Artykuł metodologiczny

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

DOI:

10.3791/60056

⸱

16 września 2019

 ,  , 
1Institute for Integrative Biology of the Cell, UMR9198, CNRS CEA Univ Paris-Sud, Université Paris-Saclay

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie małych RNA (sRNA) za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS) napotyka na problemy z błędami podczas przygotowywania biblioteki. Kilka typów sRNA, takich jak mikroRNA roślinne (miRNA), przenosi modyfikację 2'-O-metylu (2'-OMe) w swoim końcowym nukleotydzie 3'. Ta modyfikacja dodaje kolejną trudność, ponieważ hamuje podwiązanie adaptera 3'. Wcześniej wykazaliśmy, że zmodyfikowane wersje protokołu "TruSeq (TS)" mają mniejsze odchylenie i lepszą detekcję 2'-OMe RNA. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół "TS5", który wykazał się najlepszą ogólną wydajnością. TS5 można stosować przy użyciu odczynników domowej roboty lub odczynników z zestawu TS, z równą wydajnością.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe RNA (sRNA) biorą udział w kontroli różnorodnych procesów biologicznych1. Eukariotyczne regulatorowe sRNA mają zwykle wielkość od 20 do 30 nt; trzy główne typy to mikroRNA (miRNA), RNA oddziałujące z piwi (piRNA) i małe interferujące RNA (siRNA). Nieprawidłowe poziomy ekspresji miRNA są związane z różnymi chorobami2. Podkreśla to znaczenie miRNA w zdrowiu i chorobie oraz zapotrzebowanie na dokładne, ilościowe narzędzia badawcze do wykrywania sRNA w ogóle.

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest powszechnie stosowaną metodą badania sRNA. Główne zalety NGS w porównaniu z innymi podejścia....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja małych RNA

  1. Ekstrahować całkowite RNA za pomocą odczynników na bazie fenolu lub dowolnej innej metody. Sprawdź, czy RNA jest dobrej jakości.
  2. Uruchom wstępnie 15% żel mocznikowy TBE (patrz tabela materiałów) przez 15 minut przy napięciu 200 V.
  3. Podczas przygotowywania żelu wymieszaj 5-20 μg całkowitego RNA w objętości 5-15 μl z równą objętością barwnika ładującego formamid (patrz Tabela materiałów; 95% dejonizowany formamid, 0,025% błękit bromofenolowy, 0,025% cyjanol ksylenowy, 5 mM EDTA pH 8) w probówce PCR o pojemności 200 μl. Podobnie, zmieszaj 10 μl (200 ng) drabinki z małym RNA (patrz

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe etapy to izolacja małej frakcji RNA z początkowego całkowitego materiału RNA (Rysunek 3) oraz pożądany końcowy produkt biblioteczny (Rysunek 4). Oba etapy obejmują oczyszczanie żelem poliakrylamidowym; małe RNA jest izolowane z 15% żeli mocznikowych TBE, podczas gdy końcowe biblioteki są izolowane z 6% natywnych żeli TBE. Małe RNA wyizolowane z żelu można analizować na małym chipie do elektroforezy kapilarnej RNA (Tabela materiałów;

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie małej biblioteki RNA pozostaje wyzwaniem ze względu na odchylenia, które pojawiają się głównie na etapach ligacji adaptera. RNA z modyfikacją 2'-OMe na końcu 3', takie jak miRNA roślinne, piRNA u owadów, nicieni i ssaków oraz małe interferujące RNA (siRNA) u owadów i roślin, są szczególnie trudne do zbadania, ponieważ modyfikacja 2'-OMe hamuje ligację adaptera 3'. W literaturze zaproponowano szereg rozwiązań mających na celu ulepszenie protokołów przygotowania bibliotek sRNA, ale większość dostępnych na ryn.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodowe Centrum Badań Naukowych (CNRS), Francuską Komisję ds. Alternatywnych Źródeł Energii i Energii Atomowej (CEA) oraz Uniwersytet Paris-Sud. Wszystkie przygotowania biblioteki, sekwencjonowanie Illumina i analizy bioinformatyczne na potrzeby tego badania zostały przeprowadzone w ośrodku I2BC Next-Generation Sequencing (NGS). Członkowie placówki I2BC NGS są doceniani za krytyczną lekturę manuskryptu i pomocne sugestie.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przyrząd do bioanalizowania 2100 AgilentG2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)ThermoFisherAM9720
Adenozyno-5'-trifosforan (ATP)Nex England BiolabsP0756S
Koraliki Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880
Bioanalizator Zestaw DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626
Bioanalyzer Mały zestaw RNAAgilent5067-1548
Filtry probówkowe wirówki Corning Costar Spin-XSigma AldrichCLS8162-96EA
Dark Reader transilluminatorróżne dostawcy
HotStart PCR Kit, z dNTPKapa BiosystemsKK2501
NEXTflex mały zestaw RNA-seq V3BIOO ScientificNOVA-5132-05opcjonalnie
żele Novex TBE 6%ThermoFisherEC6265BOX
Novex TBE Żele mocznikowe 15%ThermoFisherEC6885BOX
Zestaw do usuwania nukleotydów QIAquickQiagen 28304
Zestaw startowy do oznaczania ilościowego Qubit 4ThermoFisherQ33227
Zestaw do oznaczania ssDNA QubitThermoFisherQ10212
Barwnik ładujący żel RNA (2X)ThermoFisherR0641
Barwnik ładujący żel RNA (2X)InhibitorThermoFisher R0641
, mysi Nex England BiolabsM0314S
SuperScript IV Odwrotna transkryptazaThermoFisher18090200
SYBR Gold Barwnik żelowy z kwasem nukleinowymThermoFisherS11494
T4 Ligaza RNA 1 (ligaza ssRNA)Nex England BiolabsM0204S
T4 RNA Ligaza 2, skróconaNex England BiolabsM0242S
TrackIt 50 pz DNA drabinkaThermoFisher10488043
TruSeq Zestaw do przygotowania małej biblioteki RNAIlluminaRS-200-0012/24/36/48opcjonalnie
UltraPureGlycogen ThermoFisher10814010
XCell SureLock Mini-CellThermoFisherEI0001
XCell SureLock Mini-CellThermoFisherEI0001
ZR mała drabinka RNAZymo ResearchR1090
ostatnie dwie cyfry odpowiadają zestawowi indeksów
RNazy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
  2. Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie ma ych RNAwykrywanie RNA zmetylowanego w pozycji 2 Oprotok TruSeq TS5przygotowanie biblioteki RNAelektroforeza elowaoczyszczanie kuleczkami magnetycznymiinhibicja ligacji adapter wanaliza mikroRNA ro lindopasowanie sekwencji Bowtie2kapilarna elektroforeza elowa

Powiązane artykuły