Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Summary

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Abstract

Białka zazwyczaj pełnią funkcje biologiczne poprzez interakcje z innymi białkami, zarówno w dynamicznych zespołach białkowych, jak i jako część stabilnie utworzonych kompleksów. Ten ostatni można elegancko rozdzielić w zależności od wielkości cząsteczki za pomocą natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). Sprzężenie takich separacji z czułą spektrometrią mas (BN-MS) jest dobrze znane i teoretycznie pozwala na wyczerpującą ocenę ekstrahowalnego kompleksomu w próbkach biologicznych. Jednak takie podejście jest dość pracochłonne i zapewnia ograniczony złożony rozmiar, rozdzielczość i czułość. Ponadto jego zastosowanie pozostało ograniczone do obfitych białek mitochondrialnych i plastydowych. W związku z tym w przypadku większości białek nadal brakuje informacji na temat integracji w stabilne kompleksy białkowe. Przedstawiono zoptymalizowane podejście do profilowania kompleksomu, obejmujące separację BN-PAGE w skali preparatywnej, submilimetrowe pobieranie próbek szerokich pasów żelu za pomocą kropienia kriomikrotomu oraz analizę spektrometryczną mas z kwantyfikacją białek bez znaczników. Szczegółowo opisano procedury i narzędzia dla krytycznych etapów. Jako zastosowanie, raport opisuje analizę kompleksomową rozpuszczonej frakcji błonowej wzbogaconej w endosomy z nerek myszy, z łącznie 2545 profilowanymi białkami. Wyniki wskazują na identyfikację jednorodnych białek błonowych o niskiej liczebności, takich jak wewnątrzkomórkowe kanały jonowe, a także złożonych wzorców składania białek o wysokiej rozdzielczości, w tym izoform glikozylacji. Wyniki są zgodne z niezależnymi analizami biochemicznymi. Podsumowując, metodologia ta pozwala na kompleksową i bezstronną identyfikację (super)kompleksów białkowych i ich składu podjednostek, stanowiąc podstawę do badania stechiometrii, składania i dynamiki interakcji kompleksów białkowych w dowolnym systemie biologicznym.

Introduction

Separacja BN-PAGE została po raz pierwszy bezpośrednio sprzężona z analizą LC-MS (BN-MS) przez grupy badawcze Majeran¹ i Wessels² przy użyciu ręcznego krojenia pasów żelowych BN-PAGE. Ich analizy pozwoliły zidentyfikować szereg licznych kompleksów białek błonowych o znanym składzie podjednostek pochodzących odpowiednio z plastydów roślinnych i mitochondriów komórek HEK. Analizy te były jednak dalekie od kompleksowości i nie pozwalały na bezstronną identyfikację nowych zespołów. Od tego czasu wydajność spektrometrów masowych i metod kwantyfikacji bez znaczników znacznie się poprawiła, co umożliwiło kompleksowe analizy BN-MS. W ten sposób ukuto termin "profilowanie kompleksomowe". Na przykład Heide i współpracownicy przeanalizowali mitochondria serca szczura, identyfikując i grupując 464 białka mitochondrialne, potwierdzając w ten sposób wiele znanych zespołów. Ponadto okazało się, że TMEM126B jest nową i kluczową podjednostką określonego kompleksu montażowego³. Porównywalne wyniki (z 437 mitochondrialnymi profilami białkowymi) uzyskano w równoległym badaniu mitochondriów komórek HEK⁴.

Pomimo tych ulepszeń, pozostało kilka problemów, które ograniczają pełny potencjał BN-MS do profilowania kompleksomów. Głównym ograniczeniem jest efektywna rozdzielczość wielkości kompleksów, która jest określana przez dwa czynniki: (i) jakość separacji BN-PAGE, która zależy od jednorodności gradientu porów matrycy żelowej, jak również stabilność/rozpuszczalność kompleksów próbek, oraz (ii) wielkość kroku pobierania próbek żelu, która wynosi co najwyżej 1 mm przy użyciu konwencjonalnego ręcznego krojenia^{5, 6}. Słaba rozdzielczość rozmiaru nie tylko pomija subtelne złożone izoformy i niejednorodności, ale także negatywnie wpływa na zakres dynamiki i pewność bezstronnego, de novo przypisywania i kwantyfikacji podjednostek.

Inne wyzwania obejmują precyzję kwantyfikacji białek i pokrycie rzeczywistego dynamicznego zakresu obfitości białek w próbce za pomocą analizy spektrometrii mas. W związku z tym zastosowanie profilowania kompleksomu BN-MS pozostało w dużej mierze ograniczone do próbek biologicznych o mniejszej złożoności, wysokiej ekspresji docelowych kompleksów i korzystnych właściwościach solubilizacyjnych (tj. plastydów, mitochondriów i mikroorganizmów)^6,7,8,9,10.

Niedawno wprowadziliśmy BN-MS wspomagany kroniem kriomikrotomu (csBN-MS), który łączy precyzyjne submilimetrowe próbkowanie pasów żelowych BN-PAGE z kompleksową analizą MS i skomplikowanym przetwarzaniem danych MS w celu określenia profili białek z wysokim zaufaniem¹¹. Zastosowanie preparatu błony mitochondrialnej z mózgów szczurów wykazało wcześniej niespotykaną efektywną rozdzielczość rozmiaru kompleksu i maksymalne pokrycie podjednostek kompleksu oksydacyjnego łańcucha oddechowego (OXPHOS) (tj. 90 z 90 dostępnych dla MS). W tym przykładzie zidentyfikowano również szereg nowych zespołów białkowych.

Opisane tutaj są zoptymalizowane procedury do separacji kompleksów białkowych w skali preparatywnej BN-PAGE (nie ograniczonej do konkretnego źródła biologicznego), odlewania dużych preparatywnych żeli BN-PAGE, kronia kriomikrotomu szerokich pasów żelu i przetwarzania danych MS. Skuteczność profilowania w wysokiej rozdzielczości wykazano dla preparatu kompleksu białkowego z błon wzbogaconych endosomami nerki myszy. Na koniec omówiono korzyści płynące ze zwiększenia rozdzielczości i precyzji kwantyfikacji spektrometrii mas.

