Artykuł metodologiczny

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60096

⸱

15 października 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, Freiburg, Germany, 2Institute of Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, Freiburg, Germany, 3Signalling Research Centres BIOSS and CIBSS, Freiburg, Germany, 4Logopharm GmbH, Germany

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Białka zazwyczaj pełnią funkcje biologiczne poprzez interakcje z innymi białkami, zarówno w dynamicznych zespołach białkowych, jak i jako część stabilnie utworzonych kompleksów. Ten ostatni można elegancko rozdzielić w zależności od wielkości cząsteczki za pomocą natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). Sprzężenie takich separacji z czułą spektrometrią mas (BN-MS) jest dobrze znane i teoretycznie pozwala na wyczerpującą ocenę ekstrahowalnego kompleksomu w próbkach biologicznych. Jednak takie podejście jest dość pracochłonne i zapewnia ograniczony złożony rozmiar, rozdzielczość i czułość. Ponadto jego zastosowanie pozostało ograniczone do obfitych białek mitochondrialnych i plastydowych. W związku z tym w przypadku większości białek nadal brakuje informacji na temat integracji w stabilne kompleksy białkowe. Przedstawiono zoptymalizowane podejście do profilowania kompleksomu, obejmujące separację BN-PAGE w skali preparatywnej, submilimetrowe pobieranie próbek szerokich pasów żelu za pomocą kropienia kriomikrotomu oraz analizę spektrometryczną mas z kwantyfikacją białek bez znaczników. Szczegółowo opisano procedury i narzędzia dla krytycznych etapów. Jako zastosowanie, raport opisuje analizę kompleksomową rozpuszczonej frakcji błonowej wzbogaconej w endosomy z nerek myszy, z łącznie 2545 profilowanymi białkami. Wyniki wskazują na identyfikację jednorodnych białek błonowych o niskiej liczebności, takich jak wewnątrzkomórkowe kanały jonowe, a także złożonych wzorców składania białek o wysokiej rozdzielczości, w tym izoform glikozylacji. Wyniki są zgodne z niezależnymi analizami biochemicznymi. Podsumowując, metodologia ta pozwala na kompleksową i bezstronną identyfikację (super)kompleksów białkowych i ich składu podjednostek, stanowiąc podstawę do badania stechiometrii, składania i dynamiki interakcji kompleksów białkowych w dowolnym systemie biologicznym.

Wprowadzenie

Separacja BN-PAGE została po raz pierwszy bezpośrednio sprzężona z analizą LC-MS (BN-MS) przez grupy badawcze Majeran1 i Wessels2 przy użyciu ręcznego krojenia pasów żelowych BN-PAGE. Ich analizy pozwoliły zidentyfikować szereg licznych kompleksów białek błonowych o znanym składzie podjednostek pochodzących odpowiednio z plastydów roślinnych i mitochondriów komórek HEK. Analizy te były jednak dalekie od kompleksowości i nie pozwalały na bezstronną identyfikację nowych zespołów. Od tego czasu wydajność spektrometrów masowych i metod kwantyfikacji bez znaczników znacznie się poprawiła, co umożliwiło kompleksowe analizy BN-MS. W ten sposób ukuto termin "profilowanie kompleksomowe". Na przykład Heide i współpracownicy przeanalizowali mitochondria serca szczura, identyfikując i grupując 464 białka mitochondrialne, potwierdzając w ten sposób wiele znanych zespołów. Ponadto okazało się, że TMEM126B jest nową i kluczową podjednostką określonego kompleksu montażowego3. Porównywalne wyniki (z 437 mitochondrialnymi profilami białkowymi) uzyskano w równoległym badaniu mitochondriów komórek HEK4.

Pomimo tych ulepszeń, pozostało kilka problemów, które ograniczają pełny potencjał BN-MS do profilowania kompleksomów. Głównym ograniczeniem jest efektywna rozdzielczość wielkości kompleksów, która jest określana przez dwa czynniki: (i) jakość separacji BN-PAGE, która zależy od jednorodności gradientu porów matrycy żelowej, jak również stabilność/rozpuszczalność kompleksów próbek, oraz (ii) wielkość kroku pobierania próbek żelu, która wynosi co najwyżej 1 mm przy użyciu konwencjonalnego ręcznego krojenia5, 6. Słaba rozdzielczość rozmiaru nie tylko pomija subtelne złożone izoformy i niejednorodności, ale także negatywnie wpływa na zakres dynamiki i pewność bezstronnego, de novo przypisywania i kwantyfikacji podjednostek.

Inne wyzwania obejmują precyzję kwantyfikacji białek i pokrycie rzeczywistego dynamicznego zakresu obfitości białek w próbce za pomocą analizy spektrometrii mas. W związku z tym zastosowanie profilowania kompleksomu BN-MS pozostało w dużej mierze ograniczone do próbek biologicznych o mniejszej złożoności, wysokiej ekspresji docelowych kompleksów i korzystnych właściwościach solubilizacyjnych (tj. plastydów, mitochondriów i mikroorganizmów)6,7,8,9,10.

Niedawno wprowadziliśmy BN-MS wspomagany kroniem kriomikrotomu (csBN-MS), który łączy precyzyjne submilimetrowe próbkowanie pasów żelowych BN-PAGE z kompleksową analizą MS i skomplikowanym przetwarzaniem danych MS w celu określenia profili białek z wysokim zaufaniem11. Zastosowanie preparatu błony mitochondrialnej z mózgów szczurów wykazało wcześniej niespotykaną efektywną rozdzielczość rozmiaru kompleksu i maksymalne pokrycie podjednostek kompleksu oksydacyjnego łańcucha oddechowego (OXPHOS) (tj. 90 z 90 dostępnych dla MS). W tym przykładzie zidentyfikowano również szereg nowych zespołów białkowych.

Opisane tutaj są zoptymalizowane procedury do separacji kompleksów białkowych w skali preparatywnej BN-PAGE (nie ograniczonej do konkretnego źródła biologicznego), odlewania dużych preparatywnych żeli BN-PAGE, kronia kriomikrotomu szerokich pasów żelu i przetwarzania danych MS. Skuteczność profilowania w wysokiej rozdzielczości wykazano dla preparatu kompleksu białkowego z błon wzbogaconych endosomami nerki myszy. Na koniec omówiono korzyści płynące ze zwiększenia rozdzielczości i precyzji kwantyfikacji spektrometrii mas.

