Artykuł metodologiczny

Celowane blokowanie przeciwciał przez dwufunkcyjny koniugat peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF)

DOI:

10.3791/60063

⸱

17 września 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake University, 2Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 3MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowanie dwufunkcyjnego koniugatu peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF) jest nowatorskie dla eliminacji szkodliwych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół syntezy cząsteczki DCAF1, która może selektywnie blokować przeciwciało 4G2 w celu wyeliminowania efektu wzmocnienia zależnego od przeciwciał podczas infekcji wirusem dengi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eliminacja szkodliwych przeciwciał z organizmów jest cennym podejściem do interwencji chorób związanych z przeciwciałami, takich jak denga, gorączka krwotoczna i choroby autoimmunologiczne. Ponieważ we krwi krążą tysiące przeciwciał o różnych epitopach, nie zgłoszono żadnej uniwersalnej metody, z wyjątkiem dwufunkcyjnego koniugatu peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF), która byłaby ukierunkowana na określone szkodliwe przeciwciała. Opracowanie cząsteczek DCAF w znacznym stopniu przyczynia się do postępu terapii celowanej, w której, jak wykazano, eliminują efekt wzmocnienia zależnego od przeciwciał (ADE) w modelu zakażenia wirusem dengi (DENV) oraz zwiększają aktywność receptora acetylocholiny w modelu miastenii. W tym miejscu opisujemy protokół syntezy cząsteczki DCAF (DCAF1), która może selektywnie blokować przeciwciało 4G2 w celu osłabienia efektu ADE podczas infekcji wirusem dengi i ilustrujemy wiązanie przeciwciała DCAF1 z 4G2 za pomocą testu ELISA. W naszej metodzie DCAF1 jest syntetyzowany przez koniugację pochodnej hydrazyny peptydu Fc-III i rekombinantu wyrażanego przez długą α-helisę z sekwencją antygenową poprzez natywną ligację chemiczną (NCL). Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do DCAF1, a także innych cząsteczek DCAF w celu ukierunkowania na pokrewne przeciwciała.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeciwciała odgrywają ważną rolę w humoralnej odpowiedzi immunologicznej na neutralizację chorobotwórczych bakterii i wirusów1. Jednak niektóre przeciwciała wykazują szkodliwy wpływ na organizmy, takie jak przeciwciała reagujące krzyżowo w efekcie ADE podczas infekcji DENV i nadmiernie reaktywne przeciwciała w miastenii, która jest chorobą autoimmunologiczną2,3. Efekt ADE jest pośredniczony przez przeciwciała reagujące krzyżowo, które tworzą most łączący komórki prezentujące receptor DENV i Fc4,5, podczas gdy miastenia jest spowodowana nadmiarem przeciwciał, które atakują receptory acetylocholiny między połączeniami komórka-komórka w tkance mięśniowej6,7. Chociaż opracowano częściowo skuteczne metody leczenia tych chorób8,9, bez wątpienia bezpośrednia eliminacja tych szkodliwych przeciwciał przyczyniłaby się do postępu w interwencjach.

Ostatnio, cząsteczki DCAF, które mają podwójne grupy funkcyjne, zostały opracowane do celowanego blokowania przeciwciał10. DCAF to długi peptyd, który składa się z 3 części: 1) części antygenu, która może specyficznie rozpoznać pokrewne przeciwciało, 2) znacznika Fc-III lub Fc-III-4C do silnego wiązania się z regionem Fc przeciwciała w celu zahamowania receptora Fc lub białek składowych dopełniacza, 3) długiego α-helisowego łącznika, który sprzęga te dwie grupy funkcyjne10. Część łącznikowa, zaprojektowana z domeny Moesin FERM, została zoptymalizowana przez oprogramowanie Rosseta, aby zapewnić, że część antygenowa i część Fc-III w cząsteczce DCAF mogą jednocześnie wiązać się z regionami Fab i Fc IgG. Cztery cząsteczki DCAF zostały zsyntetyzowane w celu ukierunkowania na 4 różne przeciwciała, wśród których DCAF1 został użyty do wyeliminowania przeciwciała 4G2, które jest przeciwciałem reagującym krzyżowo podczas infekcji DENV, przyczyniając się do efektu ADE; a DACF4 został zaprojektowany do ratowania receptorów acetylocholiny poprzez blokowanie przeciwciała mab35 w miastenii gravis10.