Protocol

1. Preparatywna BN-PAGE

1. Przygotowanie żelu
   1. Stosować średnio- i wielkoformatowy pionowy system elektroforezy żelowej (odległość separacji żelu >10 cm; odstęp 14 cm x 11 cm, odstęp 1,5 mm) z efektywnym chłodzeniem ustawionym na 10 °C.
   2. Odlewać liniowy lub hiperboliczny żel o gradiencie porów (przekładki 1,5-3,0 mm) za pomocą mieszającego dwukomorowego mieszalnika gradientowego napędzanego pompą (patrz Tabela materiałów i odczynników). W przedstawionym przykładzie (liniowy żel gradientowy 1%-13%):
      1. Przygotować 13 ml roztworu do przedniej komory (mieszania) składającego się z: 13% akrylamidu (z 30% roztworu podstawowego, 37,5:1,0 akrylamid:bisakrylamid), 0,75 M kwasu aminokapronowego, 50 mM Bis-Tris (pH = 7,0) i 10% glicerolu.
      2. Przygotować 10 ml roztworu do komory zbiornika składającego się z: 1% akrylamidu (z 30% roztworu podstawowego, 37,5:1,0 akryloamidu:bisakryloamidu), 0,75 M kwasu aminokapronowego, 50 mM Bis-Tris (pH = 7,0) i 0,2% detergentu CL-47.
   3. Uruchomić mieszadło i dodać 30 mikrolitrów APS (nadtlenodissiarczan amonu, 10% roztwór podstawowy) i 2,5 μl TEMED (N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina) i 2,5 mikrolitrów TEMED do roztworu w komorze przedniej. Uruchom pompę i otwórz przedni zawór (przepływ należy dostosować tak, aby zakończyć odlewanie w ciągu 10 minut). Po upływie 1 minuty dodać 90 μl APS i 5 μl TEMED do roztworu w komorze zbiornika i otworzyć przyłącze komory.
   4. Pozostawić żel do powolnej, ale dokładnej polimeryzacji przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej (RT), aby wytworzyć jednorodny gradient wielkości porów. Spolimeryzowany żel przechowywany w stanie wilgotnym można przechowywać w pozycji pionowej w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
      UWAGA: Celowo wierzch żelu będzie miał miękką/śluzowatą konsystencję. Zostanie to później usunięte, ale pozwala na płynne wejście białek do żelu, przy minimalnym ryzyku wytrącenia się białka, które w przeciwnym razie może prowadzić do artefaktów migracji (tj. smug lub wytrącania się białek).
2. Przygotowanie i ładowanie próbki
   1. Przygotuj szczeliny załadowcze, wkładając odpowiednie przekładki (np. rurki silikonowe) między szklane płytki w celu oddzielenia 0,5-2,0 mg białka. Szczeliny powinny mieć co najmniej 3 cm szerokości (lub lepiej 5-6 cm szerokości).
   2. Rozpuścić ~2,5 mg błony (preparat wzbogacony w endosomy nerki myszy) w 2 ml buforu do rozpuszczania zawierającego 1% (w/v) niedenaturującego detergentu (ComplexioLyte CL-47) przez 30 minut na lodzie. Ultrawirówka (punkt odcięcia sedymentacji = 200 S lub mniej; stosuje się tutaj 130 000 x g/11 min).
   3. Skoncentrować solubilizat na krótkim gradiencie krokowym sacharozy 50%/20% (w/v, 0,3 ml każdy) przez ultrawirowanie przez 1 godzinę przy 400 000 x g. Ostateczna wydajność białka powinna wynosić co najmniej 1 mg.
   4. Dodać 0,05% (w/v) Coomassie G-250 do solubilizatu i załadować próbkę na żel. Ogranicz obciążenie białkiem do przekroju poprzecznego pasa żelu 10-15 μg/^mm2, aby uzyskać wysoką rozdzielczość i uniknąć artefaktów wynikających z wytrącania się białek.
3. Warunki pracy BN-PAGE
   1. Do uruchamiania należy przygotować standardowy bufor katodowy składający się z 50 mM tricine, 15 mM Bis-Tris i 0,01% Coomassie G-250. Przygotować wzorcowy bufor anodowy składający się z 50 mM Bis-Tris (pH = 7,0).
   2. Uruchom preparatywny BN-PAGE w temperaturze 10 °C przez noc, korzystając z trzystopniowego protokołu napięcia¹³ składającego się z: fazy równoważenia przez 30 minut przy 100 V, a następnie powolnej (3 godziny) rampy do maksymalnego napięcia (40-50 V/cm długości żelu), która jest ostatecznie utrzymywana przez co najmniej 6 godzin w celu skupienia białka w punkcie końcowym.
      UWAGA: Zaleca się wstrzymanie elektroforezy, gdy front migracji dotrze do środka żelu i wymianę bufora katodowego na świeży bufor bez Coomassie G250. Pomaga to uniknąć artefaktów wytrącania się w żelu wynikających z miejscowego zapadania się struktury porów matrycy.

2. Pobieranie próbek żelu i trawienie

1. Wycięcie pasów żelowych
   1. Po zakończeniu pracy zeskanuj żele w celach dokumentacyjnych, trzymając je między szklanymi płytkami.
   2. Zdemontuj tablice i wytnij interesujący Cię odcinek (odcinki) pasa ruchu.
   3. Pobrać próbny pasek pasa do analizy za pomocą 2D BN/SDS-PAGE i barwienia białek lub western blotting (jak pokazano na Rysunek 1B), aby określić obszary zainteresowania, efektywną rozdzielczość rozmiaru zespolonego i obfitość białka.
   4. Utrwal wybrane pasy żelu dwukrotnie przez co najmniej 30 minut za pomocą 30% (v/v) etanolu i 15% (v/v) kwasu octowego.
   5. Przenieść próbkę do podłoża zatapiającego i pozostawić do namoczenia i zrównoważenia przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 4 °C, utrzymując płytę żelową w zwolnionym tempie na wytrząsarce orbitalnej.
      UWAGA: Separacja żelu powinna być dokładnie sprawdzona pod kątem ogólnej jakości separacji i artefaktów migracji. Paseczki żelowe reprezentujące białka dominujące powinny być wolne od zniekształceń i jednorodne pod względem intensywności. Lokalne artefakty na żelu należy wyciąć lub pominąć w analizie.
2. Osadzanie i krojenie kriomikrotomu
   UWAGA: Jest to ulepszona wersja procedury osadzania opisanej i udokumentowanej wcześniej na zdjęciach, która pozwala na osadzanie i krojenie szerszych pasów żelu do 8 cm¹¹.
   1. Najpierw pokrój stałe pasy żelu na sekcje (w tym przypadku 3 cm) dokładnie równolegle do wzorca migracji białka na froncie/prążku. Aby ułatwić obsługę, umieść każdą sekcję na plastikowym wsporniku z folii o równych wymiarach.
   2. Przenieś pasy do otwartej tuby z korkami (zamkniętej na dole, centralnie perforowanej na górze, obie dokładnie wyrównane z górnym i dolnym końcem sekcji żelowej).
   3. Zanurz na krótko cylinder w ciekłym azocie, aby szybko zainicjować krzepnięcie. Przezroczyste podłoże do zatapiania zestala się w ciągu kilku sekund i staje się białe.
   4. Napełnij wnękę medium do zatapiania, na krótko zanurz je w ciekłym azocie i zamroź cylinder w temperaturze -20 °C na kilka godzin.
      UWAGA: Szybkie chłodzenie butli poprzez zanurzenie jej w ciekłym azocie pomaga uniknąć przemieszczenia płyty żelowej w rurce. Należy unikać zniekształceń, aby zapewnić wysoką rozdzielczość w następującej analizie państwa członkowskiego.
   5. Po zdemontowaniu usuń folię z tworzywa sztucznego i przenieś blok z osadzoną sekcją żelową do schłodzonego metalowego cylindra o większej średnicy umieszczonego na płaskim wsporniku (tj. szalce Petriego) i uszczelnionego medium do zatapiania na zewnątrz cylindra. Napełnij cylinder medium do zatapiania i dokładnie zamroź.
   6. Powtórz tę procedurę z drugą stroną cylindra, aby uzyskać solidny blok o współpłaszczyznowych powierzchniach.
   7. Wyjmij blok z cylindra, przyklej go medium do zatapiania na wstępnie schłodzonym metalowym uchwycie i włóż uchwyt do maszyny do krioplastowania (kriotomu). Powierzchnia bloku musi być dokładnie wyrównana w stosunku do płaszczyzny krojenia. Pozwól mu zrównoważyć się w temperaturze optymalnej dla procesu krojenia (tutaj -15 °C).
      UWAGA: Użyj powoli postępującego ręcznego cyklu krojenia w kroku 0.1 mm, aż do uderzenia w powierzchnię osadzonej sekcji żelu, aby zapewnić prawidłowe ustawienie.
   8. Zbierz plastry żelu jeden po drugim, z ostateczną pożądaną grubością kroku 0,25 mm i przenieś je pojedynczo do probówek reakcyjnych o niskich właściwościach wiązania białek.
      UWAGA: W tym zestawie można łatwo uzyskać jednolite plastry żelu o grubości zaledwie 0,1 mm i 0,5 mm.
3. Trawienie tryptyczne
   1. Przeprowadzić trawienie tryptyczne w żelu po intensywnym umyciu plastrów żelu (zaleca się co najmniej trzy dodatkowe rundy płukania w celu usunięcia składników polimerowych z podłoża do zatapiania) zgodnie ze standardową procedurą¹¹.
   2. Suszyć próżniowo eluowane peptydy i ponownie rozpuścić w 0,5% (v/v) kwasie trifluorooctowym przez wstrząsanie w temperaturze 37 °C (10 min), a następnie sonikację kąpieli (5 min) i krótkie odwirowanie.