Protokół

1. Preparatywna BN-PAGE

  1. Przygotowanie żelu
    1. Stosować średnio- i wielkoformatowy pionowy system elektroforezy żelowej (odległość separacji żelu >10 cm; odstęp 14 cm x 11 cm, odstęp 1,5 mm) z efektywnym chłodzeniem ustawionym na 10 °C.
    2. Odlewać liniowy lub hiperboliczny żel o gradiencie porów (przekładki 1,5-3,0 mm) za pomocą mieszającego dwukomorowego mieszalnika gradientowego napędzanego pompą (patrz Tabela materiałów i odczynników). W przedstawionym przykładzie (liniowy żel gradientowy 1%-13%):
      1. Przygotować 13 ml roztworu do przedniej komory (mieszania) składającego się z: 13% akrylamidu (z 30% roztworu podstawowego, 37,5:1,0 akrylamid:bisakrylamid), 0,75 M kwasu aminokapronowego, 50 mM Bis-Tris (pH = 7,0) i 10% glicerolu.
      2. Przygotować 10 ml roztworu do komory zbiornika składającego się z: 1% akrylamidu (z 30% roztworu podstawowego, 37,5:1,0 akryloamidu:bisakryloamidu), 0,75 M kwasu aminokapronowego, 50 mM Bis-Tris (pH = 7,0) i 0,2% detergentu CL-47.
    3. Uruchomić mieszadło i dodać 30 mikrolitrów APS (nadtlenodissiarczan amonu, 10% roztwór podstawowy) i 2,5 μl TEMED (N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina) i 2,5 mikrolitrów TEMED do roztworu w komorze przedniej. Uruchom pompę i otwórz przedni zawór (przepływ należy dostosować tak, aby zakończyć odlewanie w ciągu 10 minut). Po upływie 1 minuty dodać 90 μl APS i 5 μl TEMED do roztworu w komorze zbiornika i otworzyć przyłącze komory.
    4. Pozostawić żel do powolnej, ale dokładnej polimeryzacji przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej (RT), aby wytworzyć jednorodny gradient wielkości porów. Spolimeryzowany żel przechowywany w stanie wilgotnym można przechowywać w pozycji pionowej w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
      UWAGA: Celowo wierzch żelu będzie miał miękką/śluzowatą konsystencję. Zostanie to później usunięte, ale pozwala na płynne wejście białek do żelu, przy minimalnym ryzyku wytrącenia się białka, które w przeciwnym razie może prowadzić do artefaktów migracji (tj. smug lub wytrącania się białek).
  2. Przygotowanie i ładowanie próbki
    1. Przygotuj szczeliny załadowcze, wkładając odpowiednie przekładki (np. rurki silikonowe) między szklane płytki w celu oddzielenia 0,5-2,0 mg białka. Szczeliny powinny mieć co najmniej 3 cm szerokości (lub lepiej 5-6 cm szerokości).
    2. Rozpuścić ~2,5 mg błony (preparat wzbogacony w endosomy nerki myszy) w 2 ml buforu do rozpuszczania zawierającego 1% (w/v) niedenaturującego detergentu (ComplexioLyte CL-47) przez 30 minut na lodzie. Ultrawirówka (punkt odcięcia sedymentacji = 200 S lub mniej; stosuje się tutaj 130 000 x g/11 min).
    3. Skoncentrować solubilizat na krótkim gradiencie krokowym sacharozy 50%/20% (w/v, 0,3 ml każdy) przez ultrawirowanie przez 1 godzinę przy 400 000 x g. Ostateczna wydajność białka powinna wynosić co najmniej 1 mg.
    4. Dodać 0,05% (w/v) Coomassie G-250 do solubilizatu i załadować próbkę na żel. Ogranicz obciążenie białkiem do przekroju poprzecznego pasa żelu 10-15 μg/mm2, aby uzyskać wysoką rozdzielczość i uniknąć artefaktów wynikających z wytrącania się białek.
  3. Warunki pracy BN-PAGE
    1. Do uruchamiania należy przygotować standardowy bufor katodowy składający się z 50 mM tricine, 15 mM Bis-Tris i 0,01% Coomassie G-250. Przygotować wzorcowy bufor anodowy składający się z 50 mM Bis-Tris (pH = 7,0).
    2. Uruchom preparatywny BN-PAGE w temperaturze 10 °C przez noc, korzystając z trzystopniowego protokołu napięcia13 składającego się z: fazy równoważenia przez 30 minut przy 100 V, a następnie powolnej (3 godziny) rampy do maksymalnego napięcia (40-50 V/cm długości żelu), która jest ostatecznie utrzymywana przez co najmniej 6 godzin w celu skupienia białka w punkcie końcowym.
      UWAGA: Zaleca się wstrzymanie elektroforezy, gdy front migracji dotrze do środka żelu i wymianę bufora katodowego na świeży bufor bez Coomassie G250. Pomaga to uniknąć artefaktów wytrącania się w żelu wynikających z miejscowego zapadania się struktury porów matrycy.

2. Pobieranie próbek żelu i trawienie

  1. Wycięcie pasów żelowych
    1. Po zakończeniu pracy zeskanuj żele w celach dokumentacyjnych, trzymając je między szklanymi płytkami.
    2. Zdemontuj tablice i wytnij interesujący Cię odcinek (odcinki) pasa ruchu.
    3. Pobrać próbny pasek pasa do analizy za pomocą 2D BN/SDS-PAGE i barwienia białek lub western blotting (jak pokazano na Rysunek 1B), aby określić obszary zainteresowania, efektywną rozdzielczość rozmiaru zespolonego i obfitość białka.
    4. Utrwal wybrane pasy żelu dwukrotnie przez co najmniej 30 minut za pomocą 30% (v/v) etanolu i 15% (v/v) kwasu octowego.
    5. Przenieść próbkę do podłoża zatapiającego i pozostawić do namoczenia i zrównoważenia przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 4 °C, utrzymując płytę żelową w zwolnionym tempie na wytrząsarce orbitalnej.
      UWAGA: Separacja żelu powinna być dokładnie sprawdzona pod kątem ogólnej jakości separacji i artefaktów migracji. Paseczki żelowe reprezentujące białka dominujące powinny być wolne od zniekształceń i jednorodne pod względem intensywności. Lokalne artefakty na żelu należy wyciąć lub pominąć w analizie.
  2. Osadzanie i krojenie kriomikrotomu
    UWAGA: Jest to ulepszona wersja procedury osadzania opisanej i udokumentowanej wcześniej na zdjęciach, która pozwala na osadzanie i krojenie szerszych pasów żelu do 8 cm11.
    1. Najpierw pokrój stałe pasy żelu na sekcje (w tym przypadku 3 cm) dokładnie równolegle do wzorca migracji białka na froncie/prążku. Aby ułatwić obsługę, umieść każdą sekcję na plastikowym wsporniku z folii o równych wymiarach.
    2. Przenieś pasy do otwartej tuby z korkami (zamkniętej na dole, centralnie perforowanej na górze, obie dokładnie wyrównane z górnym i dolnym końcem sekcji żelowej).
    3. Zanurz na krótko cylinder w ciekłym azocie, aby szybko zainicjować krzepnięcie. Przezroczyste podłoże do zatapiania zestala się w ciągu kilku sekund i staje się białe.
    4. Napełnij wnękę medium do zatapiania, na krótko zanurz je w ciekłym azocie i zamroź cylinder w temperaturze -20 °C na kilka godzin.
      UWAGA: Szybkie chłodzenie butli poprzez zanurzenie jej w ciekłym azocie pomaga uniknąć przemieszczenia płyty żelowej w rurce. Należy unikać zniekształceń, aby zapewnić wysoką rozdzielczość w następującej analizie państwa członkowskiego.
    5. Po zdemontowaniu usuń folię z tworzywa sztucznego i przenieś blok z osadzoną sekcją żelową do schłodzonego metalowego cylindra o większej średnicy umieszczonego na płaskim wsporniku (tj. szalce Petriego) i uszczelnionego medium do zatapiania na zewnątrz cylindra. Napełnij cylinder medium do zatapiania i dokładnie zamroź.
    6. Powtórz tę procedurę z drugą stroną cylindra, aby uzyskać solidny blok o współpłaszczyznowych powierzchniach.
    7. Wyjmij blok z cylindra, przyklej go medium do zatapiania na wstępnie schłodzonym metalowym uchwycie i włóż uchwyt do maszyny do krioplastowania (kriotomu). Powierzchnia bloku musi być dokładnie wyrównana w stosunku do płaszczyzny krojenia. Pozwól mu zrównoważyć się w temperaturze optymalnej dla procesu krojenia (tutaj -15 °C).
      UWAGA: Użyj powoli postępującego ręcznego cyklu krojenia w kroku 0.1 mm, aż do uderzenia w powierzchnię osadzonej sekcji żelu, aby zapewnić prawidłowe ustawienie.
    8. Zbierz plastry żelu jeden po drugim, z ostateczną pożądaną grubością kroku 0,25 mm i przenieś je pojedynczo do probówek reakcyjnych o niskich właściwościach wiązania białek.
      UWAGA: W tym zestawie można łatwo uzyskać jednolite plastry żelu o grubości zaledwie 0,1 mm i 0,5 mm.
  3. Trawienie tryptyczne
    1. Przeprowadzić trawienie tryptyczne w żelu po intensywnym umyciu plastrów żelu (zaleca się co najmniej trzy dodatkowe rundy płukania w celu usunięcia składników polimerowych z podłoża do zatapiania) zgodnie ze standardową procedurą11.
    2. Suszyć próżniowo eluowane peptydy i ponownie rozpuścić w 0,5% (v/v) kwasie trifluorooctowym przez wstrząsanie w temperaturze 37 °C (10 min), a następnie sonikację kąpieli (5 min) i krótkie odwirowanie.

