Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60083

⸱

17 marca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jest poważnym powikłaniem po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. W niniejszym artykule opisano nowatorską platformę przeszczepu szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i efektowi przeszczep przeciwko białaczce.

Streszczenie

Allogeniczny przeszczep szpiku kostnego (BMT) jest skuteczną terapią nowotworów hematologicznych spowodowanych efektem przeszczep przeciwko białaczce (GVL) w celu wyeliminowania nowotworów. Jednak jego zastosowanie jest ograniczone przez rozwój choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD), która jest głównym powikłaniem BMT. GVHD jest wywoływana, gdy limfocyty T w przeszczepach dawcy rozpoznają alloantygen wyrażany przez komórki biorcy i przeprowadzają niepożądane ataki immunologiczne na zdrowe tkanki biorcy. Tak więc tradycyjne terapie mają na celu zahamowanie alloreaktywności limfocytów T dawcy. Jednak podejścia te znacznie osłabiają efekt GVL, tak że przeżycie biorcy nie ulega poprawie. Zrozumienie wpływu podejść terapeutycznych na BMT, GVL i GVHD jest zatem niezbędne. Ze względu na zdolność prezentacji antygenu i wydzielania cytokin do stymulacji limfocytów T dawcy, komórki dendrytyczne biorcy (DC) odgrywają znaczącą rolę w indukcji GVHD. W związku z tym określanie docelowe kontrolerów domeny adresatów staje się potencjalnym podejściem do kontrolowania GVHD. Praca ta zawiera opis nowatorskiej platformy BMT w celu zbadania, w jaki sposób DC gospodarza regulują odpowiedzi GVH i GVL po przeszczepie. Zaprezentowano również skuteczny model BMT do badania biologii GVHD i GVL po przeszczepie.

Wprowadzenie

Allogeniczne przeszczepienie krwiotwórczych komórek macierzystych (BMT) jest skuteczną terapią w leczeniu nowotworów hematologicznych1,2 poprzez efekt przeszczep kontra białaczka (GVL)3. Jednak limfocyty dawcy zawsze przeprowadzają niepożądane ataki immunologiczne na tkanki biorcy, w procesie zwanym chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD)4.

Mysie modele GVHD są skutecznym narzędziem do badania biologii GVHD i odpowiedzi GVL5. Myszy są opłacalnym modelem zwierzęcym do badań. Są one małe i skutecznie dozowane z cząsteczkami i lekami biologicznymi we wczesnych fazach rozwoju6. Myszy są idealnymi zwierzętami badawczymi do badań nad manipulacjami genetycznymi, ponieważ są genetycznie dobrze zdefiniowane, co jest idealne do badania szlaków i mechanizmów biologicznych6. Kilka mysich modeli GVHD z niedopasowanym MHC do głównych układów zgodności tkankowej (MHC) zostało dobrze ustalonych, takich jak C57BL/6 (H2b) do BALB/c (H2d) i FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7. Są to szczególnie cenne modele do określenia roli poszczególnych typów komórek, genów i czynników wpływających na GVHD. Przeszczepienie od dawców rodzicielskich C57/BL/6 (H2b) do biorców z mutacjami w MHC I (B6. C-H2bm1) i/lub MHC II (B6. C-H2bm12) ujawniły, że niezgodność zarówno w MHC klasy I, jak i klasy II jest ważnym wymogiem dla rozwoju ostrej GVHD. Sugeruje to, że zarówno limfocyty T CD4+, jak i CD8+ są niezbędne do rozwoju choroby7,8. GVHD jest również zaangażowana w kaskadę zapalną znaną jako "prozapalna burza cytokinowa"9. Najczęstszą metodą kondycjonowania w modelach mysich jest napromienianie całego ciała (TBI) za pomocą promieniowania rentgenowskiego lub 137Cs. Prowadzi to do ablacji szpiku kostnego biorcy, umożliwiając w ten sposób przeszczepienie komórek macierzystych dawcy i zapobiegając odrzuceniu przeszczepu. Odbywa się to poprzez ograniczenie proliferacji limfocytów T biorcy w odpowiedzi na komórki dawcy. Ponadto różnice genetyczne odgrywają ważną rolę w indukcji choroby, która zależy również od niewielkiego niedopasowania MHC10. Dlatego dawka promieniowania mieloablacyjnego różni się w różnych szczepach myszy (np. BALB/c→C57BL/6).