W obecnym badaniu, biorąc za przykład DCAF1, pokazaliśmy protokoły syntezy cząsteczki DCAF i wykrywania interakcji między DCAF a pokrewnym przeciwciałem. DCAF1 jest częściowo syntetyzowany przez NCL approach11,12,13,14, który sprzęga ze sobą pochodną hydrazyny peptydu Fc-III i wyrażonymi częściami antygenu łącznikowego. Podejście NCL ma znaczące zalety w porównaniu z pełną syntezą chemiczną i w pełni rekombinowaną ekspresją syntezy DCAF1, ponieważ obie te metody prowadzą do niskiej wydajności i wysokich kosztów. Obecne podejście jest nie tylko najbardziej opłacalnym sposobem uzyskania pełnowymiarowego DCAF, ale także może utrzymać konformację części łącznika podobną do jej natywnej formy. Ponieważ różne cząsteczki DCAF mają podobne sekwencje, z wyjątkiem części antygenu, nasze metody syntezy DCAF1 i testu interakcji między przeciwciałami DCAF1 i 4G2 można zastosować do innych cząsteczek DCAF w celu celowanego zablokowania ich pokrewnych przeciwciał.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza chemiczna pochodnej hydrazyny peptydu Fc-III

  1. Konwersja żywicy 2-Cl-(Trt)-Cl na żywicę 2-Cl-(Trt)-NHNH2
    1. Odważyć 625 mg żywicy 2-Cl-(Trt)-Cl (0,25 mmol) do naczynia do syntezy peptydów o pojemności 25 ml.
    2. Dodaj 5 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF) do żywicy od góry naczynia, załóż nakrętkę z powrotem, delikatnie potrząsaj naczyniem przez 15 sekund, a następnie odcedź je. Powtórz mycie DMF jeszcze dwa razy.
    3. Dodać 5 ml dichlorometanu (DCM) do naczynia, założyć nakrętkę z powrotem, delikatnie wstrząsać naczyniem przez 15 sekund, a następnie odcedzić. Powtórz mycie DCM jeszcze dwa razy.
    4. Powtórz krok 1.1.2 trzy razy.
    5. Użyj 6 ml 50% (vol/vol) DMF/DCM, aby spęcznić żywicę przez 30 minut, a następnie odcedź ją.
    6. Przenieść 6 ml 5% (vol/vol) NH2NH2 w DMF do naczynia reakcyjnego, wstrząsnąć mieszaniną z prędkością 120 obr./min, 30 °C przez 30 min, a następnie spuścić roztwór za pomocą pompy próżniowej.
      UWAGA: Dodaj 0,3 ml hydratu hydrazyny do 5,7 ml DMF, aby uzyskać 5% (obj. / obj.) NH2NH2. Świeżo przygotować NH2NH2 przed użyciem.
      UWAGA: Hydrat hydrazyny jest substancją niebezpieczną i może powodować raka. Załóż fartuch laboratoryjny, rękawice i maskę. Wykonaj eksperymenty w dygestorium.
    7. Dodaj 5 ml DMF do naczynia, delikatnie potrząsaj nim przez 15 sekund, a następnie odcedź .
    8. Powtórz krok 1.1.6, a następnie umyj żywicę, powtarzając kroki 1.1.2-1.1.4 dwa razy.
    9. Dodać 6 ml 5% (obj./obj.) MeOH/DMF do naczynia, delikatnie wstrząsnąć przez 10 minut, a następnie odcedzić.
      UWAGA: Ten krok jest bardzo ważny, aby upewnić się, że nieprzereagowane miejsca na żywicy są zakryte.
    10. Dokładnie umyj żywicę, powtarzając kroki 1.1.2-1.1.4.
    11. Dodaj 5 ml DCM do żywicy, potrząsaj nią delikatnie przez 15 s, a następnie odcedź do uzyskania żywicy 2-Cl-(Trt)-NHNH2.
      UWAGA: Żywica zmienia kolor na żółty lub jasnozielony, gdy zamiana się powiedzie.
  2. Wydłużenie peptydów
    1. Dodać 1 mmol Fmoc-Ala-OH (934 mg) i 0,95 mmol 1-[bis(dimetyloamino)metyleno]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b] tlenku 3-tlenku heksafluorofosforanu pirydyny (HATU) (360 mg) do probówki o pojemności 5 ml zawierającej 3 ml DMF.
      UWAGA: Narażenie na HATU może wywołać reakcję alergiczną. Załóż fartuch laboratoryjny, rękawice i maskę.
    2. Dodać 2 mmol N,N-diizopropyloetyloaminy (DIEA) (0,36 ml) do rozpuszczonego roztworu i wirować przez 0,5–1 min.
      UWAGA: Krok krytyczny: Aktywacja nie powinna zająć więcej niż 5 minut, ponieważ aktywowane aminokwasy z czasem izomeryzują z bardziej aktywnych form O do mniej aktywnych form N.