3. Spektrometria mas

  1. konfiguracja nanoHPLC i MS
    1. Załadować strawione próbki do kolumny C18 (wielkość cząstek = 5 μm; średnica = 300 μm) 0,05% (v/v) kwasu trifluorooctowego przy użyciu (nierozszczepionego) nano-HPLC sprzężonego ze spektrometrem mas o wysokiej rozdzielczości.
    2. Elute wychwycone peptydy o gradiencie wodno-organicznym (eluent A): 5 min 3% B, 120 min od 3% B do 30% B, 20 min od 30% B do 99% B, 5 min 99% B, 5 min od 99% B do 3% B, 15 min 3% B (natężenie przepływu = 300 nL/min).
      UWAGA: plastry żelu csBN-MS zazwyczaj dają próbki o niskiej lub pośredniej obfitości peptydów i ograniczonym stopniu złożoności. Analiza nanoLC-MS/MS powinna być zatem wykonywana z konfiguracją zapewniającą rozsądną czułość i szybkość sekwencjonowania, wysoką rozdzielczość masy (>100 000) i maksymalny zakres dynamiki (efektywnie 3-4 rzędy wielkości). Nie wymaga jednak długich wymiarów kolumny ani gradientów elucji przekraczających 3 godziny.
    3. Oddziel eluowane peptydy w emiterze (średnica wewnętrzna 75 μm; końcówka = 8 μm) ręcznie zapakowane około 20 cm materiałem C18 (wielkość cząstek = 3 μm). Próbki należy rozpylać elektrodynamicznie pod napięciem 2,3 kV (tryb jonów dodatnich) do ogrzewanej kapilary transferowej (250 °C) spektrometru mas.
    4. Wykonuj analizy z następującymi ustawieniami przyrządu11: maksymalny czas wstrzykiwania MS/MS = 400 ms; czas trwania wykluczenia = 60 s; minimalny próg sygnału = 5,000 zliczeń, 10 najlepszych prekursorów pofragmentowanych; szerokość izolacji = 1,0 m/z).
      UWAGA: Aby ułatwić kalibrację masy, czasu retencji i przypisania sygnałów peptydowych w dużej liczbie zestawów danych lub pomiarów, zaleca się wykonywanie odpowiednich serii pomiarowych MS bez przerw lub zmian parametrów i sprzętu (tj. na tej samej kolumnie/emiterze C18).
  2. Identyfikacja białka (dane MS oceniane zgodnie z wcześniejszym opisem11)
    1. Wyodrębnij listy pików z widm jonów fragmentowych za pomocą narzędzia "msconvert.exe" (część ProteoWizard).
    2. Przesunąć wszystkie wartości m/z prekursorów dla każdego zestawu danych o medianę przesunięcia m/z wszystkich peptydów przypisanych do białek we wstępnym przeszukiwaniu bazy danych z tolerancją masy peptydu 50 ppm.
    3. Przeszukaj poprawione listy pików za pomocą odpowiedniej wyszukiwarki (tutaj, Mascot 2.6.2) wśród wszystkich wpisów myszy w bazie danych UniProtKB/Swiss-Prot (wydanie 2018_11).
    4. Wybierz "Acetyl (Białko N-termin)", "Karbamidometyl (C)", "Gln | pyro-Glu (N-termin Q), Glu | piro-Glu (N-termin E)", "Utlenianie (M)" i "Propionamid (C)" jako zmienne modyfikacje.
    5. Ustaw tolerancję masy peptydu i fragmentu odpowiednio na ± 5 ppm i ± 0,8 Da i pozwól na jedno pominięte rozszczepienie tryptyczne. Ustaw wartość graniczną oczekiwanej dla identyfikacji peptydu na 0,5 lub mniej. Użyj wyszukiwania w bazie danych przynęty, aby określić współczynnik wyników fałszywie dodatnich (FDR). Ustaw FDR na 1% lub zastosuj dodatkowe kryteria jakości, aby zapewnić wiarygodną identyfikację.
      UWAGA: W przedstawionym eksperymencie zidentyfikowano ponad 3500 białek o średnim FDR peptydu wynoszącym 4,4 ± 0,77% (n = 101 próbek warstwowych) lub 3000 białek, gdy peptyd FDR był ustawiony na 1%. Co ważne, zastosowano bardziej rygorystyczne kryteria doboru profilowanych białek (2 568). Obejmował on wszystkie białka, które zostały zidentyfikowane z co najmniej dwoma peptydami, z których co najmniej jeden był specyficzny dla białka, w co najmniej jednej ze 101 próbek plasterków.
  3. Kwantyfikacja białek
    1. Użyj intensywności sygnału peptydowego (objętości pików [PV]) do kwantyfikacji białek, które uzyskuje się z pełnych skanów FT i koryguj czas retencji i przesunięcia masy za pomocą odpowiedniego oprogramowania (tutaj, MaxQuant v1.6.3).
    2. Dopasuj zestawy danych MS jeden po drugim do referencyjnych (całkowitych średnich) czasów elucji peptydów za pomocą regresji LOESS. Przypisz PV do peptydów bezpośrednio (identyfikacja na podstawie MS/MS) lub pośrednio (tj. na podstawie ich dopasowania m/z i czasu elucji w bardzo wąskich tolerancjach).
      UWAGA: Ten protokół wykorzystuje wewnętrzne oprogramowanie do przypisywania "wstawionych" peptydów nazywanych peptydami. Ustawione parametry skutkują efektywnymi tolerancjami dopasowania m/z i czasu elucji wynoszącymi odpowiednio ± 2 ppm i ± 1 min (patrz Rysunek 2A,B).
    3. Skoryguj systematyczne zmiany obciążenia peptydów i wydajności jonizacji między seriami poprzez przeskalowanie intensywności peptydów obliczone na podstawie mediany różnic względnych intensywności peptydów między sąsiednimi próbkami warstw (Rysunek 2C).
    4. Filtrowanie danych PV pod kątem wartości odstających i pozostałych wyników fałszywie dodatnich zidentyfikowanych przez wewnętrzną analizę spójności PV.
    5. Znormalizuj PV każdego peptydu do ich maksymalnych wartości we wszystkich zestawach danych wycinków, uzyskując względne profile obfitości peptydów.
    6. Na koniec oblicz względne profile obfitości białek jako średnie z co najmniej dwóch (i do sześciu lub 50%, w zależności od tego, która wartość jest większa) najlepiej korelujących profili peptydowych w oknie trzech kolejnych wycinków. Pozwala to na zniwelowanie brakujących wartości PV i zmniejszenie hałasu.
      UWAGA: Ostatecznie zaowocowało to 2 545 (z 2 568 wstępnie wybranych) profilami białkowymi (Rysunek 2D).
  4. Charakterystyka kompleksów białkowych
    1. Analizuj profile białek, najpierw wykrywając piki przy użyciu metody maksimów lokalnych, a następnie dopasuj rozkłady normalne do tych pików, uzyskując pozycję (tj. indeks wycinka lub pozorny rozmiar zespolony) ich maksimów i wartości FWHM (pełna szerokość przy połowie maksymalnej intensywności) (wstawka Rysunek 4).
      UWAGA: W zestawie danych profile są analizowane automatycznie przy użyciu skryptów niestandardowych. Najmniejsze wartości FWHM wskazują na efektywną rozdzielczość rozmiaru podejścia (tutaj 6 x 0,25 = 1,5 mm).
    2. Użyj referencyjnych pików kompleksu białkowego o zdefiniowanej masie cząsteczkowej (zgodnie z informacją zawartą w bazie danych UniProtKB/Swiss-Prot ) do analizy regresji liniowej wartości log10 (przewidywana masa cząsteczkowa) w celu przeliczenia wskaźników liczby wycinków na pozorne rozmiary molekularne (tj. pozorny rozmiar kompleksu w kDa).
      UWAGA: W tym badaniu wybrano 23 kompleksy markerowe w próbce (Rysunek 4) na podstawie (i) monodyspersyjnych kształtów pików profilu, (ii) eksperymentalnego wsparcia mas cząsteczkowych oraz (iii) rozkładów wzdłuż badanych odcinków żelu BN-PAGE.

