTP, 1 μl 100 mM DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy (tabela materiałów). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C.
  5. Amplifikacja PCR
    1. Do 12,5 μl mieszaniny reakcyjnej RT dodać następujące odczynniki: 10 μl buforu polimerazy PCR, 2 μl uniwersalnego startera P5 (10 μM; Tabela 1), 2 μl startera o indeksie P7 (10 μM; Tabela 1), 1 μl 12,5 mM dNTP, 0,5 μl polimerazy DNA (tabela materiałów) i 22 μl wody. Utrzymuj reakcję na lodzie do czasu użycia.
    2. Uruchom następujący program PCR: 98 °C przez 30 s, 11 cykli (98 °C przez 10 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 15 s) i 72 °C przez 10 s. Po zakończeniu utrzymuj reakcję w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Jeśli chodzi o liczbę cykli PCR: zazwyczaj wykonujemy 11 cykli, ale powinno to być zoptymalizowane przez użytkownika. Postaraj się wykonać jak najmniejszą liczbę cykli PCR.
  6. Oczyszczanie żelu
    1. Uruchom 5, 10 i 20 μl produktu PCR na natywnym 6% żelu TBE (patrz Tabela Materiałów) wraz z odpowiednią drabinką (patrz Tabela Materiałów). Uruchom żel przez około 1 godzinę pod napięciem 145 V (do momentu, gdy błękit bromofenolowy dotrze do dna; barwnik ten migruje w pozycji 65 pz).
    2. Usuń żel i inkubuj z barwnikiem z żelu z kwasem nukleinowym (patrz tabela materiałów) w wodzie przez 10-15 minut.
    3. Obejrzyj żel na iluminatorze trans "Dark Reader" (zdecydowanie zaleca się unikanie promieniowania UV, ponieważ może to uszkodzić RNA) i wyciąć pasmo biblioteki przy 150 pz. Przygotuj system do elucji RNA z żelu, jak opisano w kroku 1.5 i przenieś kawałek żelu do probówki o pojemności 0,5 ml.
    4. Wirować w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 2 minuty. Wyjmij probówkę o pojemności 0,5 ml, która powinna być teraz pusta.
    5. Dodać 300 μl wody wolnej od nukleaz do probówki o pojemności 2 ml zawierającej rozdrobniony żel i obracać przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc.
    6. Przenieść zawiesinę rozdrobnionych kawałków żelu w wodzie do kolumny wirowej i wirować przez 2 minuty z maksymalną prędkością.
    7. Dodać 1 μl (20 μg/μL) glikogenu, 30 μL 3 M NaOAc i 975 μl lodowatego 100% etanolu. Wirować przez 20 minut z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C.
    8. Zawiesić osad w 20 μl 10 mM Tris pH8. Użyj 1 μl do pomiaru stężenia i 1 μl do kontroli jakości.

4. Analiza danych

UWAGA: Opisana poniżej procedura analizy danych jest oparta na systemie operacyjnym Linux Ubuntu 16.04 LTS.