    3. Dodać aktywowany Fmoc-Ala-OH do naczynia reakcyjnego zawierającego żywicę 2-Cl-(Trt)-NHNH2, przygotowaną z kroku 1.1. Delikatnie wstrząsać przy 120 obr./min, 30 °C przez 20 minut w wytrząsarce o stałej temperaturze, a następnie spuścić roztwór za pomocą pompy próżniowej.
    4. Dodaj 5 ml DMF, aby umyć żywicę, delikatnie potrząsaj nią przez 15 s, a następnie odcedz
      5. .
    5. Dodać 1 mmol Fmoc-Ala-OH (934 mg) i 0,95 mmol 2-(6-chloro-1H-benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloamoniowego heksafluorofosforanu (HCTU) (390 mg) do probówki o pojemności 5 ml zawierającej 3 ml DMF.
      UWAGA: Narażenie na HCTU może wywołać reakcję alergiczną. Załóż fartuch laboratoryjny, rękawice i maskę.
    6. Dodaj 2 mmol DIEA (0,36 ml) do probówki i wiruj przez 0,5-1 minutę, aby ją rozpuścić.
    7. Dodać aktywowany Fmoc-Ala-OH do naczynia reakcyjnego. Delikatnie wstrząsać przy 120 obr./min, 30 °C przez 40-60 minut w wytrząsarce o stałej temperaturze, a następnie spuścić roztwór za pomocą pompy próżniowej.
    8. Umyj żywicę, powtarzając kroki 1.1.2-1.1.4.
    9. Dodać 4 ml 20% (obj./obj.) piperydyny w DMF do żywicy, delikatnie wstrząsać przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie spuścić roztwór.
      UWAGA: Pirydyna jest wysoce łatwopalna i toksyczna. Wykonaj eksperymenty w dygestorium.
    10. Dodaj kolejne 4 ml 20% (obj./obj.) piperydyny w DMF do żywicy, delikatnie potrząsaj nią przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie spuść roztwór.
    11. Wykonaj kroki 1.2.1-1.2.10, aby połączyć i zdeprotect Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-His-OH i Fmoc-Ala-OH. Powtórz kroki 1.2.5-1.2.10, aby sprzęgnąć i odbezpieczyć Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gly-OH i Fmoc-Asp-OH.
    12. Powtórz kroki 1.1.2-1.1.4, aby dokładnie umyć żywicę.
    13. Powtórz krok 1.1.3, aby umyć żywicę, a następnie wysuszyć żywicę próżniowo przez 5 minut.
  3. Rozszczepienie surowego peptydu Fc-III pochodzącego z hydrazyny
    1. Dodać 12 ml koktajlu kwasu trifluorooctowego (TFA)/2,2′-(etylenodioksy)dihanetiolu (DODT)/triizopropylosilanu (TIPS)/H2O(92,5/2,5/2,5/2,5) do żywicy, a następnie użyć wytrząsarki o stałej temperaturze do oddzielenia peptydu od żywicy przy 200 obr./min, 37 °C około 2 godzin. Przefiltrować mieszaninę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    2. Dodaj 1 ml koktajlu do żywicy, aby ją umyć i zebrać filtrat do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Powtórz dwa razy.
    3. Zagęścić mieszaninę do 2 ml za pomocą wirnika parownika w dygestorium, a następnie dodać 20 ml wstępnie schłodzonego eteru dietylowego do probówki, aby wytrącić surowe peptydy.
      UWAGA: Bezwodny eter należy wstępnie schłodzić do 0 °C, aby uniknąć gwałtownego wydzielania ciepła, które może powodować reakcje uboczne surowego peptydu.
    4. Inkubować wytrącanie peptydu w temperaturze -20 °C przez 1-2 godziny.
    5. Wirować w temperaturze 5 000 x g, 4 °C przez 10 minut i ostrożnie usunąć rozpuszczalnik z probówki wirówkowej.
    6. Dodać 20 ml wstępnie schłodzonego eteru dietylowego do probówki dwa razy zgodnie z krokami 1.3.3-1.3.5 w celu przepłukania osadu. Wysuszyć produkt peptydowy na powietrzu w szkiełku zegarkowym przez około 15 minut. Przechowywać wysuszone surowe peptydy w temperaturze 4 °C do dalszej analizy.
  4. Oczyszczanie pochodnej hydrazyny peptydu Fc-III
    1. Użyć systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) do oczyszczenia peptydu przez 30-minutową elucję gradientową (0-1 min, 5% B; 1-20 min, 50% B; 20-25 min, 85% B; 25-30 min, 85% B) przy natężeniu przepływu 1 ml/min.
      UWAGA: Kolumna ma średnicę wewnętrzną 4,6 mm, długość 250 mm, wypełniona żywicą C-18. Faza ruchoma A składała się z 0,1% TFA w wodzie, a faza ruchoma B składała się ze 100% acetonitrylu i 0,1% TFA.