3. Spektrometria mas

1. konfiguracja nanoHPLC i MS
   1. Załadować strawione próbki do kolumny C18 (wielkość cząstek = 5 μm; średnica = 300 μm) 0,05% (v/v) kwasu trifluorooctowego przy użyciu (nierozszczepionego) nano-HPLC sprzężonego ze spektrometrem mas o wysokiej rozdzielczości.
   2. Elute wychwycone peptydy o gradiencie wodno-organicznym (eluent A): 5 min 3% B, 120 min od 3% B do 30% B, 20 min od 30% B do 99% B, 5 min 99% B, 5 min od 99% B do 3% B, 15 min 3% B (natężenie przepływu = 300 nL/min).
      UWAGA: plastry żelu csBN-MS zazwyczaj dają próbki o niskiej lub pośredniej obfitości peptydów i ograniczonym stopniu złożoności. Analiza nanoLC-MS/MS powinna być zatem wykonywana z konfiguracją zapewniającą rozsądną czułość i szybkość sekwencjonowania, wysoką rozdzielczość masy (>100 000) i maksymalny zakres dynamiki (efektywnie 3-4 rzędy wielkości). Nie wymaga jednak długich wymiarów kolumny ani gradientów elucji przekraczających 3 godziny.
   3. Oddziel eluowane peptydy w emiterze (średnica wewnętrzna 75 μm; końcówka = 8 μm) ręcznie zapakowane około 20 cm materiałem C18 (wielkość cząstek = 3 μm). Próbki należy rozpylać elektrodynamicznie pod napięciem 2,3 kV (tryb jonów dodatnich) do ogrzewanej kapilary transferowej (250 °C) spektrometru mas.
   4. Wykonuj analizy z następującymi ustawieniami przyrządu¹¹: maksymalny czas wstrzykiwania MS/MS = 400 ms; czas trwania wykluczenia = 60 s; minimalny próg sygnału = 5,000 zliczeń, 10 najlepszych prekursorów pofragmentowanych; szerokość izolacji = 1,0 m/z).
      UWAGA: Aby ułatwić kalibrację masy, czasu retencji i przypisania sygnałów peptydowych w dużej liczbie zestawów danych lub pomiarów, zaleca się wykonywanie odpowiednich serii pomiarowych MS bez przerw lub zmian parametrów i sprzętu (tj. na tej samej kolumnie/emiterze C18).
2. Identyfikacja białka (dane MS oceniane zgodnie z wcześniejszym opisem¹¹)
   1. Wyodrębnij listy pików z widm jonów fragmentowych za pomocą narzędzia "msconvert.exe" (część ProteoWizard).
   2. Przesunąć wszystkie wartości m/z prekursorów dla każdego zestawu danych o medianę przesunięcia m/z wszystkich peptydów przypisanych do białek we wstępnym przeszukiwaniu bazy danych z tolerancją masy peptydu 50 ppm.
   3. Przeszukaj poprawione listy pików za pomocą odpowiedniej wyszukiwarki (tutaj, Mascot 2.6.2) wśród wszystkich wpisów myszy w bazie danych UniProtKB/Swiss-Prot (wydanie 2018_11).
   4. Wybierz "Acetyl (Białko N-termin)", "Karbamidometyl (C)", "Gln | pyro-Glu (N-termin Q), Glu | piro-Glu (N-termin E)", "Utlenianie (M)" i "Propionamid (C)" jako zmienne modyfikacje.
   5. Ustaw tolerancję masy peptydu i fragmentu odpowiednio na ± 5 ppm i ± 0,8 Da i pozwól na jedno pominięte rozszczepienie tryptyczne. Ustaw wartość graniczną oczekiwanej dla identyfikacji peptydu na 0,5 lub mniej. Użyj wyszukiwania w bazie danych przynęty, aby określić współczynnik wyników fałszywie dodatnich (FDR). Ustaw FDR na 1% lub zastosuj dodatkowe kryteria jakości, aby zapewnić wiarygodną identyfikację.
      UWAGA: W przedstawionym eksperymencie zidentyfikowano ponad 3500 białek o średnim FDR peptydu wynoszącym 4,4 ± 0,77% (n = 101 próbek warstwowych) lub 3000 białek, gdy peptyd FDR był ustawiony na 1%. Co ważne, zastosowano bardziej rygorystyczne kryteria doboru profilowanych białek (2 568). Obejmował on wszystkie białka, które zostały zidentyfikowane z co najmniej dwoma peptydami, z których co najmniej jeden był specyficzny dla białka, w co najmniej jednej ze 101 próbek plasterków.
3. Kwantyfikacja białek
   1. Użyj intensywności sygnału peptydowego (objętości pików [PV]) do kwantyfikacji białek, które uzyskuje się z pełnych skanów FT i koryguj czas retencji i przesunięcia masy za pomocą odpowiedniego oprogramowania (tutaj, MaxQuant v1.6.3).
   2. Dopasuj zestawy danych MS jeden po drugim do referencyjnych (całkowitych średnich) czasów elucji peptydów za pomocą regresji LOESS. Przypisz PV do peptydów bezpośrednio (identyfikacja na podstawie MS/MS) lub pośrednio (tj. na podstawie ich dopasowania m/z i czasu elucji w bardzo wąskich tolerancjach).
      UWAGA: Ten protokół wykorzystuje wewnętrzne oprogramowanie do przypisywania "wstawionych" peptydów nazywanych peptydami. Ustawione parametry skutkują efektywnymi tolerancjami dopasowania m/z i czasu elucji wynoszącymi odpowiednio ± 2 ppm i ± 1 min (patrz Rysunek 2A,B).
   3. Skoryguj systematyczne zmiany obciążenia peptydów i wydajności jonizacji między seriami poprzez przeskalowanie intensywności peptydów obliczone na podstawie mediany różnic względnych intensywności peptydów między sąsiednimi próbkami warstw (Rysunek 2C).
   4. Filtrowanie danych PV pod kątem wartości odstających i pozostałych wyników fałszywie dodatnich zidentyfikowanych przez wewnętrzną analizę spójności PV.
   5. Znormalizuj PV każdego peptydu do ich maksymalnych wartości we wszystkich zestawach danych wycinków, uzyskując względne profile obfitości peptydów.
   6. Na koniec oblicz względne profile obfitości białek jako średnie z co najmniej dwóch (i do sześciu lub 50%, w zależności od tego, która wartość jest większa) najlepiej korelujących profili peptydowych w oknie trzech kolejnych wycinków. Pozwala to na zniwelowanie brakujących wartości PV i zmniejszenie hałasu.
      UWAGA: Ostatecznie zaowocowało to 2 545 (z 2 568 wstępnie wybranych) profilami białkowymi (Rysunek 2D).
4. Charakterystyka kompleksów białkowych
   1. Analizuj profile białek, najpierw wykrywając piki przy użyciu metody maksimów lokalnych, a następnie dopasuj rozkłady normalne do tych pików, uzyskując pozycję (tj. indeks wycinka lub pozorny rozmiar zespolony) ich maksimów i wartości FWHM (pełna szerokość przy połowie maksymalnej intensywności) (wstawka Rysunek 4).
      UWAGA: W zestawie danych profile są analizowane automatycznie przy użyciu skryptów niestandardowych. Najmniejsze wartości FWHM wskazują na efektywną rozdzielczość rozmiaru podejścia (tutaj 6 x 0,25 = 1,5 mm).
   2. Użyj referencyjnych pików kompleksu białkowego o zdefiniowanej masie cząsteczkowej (zgodnie z informacją zawartą w bazie danych UniProtKB/Swiss-Prot ) do analizy regresji liniowej wartości log10 (przewidywana masa cząsteczkowa) w celu przeliczenia wskaźników liczby wycinków na pozorne rozmiary molekularne (tj. pozorny rozmiar kompleksu w kDa).
      UWAGA: W tym badaniu wybrano 23 kompleksy markerowe w próbce (Rysunek 4) na podstawie (i) monodyspersyjnych kształtów pików profilu, (ii) eksperymentalnego wsparcia mas cząsteczkowych oraz (iii) rozkładów wzdłuż badanych odcinków żelu BN-PAGE.