  1. Postępowanie z surowymi plikami sekwencji
    1. Pobierz plik(i) sekwencji FASTQ wygenerowany podczas sekwencjonowania. W razie potrzeby wykonaj demultipleksowanie za pomocą bcl2fastq2 (wersja V2.2.18.12; instrukcję można pobrać z następującego linku: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html).
      Użyj następującego polecenia:
      nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --output-dir Pathway_of_Output_Directory --błędy-kodów kreskowych 1 --zagregowane-kafelki AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16
    2. Usuń sekwencje adapterów za pomocą Cutadapt19 wersja 1.15. Instrukcję można pobrać tutaj: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html.
      Użyj następującego polecenia:
      Pathway_to_cutadapt/cutadapt -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Output_File_Read1_cutadapt.fastq.gz Input_File_Read1.fastq.gz
      Zauważ, że sekwencja w poleceniu odpowiada adapterowi 3' HD bez 4 losowych nukleotydów; W związku z tym nie zostaną one usunięte na tym etapie.
    3. Użyj seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) do usunięcia końcowych losowych nukleotydów w odczytach sekwencjonowania. Użyj następującego polecenia (nazwy zmiennych są pogrubione):
      seqtk trimfq -b 4 -e 4 Output_File_Read1_cutadapt.fastq > Output_File_Read1_trimmed.fastq
    4. Użyj następującego polecenia awk, aby odrzucić sekwencje krótsze niż 10 nt:
      awk 'BEGIN {FS = "\t" ; OFS = "\n"} {nagłówek = $0 ; getline seq ; getline qheader ; getline qseq ; if (length(seq) >= 10) {print header, seq, qheader, qseq}}' Output_File_Read1_trimmed.fastq > Length_Filtered.fastq
  2. Mapowanie przyciętych sekwencji
    1. Pobierz bazę danych odpowiadającą badanemu organizmowi z miRBazy w następujący sposób. Przejdź do http://www.mirbase.org/ftp.shtml i pobierz plik "mature.fa". Należy pamiętać, że sekwencje są wskazane w notacji RNA. Zastąp pozostałości U przez T za pomocą następującego polecenia:
      sed -i '/^>/! s/U/T/g' mature.fa
      UWAGA: W ten sposób uzyskasz pełną listę wszystkich miRNA w miRBazie, pochodzących z różnych organizmów.
    2. Wybierz sekwencje miRNA interesującego Cię organizmu za pomocą następującego polecenia:
      awk 'name_of_the_organism{print; nr[NR+1]; następny}; NR w nr' mature.fa > mature_name_of_the_organism_mirs.fa
    3. Zmapuj odczyty do wyżej utworzonego pliku za pomocą Bowtie220 (wersja 2.3.0), nie dopuszczając żadnych niezgodności. Najpierw utwórz indeks dla pliku za pomocą następującego polecenia:
      bowtie2-build mature_name_of_the_organism_mirs.fa mature_name_of_the_organism_mirs
    4. Dopasuj odczyty sekwencjonowania do bazy danych, wymagając, aby odczyt był całkowicie mapowany na miRNA bazy danych, bez żadnych niezgodności. W tym celu użyj następującego narzędzia:
      muszka2 -N 0 -L 10 --score-min C,0,0 --end-to-end --time -x mature_name_of_the_organism_mirs -U Length_Filtered.fastq -S Length_Filtered_ALIGNMENT.sam
      UWAGA: Opcja: --score-min C,0,0 zapewnia, że wyrównanie jest bez żadnych niezgodności. Aby uzyskać wyjaśnienie różnych parametrów w narzędziu, odwiedź następującą stronę internetową: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml
    5. Aby odrzucić odczyty, które nie zostały wyrównane, użyj następującego polecenia:
      samtools view -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam > Reads_aligned_to_Mirs.sam
      UWAGA: W wyniku tych kroków powinieneś teraz uzyskać wyrównane odczyty, odpowiadające miRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kluczowymi etapami są izolacja frakcji małego RNA z wyjściowego materiału całkowitego RNA (Rycina 3) oraz pożądany końcowy produkt biblioteki (Rysunek 4). Oba etapy obejmują oczyszczanie za pomocą żelu poliakrylamidowego; małe RNA jest izolowane z 15% żeli TBE z mocznikiem, natomiast końcowe biblioteki są izolowane z 6% natywnych żeli TBE. Małe RNA izolowane z żelu można analizować za pomocą chipa do elektroforezy kapilarnej małych RNA (Tabela materiałów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przygotowanie małej biblioteki RNA pozostaje wyzwaniem ze względu na odchylenia, które pojawiają się głównie na etapach ligacji