2. Ekspresja białek i oczyszczanie części łącznika i antygenu

  1. Budowa plazmidu
    1. Zsyntetyzuj całą sekwencję genu, która może wyrażać antygen SUMO-linker (patrz tabela materiałów).
    2. Wyciąć 10 ng pustego wektora PET-28a i 50 ng zsyntetyzowanego fragmentu DNA antygenu SUMO-linker-antigen za pomocą NcoI i XhoI w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
    3. Oczyść podwójnie strawiony wektor i fragment DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA.
    4. Dodać 5 μl fragmentu DNA strawionego DNA, 5 μl strawionego wektora, 1 μl ligazy DNA T4, 2 μl 10x buforu ligazy i 7 μl ddH2O do probówki reakcyjnej, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 16 °C.
    5. Zmieszać 10 μl produktu ligacji z kroku 2.1.4 ze 100 μl kompetentnych komórek (DH5α) i umieścić w łaźni lodowej na 30 minut. Umieścić właściwe komórki w łaźni wodnej o temperaturze 42°C na 90 s i szybko przenieść do łaźni lodowej na 2 minuty. Dodać 800 ml płynnej pożywki LB (bez antybiotyków) do probówki i wstrząsnąć w temperaturze 37 °C, 180 obr./min przez 1 godzinę. Pokryć właściwe komórki na płytce Kanamycyny LB, aby były równomiernie rozłożone, i umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na noc.
    6. Pobrać 5 pojedynczych kolonii z płytki i wyhodować bakterie w 5 ml pożywki LB w probówce za pomocą wytrząsarki o temperaturze 37 °C.
    7. Ekstrahować plazmidy z bakterii zebranych w kroku 2.1.6 za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu.
    8. Wyślij plazmidy do sekwencjonowania genów i wybierz dodatnią kolonię, która może wyrażać białko fuzyjne SUMO-linker-antygen. Przekształć dodatni plazmid w kompetentne komórki BL21(DE3)plysS zgodnie z krokiem 2.1.5.
  2. Oczyszczanie białek
    1. Wybrać pojedynczą kolonię transformantów z kroku 2.1.7 do 5 ml płynnego podłoża LB zawierającego kanamycynę (50 μg/ml). Wstrząsać kulturami przez noc przy 200 obr./min, 37 °C.
    2. Zaszczepić 1 l wstępnie podgrzanej pożywki LB zawierającej kanamycynę (50 μg/ml) w kolbie z 5 ml nocnych kultur i rosnąć w temperaturze 37 °C z energicznym wstrząsaniem, aż OD600 wyniesie 0,6.
    3. Dodać β-D-tiogalaktozyd izopropylu (IPTG) do podłoża do końcowego stężenia 0,4 mM i wstrząsnąć kolbą z prędkością 200 obr./min przez noc w temperaturze 20 °C.
      UWAGA: Niska temperatura do indukcji białek jest ważna, aby uniknąć tworzenia się ciał inkluzyjnych, więc upewnij się, że temperatura nie przekracza 22 °C.
    4. Po zebraniu komórek dodaj 50 ml buforu do lizy do granulek komórek, aby ponownie zawiesić komórki. Sonikować komórki dwukrotnie przez 5 minut przy 200 W, ultradźwięki 3 s, odstęp 3 s na lodzie. Odwirować w temperaturze 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania supernatantów.
      UWAGA: Bufor do lizy składa się z 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu. Dostosuj wartość pH do 8,0 za pomocą NaOH.