Results

Zdecydowana większość konwencjonalnych badań BN-MS, jak również niedawno ustanowione podejście csBN-MS o wysokiej rozdzielczości, zostały zastosowane do preparatów mitochondrialnych i plastydowych, które są (i) łatwo dostępne, (ii) mają ograniczoną złożoność i (iii) wyrażają docelowe (błonowe) kompleksy białkowe przy dużych gęstościach. Protokół ten rozszerza zastosowanie profilowania kompleksomu o wysokiej rozdzielczości na błony niemitochondrialne wykazujące ekspresję białek o niskiej liczebności, o których dostępnych jest niewiele informacji na temat ich integracji w kompleksy. Do celów demonstracyjnych wybraliśmy preparat błonowy wzbogacony endosomami z nerki myszy uzyskany przez wirowanie w gradiacji gęstości.

Optymalizacja tego preparatu została ukierunkowana na białko markerowe TPC1, które tworzy wewnątrzkomórkowe kanały jonowe zlokalizowane głównie we wczesnych i recyklingowych endosomach¹². Jest również silnie eksprymowany w komórkach kanalików proksymalnych nerek, jak wykazano w analizie immunohistochemicznej skrawków tkanki nerkowej (Rysunek 1A). Błony te delikatnie rozpuszczono (ComplexioLyte 47 przy niskim stosunku białka do detergentu wynoszącym 1:8) i skoncentrowano na poduszce sacharozowej przez ultrawirowanie. To ostatnie okazało się ważnym krokiem w usuwaniu nadmiaru składników o mniejszej masie cząsteczkowej (tj. detergentów, lipidów, soli, polimerów organicznych i metabolitów), które mają tendencję do negatywnego wpływu na rozdzielczość preparatywnych separacji BN-PAGE.

Złożona separacja na natywnym żelu gradientowym poliakrylamidowym 1%-13% (w/v) (Rysunek 1B, środkowy panel) wykazała silnie zabarwione pasma białkowe z bardzo małą ilością artefaktów migracji. Separacja SDS-PAGE wąskiego paska żelu BN-PAGE (Rysunek 1B, ramka w czerwonym ramce) jako drugi wymiar, a następnie analiza western blot wykazała dobrze rozwiązany wzór odrębnych populacji kompleksów związanych z TPC1 (Rysunek 1B, górny panel, oznaczony czerwonymi strzałkami), najprawdopodobniej wynikający z powiązania z dodatkowymi podjednostkami białka i/lub modyfikacjami potranslacyjnymi (takimi jak glikozylacja¹²). Interesujący nas 3-centymetrowy fragment został wycięty, utrwalony i przetworzony do kropienia kriomikrotomu zgodnie z opisem¹¹. Poszczególne etapy tej procedury (w szczególności precyzyjne wyrównanie szerokiego odcinka żelu), które ma kluczowe znaczenie dla zachowania rozdzielczości podczas pobierania próbek, są udokumentowane na załączonym filmie. Osadzona sekcja żelu została ostatecznie pocięta na 101 plastrów żelu o jednolitej grubości 0,25 mm (Rysunek 1B, dolny panel), które zostały oddzielnie strawione i przeanalizowane za pomocą wysokowydajnej spektrometrii mas sprzężonej z LC.

