Artykuł metodologiczny

Poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych

DOI:

10.3791/60057

⸱

30 lipca 2019

 ,  , 
1Ruth L. and David S. Gottesman Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine Research, Albert Einstein College of Medicine, 2Departments of Cell Biology and Stem Cell Institute, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 4Albert Einstein Cancer Center and Diabetes Research Center, Albert Einstein College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ksenobiotyczne pompy wypływowe są bardzo aktywne w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) i powodują ekstruzję TMRM, barwnika fluorescencyjnego o potencjale błony mitochondrialnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół do dokładnego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w HSPC za pomocą TMRM w obecności Werapamilu, inhibitora pompy wypływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ metabolizm komórkowy jest kluczowym regulatorem samoodnawiania się hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC), różne role odgrywane przez mitochondria w homeostazie hematopoetycznej były intensywnie badane przez badaczy HSC. Poziomy aktywności mitochondriów znajdują odzwierciedlenie w ich potencjałach błonowych (ΔΨm), które można mierzyć za pomocą barwników kationowych przenikających komórkę, takich jak TMRM (tetrametylodamina, ester metylowy). Zdolność pomp wypływowych do wytłaczania tych barwników z komórek może jednak ograniczać ich użyteczność. Wynikający z tego błąd systematyczny pomiaru jest szczególnie istotny przy ocenie HSC, ponieważ transportery ksenobiotyków wykazują wyższy poziom ekspresji i aktywności w HSC niż w komórkach zróżnicowanych. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący werapamil, inhibitor pompy odpływowej, do dokładnego pomiaru ΔΨm w wielu populacjach szpiku kostnego. Wykazano, że wynikające z tego zahamowanie aktywności pompy zwiększa intensywność TMRM w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC), pozostawiając ją stosunkowo niezmienioną w dojrzałych frakcjach. Podkreśla to zwrócenie szczególnej uwagi na aktywność wypływu barwnika, która jest wymagana, gdy stosowane są barwniki zależne od ΔΨm, a jak napisano i zwizualizowano, protokół ten może być wykorzystany do dokładnego porównania różnych populacji w szpiku kostnym lub tej samej populacji w różnych modelach eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są samoodnawiające się, multipotencjalne i zdolne do powstania wszystkich komórek krwi1,2. Metabolizm komórkowy jest kluczowym regulatorem utrzymania HSC, wraz z czynnikami transkrypcyjnymi, sygnałami wewnętrznymi i mikrośrodowiskiem3,4,5. Właściwa kontrola funkcji i jakości mitochondriów ma zatem kluczowe znaczenie dla utrzymania HSC6,7.

Potencjał błony mitochondrialnej (ΔΨm) jest kluczowym parametrem w ocenie mitochondriów, ponieważ bezpośrednio odzwierciedla ich funkcjonalność, która wynika z równowagi aktywności pompowania protonów w łańcuchu transportu elektronów i przepływu protonów przez syntazę F1/F O ATP. Oba te czynniki są wymagane (w zależności od ekspresji genów i dostępności substratu) do zależnej od tlenu fosforylacji ADP do ATP8,9. Wykorzystując elektroujemność przedziału mitochondrialnego, opracowano różne barwniki potencjometryczne do pomiaru ΔΨm. Jednym z nich jest nadchloran estru metylowego tetrametylorodaminy (TMRM), który jest szeroko stosowany do pomiaru ΔΨm za pomocą cytometrii przepływowej w różnych komórkach10, w tym w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych11.  

Barwniki mitochondrialne muszą być jednak używane z pewną ostrożnością w HSC, ponieważ wysoka aktywność ksenobiotycznych pomp wypływowych tych komórek może spowodować wytłaczanie barwnika12. Rzeczywiście, ekstruzja barwników mitochondrialnych, takich jak Rhodamine 123, pozwoliła naukowcom wyizolować HSCs13 lub zidentyfikować "populacje boczne" HSC, wykorzystując różnicową ekstruzję barwników Hoechst Blue i Hoechst Red14,15. Wykazano również, że Fumitremorgina C, specyficzny bloker transportera podrodziny G członka 2 (ABCG2) wiążącej ATP, nie wpływa na wzór barwienia MitoTracker w HSPCs16. Po opublikowaniu tych wyników przeprowadzono wiele badań z użyciem barwników mitochondrialnych przy braku ksenobiotycznych inhibitorów pompy wypływowej, co doprowadziło do powszechnego wrażenia, że HSC mają tylko niewielką liczbę mitochondriów o niskim ΔΨm16,17,18.