Aktywacja limfocytów T dawcy przez komórki prezentujące antygen gospodarza (APC) jest niezbędna do rozwoju GVHD. Wśród APC najsilniejsze są komórki dendrytyczne (DC). Są dziedzicznie zdolne do indukowania GVHD ze względu na ich lepszy wychwyt antygenu, ekspresję cząsteczek kostymulujących limfocyty T i produkcję cytokin prozapalnych, które polaryzują limfocyty T w podzbiory patogenne. Centra biorców mają kluczowe znaczenie dla ułatwienia primingu limfocytów T i indukcji GVHD po przeszczepie11,12. W związku z tym DC stały się interesującymi celami w leczeniu GVHD12.

TBI jest wymagane do wzmocnienia wszczepienia komórek dawcy. Ze względu na efekt TBI, biorcy DC są aktywowani i przeżywają przez krótki czas po przeszczepie12. Pomimo znacznych postępów w wykorzystaniu bioluminescencji lub fluorescencji, ustanowienie skutecznego modelu do badania roli biorców DC w GVHD jest nadal wyzwaniem.

Ponieważ limfocyty T dawcy są siłą napędową aktywności GVL, strategie leczenia za pomocą leków immunosupresyjnych, takich jak sterydy, w celu stłumienia alloreaktywności limfocytów T, często powodują nawrót nowotworu lub infekcję13. W związku z tym ukierunkowanie na biorców DC może stanowić alternatywne podejście do leczenia GVHD przy jednoczesnym zachowaniu efektu GVL i uniknięciu infekcji.

W skrócie, obecne badanie dostarcza platformy do zrozumienia, w jaki sposób różne rodzaje sygnalizacji w DC biorców regulują rozwój GVHD i efekt GVL po BMT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Centralnej Florydy.

1. Indukcja GVHD

UWAGA: Allogeniczny przeszczep komórek szpiku kostnego (BM) (krok 1.2) jest wykonywany w ciągu 24 godzin po napromieniowaniu. Wszystkie opisane poniżej zabiegi wykonywane są w sterylnym środowisku. Wykonaj zabieg w kapturze do hodowli tkankowej i użyj przefiltrowanych odczynników.

