Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Allogeniczne przeszczepienie krwiotwórczych komórek macierzystych (BMT) jest skuteczną terapią w leczeniu nowotworów hematologicznych^1,2 poprzez efekt przeszczep kontra białaczka (GVL)³. Jednak limfocyty dawcy zawsze przeprowadzają niepożądane ataki immunologiczne na tkanki biorcy, w procesie zwanym chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD)⁴.

Mysie modele GVHD są skutecznym narzędziem do badania biologii GVHD i odpowiedzi GVL⁵. Myszy są opłacalnym modelem zwierzęcym do badań. Są one małe i skutecznie dozowane z cząsteczkami i lekami biologicznymi we wczesnych fazach rozwoju⁶. Myszy są idealnymi zwierzętami badawczymi do badań nad manipulacjami genetycznymi, ponieważ są genetycznie dobrze zdefiniowane, co jest idealne do badania szlaków i mechanizmów biologicznych⁶. Kilka mysich modeli GVHD z niedopasowanym MHC do głównych układów zgodności tkankowej (MHC) zostało dobrze ustalonych, takich jak C57BL/6 (H2^b) do BALB/c (H2^d) i FVB (H2^q)→C57BL/6 (H2^b)^5,7. Są to szczególnie cenne modele do określenia roli poszczególnych typów komórek, genów i czynników wpływających na GVHD. Przeszczepienie od dawców rodzicielskich C57/BL/6 (H2^b) do biorców z mutacjami w MHC I (B6. C-H2^bm1) i/lub MHC II (B6. C-H2b^m12) ujawniły, że niezgodność zarówno w MHC klasy I, jak i klasy II jest ważnym wymogiem dla rozwoju ostrej GVHD. Sugeruje to, że zarówno limfocyty T CD4⁺, jak i CD8⁺ są niezbędne do rozwoju choroby^7,8. GVHD jest również zaangażowana w kaskadę zapalną znaną jako "prozapalna burza cytokinowa"⁹. Najczęstszą metodą kondycjonowania w modelach mysich jest napromienianie całego ciała (TBI) za pomocą promieniowania rentgenowskiego lub ¹³⁷Cs. Prowadzi to do ablacji szpiku kostnego biorcy, umożliwiając w ten sposób przeszczepienie komórek macierzystych dawcy i zapobiegając odrzuceniu przeszczepu. Odbywa się to poprzez ograniczenie proliferacji limfocytów T biorcy w odpowiedzi na komórki dawcy. Ponadto różnice genetyczne odgrywają ważną rolę w indukcji choroby, która zależy również od niewielkiego niedopasowania MHC¹⁰. Dlatego dawka promieniowania mieloablacyjnego różni się w różnych szczepach myszy (np. BALB/c→C57BL/6).

Aktywacja limfocytów T dawcy przez komórki prezentujące antygen gospodarza (APC) jest niezbędna do rozwoju GVHD. Wśród APC najsilniejsze są komórki dendrytyczne (DC). Są dziedzicznie zdolne do indukowania GVHD ze względu na ich lepszy wychwyt antygenu, ekspresję cząsteczek kostymulujących limfocyty T i produkcję cytokin prozapalnych, które polaryzują limfocyty T w podzbiory patogenne. Centra biorców mają kluczowe znaczenie dla ułatwienia primingu limfocytów T i indukcji GVHD po przeszczepie^11,12. W związku z tym DC stały się interesującymi celami w leczeniu GVHD¹².

TBI jest wymagane do wzmocnienia wszczepienia komórek dawcy. Ze względu na efekt TBI, biorcy DC są aktywowani i przeżywają przez krótki czas po przeszczepie¹². Pomimo znacznych postępów w wykorzystaniu bioluminescencji lub fluorescencji, ustanowienie skutecznego modelu do badania roli biorców DC w GVHD jest nadal wyzwaniem.

Ponieważ limfocyty T dawcy są siłą napędową aktywności GVL, strategie leczenia za pomocą leków immunosupresyjnych, takich jak sterydy, w celu stłumienia alloreaktywności limfocytów T, często powodują nawrót nowotworu lub infekcję¹³. W związku z tym ukierunkowanie na biorców DC może stanowić alternatywne podejście do leczenia GVHD przy jednoczesnym zachowaniu efektu GVL i uniknięciu infekcji.