Ostatnio wykazano jednak, że Verapamil, inhibitor pomp wypływowych o szerokim spektrum działania, znacząco modyfikuje wzór barwienia barwnika mitochondrialnego MitoTracker Green19. Ta rozbieżność jest prawdopodobnie spowodowana faktem, że Fumitremorgina C jest wysoce selektywna dla Abcg2, podczas gdy HSC wyrażają również inne transportery, takie jak Abcb1a (który jest tylko słabo wrażliwy na Fumitremorginę C)19. Informowaliśmy również, że inne barwniki mitochondrialne, takie jak TMRM, oranż nonylowo-akrydynowy i Mitotracker Orange (MTO) wykazują takie same wzorce jak Mitotracker Green. Co ważniejsze, zaobserwowaliśmy, że wzorce cytometrii przepływowej HSPC odzwierciedlają ich ΔΨm oprócz masy mitochondrialnej11.

Spożycie barwnika TMRM ściśle zależy od ujemnego ładunku mitochondriów, ale wynikowa akumulacja barwnika jest w stałej równowadze między jego pobraniem a klirensem przez pompy wypływu20. Różnica w ekspresji ksenobiotycznej pompy wypływowej między HSC a populacjami dojrzałych komórek wpływa na tę równowagę i może prowadzić do stronniczych wyników. Stosowanie dedykowanych inhibitorów, takich jak Werapamil, powinno być brane pod uwagę w analizie ΔΨm za pomocą barwników potencjometrycznych. W tym miejscu opisujemy zmodyfikowany protokół dokładnego pomiaru ΔΨm za pomocą cytometrii przepływowej opartej na TMRM, która koryguje aktywność transportera ksenobiotyków poprzez zastosowanie dedykowanych inhibitorów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Albert Einstein College of Medicine.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Bufor barwiący (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 2% płodowa surowica bydlęca (FBS)): Dodać 10 ml FBS do 500 ml sterylnego roztworu PBS.
    nuta: Roztwór ten może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez co najmniej jeden miesiąc w sterylnym stanie. Przed przystąpieniem do poniższych procedur należy umieścić podwielokrotność tego roztworu (50 ml) na lodzie.
  2. Bufor do lizacji ACK (chlorek amonu i potasu): Przed rozpoczęciem procedury umieścić podwielokrotność buforu lizującego ACK (1 ml) na lodzie.
    nuta: Aby przygotować ten sam bufor niedostępny w handlu, rozpuść 8,02 g NH4Cl, 1 gKHCO3 i 37,2 mg Na2EDTA w 1 l H2O. Dostosuj pH do 7,2-7,4. Przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze pokojowej.
  3. Pożywka hodowlana: Dodać 50 ng/ml czynnika komórek macierzystych (SCF) i 50 ng/ml trombopoetyny (TPO) do pożywki wolnej od surowicy w celu hodowli i namnażania komórek krwiotwórczych (zalecana jest patrz tabela materiałów dla pożywki komercyjnej).
  4. Roztwór podstawowy TMRM: Przygotować roztwór TMRM (1 μM), rozpuszczając 5 μg proszku TMRM w 10 ml etanolu. Roztwór należy przechowywać w temperaturze -20 °C, chroniąc przed światłem.
  5. Roztwór podstawowy werapamilu: Przygotować roztwór werapamilu (50 mM), rozcieńczając 24 mg werapamilu w 1 ml etanolu. Przechowywać ten roztwór w temperaturze -20 °C.
  6. Roztwór podstawowy FCCP: Przygotować roztwór p-triflouromethoxyfenylhydrazonu karbonilocyjanku (FCCP) (1 M), rozpuszczając 254 mg w 1 ml etanolu. Roztwór należy przechowywać w temperaturze -20 °C, chroniąc przed światłem.

2. Izolacja szpiku kostnego

  1. Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i spryskaj myszy 70% etanolem.
    nuta: Ten etap zapobiega zanieczyszczeniu komórek będących przedmiotem zainteresowania bez uszczerbku dla wyników eksperymentalnych.
  2. Za pomocą kleszczy i ostrych nożyczek wykonaj małe nacięcie w brzusznej skórze myszy i rozciągnij skórę.
  3. Wyciągnij kość udową i piszczelową, uważając, aby nie przesunąć głów kości udowej, ponieważ zawierają one dużą ilość komórek szpiku kostnego. Umieść usunięte kości na 6-dołkowej płytce wypełnionej 1,5 ml buforu barwiącego.
    nuta: Ta procedura nie wymaga sterylnego obszaru.
  4. Usuń mięśnie z kości i odetnij końce kości, umożliwiając wyjście szpiku kostnego (Rysunek 1A). Umieść oczyszczone kości w nowych studzienkach z 1,5 ml buforu barwiącego.
    nuta: Mięśnie i inne tkanki należy ostrożnie usunąć, aby uniknąć zatkania strzykawki w następnym kroku.
  5. Wypłukać szpik kostny za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml z igłą 25 G.
    nuta: Kontynuuj płukanie szpiku kostnego, aż kość stanie się biała (Rysunek 1B).
  6. Zebrać wszystkie komórki do probówki o pojemności 1,5 ml, odwirować przez 5 minut przy 180 x g, a następnie wyrzucić supernatant (Rysunek 1C).
  7. Ponownie zawiesić osad w 300 μl lodowatego buforu lizującego ACK bardzo ostrożnie, umieścić na lodzie na 1 minutę i natychmiast nieaktywną lizę, dodając 1 ml buforu barwiącego. Wirować przez 5 minut przy 180 x g.
    nuta: Kulka komórek wydaje się biała (Rysunek 1D). Całkowita liczba izolowanych komórek wynosi około 2-4 x 107.
  8. Ponownie zawiesić granulki w 1 ml buforu barwiącego i przefiltrować za pomocą nasadki sitka (12 x 75 mm2, 5 ml pojemności) z wbudowaną siatką nylonową o grubości 35 μm w celu uzyskania komórek jednojądrzastych. Po zablokowaniu należy utrzymać próbkę na lodzie.