    5. Dodać 2 ml 50% seforazy Ni-NTA, zrównoważonej buforem do lizy, do oczyszczonych supernatantów i delikatnie wymieszać przez wytrząsanie (200 obr./min na wytrząsarce obrotowej) w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    6. Załaduj mieszaninę lizatu i Ni-NTA do kolumny z zaślepionym dolnym wylotem, zdejmij dolną nasadkę i wyrzuć przepływ kolumny.
    7. Przemyć trzykrotnie 6 ml buforu do przemywania wodą, a następnie 3 razy wymyć docelowe białko za pomocą 1,5 ml buforu elucyjnego. Zebrać eluat w jednej probówce.
      UWAGA: Bufor płuczący składa się z 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 30 mM imidazolu. Dostosuj wartość pH do 8,0 za pomocą NaOH. Bufor elucyjny składa się z 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolu. Dostosuj wartość pH do 8,0 za pomocą NaOH.
    8. Umieścić eluat w worku dializacyjnym w 1 litrze 50 mM PBS w temperaturze 4 °C w celu odsolenia białka. Wymień nowy buforowany fosforanem sól fizjologiczną (PBS) 3 razy.
  3. Dekolt SUMO
    1. Dodać 2 ml białka znakowanego małym modyfikatorem ubikwityny (SUMO) o stężeniu 1 mg/ml, 1 ml proteazy SUMO (patrz tabela materiałów), 1 ml 10x buforu proteazy SUMO i 6 ml ddH2O w celu przygotowania roztworu reakcyjnego.
      UWAGA: Stężenie białka SUMO tag wynosi około 1 mg/mL. Nadmierne stężenia po trawieniu enzymatycznym mogą powodować krzepnięcie białka.
    2. Inkubować mieszaninę przez 12-16 godzin w temperaturze 4 °C.
    3. Odwirować mieszaninę o sile 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i wyrzucić kruszywa. Dodać 0,5 ml 50% zawiesiny Ni-NTA, zrównoważonej przez 50 mM PBS, do 10 ml oczyszczonych supernatantów i delikatnie wymieszać przez wytrząsanie (200 obr./min na wytrząsarce obrotowej) w temperaturze 4 °C przez 60 min.
    4. Załaduj mieszaninę lizatu i Ni-NTA do kolumny z zaślepionym dolnym wylotem. Zdejmij dolną nakrętkę, a następnie zachowaj przepływ w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Białko SUMO z histaggedią wiąże się na kolumnie. Część antygenu łącznikowego, która zaczyna się od Cys dla reakcji NCL, jest w przepływie.
    5. Odwirować przepływ o stężeniu 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i wyrzucić kruszywa. Oczyść część łącznika-antygen za pomocą HPLC przez 25-minutową elucję gradientową (0-1 min, 5% B; 1-3 min, 15% B; 3-20 min, 45% B; 20-21 min, 85% B; 21-25 min, 85% B) przy natężeniu przepływu 1 ml / min.
      UWAGA: Kolumna ma średnicę wewnętrzną 4,6 mm, długość 250 mm, wypełniona żywicą C-18. Faza ruchoma A składała się z 0,1% TFA w wodzie, a faza ruchoma B składała się ze 100% acetonitrylu i 0,1% TFA.
    6. Zebrać oczyszczony produkt z HPLC, a następnie liofilizować przez noc, aby uzyskać produkt antygenu łącznikowego.