  1. Dzień 0: Przygotuj myszy biorców.
    1. Jako biorców należy użyć samic myszy typu dzikiego (WT) na tle BALB/c (CD45.2+ H2kd+), w wieku 10-12 tygodni.
    2. Załóż kolczyk na uszy i zważ biorców przed TBI. Następnie umieść do 11 myszy w komorze naświetlającej i trzymaj ją w promienniku. Naświetlać pojedynczą dawką 700 cGy przez 10-15 min.
    3. Przed przeszczepem należy zwrócić napromieniowane zwierzęta do klatek i umieścić je w pomieszczeniach wolnych od patogenów.
      UWAGA: Minimalna masa ciała biorców powinna wynosić około 20 g. Użyj tej masy jako odniesienia do obliczenia utraty masy ciała w okresie eksperymentalnym.
  2. Dzień 1: Przygotuj szpik kostny zubożony w limfocyty T (TCD-BM) od myszy dawców.
    1. Poddaj eutanazji myszy CD45.1 / Ly5.1 C57BL / 6 przez uduszenie CO2 i poczekaj 2-3 minuty, aż stracą przytomność. W razie potrzeby należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy jako wtórną eutanazję.
    2. Umieść każdą mysz na czystej tablicy roboczej. Zdezynfekuj sierść i skórę 70% izopropanolem.
    3. Zbierz kość piszczelową i kość udową z obu nóg za pomocą kleszczy i nożyczek. Umieść je w lodowatym RPMI zawierającym 1% FCS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy (1% RPMI) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Dokładnie oczyść kość udową i piszczelową, usuwając wszystkie tkanki mięśniowe za pomocą kleszczy i nożyczek. Przenieść kość udową i piszczelową z probówek stożkowych o pojemności 50 ml na szalkę Petriego o średnicy 92 mm zawierającą 1% RPMI.
    4. Za pomocą nożyczek odetnij końce kości udowej lub piszczelowej. Napełnij probówkę o pojemności 50 ml 25 ml pożywki 1% RPMI 1640. Użyj tego, aby napełnić strzykawkę o pojemności 3 ml dołączoną do igły 26 G 3 ml 1% RPMI. Włożyć tę strzykawkę do kości i wcisnąć tłok, aby wypłukać szpik kostny (BM) z jamy do probówki zbiorczej z 1% RPMI (~3 ml/kość).
    5. Powtórz krok 1.2.4 dla wszystkich pozostałych kości piszczelowych i udowych innych myszy dawców. Trzymaj wszystkie probówki zbiorcze na lodzie.
    6. Zawiesinę jednokomórkową należy sporządzić przez przepłukanie fragmentów szpiku kostnego przez sitko siatkowe o wielkości 75 μm. Zawiesinę jednokomórkową należy zebrać do probówki o pojemności 50 ml.
    7. Probówki wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w buforze PBS zawierającym 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 20 x 106 komórek/ml. Zapisz podwielokrotność 2 x 106 komórek do barwienia czystością.
    8. Dodać przeciwciało Thy 1 w stężeniu 0,05 μg/106 komórek14 i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć raz 25 ml lodowatego PBS. Zawiesić w 20 x 106/ml w 0,5% BSA/10% dopełniaczu młodego królika/2% DNazie (10 000 U/ml w sterylnymH2O). Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C i myć 2x jak poprzednio.
      UWAGA: Limfocyty T są zubożone przy użyciu mAb specyficznego dla Thy1, białka wyrażanego przez wszystkie limfocyty T, ale nie przez inne leukocyty.
    9. Ponownie zawiesić komórki w 20 ml buforu PBS zawierającego 0,5% BSA. Policz komórki szpiku kostnego w 1% kwasie octowym za pomocą hemocytometru. Zachować podwielokrotność 2 x 106 komórek do kontroli czystości za pomocą cytometrii przepływowej po oczyszczeniu komórek.
      UWAGA: Jedna mysz dawcy zwykle generuje około 25 x 106 TCD-BM.
    10. Użyj cytometrii przepływowej, aby potwierdzić pomyślne wyczerpanie limfocytów T. Wybarwić 1 x 106 komórek, zachowanych z etapów 1.2.7 (przed wyczerpaniem limfocytów T) i 1.2.9 (TCD-BM po wyczerpaniu limfocytów T) następującymi przeciwciałami: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1,5) i α-CD8α (53-6,7).
  3. Dzień 1: Przygotowanie limfocytów T od myszy dawcy
    1. Użyj myszy typu dzikiego (WT) CD45.2 + H2kb + C57BL / 6 (WT) jako dawców limfocytów T.
    2. Poddaj eutanazji myszy C57BL/6 przez uduszenie dwutlenkiem węgla (CO2), jak opisano w 1.2.1.
    3. Dokładnie oczyść sierść i skórę myszy 70% etanolem. Wyciąć śledziony i węzły chłonne i rozdzielić je na jednokomórkową zawiesinę splenocytów za pomocą tłoka strzykawki i siatek o wielkości 40 μm. Przemyć sitko i tłok strzykawki 1% RPMI (1% FBS zawierający pożywkę RPMI), aby zebrać wszystkie splenocyty.
    4. Odwirować zawiesinę komórek przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 5 ml buforu lizującego ACK (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7,2) po odrzuceniu supernatantu. Inkubować zawiesinę komórkową przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Bufor do lizy ACK służy do lizy czerwonych krwinek.
    5. Dodaj 5 ml 1% RPMI, aby zatrzymać lizę. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    6. Przygotuj lodowaty bufor do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) (0,5% BSA, 2 mM EDTA w PBS, pH 7,2). Odgazuj bufor przed użyciem. Ponownie zawiesić osady komórek w 5 ml buforu MACS.
    7. Policz splenocyty i sprawdź, czy są żywe i martwe komórki za pomocą hemocytometru i 1% błękitu trypanowego. Zapisz podwielokrotność 2 x 106 komórek, aby ocenić wydajność oczyszczania za pomocą analizy cytometrii przepływowej.
    8. Zawiesić splenocyty w stężeniu 200 x10 6/ml w buforze MACS. Dodać 0,03 μl biotyny anty-myszy-Ter-119, 0,03 μl biotyny anty-mysiej CD11b, 0,03 μl biotyny anty-myszy-CD45R i 0,03 μl biotyny anty-myszy-DX5 na 106 komórek. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Biotyna anty-mysie-Ter-119, biotyna anty-mysie-CD11b, biotyna anty-mysz-CD45R i biotyna anty-mysz-DX5 były używane do reagowania odpowiednio z erytroidami, granulocytami, komórkami B i komórkami NK. W związku z tym te podzbiory komórek są wyczerpywane w następującym kroku 15.
    9. Dodać 10 ml lodowatego buforu MACS do zawiesiny komórek. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    10. Zawiesić osady komórkowe w buforze MACS w stężeniu 100 x 106/ml. Dodaj mikrogranulki antybiotyny (0,22 μL/106 komórek) do zawiesiny splenocytów. Dobrze wymieszać i inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć zawiesinę komórkową 10 ml lodowatego buforu MACS. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    11. Umieść magnetyczną kolumnę oddzielającą w polu magnetycznym. Przepłukać kolumnę 3 ml buforu MACS. Upuść zawiesinę komórek na kolumnę. Zebrać przepływ składający się z niezwiązanych, wzbogaconych limfocytów T w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przemyć kolumnę MS 3 ml lodowatego buforu MACS.
      UWAGA: Upewnij się, że kolumna jest pusta przed wykonaniem etapów mycia.
    12. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu MACS.