adaptera. RNA z modyfikacją 2'-OMe na końcu 3', takie jak miRNA roślinne, piRNA u owadów, nicieni i ssaków oraz małe interferujące RNA (siRNA) u owadów i roślin, są szczególnie trudne do zbadania, ponieważ modyfikacja 2'-OMe hamuje ligację adaptera 3'. W literaturze zaproponowano szereg rozwiązań mających na celu ulepszenie protokołów przygotowania bibliotek sRNA, ale większość dostępnych na ryn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodowe Centrum Badań Naukowych (CNRS), Francuską Komisję ds. Alternatywnych Źródeł Energii i Energii Atomowej (CEA) oraz Uniwersytet Paris-Sud. Wszystkie przygotowania biblioteki, sekwencjonowanie Illumina i analizy bioinformatyczne na potrzeby tego badania zostały przeprowadzone w ośrodku I2BC Next-Generation Sequencing (NGS). Członkowie placówki I2BC NGS są doceniani za krytyczną lekturę manuskryptu i pomocne sugestie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przyrząd do bioanalizowania 2100 AgilentG2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)ThermoFisherAM9720
Adenozyno-5'-trifosforan (ATP)Nex England BiolabsP0756S
Koraliki Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880
Bioanalizator Zestaw DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626
Bioanalyzer Mały zestaw RNAAgilent5067-1548
Filtry probówkowe wirówki Corning Costar Spin-XSigma AldrichCLS8162-96EA
Dark Reader transilluminatorróżne dostawcy
HotStart PCR Kit, z dNTPKapa BiosystemsKK2501
NEXTflex mały zestaw RNA-seq V3BIOO ScientificNOVA-5132-05opcjonalnie
żele Novex TBE 6%ThermoFisherEC6265BOX
Novex TBE Żele mocznikowe 15%ThermoFisherEC6885BOX
Zestaw do usuwania nukleotydów QIAquickQiagen 28304
Zestaw startowy do oznaczania ilościowego Qubit 4ThermoFisherQ33227
Zestaw do oznaczania ssDNA QubitThermoFisherQ10212
Barwnik ładujący żel RNA (2X)ThermoFisherR0641
Barwnik ładujący żel RNA (2X)InhibitorThermoFisher R0641
, mysi Nex England BiolabsM0314S
SuperScript IV Odwrotna transkryptazaThermoFisher18090200
SYBR Gold Barwnik żelowy z kwasem nukleinowymThermoFisherS11494
T4 Ligaza RNA 1 (ligaza ssRNA)Nex England BiolabsM0204S
T4 RNA Ligaza 2, skróconaNex England BiolabsM0242S
TrackIt 50 pz DNA drabinkaThermoFisher10488043
TruSeq Zestaw do przygotowania małej biblioteki RNAIlluminaRS-200-0012/24/36/48opcjonalnie
UltraPureGlycogen ThermoFisher10814010
XCell SureLock Mini-CellThermoFisherEI0001
XCell SureLock Mini-CellThermoFisherEI0001
ZR mała drabinka RNAZymo ResearchR1090
ostatnie dwie cyfry odpowiadają zestawowi indeksów
RNazy

Bibliografia

  1. Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
  2. Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
  3. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358(2012).
  4. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
  5. Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
  6. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
  7. Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4(2012).
  8. Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
  9. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141(2011).
  10. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54(2012).
  11. Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049(2015).
  12. Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118(2018).
  13. Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969(2011).
  14. Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
  15. Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619(2014).
  16. Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109(2013).
  17. Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105(2018).
  18. Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41(2012).
  19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
  20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25(2009).
  21. Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekwencjonowanie ma ych RNAwykrywanie RNA zmetylowanego w pozycji 2 Oprotok TruSeq TS5przygotowanie biblioteki RNAelektroforeza elowaoczyszczanie kuleczkami magnetycznymiinhibicja ligacji adapter wanaliza mikroRNA ro lindopasowanie sekwencji Bowtie2kapilarna elektroforeza elowa
Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.