Oprócz rozdzielczości rozmiaru, jakość kwantyfikacji białek jest kluczowa dla skutecznego profilowania kompleksomu. Dzięki zastosowanej konfiguracji i ustawieniom MS, analiza próbek była dość wszechstronna, co zaowocowało średnią identyfikacją ponad 1000 białek i 10 000 peptydów (z których 8 200 było specyficznych dla białka) na plasterek, a łącznie około 3 000 białek i 43 000 peptydów (z których 38 500 było specyficznych dla białka). Niemniej jednak, ze względu na stochastyczny charakter sekwencjonowania MS/MS zależnego od danych i jego ograniczenia w zakresie dynamiki, informacje o intensywności były nadal fragmentaryczne w przypadku mniej obfitych białek. W związku z tym przeprowadzono skomplikowaną procedurę przetwarzania danych MS¹¹, która opiera się na precyzyjnym przypisaniu sygnałów peptydowych (objętości pików [PVs] = intensywności sygnałów związanych z peptydami zintegrowane w m/z i czasie) w całej serii zestawów danych.

Jak pokazano na Rysunek 2A,B, odchylenia sygnałów peptydowych w masie i czasie retencji, które pozostały po kalibracji, były identyczne dla sekwencjonowanych przez MS i dla pośrednio przypisanych PV (z bardzo wąskimi tolerancjami <1 ppm i <0,5 min dla 95% PVs), co wskazuje na bardzo niski wskaźnik fałszywie dodatniego przypisania PV. Pozostałe wartości odstające zostały przefiltrowane na podstawie ich spójności z innymi powiązanymi PV. Ponieważ wszystkie pomiary MS były wykonywane kolejno na tej samej konfiguracji LC-MS bez zmian parametrów lub komponentów sprzętowych, różnice między biegami (określone jako mediana wszystkich intensywności PV w próbce w stosunku do tych w sąsiednich warstwach) były małe i łatwe do wyeliminowania przez przeskalowanie zestawów danych PV (Rysunek 2C). Uzyskane w ten sposób informacje o intensywności peptydów wykorzystano następnie do zrekonstruowania 2545 profili względnej obfitości białek. Jak pokazano w Rysunek 2D, ponad 75% tych profili białkowych opierało się na co najmniej trzech niezależnych peptydach specyficznych dla białek.

Następnie, protokół ocenił znaczenie wielkości kroku próbkowania żelu BN-PAGE dla rozdzielczości kompleksów białkowych. W tym celu zestawy danych warstwowych połączono poprzez zsumowanie informacji o PV z dwóch, trzech lub czterech kolejnych warstw, symulując w ten sposób wynik dla rozmiarów kroków 0,5 mm, 0,75 mm i 1 mm (w porównaniu z pierwotnym próbkowaniem 0,25 mm). Rysunek 3 ilustruje wynikowe profile liczebności dla białka TPC1 jako przykład (A-D). Przy 0,25 mm względna intensywność i separacja wielkości populacji kompleksu związanego z TPC1 (Rysunek 3A) były dobrze zgodne z wynikami analizy western blot (Rysunek 1B, górny panel); chociaż profil wykazywał pewne szumy, głównie wynikające z brakujących wartości ("luk") w matrycy fotowoltaicznej używanej do kwantyfikacji.

Połączenie dwóch warstw odpowiadających 0,5 mm utrzymało prawidłową intensywność i separację kompleksów związanych z TPC1 oraz usunęło szum kwantyfikacji (Rysunek 3B). W przeciwieństwie do tego, większe rozmiary kroków wynoszące 0,75 mm i 1 mm (Rysunek 3C,D) doprowadziły do utraty rozdzielczości rozmiaru i zniosły dyskryminację subpopulacji złożonych TPC1. Należy zauważyć, że zdecydowana większość opublikowanych konwencjonalnych analiz BN-MS wykorzystuje ręcznie wycinane warstwy 2 mm (około 60, aby pokryć cały pas żelowy)^7,8,9,10.

Konwersja odległości migracji lub indeksu wycinka na wielkość cząsteczki jest zazwyczaj oparta na markerach, albo dostępnych na rynku natywnych białkach standardowych, albo dobrze scharakteryzowanych endogennych kompleksach białkowych o znanym składzie podjednostek (głównie [super]kompleksy mitochondrialnego oksydacyjnego łańcucha oddechowego [OXPHOS])¹³. Ponieważ jednak separacja BN-PAGE opiera się na efektywnym przekroju molekularnym, który jest określany nie tylko przez masę cząsteczkową, ale także przez strukturę 3D i liczbę powiązanych lipidów, detergentów i cząsteczek Coomassie, poszczególne białka mogą wykazywać większe odchylenia. W związku z tym zdecydowano się na użycie większych zestawów kompleksów białkowych jako markerów¹¹. Wykres w Rysunek 4 pokazuje 23 wybrane markery z reprezentatywną podjednostką pokazaną jako czarne kółko, wskazujące wartości log10 przewidywanej masy cząsteczkowej (zgodnie z bazą danych UniProtKB/Swiss-Prot vs. Indeks przekroju odpowiadającego maksimum piku profilu. Te ostatnie uzyskano z automatycznych dopasowań Gaussa do danych o obfitości względnej, jak pokazano we wstawce Rysunek 4 przedstawiający przykład z opiekunem BCS1. Regresja liniowa (czerwona linia) dostarczyła funkcji do przeliczania wartości indeksu warstw na pozorne rozmiary molekularne, które wahały się od 160 do 630 kDa, wzdłuż badanego przekroju żelu.

Na koniec, analiza dostarczyła informacji na temat dobrze scharakteryzowanych kompleksów i wykazała istnienie nowych podjednostek i złożonych zespołów. Przykłady podkreślające różne aspekty kompleksomu przedstawiono w Rysunek 5 (A-C: białka ulegające ekspresji lub korzystnie zlokalizowane w przedziałach endosomalnych; D-F: kompleksy z innych lokalizacji subkomórkowych). Wiadomo, że białko transportujące żelazo ferrytyna tworzy kompleksy z 24 lekkich (FRIL1) i/lub ciężkich (FRIH) podjednostek o całkowitej masie cząsteczkowej 440 kDa¹⁴ (Rysunek 5A, wypełniona strzałka). Profile podjednostek (Rysunek 5A) sugerują istnienie co najmniej dwóch mniejszych form kompleksu (o pozornej masie 360 kDa i 340 kDa; otwarte strzałki) z wyraźnymi stechiometriami łańcuchów ciężkich/lekkich (lepiej widocznymi po przeskalowaniu obfitości, wstawka Rysunek 5A), które są obficie obecne w endosomach.