    13. Policz komórki w 1% błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru. Zachowaj podwielokrotność 2 x 106 komórek do kontroli czystości za pomocą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Średnia wydajność limfocytów T śledziony wyizolowanych tą metodą wynosi ~20−25 x 106 komórek na mysz.
    14. Potwierdź wydajność wzbogacania limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej. Wybarwić 1 x 106 komórek, zachowanych z etapów 1.3.7 (przed wyczerpaniem limfocytów T) i 1.3.13 (TCD-BM po wyczerpaniu limfocytów T), następującymi przeciwciałami: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1,5) i α-CD8α (53-6,7).
  4. Dzień 1: Wstrzyknij napromieniowanym myszom limfocyty T dawcy i TCD-BM.
    1. Przemyć TCD-BM i komórki T 2x PBS (800 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C). Ponownie zawiesić komórki w lodowatym PBS do wstrzyknięcia. Dostosuj stężenie komórek do 20 x 106/ml dla TCD BM i 4 x 106/ml dla limfocytów T.
    2. Podgrzej zwierzę za pomocą lampy grzewczej, aby zwiększyć widoczność obustronnych żył ogonowych. W razie potrzeby umieść mysz w ograniczniku.
    3. Oczyść powierzchnię ogona za pomocą 70% izopropanolu. Wstrzyknąć TCD-BM (5 x 106 komórek/mysz) z lub bez limfocytów T (0,75 x 106 komórek/mysz). Należy uważać, aby nie wprowadzić powietrza do strzykawki.
    4. Wyjmij igłę i przyłóż wacik antyseptyczny bezpośrednio do miejsca wstrzyknięcia 5-10 s, aby zatrzymać krwawienie.
  5. Oceń GVHD w dniach 2-80.
    1. Śledź przeżywalność zwierząt. Monitoruj objawy kliniczne GVHD dostosowane do systemu punktacji ustanowionego wcześniej przez Cooka i wsp.16 oraz masę ciała myszy biorców 2x w tygodniu. Użyj masy ciała określonej przed TBI, aby obliczyć utratę masy ciała.
    2. Zważ każdą mysz indywidualnie. Oceń utratę masy ciała w następujący sposób: ocena 0 = mniej niż 10%; ocena 1 = 10%−20%; Stopień 2 = więcej niż 20%.
    3. Oceń znak postawy biorców: ocena 0 = brak przeczucia; ocena 0,5 = lekkie zgarbienie, ale prostuje się podczas chodzenia; ocena 1 = zwierzę pozostaje zgarbione podczas chodzenia; ocena 1,5 = zwierzę nie prostuje się; ocena 2,0 = zwierzę stoi na tylnych palcach.
    4. Oceń znak mobilności odbiorców: ocena 0 = bardzo aktywna; ocena 0,5 = wolniejsza niż naiwne myszy; ocena 1,0 = porusza się tylko po szturchnięciu; ocena 1,5 = porusza się nieznacznie po szturchnięciu; ocena 2,0 = nie porusza się po szturchnięciu.
    5. Oceń skórę biorców: stopień 0 = brak otarć, zmian lub łuszczenia się; stopień 0,5 = zaczerwienienie w jednym określonym obszarze; stopień 1 = otarcie w jednym obszarze lub łagodne otarcie w dwóch obszarach; stopień 1,5 = poważne otarcia w dwóch lub więcej obszarach; stopień 2,0 = poważne otarcia, pękająca skóra, zaschnięta krew.
    6. Oceń futro biorców: ocena 0 = brak nieprawidłowych objawów; ocena 0,5 = obsiadka z boku brzucha lub karku, ocena 1,0 = obwisłość w poprzek lub z boku brzucha i szyi; ocena 1,5 = zaniedbane, skołtunione i pomarszczone futro; ocena 2,0 = źle skołtuniona sierść na brzuchu i plecach.
    7. Oceń biegunkę biorców: stopień 0 = brak biegunki; stopień 0,5 = lekki i miękki stolec; stopień 1,0 = łagodny (żółty stolec); stopień 1,5 = umiarkowany (żółty stolec z niewielką ilością krwi); stopień 2 = ciężki (jasnożółty i krwawy stolec, "wysuszone stolce" pojawiają się w okolicy odbytu).

2. Model kotransplantacji

  1. Generuj komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego (BM-DC).
    1. Odizoluj szpik kostny od kości udowych i piszczelowych myszy WT lub czynnika B (fB)-/- na tle B6, jak opisano w krokach 1.2.3−1.2.4. Wiruj komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut.
    2. Zawiesić osad w 5 ml buforu lizującego ACK w celu lizy krwinek czerwonych. Inkubować zawiesinę komórkową przez 5 minut na lodzie. Dodać 10 ml 1% RPMI do zawiesiny komórek, aby zatrzymać lizę i odwirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    3. Zawiesić osady komórkowe w 10 ml pożywki hodowlanej (RPMI 1460 zawierającej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 2 mM l-glutaminy i 50 mM β-merkaptoetanolu) i dostosować objętość, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 106 komórek/ml.
    4. Dodać 20 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) do zawiesiny komórkowej. Hodować komórki szpiku kostnego na szalkach Petriego o wymiarach 100 x 15 mm w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 6 dni.
    5. Zastąp połowę trwających pożywek hodowlanych (około 5 ml) świeżymi pożywkami zawierającymi 40 ng/mL GM-CSF w dniu 3.
    6. Podgrzej pożywkę hodowlaną w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Zebrać około 5 ml pożywki z szalek do hodowli szpiku kostnego. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w pożywce hodowlanej o pojemności 5 ml zawierającej 40 ng/ml gm-csf.
    7. Dodać 25 μg/ml lipopolisacharydu (LPS) do pożywki w 6. dniu hodowli, aby dojrzeć BM-DC. Zapisz podwielokrotność 2 x 106 komórek, aby określić skuteczność różnicowania DC za pomocą cytometrii przepływowej.
    8. Zbierz dojrzałe BM-DC: Użyj podnośników komórkowych, aby delikatnie zeskrobać DC z szalek Petriego. Zebrać wszystkie zawiesiny komórek w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Odwirować przy 800 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Umyj granulki komórek 3x 50 ml lodowatego PBS. Zaoszczędź około 2 x 106 BM-DC do immunologicznej analizy fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej.
  2. Wykonaj kotransplantację komórek dendrytycznych BMT (BMT współprzeszczepianie DC).
    UWAGA: Użyj myszy FVB (H2kq) jako dawców komórek T i komórek BM. Napromieniać myszy biorcy B6 Ly5.1 w dawce 1 100 cGy (2 dawki, odstęp 3 godziny). Zobacz szczegóły w kroku 1.1.
    1. Wyizoluj BM z kości udowych i piszczelowych myszy dawców FVB. Zobacz szczegóły w krokach 1.2.3−1.2.10.
      UWAGA: W tym modelu należy użyć całkowitego izolowanego szpiku kostnego zamiast TCD-BM.
    2. Oczyść limfocyty T ze śledziony i węzłów chłonnych myszy dawców FVB. Szczegółowe informacje znajdują się w krokach 1.3.1-1.3.13.
    3. Wstrzyknąć BM (5 x 106 / mysz), limfocyty T (0,5 x 106 / mysz) z BM-DC (2 x 106 / mysz) w dniu 0 kursu eksperymentalnego.
    4. W 3 dniu po przeszczepieniu należy zbadać rekonstytucję DC dawcy za pomocą cytometrii przepływowej.
      1. Zbierz krew z oczu biorców.
      2. Znieczulić myszy CD45.1 / Ly5.1 B6 przez 3% inhalację izofluranu. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
      3. Umieść sterylną szklaną rurkę do pipety w przyśrodkowej kancie oka, skierowaną doogonowo pod kątem 30−45° od płaszczyzny nosa. Wywieraj nacisk, delikatnie obracając rurkę.
      4. Wrzuć krew do sterylnych probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml zawierających heparynę o pojemności 10 μl. Przenieś 50 μl krwi do szklanych probówek przepływowych o pojemności 5 ml.
      5. Dodać 2 ml buforu lizującego ACK. Inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 45 minut. Dodać 2 ml buforu barwiącego FACS. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
      6. Zawiesić osady komórkowe za pomocą 200 μl buforu FACS zawierającego odpowiednie przeciwciała barwiące przepływ (żółty żywy/śmierci, α-H-2Kb, α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c i α-MHCII). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Przemyć 2x 1 ml buforu FACS. Zawiesić osady komórkowe w 200 μl buforu FACS i przeprowadzić analizę za pomocą cytometrii przepływowej.

3. Modele GVHD/GVL BMT

  1. Wykonaj indukcję GVHD/GVL.
    1. Hodowla chłoniaka z komórek B A20 transdukowanego lucyferazy w pożywkach hodowlanych RPMI.
    2. Napromieniować biorcę BARLB/c w tle WT lub Ly5.1 w dawce 700 cGy (pojedyncza dawka). Zobacz szczegóły w kroku 1.1.
    3. Odizolować TCD-BM od kości udowych i piszczelowych witaminy B6. Myszy dawcy Ly5.1. Zobacz szczegóły w krokach 1.2.1−1.2.10.
    4. Oczyść limfocyty T ze śledziony i węzłów chłonnych myszy dawcy C57BL / 6. Zobacz szczegóły w krokach 1.3.1−1.3.15.
    5. Umyj chłoniaka A20 2x 25 ml PBS. Ponownie zawiesić granulki komórek w 10 ml lodowatego PBS. Pobrać podwielokrotność zawiesiny komórkowej (10 μl) i policzyć komórki za pomocą 1% błękitu trypanowego i hemocytometru. Dostosuj stężenie komórek do 20 000 komórek/ml.
    6. Wstrzyknąć TCD-BM (5 x 106 / mysz) z lub bez limfocytów T (0,75 x 106 / mysz) i chłoniaka A20 (5 000 komórek / mysz).
    7. Monitorowanie przeżycia biorcy, objawów klinicznych GVHD i utraty masy ciała podczas kursu eksperymentalnego. Zobacz szczegóły w kroku 1.5.
  2. Wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne.
    1. Monitoruj wzrost guza u przeszczepionego biorcy, wstrzykując myszom biorcy 4 mg D-lucyferyny. Inkubuj przez 5 minut, aby upewnić się, że lucyferyna reaguje z lucyferazy.
    2. Znieczulić mysz za pomocą 3% izofluranu w komorze obrazownika bioluminescencyjnego i obrazować biorców przez 5 minut w polu D i czasie ekspozycji 1 min.
    3. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Zmień skalę obrazów pseudokolorowych, aby uzyskać najlepsze wyniki.
      UWAGA: Wszystkie obrazy muszą być w tej samej skali we wszystkich eksperymentach.
    4. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby określić obszary zainteresowania i określić ilościowo gęstość sygnału, obliczając strumień (fotony/s) emitowany z każdego obszaru zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Główny model z dużym niedopasowaniem MHC B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd) ściśle odpowiadał rozwojowi GVHD po transplantacji (Rycina 2). Wszystkie sześć objawów klinicznych GVHD, ustalonych wcześniej przez Cooke i współpracowników16, wystąpiło u biorców z przeszczepem limfocytów T WT-B6, ale nie u biorców z samym BM (krok 1.5), którzy stanowili grupę ujemną pod kątem GVHD. W tym modelu rozwój GVHD przebiega w dwóch fazach....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykorzystanie komórek macierzystych w celu dopasowania do konkretnej osoby jest skutecznym podejściem do leczenia zaawansowanych i opornych nowotworów18. Jednak farmaceutyki małocząsteczkowe od dawna pozostają głównym celem spersonalizowanej terapii przeciwnowotworowej. Z drugiej strony, w terapii komórkowej mnogość interakcji między dawcą a gospodarzem może mieć decydujący wpływ na wyniki leczenia, takie jak rozwój GVHD po BMT1.

Główne mysie mod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

To badanie jest wspierane przez grant start-up University of Central Florida College of Medicine (dla HN), grant na rozpoczęcie działalności University of Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center (dla HL), grant dla NIH w Stanach Zjednoczonych #1P20CA210300-01 oraz grant Ministerstwa Zdrowia Wietnamu #4694/QD-BYT (dla PTH). Dziękujemy dr Xue-zhong Yu z Uniwersytetu Medycznego w Południowej Karolinie za dostarczenie materiałów do badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA pH 8,0 100 mlBufor MACSFisher ScientificBP2482100
10X PBSFisher ScientificBP3994Bufor MACS
Chłoniak z komórek B A20Uniwersytet Środkowej FlorydyW własnymeksperymencie GVL
ACC1 fl/flJackson Lab30954Eksperyment GVL
ACC1 fl/fl CD4creUniwersytet Środkowej FlorydyEksperyment GVL
Mikrokulki antybiotynoweMiltenyi Biotec130-090-485Wzbogacanie limfocytów T
Anty-ludzkie/mysie CD45R (B220)Thermo Fisher Scientific13-0452-85Wzbogacanie limfocytów T Anty-mysie
B220 FITCThermo Fisher Scientific10452-85Analiza cytometrii przepływowej
Anty-mysie CD11c- AF700Thermo Fisher Scientific117319Analiza cytometrii przepływowej
Anti-Mouse CD25 PEThermo Fisher Scientific12-0251-82Barwienie przepływowe
Anti-Mouse CD4 BiotynaThermo Fisher Scientific13-0041-86Wzbogacanie limfocytów
T Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® zamiennik)Thermo Fisher Scientific48-0042-82Barwienie przepływowe
Anti-Mouse CD45.1 PEThermo Fisher Scientific12-0900-83Analiza cytometrii przepływowej
Anti-Mouse CD8a APCThermo Fisher Scientific17-0081-83Analiza cytometrii przepływowej
Anti-mysz H-2Kb PerCP-Fluor 710Thermo Fisher Scientific46-5958-82Analiza cytometrii przepływowej
Przeciwciało anty-mysie MHC klasy II APCThermo Fisher Scientific17-5320-82Analiza cytometrii przepływowej
Anti-Mouse TER-119 BiotynaThermo Fisher Scientific13-5921-85Wzbogacanie limfocytów T
Anti-Thy1.2Bio ExcelBE0066BM generacja
B6 fB-/-myszy University of Central FloridaW domuOdbiorcy
B6. Myszy Ly5.1 (CD45.1+)Charles River564Dawcy
BALB/c myszyCharles River028Biorcy przeszczepu
C57BL/6 myszyCharles River027Dawcy/biorcy
CD11bThermo Fisher Scientific13-0112-85Wzbogacanie limfocytów T
CD25-biotynaThermo Fisher Scientific13-0251-82Wzbogacanie limfocytów T
CD45RThermo Fisher Scientific13-0452-82Wzbogacanie limfocytów T
CD49b Przeciwciało monoklonalne (DX5)-biotynaThermo Fisher Scientific13-5971-82Wzbogacanie limfocytów
T Sitko do komórek 40 uMThermo Fisher Scientific22363547Przygotowanie komórek
Sitko do komórek 70 uMThermo Fisher Scientific22363548Przygotowanie komórek
D-LuciferinGoldbioLUCK-1GObrazowanie żywych zwierząt
Surowica bydlęca płodu (FBS)Atlanta Bilogicals R& System DD17051Probówki
cytometrii przepływowejFisher Scientific352008Analiza cytometrii przepływowej
FVB/NCrlCharles River207Dawcy
Lipopolisacharyd (LPS)Millipore SigmaL4391-1MGDC dojrzała
kolumna LSMitenyi Biotec130-042-401Przygotowanie komórek
MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302Wzbogacanie limfocytów T
Inkubator New Brunswick Galaxy 170REppendorfGalaxy 170 RCell Culture
Penicylina + streptomycynaPenicylina / Streptomycyna (10 000 jednostek penicyliny / 10 000 mg / ml paciorkowca)GIBCO15140Media
RPMI 1640Thermo Fisher Scienctific11875-093Media
TER119Thermo Fisher Naukowy13-5921-82Wzbogacanie limfocytów T
Xenogen IVIS-200Perkin ElmerXenogen IVIS-200Obrazowanie żywych zwierząt
X-RAD 320 Biologiczny naświetlaczPrecyzyjny X-RADX-RAD 320Napromienianie całego ciała
do do hodowli komórkowych

Bibliografia

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006(2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417(2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

efekt przeszczep przeciw bia aczcedeplecja limfocyt w Tseparacja za pomoc kulek magnetycznychdendrytyczne kom rki pochodz ce z szpiku kostnegonokaut czynnika Bmodel z niezgodno ci MHCA20 transdukowane lucyferaz
Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.