3. Barwienie immunologiczne do wykrywania HSC

  1. Przygotuj koktajl Lineage (Lin). Do 400 μl buforu barwiącego dodać 4 μl następujących biotynilowanych przeciwciał przeciwko CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk1.1, IgM i Il7Ra, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:100.
  2. Przygotuj przeciwciała sprzężone z fluoroforami (Abs). Do 400 μl buforu barwiącego dodać 4 μl następujących Abs, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:100. Streptawidyna-Błękit pacyficzny, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy5.5 i CD34-FITC. Przechowywać w lodowi, chronić przed światłem.
  3. Odwirować próbkę przez 5 minut przy sile 180 x g, a następnie odrzucić supernatant.
  4. Dodaj 400 μl roztworu koktajlu Lin do osadu komórek. Szybko dodaj 4 μl biotynilizowanego Ab. Vortex do mieszania i inkubacji przez 30 minut w lodzie.
  5. Przemyć próbkę, dodając 3 ml buforu barwiącego, odwirowywać przez 5 minut w temperaturze 180 x g i odrzucić sklarowany osad.
  6. Dodać 400 μl roztworu Abs. Szybko wirować, aby wymieszać i inkubować przez 30 minut na lodzie.
  7. Przemyć próbki 3 ml buforu barwiącego, wirować przez 5 minut w temperaturze 180 x g i odrzucić supernatant.

4. Barwienie TMRM

  1. Przygotuj roztwór barwiący TMRM. Dodać 2,2 μl roztworu podstawowego TMRM i 1,1 μl Werapamilu (odpowiednio 2 nM i 50 μM jako stężenie końcowe) do 1,1 ml pożywki wolnej od surowicy do hodowli i ekspansji komórek krwiotwórczych (zalecana jest tabela materiałów dla pożywki handlowej) z TPO i SCF.
    nuta: Jest to najważniejszy krok protokołu. Dodatek werapamilu jest konieczny do zablokowania pomp wypływowych, które są silnie eksprymowane w HSC i mogą wytłaczać TMRM.
  2. Zawiesić szpik kostny w 1 ml roztworu barwiącego TMRM, szybko przetrząsnąć i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    nuta: Barwienia TMRM nie mogą być zmywane. Dedykowana dla PE kontrola kompensacyjna jest również ponownie zawieszana w 100 μl roztworu barwiącego TMRM i poddawana inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C po szybkim wirowaniu.
  3. Przefiltrować próbkę za pomocą nasadki z sitkiem (12 x 75 mm2, 5 ml pojemności) z wbudowaną siatką nylonową o grubości 35 μm, aby uniknąć zatkania cytometru przepływowego.
    nuta: Barwienie TMRM zwiększa możliwość tworzenia się zatkania w próbce. Zalecana jest filtracja próbki tuż przed testami przepływu.
  4. Dodać 1 μl 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI), aby wykluczyć martwe komórki za pomocą cytometrii przepływowej.

5. Akwizycja za pomocą cytometru przepływowego

  1. Uruchom próbkę szpiku kostnego i uzyskaj co najmniej 1 x 106 zdarzeń.
  2. Ustaw strategię bramkowania, aby zidentyfikować różne populacje krwiotwórcze (Rysunek 2).
    1. Wyświetlić żywe komórki jednojądrzaste szpiku kostnego (BM-MNC), frakcja DAPI−, na wykresie dla Pacific Blue w celu identyfikacji frakcji CD135−Lin− (Lin−) i Lin+.
    2. Wykreśl frakcję Lin− dla APC/Cy7 (c-kit) w porównaniu z PE/Cy7 (Sca-1), aby zidentyfikować frakcję multipotencjalnych progenitorów (MPP), jako c-kit+ i Sca-1+.
    3. Wykreśl frakcję MPP dla APC (CD48) w porównaniu z PerCP/Cy5.5 (CD150), aby zidentyfikować frakcję HSC, jako CD150+ i CD48−.
    4. Wyświetl frakcję HSC dla FITC (CD34), aby podzielić CD34−-HSC i CD34+-HSC.
  3. Uzyskaj intensywność TMRM (kanał PE) w każdej populacji.
  4. Po pobraniu dodać do próbki 1 μl FCCP w celu uzyskania końcowego stężenia 1 mM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, a następnie uzyskać 1 x 10 6 zdarzeń.
    nuta: FCCP to rozprzęgacz mitochondrialny, który służy do rozpraszania ΔΨm. Jest stosowany jako kontrola eksperymentalna w celu potwierdzenia, że barwienie TMRM działa prawidłowo. Po podaniu FCCP intensywność TMRM powinna zostać drastycznie zmniejszona (Rysunek 3A).
  5. Przeanalizuj dane normalizujące średnią intensywność PE w każdej populacji przez intensywność PE wszystkich BM-MNC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany powyżej umożliwia łatwe odizolowanie BM-MNC od modelu myszy. Rysunek 1 podsumowuje główne etapy protokołu: izolację kości, wypłukanie szpiku kostnego, lizę czerwonych krwinek i barwienie przeciwciał, a następnie barwienie TMRM w celu zmierzenia potencjału błony mitochondrialnej w określonej populacji krwiotwórczej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar potencjału błony mitochondrialnej jest podstawą analizy i oceny mitochondriów, które mają kluczowe znaczenie dla stanu metabolicznego komórki. W tym miejscu opisujemy protokół analizy ΔΨm za pomocą barwienia TMRM. TMRM jest barwnikiem fluorescencyjnym przenikającym komórkę, który gromadzi się w aktywnych mitochondriach dzięki ΔΨm, a jego odpowiednie poziomy pozostają w równowadze między przedziałami zewnątrzkomórkowymi, cytoplazmatycznymi i mitochondrialnymi10. Protokół ten można dostosować...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują wszystkim członkom laboratorium Ito, szczególnie K. Ito i H. Sato, a także Einstein Stem Cell Institute za komentarze, a także Einstein Flow Cytometry and Analytical Imaging (finansowane przez National Cancer Institute grant P30 CA013330) za pomoc w przeprowadzaniu eksperymentów. K.I. jest wspierany przez granty z National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 i R01DK100689) oraz Departament Zdrowia Stanu Nowy Jork jako główny dyrektor Einstein Single-Cell Genomics/Epigenomics (C029154). K.I. Ito jest pracownikiem naukowym Towarzystwa Białaczki i Chłoniaka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor lizujący ACKLife TechnologiesA1049201
B220-biotynaBD Bioscience553086
CD3e-biotynaLife Technologies13-0031-85
CD4-biotynaFischer ScientificBDB553782
CD8-biotynaTechnologies13-0081-85
CD11b-biotynaBD Bioscience553309
CD19-biotynaBD Bioscience553784
CD34-FITCeBioscience11-0341-85
CD48-APCeBioscience17-0481-82
CD135-biotynaeBioscience13-1351-82
CD150-PerCP/Cy5.5 Biolegend115922
c-kit-APC/Cy7Biolegend105826
Cyklosporyna HMilipore SigmaSML1575-1 MG
roztwór DAPI (1 mg / ml)Life Technologies62248
Surowica bydlęca płodu (FBS)DenvilleFB5001-H
FCCP Millipore SigmaC2920-10MG
Gr1-biotynaBiolegend108404
IgM-biotynaLife Technologies13-5790-85
Il7R&alfa;-biotynaeBioscience13-1271-85
Nk1.1-biotynaFischer ScientificBDB553163
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Life Technologies10010023
Sca-1-PE/Cy7eBioscience25-5981-81
SCF mysiPEPROTECH250-03-10UG
StemSpan SFEM mediumSTEMCELL technologies9605
Streptawidyna-Pacific BlueeBioscience48-4317-82
Ter119-biotynaFischer ScientificBDB553672
TMRMMillipore SigmaT5428-25MG
TPOPEPROTECH315-14-10UG
Chlorowodorek werapamiluMillipore SigmaV4629-1G
Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
  2. Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
  3. Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
  4. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  5. Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
  6. Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
  7. Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
  8. Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
  9. Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
  10. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
  11. Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
  12. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
  13. Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
  14. Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
  15. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
  16. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
  17. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125(2016).
  18. Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
  19. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  20. Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
  21. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  22. Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
  23. Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytometria przep ywowahematopoieticyczne kom rki macierzystehamowanie pomp efleksowychbarwienie TMRMizolacja szpiku kostnegotraktowanie werapamilemdepolaryzacja FCCPmarkery powierzchniowe kom rekanaliza cytometrii przep ywowej

Powiązane artykuły