W skrócie, obecne badanie dostarcza platformy do zrozumienia, w jaki sposób różne rodzaje sygnalizacji w DC biorców regulują rozwój GVHD i efekt GVL po BMT.

Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Centralnej Florydy.

1. Indukcja GVHD

UWAGA: Allogeniczny przeszczep komórek szpiku kostnego (BM) (krok 1.2) jest wykonywany w ciągu 24 godzin po napromieniowaniu. Wszystkie opisane poniżej zabiegi wykonywane są w sterylnym środowisku. Wykonaj zabieg w kapturze do hodowli tkankowej i użyj przefiltrowanych odczynników.

1. Dzień 0: Przygotuj myszy biorców.
   1. Jako biorców należy użyć samic myszy typu dzikiego (WT) na tle BALB/c (CD45.2⁺ H2k^d+), w wieku 10-12 tygodni.
   2. Załóż kolczyk na uszy i zważ biorców przed TBI. Następnie umieść do 11 myszy w komorze naświetlającej i trzymaj ją w promienniku. Naświetlać pojedynczą dawką 700 cGy przez 10-15 min.
   3. Przed przeszczepem należy zwrócić napromieniowane zwierzęta do klatek i umieścić je w pomieszczeniach wolnych od patogenów.
      UWAGA: Minimalna masa ciała biorców powinna wynosić około 20 g. Użyj tej masy jako odniesienia do obliczenia utraty masy ciała w okresie eksperymentalnym.
2. Dzień 1: Przygotuj szpik kostny zubożony w limfocyty T (TCD-BM) od myszy dawców.
   1. Poddaj eutanazji myszy CD45.1 / Ly5.1 C57BL / 6 przez uduszenie CO₂ i poczekaj 2-3 minuty, aż stracą przytomność. W razie potrzeby należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy jako wtórną eutanazję.
   2. Umieść każdą mysz na czystej tablicy roboczej. Zdezynfekuj sierść i skórę 70% izopropanolem.
   3. Zbierz kość piszczelową i kość udową z obu nóg za pomocą kleszczy i nożyczek. Umieść je w lodowatym RPMI zawierającym 1% FCS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy (1% RPMI) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Dokładnie oczyść kość udową i piszczelową, usuwając wszystkie tkanki mięśniowe za pomocą kleszczy i nożyczek. Przenieść kość udową i piszczelową z probówek stożkowych o pojemności 50 ml na szalkę Petriego o średnicy 92 mm zawierającą 1% RPMI.
   4. Za pomocą nożyczek odetnij końce kości udowej lub piszczelowej. Napełnij probówkę o pojemności 50 ml 25 ml pożywki 1% RPMI 1640. Użyj tego, aby napełnić strzykawkę o pojemności 3 ml dołączoną do igły 26 G 3 ml 1% RPMI. Włożyć tę strzykawkę do kości i wcisnąć tłok, aby wypłukać szpik kostny (BM) z jamy do probówki zbiorczej z 1% RPMI (~3 ml/kość).
   5. Powtórz krok 1.2.4 dla wszystkich pozostałych kości piszczelowych i udowych innych myszy dawców. Trzymaj wszystkie probówki zbiorcze na lodzie.
   6. Zawiesinę jednokomórkową należy sporządzić przez przepłukanie fragmentów szpiku kostnego przez sitko siatkowe o wielkości 75 μm. Zawiesinę jednokomórkową należy zebrać do probówki o pojemności 50 ml.
   7. Probówki wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w buforze PBS zawierającym 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 20 x 10⁶ komórek/ml. Zapisz podwielokrotność 2 x 10⁶ komórek do barwienia czystością.
   8. Dodać przeciwciało Thy 1 w stężeniu 0,05 μg/10⁶ komórek¹⁴ i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć raz 25 ml lodowatego PBS. Zawiesić w 20 x 10⁶/ml w 0,5% BSA/10% dopełniaczu młodego królika/2% DNazie (10 000 U/ml w sterylnym_H2O). Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C i myć 2x jak poprzednio.
      UWAGA: Limfocyty T są zubożone przy użyciu mAb specyficznego dla Thy1, białka wyrażanego przez wszystkie limfocyty T, ale nie przez inne leukocyty.