3. Składanie DCAF1 przez natywną ligację chemiczną

  1. Sprzężenie ze sobą peptydu Fc-III i części antygenu łącznikowego
    1. Odważyć 1,8 mg (1 μmol) pochodnej hydrazyny peptydu Fc-III do probówki EP o pojemności 2 ml i dodać 0,8 ml 6 M GnHCl do 0,2 M NaH2PO4 (pH 3,0) roztworu, aby rozpuścić go przez wirowanie.
      UWAGA: 6 M GnHCl w 0,2 M NaH2PO4 (pH 3,0) roztwór przygotowuje się, dostosowując wartość pH za pomocą HCl lub NaOH.
      UWAGA: NaOH i HCl są silnie. Załóż fartuch laboratoryjny, rękawice i maskę.
    2. Po odwirowaniu probówki o sile 7 200 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, umieścić probówkę w kąpieli lodowo-solnej i delikatnie mieszać roztwór przez 15 minut za pomocą mieszania magnetycznego.
    3. Dodać 40 μl 0,5 MNaNO2 do roztworu, aby utlenić grupę hydrazynową. Delikatnie mieszaj roztwór przez kolejne 15 minut w kąpieli lodowo-solnej.
    4. Zważyć i dodać 11 mg oczyszczonej części antygenu łącznikowego przygotowanej z kroku 2.3 oraz 13,6 mg kwasu 4-merkaptofenylooctowego (MPAA) do probówki reakcyjnej w kąpieli lodowo-solnej, mieszać przez 5 minut, a następnie dostosować wartość pH do 6,8-7,0 w temperaturze pokojowej za pomocą 6 M NaOH,
      UWAGA: Dostosowanie wartości pH do neutralnej jest krytycznym krokiem do zainicjowania reakcji ligacji.
    5. Po 12 godzinach dodać 0,4 ml 0,1 M obojętnego roztworu chlorowodorku tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) (pH 7,0) do układu reakcyjnego i mieszać przez 20 minut w celu zakończenia reakcji.
      UWAGA: 0,1 M obojętny roztwór TCEP (pH 7,0) przygotowuje się przez rozpuszczenie TCEP w 6 M GnHCl w roztworze 0,2 M NaH2PO4 (pH 3,0) i użycie NaOH do dostosowania wartości pH do 7,0.
    6. Odwirować probówkę o sile 15 000 x g przez 10 minut, a następnie przeanalizować i oczyścić produkt ligacji za pomocą HPLC przez 26-minutową elucję gradientową (0-1 min, 5% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) przy natężeniu przepływu 1 ml/min. Oczekiwana wydajność reakcji podwiązania wynosi ponad 50%.
      UWAGA: Kolumna ma średnicę wewnętrzną 4,6 mm, długość 250 mm, wypełniona żywicą C-18. Faza ruchoma A składała się z 0,1% TFA w wodzie, a faza ruchoma B składała się ze 100% acetonitrylu i 0,1% TFA.
  2. Odsiarczanie sprzężonego
    1. Rozpuścić koniugat (3,4 mg, 0,3 μmol) przygotowany z etapu 3.1.6 w 50 μl 6 M GnHCl w roztworze 0,2 M NaH2PO4 (pH 7,0).
    2. Do powyższej mieszaniny dodać 50 μl 1 M TCEP, 10 μl tBuSH i 5 μl 0,1 M roztworu VA-044.
      UWAGA: 0,1 M roztwór VA-044 przygotowuje się przez rozpuszczenie 9,7 mg proszku VA-044 w 0,3 ml 6 M GnHCl w 0,2 M NaH2PO4 (pH 7,0) roztworze. Roztwór VA-044 należy przygotować świeżo przed użyciem, ponieważ VA-044 łatwo utlenia się pod wpływem powietrza.
    3. Doprowadzić końcowe pH roztworu do 6,9 i utrzymywać roztwór w temperaturze 37 °C z mieszaniem przez około 5 godzin.
    4. Odwirować probówkę o stężeniu 15 000 x g przez 10 minut i usunąć nierozpuszczalną substancję. Przeanalizować i oczyścić produkt ligacji za pomocą HPLC przez 26-minutową elucję gradientową (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) przy natężeniu przepływu 1 ml / min. Przewidywany uzysk w reakcji odsiarczania wynosi około 40%.
      UWAGA: Kolumna ma średnicę wewnętrzną 4,6 mm, długość 250 mm, wypełniona żywicą C-18. Faza ruchoma A składała się z 0,1% TFA w wodzie, a faza ruchoma B składała się ze 100% acetonitrylu i 0,1% TFA.
  3. Usunięcie Acm w celu uzyskania produktu końcowego DCAF1
    1. Rozpuścić peptyd (1,35 mg, 0,11 μmol) przygotowany z kroku 3.2.4 w 200 μl 32 mM AgOAc, a następnie mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
    2. Dodać 3 μl 1M Ditiotheitol (DTT) w 6 M GnHCl w 0,2 M NaH2PO4 (pH 7,0), aby przekształcić tiolany srebra na peptydzie w wolne tiole.
    3. Po gwałtownym mieszaniu przez 1 minutę, odwirować probówkę o stężeniu 15 000 x g przez 10 minut, aby usunąć nierozpuszczalną substancję. Analizować i oczyszczać produkt końcowy za pomocą HPLC przez 26-minutową elucję gradientową (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) przy natężeniu przepływu 1 ml / min. Oczekiwana wydajność reakcji deprotekcji Acm wynosi około 30%.
      UWAGA: Kolumna ma średnicę wewnętrzną 4,6 mm, długość 250 mm, wypełniona żywicą C-18. Faza ruchoma A składała się z 0,1% TFA w wodzie, a faza ruchoma B składała się ze 100% acetonitrylu i 0,1% TFA.
    4. Po oczyszczeniu metodą HPLC produkt końcowy należy liofilizować przez noc i rozpuścić proszek w PBS (50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8,0). Odwirować probówkę o stężeniu 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i wyrzucić osad.
    5. Dostosować stężenia produktu końcowego (od etapu 3.4) i części antygenu łącznikowego (od etapu 2.3.6) do 10 μM, zarejestrować widma dichroizmu kołowego (CD) od 260 do 195 nm tych dwóch produktów za pomocą spektrometru CD w temperaturze 25 °C przy długości drogi 1 mm.
      UWAGA: Widma CD służą do wykazania, że ilość struktury α spiralnej w produkcie końcowym jest tak samo podobna jak w strukturze wyrażonej w rekombinancie.

4. Wykrywanie produktów za pomocą spektrometrii mas

  1. Oddzielić produkt od każdej reakcji chemicznej przez 60-minutową elucję gradientową (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 30% B; 35-50 min, 50% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) przy natężeniu przepływu 0,300 μL/min za pomocą systemu nano-HPLC, który jest bezpośrednio połączony ze spektrometrem mas o wysokiej rozdzielczości.
    UWAGA: Kolumna analityczna ma średnicę wewnętrzną 75 μm, długość 150 mm, wypełniona żywicą C-18. Faza ruchoma A składała się z 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie, a faza ruchoma B składała się ze 100% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego.
  2. Uruchom spektrometr mas w trybie pełnego skanowania i ustaw zakres m/z na 300-2,000 i rozdzielczość na 60,000.
  3. Otwórz dane widm masowych i znajdź piki produktu na każdym etapie, aby potwierdzić, że reakcja chemiczna została pomyślnie uformowana.

5. Test ELISA interakcji między przeciwciałami DCAF1 i 4G2

  1. Pokryć 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania 1 przeciwciałem anty-GST (patrz tabela materiałów) w 100 μl buforu/basenika powlekającego, uszczelnić płytkę i inkubować ją w temperaturze 4 °C przez noc na wytrząsarce.
  2. Zatkać każdą studzienkę 200 μl 1% BSA w PBS, uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce.
  3. Umyj każdą studzienkę 4 razy, używając PBS z 0,05% Tween 20.
  4. Dodać białko antygenowe z fuzją GST (0,05 pmol w 100 μl roztworu blokującego) do studzienek, uszczelnić płytkę i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Białko antygenowe z fuzją GST ulega ekspresji w bakteriach i jest oczyszczane przez GSH Sepharose.
  5. Powtórz krok 5.3, aby umyć płytkę.
  6. Dodać 1 przeciwciało pmol 4G2 lub 1 przeciwciało pmol 4G2 plus pozostałe ligandy: antygen, Fc-III lub DCAF1 w ilościach seryjnych (0,1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 100 pmol i 1000 pmol) w 100 μl roztworu/basenika blokującego, uszczelnić płytkę i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na shakerze.
  7. Powtórz krok 5.3, aby umyć płytkę.
  8. Dodać przeciwciało przeciw myszom IgG, przeciwciało sprzężone z HRP (rozcieńczenie 1:20 000) w 100 μl roztworu blokującego/dołka, uszczelnić płytkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
  9. Umyj każdą studzienkę 6 razy, używając PBS z 0,05% Tween 20.
  10. Bezpośrednio przed użyciem wymieszać odczynnik TMB A i B w stosunku objętościowym 1:1, dodać 100 μl/basenik, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  11. Dodać 100 μl/studzienkę roztworu zatrzymującego i użyć czytnika płytek, aby zmierzyć wartości OD450 dla każdej studzienki w ciągu 30 minut.