Dla kontrastu, kompleksy nicalin-nomo1¹⁵ (Rysunek 5D), kompleks rdzeniowy gamma-sekretazy¹⁶ (Rysunek 5B), oraz maszyneria transamidazy GPI¹⁷ (Rysunek 5E) wykazują stałe współczynniki liczebności ich podjednostek podstawowych w całym zakresie wielkości i są niezależne od asocjacji z dodatkowymi białkami. Oznacza to, że ich podjednostki są wyłączne dla siebie. Wakuolarne H⁺-ATPazy to kompleksy wielobiałkowe złożone z puli ponad 20 podjednostek w sposób modułowy o całkowitej masie cząsteczkowej około 900 kDa. Rysunek 5C ujawnia podkompleksy o różnym składzie z co najmniej 17 podjednostek, reprezentujących biologiczne (nie)zespoły pośrednie lub podkompleksy powstałe w warunkach eksperymentalnych, z których niektóre zostały również zaobserwowane w niedawnym badaniu BN-MS¹⁸. Innym przykładem kompleksu wielobiałkowego jest proteasom¹⁹ (Rysunek 5F). Dokładne przyjrzenie się profilom liczebności podjednostek alfa i beta tworzących rdzeń proteasomu 20S sugeruje istnienie dwóch głównych złożonych populacji o subtelnych różnicach w wielkości (590 kDa i 575 kDa, oznaczonych szarymi strzałkami) i integracji trzech podjednostek beta.

Podsumowując, profilowanie kompleksomu csBN-MS błon nerkowych wzbogaconych endosomami dostarcza wyczerpujących i szczegółowych wyników dotyczących (i) integracji jednorodnych, mało obfitych białek docelowych w kompleksy, (ii) ogólnego składu podjednostek kompleksu i stechiometrii, oraz (iii) złożonych niejednorodności, podstruktur i (nie)asemblerów pośrednich.

Rycina 1: Preparatywne oddzielenie BN-PAGE rozpuszczonych błon wzbogaconych w endosomy od nerki myszy przy użyciu kanału wewnątrzkomórkowego TPC1 jako markera. (A) Immunohistochemiczna lokalizacja białka TPC1 w kanalikach proksymalnych nerek za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zielony: przeciwciało anty-TPC112 barwienie uwidocznione wtórnym Cy3-biotynylowanym kozim anty-króliczym IgG; czerwony: biotynylowana lektyna tetragonolobusu lotosu (LTL, 10 μg/ml, sprzężona z FITC) oznaczająca powierzchnię światła bliższych komórek kanalika. Wstawka pokazuje zabarwienie odpowiedniego odcinka nerki TPC1-KO jako kontrolę negatywną. Biała skala ma rozmiar 20 μm. Warto również zwrócić uwagę na silną ekspresję TPC1 w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych, znaną z niezależnych eksperymentów jako reprezentująca wczesne i recyklingowe endosomy¹². (B) Preparatywne rozdzielanie BN-PAGE 2,5 mg rozpuszczonych błon wzbogaconych w endosomy na żelu gradientowym poliakryloamidu 1%-13% (w/v). Wąski pas (obramowany na czerwono) został wycięty w celu późniejszej analizy SDS-PAGE/western blot (górny panel), rozwiązując różne kompleksy związane z TPC1 i wzorce glikozylacji (czerwone strzałki: anty-TPC1 / anty-królicze HRP / ECL prime; zielone: pozycje i przewidywane masy [MDa] kompleksów białek markerowych zidentyfikowanych przez barwienie białka całkowitego [SYPRO Ruby blot stain]) blota. Od prawej do lewej: ATPaza transportująca Na⁺/K⁺, dimer kompleksu cytochromu b-c1, syntaza ATP, NADH: oksydoreduktaza ubichinonu. Interesujący nas 3-centymetrowy odcinek z pasa żelowego został wycięty, osadzony w podłożu do zatapiania tkanek, zamontowany i pokrojony na 101 odcinków (0,25 mm) wzdłuż frontu migracji białek za pomocą kriomikrotomu (dolny panel; patrz link do filmu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kluczowe parametry określające dokładność przypisywania i kwantyfikacji sygnałów MS oraz głębokość analizy. (A) Rozkład względnych błędów masy (w ppm) po kalibracji m/z sekwencjonowanych (czerwone paski) i pośrednio przypisanych (tj. w oparciu o ściśle dopasowaną masę i czasy retencji, patrz protokół; niebieskie paski) sygnałów peptydowych. Sugeruje to końcowy błąd masy wynoszący <1 ppm (dla 95% sygnałów/przypisanych PV) i bardzo niski odsetek przypisań fałszywie dodatnich. (B) Rozkład odchyleń czasu retencji nano-HPLC od całkowitej średniej po wyrównaniu sygnałów peptydowych w czasie elucji, przy użyciu regresji lessowej (patrz protokół) i kodowania kolorami, jak zastosowano w (A). Błąd czasowy jest mniejszy niż 30 s dla >95% sygnałów peptydowych/przypisanych PV. (C) Zmienność między seriami całkowitych intensywności MS wykreślona w stosunku do średniej z dwóch sąsiednich próbek. Te współczynniki skali zostały zastosowane do surowych tabel fotowoltaicznych w celu zminimalizowania systematycznych błędów technicznych. (D) Informacje o peptydach wykorzystywane do obliczania względnych profili liczebności białek. Po przefiltrowaniu peptydów specyficznych dla białka pod kątem wartości odstających, słabo punktowanych lub pojedynczych identyfikacji (patrz protokół), określono 2545 profili obfitości białek, z których >75% opierano na co najmniej trzech peptydach z rozsądną pewnością. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Krytyczny wpływ wielkości kroku w próbkowaniu żelu na rozdzielczość kompleksomu TPC1. Zestawy danych połączono poprzez zsumowanie intensywności sygnału w grupach 1, 2, 3 i 4 kolejnych warstw (odpowiednio A-D) i przetworzono identycznie, aby zasymulować różne rozmiary kroków w plastrowaniu żelu, jak wskazano. Profil TPC1 wykazuje pewien szum (nadpróbkowanie) na poziomie 0,25 mm, ale dobrą rozdzielczość wielkości trzech złożonych populacji (zobacz także Rysunek 1B), który jest w dużej mierze zachowany przy szerokości kroku 0,5 mm. Dyskryminacja tych populacji zanika w miarę zbliżania się do 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Oznaczanie pozornej masy cząsteczkowej. Jako markery wielkości wykorzystano 23 kompleksy markerowe o określonym składzie molekularnym (zgodnie ze wskazaniami według UniProtKB/Swiss-Prot). Wartości logarytmiczne ich oczekiwanych mas cząsteczkowych (w kDa) wykreślono w porównaniu. Maksymalny wskaźnik wycinka piku profilu wskazanej reprezentatywnej podjednostki białka (wypełnione okręgi w kolorze czarnym). Regresja liniowa pasująca do tych danych (czerwona linia) zapewniła funkcję konwertującą wartości indeksu wycinka na pozorne masy cząsteczkowe. Maksima pików zostały określone przez zautomatyzowane dopasowania Gaussa do pików profilu białka, jak pokazano we wstawce (po prawej) dla białka opiekuńczego BCS1 (dane pierwotne na niebiesko, granice dopasowania oznaczone pomarańczowymi liniami, funkcja dopasowania na czerwono). Ponadto dopasowania te określały szczytowe połowy maksymalnych szerokości (zielona linia, 6,5 plasterka lub 1,6 mm w pokazanym przykładzie) z najostrzejszymi kompleksami ogniskowania rozciągającymi się wokół żelu 1,5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Przykłady profili podjednostek kompleksu białkowego. Względna obfitość białka vs. pozorna masa cząsteczkowa wykreślona dla ciężkiego i lekkiego łańcucha ferrytyny (A) ujawniająca molekularną niejednorodność stechiometrii podjednostki ferrytyny, wyraźniej widoczną po przeskalowaniu obfitości (wstawka). Wypełniona strzałka i otwarte strzałki oznaczają odpowiednio pełny kompleks (440 kDa) i dwa podkompleksy. Podjednostki gamma-sekretazy (B) ilościowo zintegrowane w populację kompleksu jednordzeniowego. Podkompleksy wakuolarnych H⁺-ATPaz (C) wykazywały wiele zespołów o odrębnym składzie podjednostek, wszystkie wyrażane w endosomach. Białka nomo1 i nikalina (D) utworzyły ekskluzywny kompleks (transamidaza GPI), który jest wielopodjednostkową maszynerią enzymatyczną tworzącą kilka kompleksów. (E) Kompleks rdzenia proteasomu 20S wykazujący (F) subtelny wzór podkompleksu z dwiema populacjami oznaczonymi strzałkami w kolorze szarym, wszystkie pochodzące z innych lokalizacji subkomórkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Prezentowane badanie opierało się na technice csBN-MS, którą wcześniej porównywano z preparatem mitochondrialnym¹¹ i zawierało ulepszenia w przygotowaniu próbek, przetwarzaniu żelu i ocenie danych dotyczących stwardnienia rozsianego. Ukierunkowana analiza fragmentu żelu BN-PAGE do separacji na dużą skalę dostarczyła kompleksowego zestawu danych pokazujących pomiary jakości porównywalne z badaniem z błonami mitochondrialnymi. Błędy masy i czasu retencji, a także wahania między seriami były utrzymywane na bardzo niskim poziomie i stanowiły podstawę do określenia wiarygodnych profili obfitości białka. Rozdzielczość rozmiaru wydawała się być dobra, z połową maksymalnej szerokości piku wynoszącą zaledwie sześć warstw (co odpowiada 1,5 mm, Rysunek 4) i względnymi różnicami wielkości mniejszymi niż 10% rozdzielczości (Rysunek 3, Rysunek 5A). Wartości te nie odpowiadały w pełni jakości rozdzielczości wielkości poprzedniej analizy mitochondriów csBN-MS (pomimo wybranego mniejszego rozmiaru kroku próbkowania żelu), ale są znacznie lepsze niż wydajność konwencjonalnych podejść BN-MS lub MS z wykluczeniem wielkości²⁰ , które stały się ostatnio popularne.