Wyniki

Zdecydowana większość konwencjonalnych badań BN-MS, a także niedawno opracowana metoda wysokorozdzielczego csBN-MS, była stosowana w odniesieniu do preparatów mitochondriów i plastydów, które (i) są łatwo dostępne, (ii) charakteryzują się ograniczoną złożonością oraz (iii) wykazują wysoką gęstość docelowych kompleksów białek (błonowych). Niniejszy protokół rozszerza zastosowanie wysokorozdzielczego profilowania kompleksomów na błony pozymitochondrialne zawierające białka o niskiej obfitości, na temat których integracji w kompleksy dostępnych jest niewiele informacji. W celach demonstracyjnych wykorzystano preparat błon wzbogaconych w endosomy z nerką myszy, otrzymany za pomocą wirowania w gradiencie gęstości.

Optymalizacja tego przygotowania była prowadzona w oparciu o białko markerowe TPC1, które tworzy wewnątrzkomórkowe kanały jonowe zlokalizowane głównie w endosomach wczesnych i recyklingujących12. Jest ono również silnie ekspresjonowane w komórkach cewek bliższych nerek, co wykazano w analizie immunohistochemicznej przekrojów tkanki nerek (Rycina 1A). Membrany te poddano łagodnej solubilizacji (ComplexioLyte 47 przy niskim stosunku białka do detergentu wynoszącym 1:8) i zagęszczono na poduszce sacharozowej za pomocą ultrawirowania. Ten ostatni etap okazał się istotny dla usunięcia nadmiaru komponentów o niskiej masie cząsteczkowej (np. detergentów, lipidów, soli, polimerów organicznych i metabolitów), które mają tendencję do negatywnego wpływu na rozdzielczość preparatywnych rozdzialeń BN-PAGE.

Rozdział kompleksów na natywnym żelu gradientowym z poliakryloamidu 1%-13% (w/v) (Rycina 1B, panel środkowy) wykazał intensywnie barwione prążki białkowe przy bardzo niewielkiej liczbie artefaktów migracji. Rozdział SDS-PAGE wąskiego paska żelu BN-PAGE (Rycina 1B, ramka zaznaczona na czerwono) jako drugiej wymiarowości, a następnie analiza western blot, wykazały dobrze rozdzielony wzorzec odrębnych populacji kompleksów związanych z TPC1 (Rycina 1B, panel górny, zaznaczone czerwonymi strzałkami), co najprawdopodobniej wynika z powiązań z dodatkowymi podjednostkami białkowymi i/lub modyfikacjami potranslacyjnych (takimi jak glikozylacja12). Wycięto, utrwalono i przygotowano do cięcia kriomikrotomem fragment żelu o długości 3 cm, zgodnie z opisem11. Poszczególne etapy tej procedury (w szczególności precyzyjne wyrównanie szerokiego fragmentu żelu), które mają krytyczne znaczenie dla zachowania rozdzielczości podczas pobierania próbek, zostały udokumentowane w towarzyszącym filmie. Osadzony fragment żelu został ostatecznie pocięty na 101 plastrów żelu o jednolitej grubości 0,25 mm (Rycina 1B, panel dolny), które poddano osobnej digestii i analizie za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS).

Oprócz rozdzielczości wielkości, kluczem do pomyślnego profilowania kompleksomu jest jakość ilościowego oznaczania białek. Przy zastosowanej konfiguracji i ustawieniach MS analiza próbek była bardzo kompleksowa, co pozwoliło na średnią identyfikację ponad 1 000 białek i 10 000 peptydów (z czego 8 200 było specyficznych dla białek) na frakcję oraz łącznie około 3 000 białek i 43 000 peptydów (z czego 38 500 było specyficznych dla białek). Niemniej jednak, ze względu na stochastyczny charakter sekwencjonowania MS/MS zależnego od danych oraz jego ograniczenia w zakresie dynamicznym, informacje o intensywności w przypadku białek o niższej zawartości były nadal fragmentaryczne. Dlatego przeprowadzono rozbudowaną procedurę przetwarzania danych MS11, opartą na precyzyjnym przypisaniu sygnałów peptydowych (objętości piku [PVs] = intensywności sygnałów związanych z peptydami zintegrowane względem m/z i czasu) w całej serii zbiorów danych.

Jak pokazano na Rysunku 2A,B, odchylenia sygnałów peptydowych w zakresie masy i czasu retencji, które pozostały po kalibracji, były identyczne dla PV sekwencjonowanych metodą MS oraz dla PV przypisanych pośrednio (przy bardzo wąskich tolerancjach <1 ppm i <0,5 min dla 95% PV), co wskazuje na bardzo niski odsetek fałszywie dodatnich przypisań PV. Pozostałe wartości odstające zostały odfiltrowane na podstawie ich spójności z innymi powiązanymi PV. Ponieważ wszystkie pomiary MS były wykonywane sekwencyjnie na tym samym układzie LC-MS bez zmian parametrów lub komponentów sprzętowych, wariacje między poszczególnymi przebiegami (wyznaczone jako mediana wszystkich intensywności PV w próbce względem tych w sąsiednich plastrach) były niewielkie i łatwo wyeliminowane poprzez przeskalowanie zbiorów danych PV (Rysunek 2C). Wynikowe informacje o intensywności peptydów zostały następnie wykorzystane do rekonstrukcji profili względnej liczności dla 2 545 białek. Jak pokazano na Rysunku 2D, ponad 75% tych profili białkowych oparto na co najmniej trzech niezależnych peptydach specyficznych dla danego białka.

Następnie w protokole oceniono znaczenie wielkości kroku próbkowania żelu BN-PAGE dla rozdzielczości kompleksów białkowych. W tym celu zestawy danych z plastrów połączono poprzez sumowanie informacji PV z dwóch, trzech lub czterech kolejnych plastrów, symulując tym samym wyniki dla kroków o wielkości 0,5 mm, 0,75 mm i 1 mm (w porównaniu z oryginalnym próbkowaniem 0,25 mm). Rycina 3 przedstawia wynikowe profile obfitości dla białka TPC1 jako przykład (A-D). Przy 0,25 mm względne intensywności i rozdzielenie wielkości populacji kompleksów związanych z TPC1 (Rycina 3A) były zgodne z wynikami analizy western blot (Rycina 1B, górny panel); mimo to profil wykazywał pewien szum, wynikający głównie z brakujących wartości („luk”) w macierzy PV użytej do kwantyfikacji.