6. Test ELISA interakcji między cząsteczką Fc-III i IgG

  1. Pokryć 96-dołkową płytkę mikromiareczkową 1 przeciwciałem anty-CA (patrz tabela materiałów) w 100 μl buforu/basenika powlekającego, uszczelnić płytkę i inkubować ją w temperaturze 4 °C przez noc na wytrząsarce.
  2. Powtórz kroki od 5.2 do 5.3.
  3. Dodać Fc-III lub Fc-III-4C skondensowane białko CA (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 i 1 pmol w 100 μl roztworu blokującego) do studzienek, uszczelnić płytkę i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Skondensowane białko CA Fc-III lub Fc-III-4C ulega ekspresji w bakteriach i jest oczyszczane przez Ni-NTA.
  4. Powtórz kroki od 5.7 do 5.11 i sprawdź wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat blokowy dla ścieżki syntezy przez natywną ligację chemiczną w tym artykule jest pokazany w Rysunek 1. Rysunki 2-6 pokazują chromatogramy (A) i widma masowe (B) odpowiednio syntetyzowanej chemicznie pochodnej hydrazyny peptydu Fc-III, rekombinowanego łącznika i części antygenu, oczyszczonego produktu z reakcji NCL, oczyszczonego produktu z reakcji odsiarczania i oczyszczonego produktu końcowego DCAF1. Chromatogramy pokazują, że oczysz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół opisuje półsyntezę i wykrywanie DCAF1 przy użyciu podejścia NCL, które pokazano na rysunku 1. Krótko mówiąc, dwa fragmenty DCAF1 są odpowiednio syntetyzowane chemicznie i wyrażane rekombinacyjnie; następnie cząsteczka DCAF1 na całej długości jest składana, modyfikowana i oczyszczana. W przypadku syntezy fragmentów Fc-III pochodzących z hydrazyny dość ważne jest użycie żywicy 2-Cl o niskiej pojemności, ponieważ duża pojemność ma negatywny wpływ na wytwarzanie hydrazyny i pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Fundację Uniwersytetu Tsinghua-Gatesa (nie. OPP1021992), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 21502103, 21877068 i 041301475) oraz Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (nr 2017YFA0505103).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Żywica 2-chlorotrytylowaTianjin Nankai HECHENG S& T
1-[Bis(dimetyloamino)metyleno]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pirydyny heksafluorofosforan 3-tlenekGL Biochem00703
2-(6-chloro-1H-benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloaminoheksofluorofosforanGL Biochem00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-ylo)propan] dichlorowodorekJ& K Scientific503236
Przeciwciało 4G2ThermoMA5-24387
Kwas 4-merkaptenofeniooctowyAlfa AesarH27658
96-dołkowe płytki do mikromiareczkowaniaNEST701001
AcetonitrylThermo-FisherA955MS Grade
AgOAcSinopharm Odczynnik chemiczny30164324
przeciwciało anty-GSTAbclonalAE001
Anty-mysie IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężonych z HRP7076P2
BSABeijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spektrometrApplied Photophysics Ltd
Torba do dializySbjbioSBJ132636
DichlorometanOdczynnik chemiczny Sinopharm80047360
eter dietylowyOdczynnik chemiczny Sinopharm10009318
Zestaw do ekstrakcji żelu DNABeyotimeD0056
Spektrometr masowy Fusion LumosThermo
GSH SepharoseGE Lifesciences
Chlorowodorek guanidynyOdczynnikchemiczny Sinopharm
Hydrat hydrazynyOdczynnik chemiczny Sinopharm80070418
Kwas solnyOdczynnik chemiczny Sinopharm10011018
imidazolSIGMA12399-100G
Izopropyl β-D-tiogalaktozydSIGMA5502-5G
kanamycynaBeyotimeST101
MetanolThermo-FisherA456MS Grade
N, N-diizopropyloetyloaminaGL Biochem90600
N, N-dimetyloformamidSinopharm Odczynnik chemiczny8100771933
NcoIThermoER0571
PBS BuforSolarbioP1022
Peptyd BEH C18 Wody kolumnowe186003625
piperydynaOdczynnik chemiczny Sinopharm80104216
zestaw do ekstrakcji plazmidu ZestawSangon BiotechB611253-0002
QIAexpress QIAGEN32149
Zestaw do szybkiej ligacji DNABeyotimeD7002
Dihydrat diwodorofosforanu soduOdczynnik chemiczny Sinopharm20040718
Wodorotlenek soduSinopharm Odczynnik chemiczny10019762
Azotyn soduOdczynnik chemiczny Sinopharm10020018
sód  chlorekOdczynnik chemiczny Sinopharm10019318
Standard Aminokwasy chronione FmocGarnek sterylizacyjny GL Biochem
TomySX-700
SUMO ProteaseThermo Fisher12588018
roztwór zatrzymującyBiolegend423001
całą sekwencję genu, która może wyrażać antygen SUMO-linkerTaihe Biotechnology Compay
TMB odczynnikBiolegend421101
Kwas trifluorooctowySIGMAT6508
TriizopropylosilanGL Biochem91100
Chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosfinyAladdinT107252-5g
tryptonOXOIDLP0042
Tween 20SolarbioT8220
Ultimate 3000 HPLCTermiczna
pompa próżniowaYUHUASHZ-95B
XhoIThermoIVGN0086
ekstrakt drożdżowyOXOIDLP0021
30095516

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. Human Physiology (4th ed.). , Thomson Learning. (2003).
  2. Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
  3. Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
  4. Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
  5. Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
  6. Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259(2016).
  7. Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
  8. Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
  9. Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
  10. Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
  11. Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
  12. Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
  13. Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
  14. Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

natywna ligacja chemicznatest ELISAwirus denguemiastenia gravissynteza peptyd wspektrometria mas

Powiązane artykuły