Znaczenie wysokiej efektywnej rozdzielczości rozmiaru kompleksu zostało podkreślone przez eksperyment symulacyjny na rysunku 3 (wykorzystujący kompleksy związane z TPC1), który z trudem może być rozwiązany za pomocą analizy western blot 2D BN/SDS-PAGE (rysunek 1B). Wyniki te sugerują, że krojenie o 0,25 mm w tym przypadku skutkowało pewnym nadpróbkowaniem, ale nadal okazało się to przydatne do eliminacji "szumu kwantyfikacji" bez uszczerbku dla efektywnej rozdzielczości rozmiaru. W związku z tym, zgodnie z poprzednimi wynikami¹¹, ogólnie zalecana jest wielkość kroku pobierania próbek wynosząca ~0,3 mm.

Warto zauważyć, że dyskryminacja kompleksów związanych z TPC1 jest całkowicie utracona przy pobieraniu próbek żelu o średnicy 1 mm, co jest najmniejszym krokiem zapewnionym przez ręczne krojenie w konwencjonalnym BN-MS ^5,6. Może to wyjaśniać fakt, że pomimo dostępności potężnych technologii SM, bardzo niewiele kompleksów i podjednostek białkowych zostało zidentyfikowanych de novo za pomocą profilowania kompleksomów. Oprócz dobrej zdolności rozdzielczej, csBN-MS oferuje dużą wszechstronność. Kompleksy związane z błoną i rozpuszczalne kompleksy białkowe w zakresie od 50 kDa do kilku MDa można skutecznie rozwiązać w jednym eksperymencie przy minimalnym odchyleniu¹¹. Kontrastuje to z alternatywnymi technikami separacji stosowanymi do profilowania kompleksomów, takimi jak wykluczanie wielkości lub chromatografia jonowymienna, które działają na podzbiorach rozpuszczalnych białek o określonych zakresach wielkości lub właściwościach ładunku. Z drugiej strony, csBN-MS jest mniej skalowalny (maksymalne obciążenie ~3 mg białka na żel), może być trudny technicznie i nie może być zautomatyzowany.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki pokazują, że profilowanie kompleksomu oparte na csBN-MS może być z powodzeniem stosowane do celów niemitochondrialnych, ale wskazuje również na pewne związane z tym wyzwania. W związku z tym wydajna ekstrakcja i stabilność biochemiczna kompleksów białkowych wymagają większej optymalizacji i etapów czyszczenia i mogą być nadal ograniczone. W badanym oknie wielkości liczba dobrze skoncentrowanych, monodyspersyjnych kompleksów białkowych była rzeczywiście znacznie niższa (dane nie pokazane) w porównaniu z próbką mitochondrialną. Zaleca się również zmniejszenie wsadu próbki BN-PAGE w celu uzyskania akceptowalnej separacji żelu. Większe obciążenia mogą wymagać szerszych pasów żelowych, które są trudniejsze do prawidłowej obróbki w celu krojenia (patrz załączony film). Co więcej, złożoność białek w próbkach była wyższa (około dwukrotnie) niż w przypadku trawienia warstw pochodzących z mitochondriów, co prowadziło do większej liczby brakujących wartości PV i zmniejszonego zakresu dynamiki. W rzeczywistości w analizach brakowało niektórych małych białek, które miały być częścią kompleksów pokazanych na rysunku 5. Problemy te można rozwiązać w przyszłości, stosując szybsze i bardziej czułe instrumenty MS lub tryby akwizycji niezależne od danych.