Połączenie dwóch plastrów o grubości 0,5 mm pozwoliło na zachowanie prawidłowej intensywności oraz separacji kompleksów związanych z TPC1 i wyeliminowało szum kwantyfikacji (Rycina 3B). Z kolei większe kroki o wartości 0,75 mm i 1 mm (Rycina 3C,D) doprowadziły do utraty rozdzielczości wielkościowej i uniemożliwiły rozróżnienie subpopulacji kompleksów TPC1. Należy zauważyć, że zdecydowana większość opublikowanych konwencjonalnych analiz BN-MS wykorzystuje plastry wycinane ręcznie o grubości 2 mm (około 60 w celu pokrycia całej ścieżki żelu)7,8,9,10.

Konwersja dystansu migracji lub indeksu warstwy (slice index) na wielkość cząsteczkową opiera się zazwyczaj na markerach, które mogą być komercyjnie dostępnymi natywnymi białkami standardowymi lub dobrze scharakteryzowanymi endogennymi kompleksami białkowymi o znanym składzie podjednostek (głównie [super]kompleksami mitochondrialnego łańcucha oddechowego [OXPHOS])13. Jednakże, ponieważ rozdział w technice BN-PAGE opiera się na efektywnym przekroju cząsteczkowym, który jest determinowany nie tylko przez masę cząsteczkową, ale także przez strukturę 3D oraz liczbę związanych lipidów, detergentu i cząsteczek Coomassie, poszczególne białka mogą wykazywać większe odchylenia. W związku z tym zdecydowano się na zastosowanie większych zestawów kompleksów białkowych jako markerów11. Wykres na Rysunku 4 przedstawia 23 wybrane markery z reprezentatywną podjednostką zaznaczoną czarnym kółkiem, wskazując wartości log10 ich przewidywanej masy cząsteczkowej (według bazy danych UniProtKB/Swiss-Prot) w stosunku do indeksu warstwy maksymalnego piku odpowiadającego profilu. Te ostatnie uzyskano za pomocą zautomatyzowanych dopasowań gaussowskich do danych o względnej obfitości, co pokazano na wstawce do Rysunku 4 na przykładzie chaperonu BCS1. Regresja liniowa (czerwona linia) pozwoliła na wyznaczenie funkcji konwertującej wartości indeksu warstwy na pozornych wielkości cząsteczkowe, które w badanym fragmencie żelu mieściły się w zakresie 160-630 kDa.

Wreszcie analiza dostarczyła informacji na temat dobrze scharakteryzowanych kompleksów oraz wykazała istnienie nowych podjednostek i zgromadzeń kompleksowych. Przykłady podkreślające różne aspekty kompleksomu przedstawiono na Rysunku 5 (A-C: białka ekspresowane lub preferencyjnie zlokalizowane w przedziałach endosomalnych; D-F: kompleksy z innych lokalizacji subkomórkowych). Białko transportujące żelazo, ferrytyna, znane jest z tworzenia kompleksów z 24 podjednostek lekkich (FRIL1) i/lub ciężkich (FRIH), o całkowitej masie cząsteczkowej 440 kDa14 (Rysunek 5A, wypełniona strzałka). Profile podjednostek (Rysunek 5A) sugerują istnienie co najmniej dwóch mniejszych form kompleksu (o pozornej masie 360 kDa i 340 kDa; puste strzałki) o odmiennej stechiometrii łańcuchów ciężkich/lekkich (lepiej widoczne po przeskalowaniu obfitości, wstawka na Rysunku 5A), które są obficie obecne w endosomach.

Z kolei kompleksy nicalin-nomo115 (Rysunek 5D), kompleks rdzeniowy gamma-sekretazy16 (Rysunek 5B) oraz aparatura GPI-transamidazy17 (Rysunek 5E) wykazują stałe stosunki obfitości swoich podjednostek rdzeniowych w całym zakresie rozmiarów, niezależnie od asocjacji z dodatkowymi białkami. Wskazuje to, że ich podjednostki są dla siebie wzajemnie ekskluzywne. Wakuolarne H+-ATPazy są kompleksami wielobiałkowymi składanymi z puli ponad 20 podjednostek w sposób modułowy, o całkowitej masie cząsteczkowej około 900 kDa. Rysunek 5C ujawnia podkompleksy o odmiennych składach, złożone z co najmniej 17 podjednostek, które reprezentują albo biologiczne produkty pośrednie procesu składania (lub rozkładu), albo podkompleksy powstałe w wyniku warunków eksperymentalnych, z których niektóre zaobserwowano również w niedawnej analizie BN-MS18. Innym przykładem kompleksu wielobiałkowego jest proteasom19 (Rysunek 5F). Szczegółowa analiza profili obfitości podjednostek alfa i beta tworzących rdzeń proteasomu 20S sugeruje istnienie dwóch głównych populacji kompleksów z niewielkimi różnicami w rozmiarze (590 kDa i 575 kDa, zaznaczone szarymi strzałkami) oraz w integracji trzech podjednostek beta.

Podsumowując, profilowanie kompleksomów metodą csBN-MS w membranach nerek wzbogaconych w endosomy dostarcza kompleksowych i szczegółowych wyników dotyczących (i) integracji jednolitych, niskoobfitych białek docelowych w kompleksy, (ii) ogólnego składu i stechiometrii podjednostek kompleksów oraz (iii) heterogeniczności kompleksów, ich podstruktur i produktów pośrednich procesu montażu i demontażu.

Schemat mikroskopii konfokalnej i BN-PAGE przedstawiający lokalizację białek i wyniki elektroforezy żelowej.
Rysunek 1: Preparatywna separacja BN-PAGE solubilizowanych błon wzbogaconych w endosomy z nerki mysiej z wykorzystaniem wewnątrzkomórkowego kanału TPC1 jako markera. (A) Lokalizacja immunohistochemiczna białka TPC1 w cewkach bliższych nerek za pomocą mikroskopii konfokalnej. Kolor zielony: barwienie przeciwciałem anty-TPC112 wizualizowane za pomocą wtórnego biotynilowanego koziego przeciwciała anty-króliczego IgG Cy3; kolor czerwony: biotynilowana lektyna Lotus tetragonolobus (LTL, 10 µg/mL, sprzężona z FITC) znakująca powierzchnię luminalną komórek cewek bliższych. Wstawka przedstawia barwienie odpowiadającego przekroju z nerki TPC1-KO jako kontroli negatywnej. Białe paski skali wynoszą 20 µm. Należy również zwrócić uwagę na silną ekspresję TPC1 w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych, które na podstawie niezależnych eksperymentów zidentyfikowano jako wczesne endosomy i endosomy recyklingowe12. (B) Preparatywna separacja BN-PAGE 2,5 mg solubilizowanych błon wzbogaconych w endosomy na żelu gradientowym z poliakryloamidu 1%-13% (w/v). Wąski pas (obramowany na czerwono) został wycięty do późniejszej analizy SDS-PAGE/western blot (panel górny), rozdzielając różne kompleksy związane z TPC1 i wzorce glikozylacji (czerwone strzałki: anty-TPC1/anty-królicze HRP/ECL prime; kolor zielony: pozycje i przewidywane masy [MDa] markerowych kompleksów białkowych zidentyfikowanych poprzez barwienie całkowitego białka [barwienie żelu SYPRO Ruby]). Od prawej do lewej: ATP-aza Na+/K+-transportująca, dimer kompleksu cytochromu b-c1, syntaza ATP, NADH:ubichinon oksydoreduktaza. Odcinek obszaru zainteresowania o długości 3 cm z pasa żelu został wycięty, zatopiony w medium do zatapiania tkanek, zamocowany i pocięty na 101 sekcji (0,25 mm) wzdłuż frontu migracji białek przy użyciu kriomikrotomu (panel dolny; patrz link do wideo). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki spektrometrii masowej; wykresy pokazują rozkład liczby jonów, wykres kołowy przedstawia ilościowe oznaczenie peptydów.
Rycina 2: Kluczowe parametry determinujące dokładność przypisania sygnału MS i ilościowego oznaczenia, a także głębokość analizy. (A) Rozkład względnych błędów masy (w ppm) po kalibracji m/z sygnałów peptydowych zsekwencjonowanych za pomocą MS/MS (słupki czerwone) oraz przypisanych pośrednio (tj. na podstawie ściśle dopasowanych mas i czasów retencji, patrz protokół; słupki niebieskie). Sugeruje to końcowy błąd masy <1 ppm (dla 95% sygnałów/przypisanych PV) i bardzo niski odsetek fałszywie dodatnich przypisań. (B) Rozkład odchyleń czasu retencji nano-HPLC od średniej całkowitej po wyrównaniu czasu elucji sygnałów peptydowych przy użyciu regresji Loess (patrz protokół) i kodowaniu kolorystycznym zastosowanym w (A). Błąd czasu jest mniejszy niż 30 s dla >95% sygnałów peptydowych/przypisanych PV. (C) Zmienność całkowitych intensywności MS między poszczególnymi przebiegami, przedstawiona względem średniej z dwóch sąsiednich próbek. Współczynniki skalujące te zostały zastosowane do surowych tabel PV w celu zminimalizowania systematycznych błędów technicznych. (D) Informacje o peptydach wykorzystane do obliczenia profili względnej obfitości białek. Po odfiltrowaniu peptydów specyficznych dla białek pod kątem wartości odstających, niskiej oceny lub pojedynczych identyfikacji (patrz protokół), wyznaczono 2 545 profili obfitości białek, z czego >75% oparto na co najmniej trzech peptydach o rozsądnym stopniu pewności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres względnej obfitości w funkcji indeksu plastra, pokazujący zmienność tekstury przy różnych grubościach.
Rycina 3: Krytyczny wpływ wielkości kroku w pobieraniu próbek z żelu na rozdzielczość kompleksomu TPC1. Zbiory danych zostały połączone poprzez sumowanie intensywności sygnału w grupach 1, 2, 3 i 4 kolejnych plastrów (odpowiednio A-D) i przetworzone w identyczny sposób, aby zasymulować różne wielkości kroku w wycinaniu żelu, zgodnie z oznaczeniami. Profil TPC1 wykazuje pewien szum (nadpróbkowanie) przy 0,25 mm, ale dobrą rozdzielczość wielkości trzech populacji kompleksów (patrz również Rycina 1B), która jest w dużej mierze zachowana przy szerokości kroku 0,5 mm. Rozróżnienie tych populacji zanika w miarę zbliżania się do 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza kompleksów białkowych, wykres log(MW) względem indeksu plastra, wstawka z obfitością BCS1, obfitość względna.
Rycina 4: Wyznaczanie pozornej masy cząsteczkowej. W качестве markerów wielkości zastosowano 23 kompleksy markerowe o zdefiniowanym składzie cząsteczkowym (zgodnie z UniProtKB/Swiss-Prot). Logarytmiczne wartości ich oczekiwanych mas cząsteczkowych (w kDa) wykreślono vs. indeks plastra maksimum piku profilu dla wskazanej reprezentatywnej podjednostki białkowej (czarne wypełnione kółka). Dopasowanie regresji liniowej do tych danych (czerwona linia) pozwoliło uzyskać funkcję przeliczającą wartości indeksu plastra na pozorne masy cząsteczkowe. Maksima pików wyznaczono za pomocą zautomatyzowanego dopasowania funkcji Gaussa do pików profilu białek, co przedstawiono we wstawce (po prawej) dla białka opiekuńczego BCS1 (dane pierwotne na niebiesko, granice dopasowania zaznaczone pomarańczowymi liniami, funkcja dopasowania na czerwono). Dodatkowo dopasowania te pozwoliły wyznaczyć szerokości połowiczne pików (zielona linia, 6,5 plastra, czyli 1,6 mm dla pokazanego przykładu), przy czym kompleksy o najostrzejszym ogniskowaniu obejmowały około 1,5 mm żelu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza kompleksów białkowych; wykres obfitości w funkcji masy cząsteczkowej; dane dla γ-sekretazy i proteasomu.
Rysunek 5: Przykłady profili podjednostek kompleksów białkowych. Względna obfitość białek vs. pozorna masa cząsteczkowa przedstawiona dla ciężkiego i lekkiego łańcucha ferrytyny (A), wykazująca heterogeniczność molekularną stechiometrii podjednostek ferrytyny, bardziej widoczna po przeskalowaniu obfitości (wstawka). Wypełniona strzałka i puste strzałki oznaczają odpowiednio pełny kompleks (440 kDa) i dwa podkompleksy. Podjednostki gamma-sekretazy (B) ilościowo zintegrowane w jedną populację kompleksów rdzeniowych. Podkompleksy wakuolarnych H+-ATPAz (C) wykazały wiele zgromadzeń o odmiennym składzie podjednostek, wszystkie ekspresowane w endosomach. Białka nomo1 i nicalina (D) tworzyły wyłączny kompleks (transamidazę GPI), która jest wielopodjednostkowym mechanizmem enzymatycznym tworzącym kilka kompleksów. (E) Rdzeniowy kompleks proteasomu 20S wykazujący (F) subtelny wzorzec podkompleksów z dwiema populacjami wskazanymi szarymi strzałkami, wszystkie pochodzące z innych lokalizacji subkomórkowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Prezentowane badanie opierało się na technice csBN-MS, którą wcześniej porównywano z preparatem mitochondrialnym11 i zawierało ulepszenia w przygotowaniu próbek, przetwarzaniu żelu i ocenie danych dotyczących stwardnienia rozsianego. Ukierunkowana analiza fragmentu żelu BN-PAGE do separacji na dużą skalę dostarczyła kompleksowego zestawu danych pokazujących pomiary jakości porównywalne z badaniem z błonami mitochondrialnymi. Błędy masy i czasu retencji, a także wahania między seriami były utrzymywane na bardzo niskim poziomie i stanowiły podstawę do określenia wiarygodnych profili obfitości białka. Rozdzielczość rozmiaru wydawała się być dobra, z połową maksymalnej szerokości piku wynoszącą zaledwie sześć warstw (co odpowiada 1,5 mm, Rysunek 4) i względnymi różnicami wielkości mniejszymi niż 10% rozdzielczości (Rysunek 3, Rysunek 5A). Wartości te nie odpowiadały w pełni jakości rozdzielczości wielkości poprzedniej analizy mitochondriów csBN-MS (pomimo wybranego mniejszego rozmiaru kroku próbkowania żelu), ale są znacznie lepsze niż wydajność konwencjonalnych podejść BN-MS lub MS z wykluczeniem wielkości20 , które stały się ostatnio popularne.

Znaczenie wysokiej efektywnej rozdzielczości rozmiaru kompleksu zostało podkreślone przez eksperyment symulacyjny na rysunku 3 (wykorzystujący kompleksy związane z TPC1), który z trudem może być rozwiązany za pomocą analizy western blot 2D BN/SDS-PAGE (rysunek 1B). Wyniki te sugerują, że krojenie o 0,25 mm w tym przypadku skutkowało pewnym nadpróbkowaniem, ale nadal okazało się to przydatne do eliminacji "szumu kwantyfikacji" bez uszczerbku dla efektywnej rozdzielczości rozmiaru. W związku z tym, zgodnie z poprzednimi wynikami11, ogólnie zalecana jest wielkość kroku pobierania próbek wynosząca ~0,3 mm.

Warto zauważyć, że dyskryminacja kompleksów związanych z TPC1 jest całkowicie utracona przy pobieraniu próbek żelu o średnicy 1 mm, co jest najmniejszym krokiem zapewnionym przez ręczne krojenie w konwencjonalnym BN-MS 5,6. Może to wyjaśniać fakt, że pomimo dostępności potężnych technologii SM, bardzo niewiele kompleksów i podjednostek białkowych zostało zidentyfikowanych de novo za pomocą profilowania kompleksomów. Oprócz dobrej zdolności rozdzielczej, csBN-MS oferuje dużą wszechstronność. Kompleksy związane z błoną i rozpuszczalne kompleksy białkowe w zakresie od 50 kDa do kilku MDa można skutecznie rozwiązać w jednym eksperymencie przy minimalnym odchyleniu11. Kontrastuje to z alternatywnymi technikami separacji stosowanymi do profilowania kompleksomów, takimi jak wykluczanie wielkości lub chromatografia jonowymienna, które działają na podzbiorach rozpuszczalnych białek o określonych zakresach wielkości lub właściwościach ładunku. Z drugiej strony, csBN-MS jest mniej skalowalny (maksymalne obciążenie ~3 mg białka na żel), może być trudny technicznie i nie może być zautomatyzowany.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki pokazują, że profilowanie kompleksomu oparte na csBN-MS może być z powodzeniem stosowane do celów niemitochondrialnych, ale wskazuje również na pewne związane z tym wyzwania. W związku z tym wydajna ekstrakcja i stabilność biochemiczna kompleksów białkowych wymagają większej optymalizacji i etapów czyszczenia i mogą być nadal ograniczone. W badanym oknie wielkości liczba dobrze skoncentrowanych, monodyspersyjnych kompleksów białkowych była rzeczywiście znacznie niższa (dane nie pokazane) w porównaniu z próbką mitochondrialną. Zaleca się również zmniejszenie wsadu próbki BN-PAGE w celu uzyskania akceptowalnej separacji żelu. Większe obciążenia mogą wymagać szerszych pasów żelowych, które są trudniejsze do prawidłowej obróbki w celu krojenia (patrz załączony film). Co więcej, złożoność białek w próbkach była wyższa (około dwukrotnie) niż w przypadku trawienia warstw pochodzących z mitochondriów, co prowadziło do większej liczby brakujących wartości PV i zmniejszonego zakresu dynamiki. W rzeczywistości w analizach brakowało niektórych małych białek, które miały być częścią kompleksów pokazanych na rysunku 5. Problemy te można rozwiązać w przyszłości, stosując szybsze i bardziej czułe instrumenty MS lub tryby akwizycji niezależne od danych.

Przygotowanie próbki ma kluczowe znaczenie dla wydobycia kompleksu białkowego, stabilności i jakości separacji żelu. Parametry i procedury powinny być zoptymalizowane dla każdej tkanki źródłowej, lizatu komórkowego, błony (frakcji) i kompleksu białkowego, który jest przedmiotem zainteresowania. Podano następujące ogólne zalecenia, które mogą pomóc w rozszerzeniu zastosowań csBN-MS:

(i) Przygotowywanie próbek w stanie świeżym i unikanie ocieplania/zamrażania, silnych rozcieńczeń, zmian warunków buforowych i niepotrzebnych opóźnień;

(ii) stosowanie, które są zasadniczo pozbawione soli (zastąpić 500-750 mM betainy lub kwasem aminokapronowym), o pH obojętnym i zawierające do 1% (w/v) detergentu niedenaturującego (stosunek białka do detergentu między 1:4-1:10 do rozpuszczania kompleksów białek błonowych, nie jest wymagany detergent do rozpuszczalnych kompleksów białkowych);

(iii) Staranne testowanie i dostosowywanie warunków detergentu za pomocą analitycznego BN-PAGE, ponieważ mogą one silnie wpływać na efektywność solubilizacji kompleksów, reprezentację kompleksów białek błonowych w próbce, stabilność i jednorodność miceli białkowo-detergentowych. Te ostatnie są warunkiem wstępnym, aby białka skupiły się jako odrębne prążki/złożone populacje w żelach BN-PAGE. Dotychczasowa literatura oferuje szeroką gamę neutralnych detergentów. Jednak DDM (n-dodecyl β-d-maltozyd)1,2,4,5,6 i digitonina 3,5,7,8,9,10,13,18 były do tej pory najpopularniejszymi wyborami do analiz BN-MS. Należy podkreślić, że każdy stan detergentu z konieczności stanowi kompromis między wydajnością solubilizacji a zachowaniem interakcji białkowych i może nie być jednakowo odpowiedni dla wszystkich rodzajów białka docelowego i materiału źródłowego;

(iv) Usuwanie naładowanych polimerów, takich jak fibryle, włókna, polilizyna, DNA i obfite składniki o niższej masie cząsteczkowej (tj. metabolity, lipidy lub peptydy). Można to osiągnąć poprzez ultrawirowanie, filtrację żelową lub dializę. Jest to szczególnie ważne w przypadku całkowitych lizatów komórkowych lub tkankowych;

(v) Dodanie Coomassie G-250 (stężenie końcowe 0,05%-0,1%) i sacharozy (w celu zwiększenia gęstości do obciążenia, stężenie końcowe 10%-20% [w/v]) do próbki tuż przed załadowaniem, w celu oczyszczenia przez krótkie ultrawirowanie, załadować próbkę bez zakłóceń i natychmiast po tym rozpocząć cykl.

W perspektywie przyszłości, profilowanie kompleksomu oparte na csBN-MS oferuje opcje multipleksowania w celu badania dynamiki kompleksów białkowych lub zmian związanych z określonymi warunkami biologicznymi. Połączona separacja próbek znakowanych metabolicznie, zgodnie z propozycją profilowania opartego na wykluczeniuwielkości21 , wydaje się prosta, ale może być utrudniona przez spontaniczną wymianę podjednostek w kompleksach zachodzących niezależnie od zastosowanej metody separacji. Alternatywnie, znakowane próbki mogą być rozpuszczane w sąsiednich pasach żelowych, które mogą być następnie krojone lub łączone po trawieniu w celu analizy różnicowej o wysokiej czułości i wytrzymałości.

Oświadczenia

Autor, Uwe Schulte, jest pracownikiem i udziałowcem firmy Logopharm GmbH, która produkuje ComplexioLyte 47 wykorzystany w tym badaniu. Firma dostarcza odczynniki ComplexioLyte instytucjom akademickim na zasadzie non-profit.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) - Project-ID 403222702 - SFB 1381 oraz w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości CIBSS - EXC-2189 - Project ID 390939984. Dziękujemy Katji Zappe za pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
30% roztwór akrylamidu/bis, 37,5:1Bio Rad#1610158Zalecany do gradientowych roztworów żelowych akryloamidu do 13%
30% Roztwór akrylamidu/bis, 19:1Bio Rad#1610154Zalecany do gradientowych roztworów żelowych akryloamidu >13%
SYPRO Barwnik białkiem rubinowymBio Rad#1703127Całkowite barwienie białkowe na błonach blotów; czułe i kompatybilne z immunodetekcją
Coomassie Brilliant Blue G-250Servano. 35050Odwirować roztwory podstawowe przed użyciem
ComplexioLyte 47LogopharmCL-47-01Gotowy do użycia bufor detergentowy (1%) do łagodnej solubilizacji białek błonowych
Medium do zatapiania / Medium do zamrażania tkanekLeica Biosystems14020108926Podłoże do zatapiania skrawków żelu do krojenia za pomocą kriomikrotomu
Membrana Immobilon-P, PVDF, 0,45 &mikro; mOdczynnik do
GE HealthcareRPN2232
Plastikowa strzykawka z gumowym korkiem, 20-30 mlb.a.n.a.dowolnydostawca, ważny do produkcji żelu narzędzie do zatapiania sekcji żelu
szeroka żyletkab.a.n.a.dowolnydostawca, do przycinania żelu BN-PAGE / wycinania pasów
metalowa rurka / cylinder, ok. 4 cm długan.a.n.a.molddo zatapiania i zamrażania próbek żelu
Protein LoBind Tubes, 1,5 mlEppendorfNr. 0030108116zdecydowanie zaleca się zminimalizowanie utraty białka/peptydu z powodu
zmodyfikowanej trypsyny do sekwencjonowaniaPrekolumna PromegaV5111
C18 PepMap100, wielkość cząstek 5 i mikro; mEmiter Dionex / Thermo ScientificP/N 160454
PicoTip (i.d. 75 µ m; Wskazówka 8 & mikro; m)Nowy obiektywFS360-75-8
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µ m)Dr. Maisch GmbHr13.93.Kolumny pakowane ręcznie
królicze przeciwciało anty-TPC1Gramsch Laboratoriesprodukcja na zamówienieopisana w Castonguay, et al., 2017 (odniesienie 12)
Cy3-biotynylowane kozie przeciwciało anty-królicze IgGVectorLaboratories CY-1300opisane w Castonguay, et al., 2017 (odniesienie 12)
biotynylowana lektyna Lotus tetragonolobus, FITC-sprzężoneVector Laboratories#B1325opisane w Castonguay, et al., 2017 ( Odniesienie 12)
kriomikrotom Leica CM1950Leica Biosystems14047743905
Mini Protean II Cell z modułem wetblotBio Radn.a.dla SDS-PAGE i Westernblot (już nie sprzedawany)
System elektroforezy Penguin Midi GelPeqLabn.a.dla BN-PAGE (już nie sprzedawany)
Mikroskop Zeiss Axiovert 200 M + Fotometria Aparat cyfrowy Coolsnap 2Zeiss / Fotometrian.a.pompa
perystaltyczna (IP wysoka precyzja wielokanałowa)IsmatecISM940do odlewania gradientowych żeli poliakrylamidowych
mieszalnik gradientowy z mieszaniem (dwie komory)własnej roboty, alternatywnie Bio Rad1652000 lub 1652001do odlewania gradientowych żeli poliakrylamidowych, ręczny dostarcza instrukcje do odlewania liniowych lub hiperbolicznych żeli gradientowych (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)
ultrawirówka Sorvall M120 z wirnikiem S80 AT3Sorvall / Thermo Scientificn.a.do przygotowania próbek (już nie sprzedawana)
UltiMate 3000 RSLCnano HPLCDionex / Thermo ScientificULTIM3000RSLCNANO
Orbitrap Elite spektrometr masowyThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMAZQ
wykrywania blottingu ECL Prime IPVH00010 forma absorpcyjnego

Bibliografia

  1. Majeran, W., et al. Consequences of C4 Differentiation for Chloroplast Membrane Proteomes in Maize Mesophyll and Bundle Sheath Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 7, 1609-1638 (2008).
  2. Wessels, H. J., et al. LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes. Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).
  3. Heide, H., et al. Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex. Cell Metabolism. 16 (4), 538-549 (2012).
  4. Wessels, H. J., et al. Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling. PLoS ONE. 8 (7), e68340(2013).
  5. Wöhlbrand, L., et al. Analysis of membrane-protein complexes of the marine sulfate reducer Desulfobacula toluolica Tol2 by 1D blue native-PAGE complexome profiling and 2D blue native-/SDS-PAGE. Proteomics. 16 (6), 973-988 (2016).
  6. Takabayashi, A., et al. PCoM-DB Update: A Protein Co-Migration Database for Photosynthetic Organisms. Plant and Cell Physiology. 58 (1), e10(2017).
  7. Senkler, J., et al. The mitochondrial complexome of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 89 (6), 1079-1092 (2017).
  8. de Almeida, N. M., et al. Membrane-bound electron transport systems of an anammox bacterium: A complexome analysis. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (10), 1694-1704 (2016).
  9. Anand, R., Strecker, V., Urbach, J., Wittig, I., Reichert, A. S. Mic13 Is Essential for Formation of Crista Junctions in Mammalian Cells. PLoS ONE. 11 (8), e0160258(2016).
  10. Eydt, K., Davies, K. M., Behrendt, C., Wittig, I., Reichert, A. S. Cristae architecture is determined by an interplay of the MICOS complex and the F1FO ATP synthase via Mic27 and Mic10. Microbial Cell. 4 (8), 259-272 (2017).
  11. Müller, C. S., et al. Cryoslicing Blue Native-Mass Spectrometry (csBN-MS), a Novel Technology for High Resolution Complexome Profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 669-681 (2016).
  12. Castonguay, J., et al. The two-pore channel TPC1 is required for efficient protein processing through early and recycling endosomes. Scientific Reports. 7 (1), 10038(2017).
  13. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  14. Banyard, S. H., Stammers, D. K., Harrison, P. M. Electron density map of apoferritin at 2.8-A resolution. Nature. 271 (5642), 282-284 (1978).
  15. Dettmer, U., et al. Transmembrane protein 147 (TMEM147) is a novel component of the Nicalin-NOMO protein complex. The Journal of Biological Chemistry. 285 (34), 26174-26181 (2010).
  16. Kimberly, W. T., et al. Gamma-secretase is a membrane protein complex comprised of presenilin, nicastrin Aph-1, and Pen-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6382-6387 (2003).
  17. Hong, Y., et al. Human PIG-U and yeast Cdc91p are the fifth subunit of GPI transamidase that attaches GPI-anchors to proteins. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1780-1789 (2003).
  18. Van Damme, T., et al. Mutations in ATP6V1E1 or ATP6V1A Cause Autosomal-Recessive Cutis Laxa. The American Journal of Human Genetics. 100 (2), 216-227 (2017).
  19. Budenholzer, L., Cheng, C. L., Li, Y., Hochstrasser, M. Proteasome Structure and Assembly. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3500-3524 (2017).
  20. Heusel, M., et al. Complex-centric proteome profiling by SEC-SWATH-MS. Molecular Systems Biology. 15 (1), e8438(2019).
  21. Kristensen, A. R., Gsponer, J., Forster, L. J. A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome. Nature Methods. 9 (9), 907-919 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Natywna elektroforeza w żelu (Native PAGE)analiza białek błonowychrozdzielanie kompleksów białkowychpobieranie próbek z wycinków żeluilościowa spektrometria masfrakcja wzbogacona w endosomyanaliza stechiometrii podjednostekdetekcja białek o niskiej zawartości
Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.