   9. Ponownie zawiesić komórki w 20 ml buforu PBS zawierającego 0,5% BSA. Policz komórki szpiku kostnego w 1% kwasie octowym za pomocą hemocytometru. Zachować podwielokrotność 2 x 10⁶ komórek do kontroli czystości za pomocą cytometrii przepływowej po oczyszczeniu komórek.
      UWAGA: Jedna mysz dawcy zwykle generuje około 25 x 10⁶ TCD-BM.
   10. Użyj cytometrii przepływowej, aby potwierdzić pomyślne wyczerpanie limfocytów T. Wybarwić 1 x 10⁶ komórek, zachowanych z etapów 1.2.7 (przed wyczerpaniem limfocytów T) i 1.2.9 (TCD-BM po wyczerpaniu limfocytów T) następującymi przeciwciałami: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1,5) i α-CD8α (53-6,7).
3. Dzień 1: Przygotowanie limfocytów T od myszy dawcy
   1. Użyj myszy typu dzikiego (WT) CD45.2 ⁺ H2k^{b +} C57BL / 6 (WT) jako dawców limfocytów T.
   2. Poddaj eutanazji myszy C57BL/6 przez uduszenie dwutlenkiem węgla (CO₂), jak opisano w 1.2.1.
   3. Dokładnie oczyść sierść i skórę myszy 70% etanolem. Wyciąć śledziony i węzły chłonne i rozdzielić je na jednokomórkową zawiesinę splenocytów za pomocą tłoka strzykawki i siatek o wielkości 40 μm. Przemyć sitko i tłok strzykawki 1% RPMI (1% FBS zawierający pożywkę RPMI), aby zebrać wszystkie splenocyty.
   4. Odwirować zawiesinę komórek przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 5 ml buforu lizującego ACK (1 mM Na₂EDTA, 10 mM KHCO₃, 144 mM NH₄Cl, pH 7,2) po odrzuceniu supernatantu. Inkubować zawiesinę komórkową przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Bufor do lizy ACK służy do lizy czerwonych krwinek.
   5. Dodaj 5 ml 1% RPMI, aby zatrzymać lizę. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
   6. Przygotuj lodowaty bufor do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) (0,5% BSA, 2 mM EDTA w PBS, pH 7,2). Odgazuj bufor przed użyciem. Ponownie zawiesić osady komórek w 5 ml buforu MACS.
   7. Policz splenocyty i sprawdź, czy są żywe i martwe komórki za pomocą hemocytometru i 1% błękitu trypanowego. Zapisz podwielokrotność 2 x 10⁶ komórek, aby ocenić wydajność oczyszczania za pomocą analizy cytometrii przepływowej.
   8. Zawiesić splenocyty w stężeniu 200 x^{10 6}/ml w buforze MACS. Dodać 0,03 μl biotyny anty-myszy-Ter-119, 0,03 μl biotyny anty-mysiej CD11b, 0,03 μl biotyny anty-myszy-CD45R i 0,03 μl biotyny anty-myszy-DX5 na 10⁶ komórek. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Biotyna anty-mysie-Ter-119, biotyna anty-mysie-CD11b, biotyna anty-mysz-CD45R i biotyna anty-mysz-DX5 były używane do reagowania odpowiednio z erytroidami, granulocytami, komórkami B i komórkami NK. W związku z tym te podzbiory komórek są wyczerpywane w następującym kroku ¹⁵.
   9. Dodać 10 ml lodowatego buforu MACS do zawiesiny komórek. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
   10. Zawiesić osady komórkowe w buforze MACS w stężeniu 100 x 10⁶/ml. Dodaj mikrogranulki antybiotyny (0,22 μL/10⁶ komórek) do zawiesiny splenocytów. Dobrze wymieszać i inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć zawiesinę komórkową 10 ml lodowatego buforu MACS. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
   11. Umieść magnetyczną kolumnę oddzielającą w polu magnetycznym. Przepłukać kolumnę 3 ml buforu MACS. Upuść zawiesinę komórek na kolumnę. Zebrać przepływ składający się z niezwiązanych, wzbogaconych limfocytów T w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przemyć kolumnę MS 3 ml lodowatego buforu MACS.
       UWAGA: Upewnij się, że kolumna jest pusta przed wykonaniem etapów mycia.
   12. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu MACS.
   13. Policz komórki w 1% błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru. Zachowaj podwielokrotność 2 x 10⁶ komórek do kontroli czystości za pomocą cytometrii przepływowej.
       UWAGA: Średnia wydajność limfocytów T śledziony wyizolowanych tą metodą wynosi ~20−25 x 10⁶ komórek na mysz.
   14. Potwierdź wydajność wzbogacania limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej. Wybarwić 1 x 10⁶ komórek, zachowanych z etapów 1.3.7 (przed wyczerpaniem limfocytów T) i 1.3.13 (TCD-BM po wyczerpaniu limfocytów T), następującymi przeciwciałami: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1,5) i α-CD8α (53-6,7).
4. Dzień 1: Wstrzyknij napromieniowanym myszom limfocyty T dawcy i TCD-BM.
   1. Przemyć TCD-BM i komórki T 2x PBS (800 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C). Ponownie zawiesić komórki w lodowatym PBS do wstrzyknięcia. Dostosuj stężenie komórek do 20 x 10⁶/ml dla TCD BM i 4 x 10⁶/ml dla limfocytów T.
   2. Podgrzej zwierzę za pomocą lampy grzewczej, aby zwiększyć widoczność obustronnych żył ogonowych. W razie potrzeby umieść mysz w ograniczniku.
   3. Oczyść powierzchnię ogona za pomocą 70% izopropanolu. Wstrzyknąć TCD-BM (5 x 10⁶ komórek/mysz) z lub bez limfocytów T (0,75 x 10⁶ komórek/mysz). Należy uważać, aby nie wprowadzić powietrza do strzykawki.
   4. Wyjmij igłę i przyłóż wacik antyseptyczny bezpośrednio do miejsca wstrzyknięcia 5-10 s, aby zatrzymać krwawienie.
5. Oceń GVHD w dniach 2-80.
   1. Śledź przeżywalność zwierząt. Monitoruj objawy kliniczne GVHD dostosowane do systemu punktacji ustanowionego wcześniej przez Cooka i wsp.¹⁶ oraz masę ciała myszy biorców 2x w tygodniu. Użyj masy ciała określonej przed TBI, aby obliczyć utratę masy ciała.
   2. Zważ każdą mysz indywidualnie. Oceń utratę masy ciała w następujący sposób: ocena 0 = mniej niż 10%; ocena 1 = 10%−20%; Stopień 2 = więcej niż 20%.
   3. Oceń znak postawy biorców: ocena 0 = brak przeczucia; ocena 0,5 = lekkie zgarbienie, ale prostuje się podczas chodzenia; ocena 1 = zwierzę pozostaje zgarbione podczas chodzenia; ocena 1,5 = zwierzę nie prostuje się; ocena 2,0 = zwierzę stoi na tylnych palcach.
   4. Oceń znak mobilności odbiorców: ocena 0 = bardzo aktywna; ocena 0,5 = wolniejsza niż naiwne myszy; ocena 1,0 = porusza się tylko po szturchnięciu; ocena 1,5 = porusza się nieznacznie po szturchnięciu; ocena 2,0 = nie porusza się po szturchnięciu.
   5. Oceń skórę biorców: stopień 0 = brak otarć, zmian lub łuszczenia się; stopień 0,5 = zaczerwienienie w jednym określonym obszarze; stopień 1 = otarcie w jednym obszarze lub łagodne otarcie w dwóch obszarach; stopień 1,5 = poważne otarcia w dwóch lub więcej obszarach; stopień 2,0 = poważne otarcia, pękająca skóra, zaschnięta krew.
   6. Oceń futro biorców: ocena 0 = brak nieprawidłowych objawów; ocena 0,5 = obsiadka z boku brzucha lub karku, ocena 1,0 = obwisłość w poprzek lub z boku brzucha i szyi; ocena 1,5 = zaniedbane, skołtunione i pomarszczone futro; ocena 2,0 = źle skołtuniona sierść na brzuchu i plecach.
   7. Oceń biegunkę biorców: stopień 0 = brak biegunki; stopień 0,5 = lekki i miękki stolec; stopień 1,0 = łagodny (żółty stolec); stopień 1,5 = umiarkowany (żółty stolec z niewielką ilością krwi); stopień 2 = ciężki (jasnożółty i krwawy stolec, "wysuszone stolce" pojawiają się w okolicy odbytu).

2. Model kotransplantacji

1. Generuj komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego (BM-DC).
   1. Odizoluj szpik kostny od kości udowych i piszczelowych myszy WT lub czynnika B (fB)^-/- na tle B6, jak opisano w krokach 1.2.3−1.2.4. Wiruj komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut.
   2. Zawiesić osad w 5 ml buforu lizującego ACK w celu lizy krwinek czerwonych. Inkubować zawiesinę komórkową przez 5 minut na lodzie. Dodać 10 ml 1% RPMI do zawiesiny komórek, aby zatrzymać lizę i odwirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
   3. Zawiesić osady komórkowe w 10 ml pożywki hodowlanej (RPMI 1460 zawierającej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 2 mM l-glutaminy i 50 mM β-merkaptoetanolu) i dostosować objętość, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 x 10⁶ komórek/ml.
   4. Dodać 20 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) do zawiesiny komórkowej. Hodować komórki szpiku kostnego na szalkach Petriego o wymiarach 100 x 15 mm w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 6 dni.
   5. Zastąp połowę trwających pożywek hodowlanych (około 5 ml) świeżymi pożywkami zawierającymi 40 ng/mL GM-CSF w dniu 3.
   6. Podgrzej pożywkę hodowlaną w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Zebrać około 5 ml pożywki z szalek do hodowli szpiku kostnego. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w pożywce hodowlanej o pojemności 5 ml zawierającej 40 ng/ml gm-csf.
   7. Dodać 25 μg/ml lipopolisacharydu (LPS) do pożywki w 6. dniu hodowli, aby dojrzeć BM-DC. Zapisz podwielokrotność 2 x 10⁶ komórek, aby określić skuteczność różnicowania DC za pomocą cytometrii przepływowej.
   8. Zbierz dojrzałe BM-DC: Użyj podnośników komórkowych, aby delikatnie zeskrobać DC z szalek Petriego. Zebrać wszystkie zawiesiny komórek w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Odwirować przy 800 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Umyj granulki komórek 3x 50 ml lodowatego PBS. Zaoszczędź około 2 x 10⁶ BM-DC do immunologicznej analizy fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej.
2. Wykonaj kotransplantację komórek dendrytycznych BMT (BMT współprzeszczepianie DC).
   UWAGA: Użyj myszy FVB (H2k^q) jako dawców komórek T i komórek BM. Napromieniać myszy biorcy B6 Ly5.1 w dawce 1 100 cGy (2 dawki, odstęp 3 godziny). Zobacz szczegóły w kroku 1.1.
   1. Wyizoluj BM z kości udowych i piszczelowych myszy dawców FVB. Zobacz szczegóły w krokach 1.2.3−1.2.10.
      UWAGA: W tym modelu należy użyć całkowitego izolowanego szpiku kostnego zamiast TCD-BM.
   2. Oczyść limfocyty T ze śledziony i węzłów chłonnych myszy dawców FVB. Szczegółowe informacje znajdują się w krokach 1.3.1-1.3.13.
   3. Wstrzyknąć BM (5 x 10⁶ / mysz), limfocyty T (0,5 x 10⁶ / mysz) z BM-DC (2 x 10⁶ / mysz) w dniu 0 kursu eksperymentalnego.
   4. W 3 dniu po przeszczepieniu należy zbadać rekonstytucję DC dawcy za pomocą cytometrii przepływowej.
      1. Zbierz krew z oczu biorców.
      2. Znieczulić myszy CD45.1 / Ly5.1 B6 przez 3% inhalację izofluranu. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
      3. Umieść sterylną szklaną rurkę do pipety w przyśrodkowej kancie oka, skierowaną doogonowo pod kątem 30−45° od płaszczyzny nosa. Wywieraj nacisk, delikatnie obracając rurkę.
      4. Wrzuć krew do sterylnych probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml zawierających heparynę o pojemności 10 μl. Przenieś 50 μl krwi do szklanych probówek przepływowych o pojemności 5 ml.
      5. Dodać 2 ml buforu lizującego ACK. Inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 45 minut. Dodać 2 ml buforu barwiącego FACS. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
      6. Zawiesić osady komórkowe za pomocą 200 μl buforu FACS zawierającego odpowiednie przeciwciała barwiące przepływ (żółty żywy/śmierci, α-H-2K^b, α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c i α-MHCII). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Przemyć 2x 1 ml buforu FACS. Zawiesić osady komórkowe w 200 μl buforu FACS i przeprowadzić analizę za pomocą cytometrii przepływowej.

3. Modele GVHD/GVL BMT

1. Wykonaj indukcję GVHD/GVL.
   1. Hodowla chłoniaka z komórek B A20 transdukowanego lucyferazy w pożywkach hodowlanych RPMI.
   2. Napromieniować biorcę BARLB/c w tle WT lub Ly5.1 w dawce 700 cGy (pojedyncza dawka). Zobacz szczegóły w kroku 1.1.
   3. Odizolować TCD-BM od kości udowych i piszczelowych witaminy B6. Myszy dawcy Ly5.1. Zobacz szczegóły w krokach 1.2.1−1.2.10.
   4. Oczyść limfocyty T ze śledziony i węzłów chłonnych myszy dawcy C57BL / 6. Zobacz szczegóły w krokach 1.3.1−1.3.15.
   5. Umyj chłoniaka A20 2x 25 ml PBS. Ponownie zawiesić granulki komórek w 10 ml lodowatego PBS. Pobrać podwielokrotność zawiesiny komórkowej (10 μl) i policzyć komórki za pomocą 1% błękitu trypanowego i hemocytometru. Dostosuj stężenie komórek do 20 000 komórek/ml.
   6. Wstrzyknąć TCD-BM (5 x 10⁶ / mysz) z lub bez limfocytów T (0,75 x 10⁶ / mysz) i chłoniaka A20 (5 000 komórek / mysz).
   7. Monitorowanie przeżycia biorcy, objawów klinicznych GVHD i utraty masy ciała podczas kursu eksperymentalnego. Zobacz szczegóły w kroku 1.5.
2. Wykonaj obrazowanie bioluminescencyjne.
   1. Monitoruj wzrost guza u przeszczepionego biorcy, wstrzykując myszom biorcy 4 mg D-lucyferyny. Inkubuj przez 5 minut, aby upewnić się, że lucyferyna reaguje z lucyferazy.
   2. Znieczulić mysz za pomocą 3% izofluranu w komorze obrazownika bioluminescencyjnego i obrazować biorców przez 5 minut w polu D i czasie ekspozycji 1 min.
   3. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Zmień skalę obrazów pseudokolorowych, aby uzyskać najlepsze wyniki.
      UWAGA: Wszystkie obrazy muszą być w tej samej skali we wszystkich eksperymentach.
   4. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby określić obszary zainteresowania i określić ilościowo gęstość sygnału, obliczając strumień (fotony/s) emitowany z każdego obszaru zainteresowania.

Główny niedopasowany model MHC B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd) ściśle odpowiadał rozwojowi GVHD po przeszczepie (Rysunek 2). Wszystkie sześć objawów klinicznych GVHD ustalonych wcześniej przez Cooke i wsp.16 wystąpiło u biorców, którym przeszczepiono limfocyty T WT-B6, ale nie u biorców, którym przeszczepiono sam BM (krok 1.5), które reprezentowały grupę GVHD-ujemną. W tym modelu istnieją dwie fazy rozwoju GVHD. Po pierwsze, szczyt nasilenia przypada na około 11 dni po przeszczepie, po którym następuje zmniejszenie wyników klinicznych i powrót do masy ciała do 16 dni. W tej fazie kilka mechanizmów, takich jak zapalenie wywołane promieniowaniem i zespół wszczepienia, napędza patogeniczność choroby i GVHD. Biorcy jednolicie ulegają GVHD około 30-40 dni po przeszczepie.

Co najmniej 85% BM zróżnicowało się na DC (Rysunek 3A). Co ciekawe, przeszczep z fB-/- DC poprawił przeżycie biorcy i wynik kliniczny GVHD (Ryc. 3B,C). Biorąc pod uwagę, że fB-/- DC mają mniejszą zdolność prezentacji antygenu, co przejawia się niższą ekspresją MHCII i zmniejszoną ekspresją receptora kostymulującego17, protokół kotransplantacji może być wystarczający do zbadania różnych sygnałów lub celów w biorczych DC w rozwoju GVHD po BMT.

Czystość limfocytów T wynosiła 90% po wzbogaceniu (Rysunek 4A). Chłoniak z komórek B A20 transdukowany lucyferazą umożliwia monitorowanie wzrostu guza u żywych zwierząt (Rysunek 4B). W tym modelu, jeśli biorcy zmarli bez żadnego sygnału i wysokiego wyniku klinicznego GVHD, stwierdzono, że zmarli z powodu GVHD. Wszyscy biorcy WT BALB/c, którzy otrzymali sam BM plus A20, zmarli z powodu nawrotu nowotworu (Ryc. 3B). W przeciwieństwie do tego, jeśli zwierzę zmarło z powodu większej gęstości sygnału, stwierdzono, że zmarło z powodu nawrotu nowotworu. Jak wykazano w Rysunek 3B, biorcy WT BALB/c przeszczepieni z BM i limfocytami T od dawcy ACC1fl/fl B6 (limfocyty T ACC1+/+) zmarli z powodu GVHD. Jeśli zwierzęta zmarły z sygnałami choroby, stwierdzono, że zmarły z powodu GVHD i nawrotu guza. Zwierzęta, które otrzymały limfocyty BM i T od dawcy ACC1fl / fl x CD4 cre B6 (limfocyty T ACC1-/-) zmarły zarówno z powodu GVHD, jak i nawrotu nowotworu (Figura 3B). Zwierzęta mogą być umieszczane z powrotem w klatce w celu zobrazowania w późniejszym czasie lub poddane eutanazji w celu obrazowania ex vivo. Za pomocą oprogramowania można również indywidualnie analizować masę guza u zwierzęcia (Rysunek 3B).

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie procedury BMT. (A) Schemat dla niezgodnego modelu BMT B6→BALB/c MHC. (B) Schemat współprzeszczepiania prądu stałego modelu FVB→B6. (C) Schemat dla modelu B6→BALB/c GVHD/GVL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ilustracja 2: główny model B6→BALB/c GVHD z niezgodnością MHC. Myszy BALB/c zostały śmiertelnie napromieniowane i przeszczepiono im 5 x 106 BM samodzielnie lub 0,75 x 106 limfocytów T. (A) dane dotyczące przeżycia, (B) utrata masy ciała oraz (C) dane dotyczące wyniku klinicznego biorców BM w monoterapii lub z limfocytami T. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Model HCT z jednoczesnym przeszczepem prądu stałego. BM wyizolowano z myszy WT i fB-/- B6 i zróżnicowano w DC poprzez hodowlę za pomocą GM-CSF. (A) Czystość DC badano za pomocą cytometrii przepływowej przez barwienie CD11c i MHCII. Śmiertelnie napromieniowanym biorcom witaminy B6 przeszczepiono BM (3 x 106 / mysz) oraz oczyszczone limfocyty T (1 x 106 / mysz) od dawców FVB. Biorcy otrzymali również 2 x 106 komórek WT lub fB-/- B6 BM-DC w dniu przeszczepu. Pokazane jest przeżycie (B) i wynik kliniczny (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ilustracja 4: Niezgodny model B6→BALB/c GVHD/GVL z głównym MHC. Biorcy WT BALB/c zostali przeszczepieni z TCD-BM (5 x 106/mysz) samodzielnie lub z limfocytami T ACC1+/+ lub limfocytami T ACC1+/+ (1 x 106/mysz) wyizolowanymi od myszy dawców tła B6. Ponadto biorcy otrzymywali 2 x 103 A20-luc w momencie przeszczepu. Czystość limfocytów T badano za pomocą cytometrii przepływowej poprzez barwienie żywymi/śmiertelnymi przeciwciałami przepływowymi żółci, CD3, CD4 i CD8 (A). Biorcy byli monitorowani pod kątem wzrostu guza określonego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego całego ciała (BLI) (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.