Przygotowanie próbki ma kluczowe znaczenie dla wydobycia kompleksu białkowego, stabilności i jakości separacji żelu. Parametry i procedury powinny być zoptymalizowane dla każdej tkanki źródłowej, lizatu komórkowego, błony (frakcji) i kompleksu białkowego, który jest przedmiotem zainteresowania. Podano następujące ogólne zalecenia, które mogą pomóc w rozszerzeniu zastosowań csBN-MS:

(i) Przygotowywanie próbek w stanie świeżym i unikanie ocieplania/zamrażania, silnych rozcieńczeń, zmian warunków buforowych i niepotrzebnych opóźnień;

(ii) stosowanie, które są zasadniczo pozbawione soli (zastąpić 500-750 mM betainy lub kwasem aminokapronowym), o pH obojętnym i zawierające do 1% (w/v) detergentu niedenaturującego (stosunek białka do detergentu między 1:4-1:10 do rozpuszczania kompleksów białek błonowych, nie jest wymagany detergent do rozpuszczalnych kompleksów białkowych);

(iii) Staranne testowanie i dostosowywanie warunków detergentu za pomocą analitycznego BN-PAGE, ponieważ mogą one silnie wpływać na efektywność solubilizacji kompleksów, reprezentację kompleksów białek błonowych w próbce, stabilność i jednorodność miceli białkowo-detergentowych. Te ostatnie są warunkiem wstępnym, aby białka skupiły się jako odrębne prążki/złożone populacje w żelach BN-PAGE. Dotychczasowa literatura oferuje szeroką gamę neutralnych detergentów. Jednak DDM (n-dodecyl β-d-maltozyd)1,2,4,5,6 i digitonina ^{3,5,7,8,9,10,13,18} były do tej pory najpopularniejszymi wyborami do analiz BN-MS. Należy podkreślić, że każdy stan detergentu z konieczności stanowi kompromis między wydajnością solubilizacji a zachowaniem interakcji białkowych i może nie być jednakowo odpowiedni dla wszystkich rodzajów białka docelowego i materiału źródłowego;

(iv) Usuwanie naładowanych polimerów, takich jak fibryle, włókna, polilizyna, DNA i obfite składniki o niższej masie cząsteczkowej (tj. metabolity, lipidy lub peptydy). Można to osiągnąć poprzez ultrawirowanie, filtrację żelową lub dializę. Jest to szczególnie ważne w przypadku całkowitych lizatów komórkowych lub tkankowych;

(v) Dodanie Coomassie G-250 (stężenie końcowe 0,05%-0,1%) i sacharozy (w celu zwiększenia gęstości do obciążenia, stężenie końcowe 10%-20% [w/v]) do próbki tuż przed załadowaniem, w celu oczyszczenia przez krótkie ultrawirowanie, załadować próbkę bez zakłóceń i natychmiast po tym rozpocząć cykl.

W perspektywie przyszłości, profilowanie kompleksomu oparte na csBN-MS oferuje opcje multipleksowania w celu badania dynamiki kompleksów białkowych lub zmian związanych z określonymi warunkami biologicznymi. Połączona separacja próbek znakowanych metabolicznie, zgodnie z propozycją profilowania opartego na wykluczeniu^wielkości21 , wydaje się prosta, ale może być utrudniona przez spontaniczną wymianę podjednostek w kompleksach zachodzących niezależnie od zastosowanej metody separacji. Alternatywnie, znakowane próbki mogą być rozpuszczane w sąsiednich pasach żelowych, które mogą być następnie krojone lub łączone po trawieniu w celu analizy różnicowej o wysokiej czułości i wytrzymałości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% roztwór akrylamidu/bis, 37,5:1	Bio Rad	#1610158	Zalecany do gradientowych roztworów żelowych akryloamidu do 13%
30% Roztwór akrylamidu/bis, 19:1	Bio Rad	#1610154	Zalecany do gradientowych roztworów żelowych akryloamidu >13%
SYPRO Barwnik białkiem rubinowym	Bio Rad	#1703127	Całkowite barwienie białkowe na błonach blotów; czułe i kompatybilne z immunodetekcją
Coomassie Brilliant Blue G-250	Serva	no. 35050	Odwirować roztwory podstawowe przed użyciem
ComplexioLyte 47	Logopharm	CL-47-01	Gotowy do użycia bufor detergentowy (1%) do łagodnej solubilizacji białek błonowych
Medium do zatapiania / Medium do zamrażania tkanek	Leica Biosystems	14020108926	Podłoże do zatapiania skrawków żelu do krojenia za pomocą kriomikrotomu
Membrana Immobilon-P, PVDF, 0,45 &mikro; m	Odczynnik do
	GE Healthcare	RPN2232
Plastikowa strzykawka z gumowym korkiem, 20-30 ml	b.a.n.a.dowolny		dostawca, ważny do produkcji żelu narzędzie do zatapiania sekcji żelu
szeroka żyletka	b.a.n.a.dowolny		dostawca, do przycinania żelu BN-PAGE / wycinania pasów
metalowa rurka / cylinder, ok. 4 cm długa	n.a.n.a.mold		do zatapiania i zamrażania próbek żelu
Protein LoBind Tubes, 1,5 ml	Eppendorf	Nr. 0030108116	zdecydowanie zaleca się zminimalizowanie utraty białka/peptydu z powodu
zmodyfikowanej trypsyny do sekwencjonowania	Prekolumna Promega	V5111
C18 PepMap100, wielkość cząstek 5 i mikro; m	Emiter Dionex / Thermo Scientific	P/N 160454
PicoTip (i.d. 75 µ m; Wskazówka 8 & mikro; m)	Nowy obiektyw	FS360-75-8
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µ m)	Dr. Maisch GmbH	r13.93.	Kolumny pakowane ręcznie
królicze przeciwciało anty-TPC1	Gramsch Laboratories	produkcja na zamówienie	opisana w Castonguay, et al., 2017 (odniesienie 12)
Cy3-biotynylowane kozie przeciwciało anty-królicze IgG	Vector	Laboratories CY-1300	opisane w Castonguay, et al., 2017 (odniesienie 12)
biotynylowana lektyna Lotus tetragonolobus, FITC-sprzężone	Vector Laboratories	#B1325	opisane w Castonguay, et al., 2017 ( Odniesienie 12)
kriomikrotom Leica CM1950	Leica Biosystems	14047743905
Mini Protean II Cell z modułem wetblot	Bio Rad	n.a.	dla SDS-PAGE i Westernblot (już nie sprzedawany)
System elektroforezy Penguin Midi Gel	PeqLab	n.a.	dla BN-PAGE (już nie sprzedawany)
Mikroskop Zeiss Axiovert 200 M + Fotometria Aparat cyfrowy Coolsnap 2	Zeiss / Fotometria	n.a.pompa
perystaltyczna (IP wysoka precyzja wielokanałowa)	Ismatec	ISM940	do odlewania gradientowych żeli poliakrylamidowych
mieszalnik gradientowy z mieszaniem (dwie komory)	własnej roboty, alternatywnie Bio Rad	1652000 lub 1652001	do odlewania gradientowych żeli poliakrylamidowych, ręczny dostarcza instrukcje do odlewania liniowych lub hiperbolicznych żeli gradientowych (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)
ultrawirówka Sorvall M120 z wirnikiem S80 AT3	Sorvall / Thermo Scientific	n.a.	do przygotowania próbek (już nie sprzedawana)
UltiMate 3000 RSLCnano HPLC	Dionex / Thermo Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Orbitrap Elite spektrometr masowy	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMAZQ