Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych

DOI:

10.3791/60103

⸱

21 sierpnia 2019

 ,  ,  , 
1U.S. Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 2Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, 3Alpha-O Peptides AG

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowa metoda jest tutaj opisana jako oczyszczanie, ponowne fałdowanie i charakterystyka samoorganizujących się nanocząstek białkowych (SAPN) do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samoorganizujące się nanocząstki białkowe (SAPN) funkcjonują jako powtarzalne wyświetlacze antygenów i mogą być wykorzystane do opracowania szerokiej gamy szczepionek na różne choroby zakaźne. W tym artykule przedstawiono metodę wytwarzania rdzenia SAPN zawierającego wiązkę sześciu helis (SHB), która jest zdolna do prezentowania antygenów w konformacji trimerycznej. Opisujemy ekspresję SHB-SAPN w układzie E. coli, a także niezbędne etapy oczyszczania białek. Uwzględniliśmy etap płukania izopropanolem w celu zmniejszenia pozostałości lipopolisacharydu bakteryjnego. Jako wskaźnik tożsamości i czystości białka, białko reagowało ze znanymi przeciwciałami monoklonalnymi w analizach Western blot. Po ponownym fałdowaniu wielkość cząstek spadła w oczekiwanym zakresie (od 20 do 100 nm), co zostało potwierdzone przez dynamiczne rozpraszanie światła, analizę śledzenia nanocząstek i transmisyjną mikroskopię elektronową. Opisana tutaj metodologia jest zoptymalizowana pod kątem SHB-SAPN, jednak z niewielkimi modyfikacjami może być stosowana do innych konstrukcji SAPN. Metodę tę można również łatwo zastosować w produkcji na dużą skalę w celu wytwarzania GMP dla szczepionek dla ludzi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas gdy tradycyjne opracowywanie szczepionek skupiało się na inaktywowanych lub atenuowanych patogenach, nacisk nowoczesnych szczepionek przesunął się w kierunku szczepionek podjednostkowych1. Takie podejście może prowadzić do bardziej ukierunkowanej odpowiedzi i potencjalnie skuteczniejszych kandydatów na szczepionki. Jednak jedną z głównych wad jest to, że szczepionki podjednostkowe nie są cząstkami stałymi, jak całe organizmy, co może skutkować zmniejszoną immunogennością2. Nanocząstka jako powtarzalny system wyświetlania antygenu może przynieść korzyści zarówno z ukierunkowanego podejścia opartego na szczepionce podjednostkowej, jak i z charakteru cząstek stałych całego organizmu1,3.

Wśród istniejących typów nanoszczepionek, racjonalnie zaprojektowane zespoły białek pozwalają na projektowanie i rozwój kandydatów na szczepionki, które mogą prezentować wiele kopii antygenu, potencjalnie w natywnej konformacji1,4,5,6. Jednym z przykładów takich zespołów białkowych są samoorganizujące się nanocząstki białkowe (SAPN)7. SAPN są oparte na domenach zwiniętych cewek i są tradycyjnie wyrażane w Escherichia coli8. Kandydaci na szczepionki SAPN zostali opracowani dla różnych chorób, takich jak malaria, SARS, grypa, toksoplazmoza i HIV-19,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Konstrukcja każdego kandydata na SAPN jest specyficzna dla patogenu będącego przedmiotem zainteresowania, jednak techniki produkcji, oczyszczania i ponownego fałdowania mają na ogół szerokie zastosowanie.

Jednym z naszych obecnych zainteresowań jest skuteczna szczepionka przeciwko HIV-1. W RV144 – jedynym badaniu klinicznym III fazy szczepionki przeciwko HIV-1, które wykazało skromną skuteczność – zmniejszone ryzyko infekcji było skorelowane z przeciwciałami IgG przeciwko pętli V1V2 białka otoczki20,21. Uważa się, że natywna prezentacja trimeryczna tego regionu jest ważna dla ochronnej immunogenności22. Aby przedstawić pętlę V1V2 w konformacji jak najbardziej zbliżonej do natywnej, opracowaliśmy kandydata na szczepionkę SAPN typu proof of principle, który zawierał wiązkę sześciu helis (SHB) otoczki HIV-1 po fuzji, aby przedstawić pętlę V1V2 w prawidłowej konformacji9. Kandydat ten został rozpoznany na podstawie znanych przeciwciał monoklonalnych przeciwko białku otoczkowemu HIV-1. Myszy zaszczepione V1V2-SHB-SAPN wytworzyły przeciwciała specyficzne dla V1V2, które, co najważniejsze, wiązały się z gp70 V1V2, prawidłowymi epitopami konformacyjnymi9. Rdzeń SHB-SAPN może pełnić inne funkcje poza rolą nośnika pętli HIV-1 V1V2. Tutaj opisujemy szczegółową metodologię ekspresji, oczyszczania, ponownego składania i walidacji rdzenia SHB-SAPN. Selekcja sekwencji, projektowanie nanocząstek, klonowanie molekularne i transformacja E. coli zostały wcześniej opisane9.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekspresja białka SHB-SAPN w E. coli BL21(DE3)

  1. Zmieszać 95 ml składnika A i 5 ml składnika B pożywki w sterylnej szklanej kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 litrów, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Dodać ampicylinę do końcowego stężenia 100 μg/ml.
  2. Zaszczepić pożywkę bakterią E. coli z wcześniej ustalonej kultury podstawowej glicerolu. Inkubować kulturę w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 200 obrotach na minutę (obr./min) przez 48 h.
    UWAGA: Użyta podstawa E. coli BL21 (DE3) zawierała wektor ekspresyjny oporny na ampicylinę23 z genem SHB-SAPN. Chociaż ogólny protokół pożywek zaleca 24 godziny inkubacji w temperaturze 37 °C, 48 godzin inkubacji w temperaturze 30 °C dało wyższą wydajność dla SHB-SAPN.
  3. Przenieść kulturę do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Odwirować probówki o stężeniu 4 000 x g przez 10 minut z wirnikiem o stałym kącie nachylenia w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i zachować osad do zebrania komórek.
    UWAGA: Granulat komórkowy można natychmiast przetworzyć lub zamrozić w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2. Liza E. coli BL21(DE3) przez sonikację

UWAGA: Używaj niepirogennych naczyń z tworzywa sztucznego i szkła pieczonych w temperaturze 250 °C przez co najmniej 30 min. Tris(2-karboksetylo)fosfina (TCEP) jako środek redukujący rozbija wiązania dwusiarczkowe wewnątrz i między białkami. TCEP jest niezbędny w podczas tego protokołu, jeśli wyświetlany antygen zawiera wiązania S-S. Tylko w przypadku rdzenia SHB-SAPN obecność TCEP w nie jest niezbędna.

  1. Przygotować bufor wolny od imidazolu (8 M mocznika, 50 mM fosforan sodu jednozasadowy, 20 mM zasada Tris, 5 mM TCEP) pH 8,0 (dostosowany za pomocą 5 N NaOH) i przefiltrować go za pomocą jednostki filtracji butelkowej próżniowej 0,22 μm.
  2. Zawiesić granulowane komórki (od kroku 1.3) z 40 ml buforu wolnego od imidazolu w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Sonikować zawieszone komórki za pomocą sondy na lodzie przez 5 minut (4 s sonikacji, 6 s odpoczynku) z mocą sonikacyjną 150 W.
  3. Odwirować lizat komórkowy (40 ml) w temperaturze 29 000 x g w temperaturze 4 °C przez 25 minut w wirniku o stałym kącie w celu wytworzenia oczyszczonego supernatantu. Przenieść supernatant do sterylnej kolby o pojemności 150 ml i wyrzucić osad. Rozcieńczyć supernatant do objętości 100 ml przy użyciu buforu wolnego od imidazolu (w dalszej części protokołu określanego jako "próbka").
    UWAGA: Ten etap rozcieńczania jest potrzebny, aby zapobiec zbyt wysokiemu ciśnieniu w układzie FPLC podczas ładowania lizatu na kolumnę.

3. Oczyszczanie białka za pomocą kolumny Hisa

UWAGA: Ten protokół został przeprowadzony przy użyciu instrumentu FPLC, ale można go dostosować do przepływu grawitacyjnego.

  1. Przygotować następujące i przefiltrować je za pomocą jednostki filtracji butelkowej próżniowej o wielkości 0,22 μm: (i) bufor bezimidazolowy "bufor A" (8 M mocznik, 50 mM fosforan sodu jednozasadowy, 20 mM zasada Tris, 5 mM TCEP) pH 8,0; (ii) 500 mM bufor imidazolowy "Bufor B" (8 M mocznik, 50 mM fosforan sodu jednozasadowy, 20 mM zasada Tris, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazol) pH 8,0; oraz (iii) płukanie izopropanolem (20 mM Tris, 60% izopropanolu) pH 8,0,
    UWAGA: pH dla każdego buforu dostosowano za pomocą 5 N NaOH.
  2. Zrównoważ kolumnę Jego.
    UWAGA: W przypadku produkcji na skalę laboratoryjną w tym protokole używana jest wstępnie zapakowana kolumna His o pojemności 5 ml, ale można użyć dowolnej kolumny o większym rozmiarze.
    1. Otwórz oprogramowanie FPLC i kliknij opcję Nowa metoda. Natychmiast otworzy się w menu ustawień metody. W menu rozwijanym dla pozycji kolumny wybierz port C1 3.
    2. Z menu rozwijanego Pokazane przez technikę wybierz powinowactwo. Z menu rozwijanego Typ kolumny wybierz inne, Histrap HP, 5 mL. Objętość kolumny i skrzynie ciśnieniowe zostaną automatycznie ustawione na odpowiednie wartości.
    3. Kliknij przycisk Konspekt metody. Przeciągnij następujące przyciski z menu kontekstowego Biblioteka faz: równowaga, przykładowe zastosowanie, mycie kolumny i elucja obok strzałki w tej dokładnie kolejności. Zamknij menu Biblioteka faz.
    4. Kliknij przycisk równoważenia. Wartości podane w tabeli to "bufor początkowy B" (4%), "bufor końcowy B" (4%) i "objętość (CV)" 5.
    5. Kliknij pole Przykładowa aplikacja. W polu ładowania próbki kliknij przycisk radiowy Wstrzyknij próbkę do kolumny z pompą do próbki. Upewnij się, że pole obok ustawień Użyj natężenia przepływu z metody jest zaznaczone w polu wtrysk próbki z pompą systemową. Obok pola głośności po prawej stronie ekranu zmień wartość na 20 ml.
    6. Kliknij przycisk Mycie kolumny. Wartości podane w tabeli to "bufor początkowy B" (4%), "bufor końcowy B" (4%) i "objętość (CV)" 5. Obok schematu zbierania ułamków odznacz pole Włącz.
    7. Kliknij przycisk elucji. Wartości podane w tabeli powinny to "bufor początkowy B" 0%, "bufor końcowy B" 100% i "objętość (CV)" 5. Obok schematu zbierania frakcji kliknij pole Włącz. Usuń zaznaczenie opcji Użyj rozmiaru frakcji z ustawień metody i dostosuj rozmiar frakcji do 4 ml w polu wypełniania poniżej.
    8. Kliknij przycisk Zapisz jako w górnej części oprogramowania. Nazwij plik "equilibration".
    9. Podłącz paczkowaną kolumnę His o pojemności 5 ml do odpowiedniego portu kolumny 3 w FPLC. Zarówno rurki pompy A, jak i pompy B, a także rurki pompy próbki należy umieścić w przefiltrowanej wodzie dejonizowanej o średnicy 0,22 μm. Uruchom program równoważenia.
    10. Umieścić zarówno pompę A, jak i pompę B, a także rurkę pompy próbki w buforze wolnym od imidazolu (bufor A) i ponownie uruchomić protokół równoważenia.
  3. Związać próbkę z kolumną i oczyścić białko.
    1. Otwórz oprogramowanie FPLC i kliknij opcję Nowa metoda. Natychmiast otworzy się w menu ustawień metody. W menu rozwijanym w polu Pozycja kolumny wybierz pozycję C1 port 3. Z menu rozwijanego Pokazane przez technikę wybierz powinowactwo. Z menu rozwijanego typu kolumny wybierz inne, Histrap HP, 5 mL. Objętość kolumny i skrzynie ciśnieniowe zostaną automatycznie ustawione na odpowiednie wartości.
    2. Kliknij przycisk Konspekt metody. Przeciągnij przyciski z menu kontekstowego Biblioteka faz: równowaga, aplikacja próbki, mycie kolumny (Mycie 1), mycie kolumny (Mycie 2), mycie kolumny (Mycie 3) i elucja obok strzałki w dokładnie tej kolejności. Zamknij menu Biblioteka faz.
    3. Kliknij przycisk Równowaga. Wartości podane w tabeli powinny być następujące: "bufor początkowy B" 4%, "bufor końcowy B" 4% i "objętość (CV)" 5.
    4. Kliknij pole Przykładowa aplikacja. W polu ładowania próbki kliknij przycisk radiowy dla opcjiNakładam próbkę na kolumnę z pompą do próbki. Upewnij się, że pole obok ustawień Użyj natężenia przepływu z metody jest zaznaczone w polu wtrysk próbki z pompą systemową.
    5. Obok pola głośności po prawej stronie ekranu zmień wartość na 100 ml. Obok schematu zbierania frakcji kliknij przycisk Włącz. Usuń zaznaczenie pola Użyj wielkości frakcji z ustawień metody, a następnie zmień rozmiar frakcji na 4 ml.
    6. Kliknij przycisk mycia pierwszej kolumny (Umyj 1). Wartości podane w tabeli powinny być następujące: "bufor początkowy B" 4%, "bufor końcowy B" 4% i "objętość (CV)" 10. Obok schematu zbierania ułamków kliknij pole Włącz. Usuń zaznaczenie opcji Użyj wielkości frakcji z metody, a następnie zmień rozmiar frakcji na 4 ml.
    7. Kliknij przycisk mycia drugiej kolumny (Wash 2). Wartości podane w tabeli powinny być następujące: "bufor początkowy B" 0%, "bufor końcowy B" 0% i "objętość (CV)" 5. Obok schematu zbierania ułamków kliknij pole Włącz. Usuń zaznaczenie opcji Użyj wielkości frakcji z metody, a następnie zmień rozmiar frakcji na 4 ml.
    8. Kliknij przycisk mycia trzeciej kolumny (Wash 3). Wartości podane w tabeli powinny być następujące: "bufor początkowy B" 0%, "bufor końcowy B" 0% i "objętość (CV)" 5. Obok schematu zbierania ułamków kliknij przycisk Włącz. Usuń zaznaczenie pola Użyj wielkości frakcji z ustawień metody, a następnie zmień rozmiar frakcji na 4 ml.
    9. Kliknij przycisk Eliminacja. W tabeli kliknij prawym przyciskiem myszy wymienione informacje, a następnie w wyświetlonym menu kliknij polecenie Usuń krok. Przeciągnij dwukrotnie przycisk gradientu izokratycznego na tabelę, tak aby były dwa wpisy.
    10. Wartość dla pierwszego wpisu powinna brzmieć "bufor początkowy B" 30%, "bufor końcowy B" 30% i "Objętość (CV)" 10. Wartość dla drugiego wpisu powinna brzmieć "bufor początkowy B" 100%, "bufor końcowy B" 100% i "objętość (CV)" 10. Obok schematu zbierania frakcji kliknij przycisk Włącz. Kliknij pole obok opcji Użyj rozmiaru ułamka z ustawień metody.
    11. Kliknij Zapisz jako przycisk w górnej części oprogramowania. Nazwij plik "oczyszczanie". Rurkę pompy A FPLC należy umieścić w buforze płuczącym bez imidazolu, natomiast rurkę pompy B należy umieścić w buforze imidazolowym 500 mM. Rurkę pompy do pobierania próbek należy umieścić w próbce o pojemności 100 ml.
    12. Uruchom program "oczyszczanie" i poczekaj na czas, w którym 60% izopropanol będzie potrzebny (Wash 2). Wstrzymaj program, przenieś rurkę pompy A z mycia bez imidazolu do mycia 60% izopropanolem. Uruchom ponownie program.
    13. Po zakończeniu etapu izopropanolu ponownie wstrzymaj program i przenieś rurkę pompy A z powrotem do buforu płuczącego bez imidazolu. Uruchom ponownie program oczyszczania (reszta przebiegu jest zautomatyzowana).

4. Ocena czystości i identyfikacja białka za pomocą SDS-PAGE

  1. Połączyć wszystkie frakcje odpowiadające (i) przepływowi (lizatowi komórkowemu, który nie związał się z kolumną He), (ii) przepłukaniu 1, (iii) przepłukaniu 3 (przemycie 60% izopropanolem) i (iv) przepłukaniu 3 w oddzielnych stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Nie łączyć 2 ml frakcji z etapów elucji.
  2. Zmieszać 15 μl z każdej z połączonych frakcji i wszystkie frakcje z etapów elucji z 2x buforem do próbek Laemmli w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml i poddać ich denaturacji w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
  3. Podczas denaturacji białka należy skonfigurować aparat do biegania żelu z 3 bezplamiącymi 4-20% prefabrykowanymi żelami poliakrylamidowymi w buforze do biegania 1x Tris-glycine SDS-PAGE.
  4. Załadować 8 μl markera masy cząsteczkowej do pierwszego dołka i 30 μl zdenaturowanej próbki do pozostałych studzienek żelu. Uruchom żele pod napięciem 200 V, aż czoło barwnika dotknie dna żelu (około 30 min). Wyjmij żele z aparatu i krótko spłucz wodą dejonizowaną. Natychmiast zobrazuj żel za pomocą systemu obrazowania bez plam.
  5. Zidentyfikuj frakcje, które zawierają prążki białkowe o odpowiedniej wielkości (18,07 kDa). Zbierz wszystkie te frakcje.

5. Identyfikacja białka za pomocą western blot

  1. Przeprowadź western blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla His (anty-6x HisTag) i przeciwciała swoistego dla SHB (167-D-IV) w celu identyfikacji oczyszczonego białka o pełnej długości. Przeciwciało anty-6x HisTag rozpoznaje koniec N białka, a przeciwciało 167-D-IV rozpoznaje koniec C, co świadczy o obecności białka o pełnej długości.
  2. Oznaczyć stężenie białka w (i) przepływowym, (ii) przemyciu 1, (iii) przepłukaniu 2 (przemycie 60% izopropanolem), (iv) przepłukaniu 3 i wszystkich frakcji z etapów elucji za pomocą spektrometru przy absorbancji 280 nm. Wytwarzać rozcieńczenia zawierające 100 ng białka w 15 μl buforu wolnego od imidazolu dla każdej z tych grup.
  3. Dodać 15 μl 2x buforu do próbek Laemmli do każdych 15 μl próbek i poddać je denaturacji zgodnie z krokiem 4.1. Po zakończeniu denaturacji odwiruj probówki, aby upewnić się, że całe białko może zostać przeniesione.
  4. Załaduj próbki i wstępnie wybarwiony marker do nieplamiącego 4–20% prefabrykowanego żelu poliakrylamidowego. Uruchom elektroforezę pod napięciem 200 V, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu.
  5. Podczas pracy żelu przygotuj 1 l TBS-T (20 mM Tris, 150 mM NaCl i 0,1% Tween 20) i 200 ml 5% mleka beztłuszczowego w TBS-T.
  6. Użyj systemu transferu western blot, aby przenieść białko na błonę nitrocelulozową. Użyj wstępnie zmontowanego stosu transferowego i umieść na nim żel. Ustaw system tak, aby działał przy napięciu 25 V przez 7 minut. Sprawdzić, czy na membranie nitrocelulozowej znajduje się wstępnie wybarwiony marker wskazujący na całkowite przeniesienie.
    UWAGA: Wszystkie kolejne kroki są wykonywane na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 100 obr./min w temperaturze pokojowej (RT).
  7. Po zakończeniu transferu przemyj kleksy dwa razy TBS-T przez 10 minut każdy.
  8. Zatkać błony nitrocelulozowe (osuszyć) 5% mlekiem beztłuszczowym w TBS-T na co najmniej 1 godzinę. Przemyć bloty dwa razy TBS-T przez 10 minut każdy.
  9. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała 167-D-IV i anty-6x HisTag do 1 mg/ml w TBS-T (zapas Ab). Rozcieńczyć podstawowe Abs 167-D-IV 10 000 razy i anty-6x HisTag 5 000 razy, dodając 2 μl podstawowego 167-D-IV i 4 μL podstawowych przeciwciał anty-6x HisTag do dwóch różnych probówek zawierających 20 ml TBS-T. Dodać całkowitą objętość 20 ml przeciwciał pierwszorzędowych, po jednym do każdej plamy, i inkubować bloty przez 1 godzinę. Umyj bloty dwa razy TBS-T przez 10 minut.
  10. Rozcieńczyć 4 μl 1 mg/ml mysiego przeciwciała drugorzędowego przeciwko człowiekowi sprzężonego z fosfatazą alkaliczną w 20 ml TBS-T (rozcieńczenie 1:5 000). Rozcieńczyć 4 μl 1 mg/ml koziego przeciwciała drugorzędowego przeciwko mysi sprzężonego z fosfatazą alkaliczną w 20 ml TBS-T (rozcieńczenie 1:5 000). Dodaj przeciwciała drugorzędowe do odpowiednich blots.
    UWAGA: Przeciwciało anty-ludzkie drugorzędowe wiąże się z 167-D, a przeciwciało anty-mysie wiąże się z anty-6x HisTag. Umyj bloty dwa razy TBS-T przez 10 minut.
  11. Dodaj wystarczającą ilość substratu fosfatazy alkalicznej BCIP/NBT, aby pokryć plamy. Rozwijaj kleksy przez około 10 minut, aż pojawią się prążki. Opłucz plamy zimną wodą z kranu i pozostaw do wyschnięcia przed skanowaniem za pomocą skanera płaskiego.

6. Ponowne składanie SHB-SAPN

  1. Dodaj białko zbiorcze (łącznie 10\u201220 ml) do odciętej kasety dializacyjnej o masie cząsteczkowej 10 kDa i dializuj je do 8 M mocznika, 20 mM Tris, 5% glicerolu, 5 mM TCEP pH 8,5 w temperaturze RT (18\u201226 °C) przez noc.
  2. Powoli dializować mocznik z próbki, stopniowo zmniejszając stężenie mocznika w buforze do dializy o 2 M co 2 godziny. Przy stężeniu mocznika 2 M przesunąć aparat do dializy na 4 °C (nie używać TCEP w buforze dializacyjnym od tego etapu). Zakończyć ponowne składanie, dializując próbkę do 120 mM mocznika, 20 mM Tris, 5% glicerolu, pH 8,5 w 4 °C przez noc.
  3. Wyjąć ponownie złożone białko (SHB-SAPN) z kasety dializy. Przefiltruj SHB-SAPN za pomocą strzykawki z filtrem 0,22 μm z polifluorku winylidenu (PVDF). Podwielokrotność SHB-SAPN rozlać do sterylnych probówek i zamrozić w temperaturze -80 °C, pozostawiając co najmniej 100 μl w temperaturze pokojowej do dalszych analiz.

7. Walidacja cząsteczek według wielkości i wyglądu

  1. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)
    1. Zmierz średnią wielkość cząstek SHB-SAPN za pomocą następujących parametrów: wybierz białko jako materiał, utwórz złożony bufor na 120 mM mocznika, 20 mM Tris, 5% glicerolu 25 °C dla temperatury, wybierz jednorazowe kuwety do analizy, wybierz pomiar automatyczny, ustaw na 5 przebiegów.
    2. Dodaj 45 μl SHB-SAPN do jednorazowej kuwety i uruchom oprogramowanie, klikając zieloną strzałkę. Wybierz procentową głośność odczytu.
  2. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    1. Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:20 w buforze do ponownego składania. Przygotować 10 ml rozcieńczonej próbki.
    2. Używając strzykawek o pojemności 3 ml, przepłucz instrument NTA buforem do ponownego składania i załaduj około 1,5 ml próbki, aby zrównoważyć instrument. Do analizy należy wykorzystać pozostałą część próbki.
    3. Utwórz nową SOP w oprogramowaniu NTA, klikając zakładkę SOP. Pod zakładką zmień liczbę przechwyć na 3 i zmień czas przechwytywania na 30 s. Naciśnij przycisk autofokusa po lewej stronie ekranu, aby ustawić ostrość próbki. Użyj pokrętła ręcznego ustawiania ostrości z boku urządzenia, aby precyzyjnie dostroić ostrość.
    4. Uruchom utworzony SOP, gdy system poprosi o załadowanie małej objętości próbki za pomocą strzykawki. Po wykonaniu wszystkich przechwyceń system automatycznie wyświetli ekran analizy. Przesuń pasek granicy wykrywalności tak, aby wszystkie rzeczywiste cząstki były oznaczone czerwonymi krzyżykami. Naciśnij przycisk uruchamiania analizy, a analiza rozpocznie się automatycznie.
  3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
    1. Folie nośne TEM z siatki jarzeniowej / węglowej 400 mesh miedzianej.
    2. Dodać 3 μl próbki o stężeniu 0,075 mg/ml do siatki na 30 s. Odsącz płyn za pomocą bibuły filtracyjnej.
    3. Umyj kratkę trzykrotnie 3 μl wody dejonizowanej, za każdym razem odprowadzając wodę bibułą filtracyjną.
    4. Dodaj 3 μl 0,5% octanu uranylu do folii nośnej i pozostaw ją na 30 sekund. Odwadź większość octanu uranylu, ale pozostaw cienką warstwę na powierzchni. Pozostawić próbki do wyschnięcia przed zobrazowaniem ich pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.
    5. Obraz próbek przy napięciu 80 kV na TEM.

8. Oznaczanie poziomów endotoksyn w próbkach za pomocą kinetycznego lizatu amebocytów limufla (LAL)

  1. Wyjąć zestaw i próbki z lodówki i pozostawić do zrównoważenia do RT.
  2. Do przeprowadzenia tego testu wymagany jest czytnik płytek z blokiem grzewczym i możliwością odczytu próbek przez 40 odczytów o długości fali 405 nm w temperaturze 37 °C. Napisz szablon programu tak, aby studzienki były odczytywane co 150 s w celu zidentyfikowania punktu czasowego początku (OD wzrósł o 0,2 w porównaniu z pierwszym odczytem).
  3. Rozcieńczyć próbkę do stężenia dawki uodparniającej w PBS.
    UWAGA: pH buforu do ponownego fałdowania wykracza poza zakres testu LAL. Rozcieńczenie próbki w PBS ustawi pH w dopuszczalnym zakresie.
  4. Zawiesić kontrolną endotoksynę w odpowiedniej objętości wolnej od endotoksyn wody LAL, zgodnie z certyfikatem analizy, aby wytworzyć 50 EU/ml. Energicznie wirować fiolkę przez 15 minut, aby zapewnić całkowite ponowne zawieszenie endotoksyny.
  5. Wygeneruj krzywą wzorcową endotoksyny, formując 10-krotne seryjne rozcieńczenie w szklanych fiolkach w zakresie od 50 EU do 0,005 EU/ml. Do każdego rozcieńczenia dodać 0,1 ml poprzedniego rozcieńczenia do 0,9 ml wody RAL. Wirować energicznie po połączeniu przez 1 min.
  6. Dodać rozcieńczenia krzywej wzorcowej i próbki SHB-SAPN w dwóch egzemplarzach do płytki 96-dołkowej. Użyj wody LAL jako kontroli negatywnej w dwóch egzemplarzach. Wstępnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  7. Pod koniec inkubacji ponownie zawiesić fiolkę z odczynnikiem do oznaczania w 2,6 ml wody LAL. Delikatnie wymieszaj zawartość pipetą serologiczną.
  8. Dodać 100 μl odczynnika do oznaczania do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Szybko przenieś tabliczkę do czytnika płytek i uruchom szablon programu napisany w kroku 8.2.
  9. Po zakończeniu programu wygeneruj krzywą standardową, używając wartości logarytmicznej elementów sterujących w funkcji wartości logarytmicznej czasu rozpoczęcia. Użyj wzoru wygenerowanego na podstawie tej krzywej, aby obliczyć stężenie endotoksyn w próbkach.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pełni zmontowany SHB-SAPN pokazany tutaj jest zbudowany na sekwencjach białek (Rysunek 1A), które zgodnie z przewidywaniami złożą się w cząstkę zawierającą 60 kopii monomeru (Rysunek 1B). Rysunek 2 przedstawia zarys metody produkcji, oczyszczania i identyfikacji rdzenia SHB-SAPN. E. coli z bulionu glicerolowego, który zawierał wektor ekspresyjny pPep-T z sekwencją genu rdzenia SHB-SAPN, indukowano w BL21 (DE3) E. coli. Komórki bakteryjne udało się wyhodować i poddać lizie w warunkach denaturacji i redukcji.

Całkowity lizat komórkowy został użyty do oczyszczenia monomerów SHB-SAPN za pomocą FPLC przy użyciu kolumny Ni2+ (Rysunek 3A). Chromatograf FPLC pokazuje, że białko eluuje się zarówno przy 150 mM, jak i 500 mM imidazolu (Rysunek 3A). Chromatogram pokazuje również dwa inne piki przy całkowitej objętości 185 ml i 210 ml, odpowiadające odpowiednio płukaniu izopropanolem i płukaniu bez imidazolu. Frakcje i czystość rekombinowanego białka zidentyfikowano za pomocą gradientowych żeli SDS-PAGE (Rysunek 3B). Interesujące białko znajdowało się przede wszystkim we frakcjach 68\u201279 (278\u2012300 ml objętości całkowitej). Frakcje te połączono w celu dalszych analiz. Western blot z przeciwciałem anty-His (N-końcowym) i przeciwciałem 167-D-IV (C-końcowy) wskazał, że połączone frakcje były rzeczywiście białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (Figura 4A, B). Plamy te wykazały również obecność multimerów SHB-SAPN. Wcześniejsze płukanie i frakcje elucyjne miały tendencję do zawierania wyższego stężenia multimeryzowanego białka i dlatego zostały wykluczone.

Próbki, które zawierały interesujące nas monomery białkowe, zostały złożone do w pełni złożonego SHB-SAPN za pomocą dializy. Rozkład wielkości cząstek określono za pomocą DLS i analizy śledzenia nanocząstek (rysunek 5A,B). DLS zidentyfikował cząstki o średniej średnicy hydrodynamicznej Z wynoszącej 67 nm, podczas gdy system NTA zmierzył średnią wielkość 81 nm. Niewielkie różnice w wielkości wynikały z technik wymiarowania cząstek, jednak rozmiar z obu analiz mieścił się w oczekiwanym zakresie 20\u2012100 nm8,24,25. SHB-SAPN zostały zwizualizowane przez TEM, a obrazy pokazały dobrze uformowane pojedyncze cząstki z rozkładem wielkości uzyskanym z dwóch technik wymiarowania cząstek (Rysunek 5C).

Podczas oczyszczania białka, kolumna została przemyta izopropanolem, aby zmniejszyć zanieczyszczenie LPS w końcowym produkcie SHB-SAPN. Aby sprawdzić, czy poziom endotoksyny jest dopuszczalny do immunizacji, stężenie LPS w próbkach SHB-SAPN oczyszczonych z lub bez etapu płukania izopropanolem określono za pomocą kinetycznego testu LAL. Wyniki wykazały, że płukanie izopropanolem obniżyło poziom endotoksyn z >0,25 EU/μg do 0,010 EU/μg białka SHB-SAPN (tabela 1).

figure-results-1
Rycina 1: Sekwencja i struktura białka SHB-SAPN. (A) Sekwencja aminokwasowa monomeru SHB-SAPN. (B) Model komputerowy struktury w pełni zmontowanego rdzenia SHB-SAPN składającego się z 60 monomerów białkowych. Schemat kolorów dla sekwencji aminokwasów: Szary = HisTag; Zielony = pentamer; Ciemnoniebieski = trymer zaprojektowany de novo; Jasnoniebieski = wiązka sześciu helis. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat blokowy protokołu produkcji SHB-SAPN. Schemat kolorów: = ekspresja monomeru białkowego w E. coli; Ciemnoszary = oczyszczanie monomeru; Średni szary = identyfikacja monomeru; Jasnoszary = ponowne składanie i charakteryzacja; Biały = w pełni zmontowany produkt SHB-SAPN. W krokach oznaczonych kolorem ciemnoszarym i średnioszarym białko znajduje się w warunkach denaturacji i redukcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Oczyszczanie białek z monomerów SHB-SAPN. (A) Chromatograf z oczyszczania FPLC. Zielona linia powyżej chromatogramu wskazuje etapy oczyszczania. Niebieska linia na chromatogramie reprezentuje gęstość optyczną frakcji o długości fali 280 nm. linia pokazuje, jaki procent buforu B (8 M mocznik, 20 mM Tris, 50 mM fosforan sodu jednozasadowy, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazol, pH 8,5), który został użyty na każdym etapie oczyszczania. (B) Żele SDS-PAGE zawierające połączone frakcje z lizatu (L), przepływające (FT), pierwsze płukanie (W1), przemywanie izopropanolem (W2), trzecie płukanie (W3) oraz poszczególne frakcje z etapów elucji 150 mM imidazolu (E150) i 500 mM imidazolu (E500) oczyszczania. Markery molekularne na pierwszym pasie (M) identyfikują pasma od 10 do 250 kDa. Białko docelowe jest oznaczone czarną strzałką. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Identyfikacja białka za pomocą western blot. Wszystkie tory są załadowane 100 ng białka. (A) Wyniki western blot z anty-6x HisTag. (B) Wyniki western blot z przeciwciałem monoklonalnym 167-D-IV HIV-1. Pasy są oznaczone jako: M = marker masy cząsteczkowej; 1 = lizat; 2 = Przepływ; 3 = pierwsze pranie; 4 = płukanie izopropanolem (drugie pranie); 5 = trzecie pranie; 6 = połączone frakcje objętościowe 56\u201261 (pierwszy pik elucji), 7 = połączone frakcje objętościowe 62\u201267 (między dwoma pikami), 8 = połączone frakcje objętościowe 68\u201278 (drugi pik elucji). Białko docelowe o oczekiwanej wielkości prążka 18,07 kDa jako monomeryczne prążko SHB-SAPN jest oznaczone czarną strzałką. Dodatkowe pasma na liniach 7 i 8 to dimery, trymery i multimery SHB-SAPN (czerwona strzałka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Charakterystyka ponownie złożonego SHB-SAPN. (A). Rozkład wielkości cząstek określony za pomocą DLS. (B) Wielkość cząstek określona przez system śledzenia nanocząstek. (C) Wizualizacja cząstek SHB-SAPN za pomocą TEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt.
próbkaEndotoksyna (EU/ml)Endotoksyna (EU/μg białka)
SAPN z myciem izopropanolemPytanie 2,020,01
SAPN bez mycia izopropanolem>50>0,25
Kontrola negatywnaPoniżej poziomu wykrywalnościN/a

Tabela 1: Poziomy endotoksyn w ponownie złożonych SHB-SAPN. Poziomy endotoksyn w próbkach SHB-SAPN oczyszczonych z płukaniem izopropanolem lub bez niego, przedstawione zarówno jako jednostki endotoksyny/ml, jak i jednostki endotoksyny/μg białka SHB-SAPN.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanotechnologia zapewnia wiele korzyści i rozwiązań w zakresie opracowywania szczepionek podjednostkowych. Nanoszczepionki mogą wielokrotnie prezentować antygeny w postaci cząstek stałych układowi odpornościowemu gospodarza, zwiększając immunogenność26. Chociaż istnieje wiele różnych rodzajów nanoszczepionek, uważamy, że te składające się z białka zaprojektowanego de novo wydają się być najsilniejszym podejściem do opracowania szczepionki1. Można je zaprojektować bez żadnej homologii sekwencji do białek gospodarza i prezentować interesujący antygen w konformacji zbliżonej do natywnej, zapewniając jednocześnie niskie koszty produkcji i wysoką wydajność produktu. Doskonałym przykładem takiego podejścia jest technologia SAPN, którą zastosowaliśmy do szczepionek przeciwko wielu chorobom zakaźnym7. Rozwiązując trudności w opracowywaniu szczepionki przeciwko HIV-1, zaprojektowaliśmy unikalny rdzeń SHB-SAPN, aby skutecznie prezentować antygen V1V2 w natywnej konformacji trimerycznej9. Wiele szczepionek, szczególnie przeciwko chorobom wirusowym, występuje w postaci trimerów27. Zjawisko to wskazuje, że nasz projekt SAPN ma szerokie implikacje dla rozwoju szczepionek podjednostkowych.

W tej metodzie pokazujemy, jak wytwarzać SHB-SAPN w systemie ekspresji E. coli . Stwierdziliśmy wysoką wydajność białka (około 6 mg/100 ml hodowli). Białko zawierało 10 histydyn i było łatwe do oczyszczenia za pomocą unieruchomionej chromatografii powinowactwa do metali z kolumną Ni2+ . Stwierdzono, że ta długość His-Tag jest optymalna dla najwyższego uzysku białka. Oczyszczone białko zawierało całą długość zaprojektowanego białka, na co wskazuje obecność zarówno N-końcowego HisTag, jak i C-końcowego powtórzenia heptadowego. Wykorzystaliśmy powszechnie akceptowane techniki i zoptymalizowaliśmy je pod kątem ekspresji, produkcji i charakterystyki rdzenia SHB-SAPN. Brak produkcji białka o pełnej długości podczas opracowywania SAPN zawierającego nowy epitop białkowy może wskazywać na problem z ekspresją genu w komórce gospodarza. Jeśli tak się stanie, gen i system ekspresji muszą zostać przeprojektowane i dostosowane do opisanego protokołu. Modyfikacja czasu lub intensywności sonikacji może również zwiększyć stężenie przewidywanego białka o pełnej długości.

Ponownie sfałdowane cząstki mieściły się w oczekiwanym zakresie wielkości (od 20 do 100 nm)8,24,25, zgodnie z DLS i analizą śledzenia nanocząstek. Wyniki te zostały dodatkowo potwierdzone przy użyciu TEM. Jeśli na tym etapie występują problemy, zwykle jest to spowodowane problemem z pH lub siłą jonową buforu do ponownego fałdowania. Gdy cząstki o dużych rozmiarach są wykrywane w technikach wymiarowania cząstek, wskazuje to na agregację, której można uniknąć, zwiększając pH buforu do ponownego fałdowania. Jeśli cząstki nie zostaną wykryte przez DLS, należy sprawdzić stężenie białka i sprawdzić pH buforu. Końcowe stężenie białka dla DLS powinno wynosić co najmniej 100 μg/ml. Jeśli stężenie nie jest problemem, wskazuje na obfitość małych, nie do końca uformowanych cząstek, których stężenie można zmniejszyć poprzez obniżenie pH. Alternatywnie, stężenie chlorku sodu można dostosować do optymalnego zakresu, aby zminimalizować obecność cząstek o niepożądanej wielkości.

Wreszcie, stosując etap płukania izopropanolem podczas oczyszczania, byliśmy w stanie zmniejszyć zanieczyszczenie LPS od gospodarza E. coli do 0,01 EU/μg SAPN, co jest poniżej limitu Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) wynoszącego 5 EU/kg masy ciała dla produktów do wstrzykiwań28. Poziom ten można dodatkowo obniżyć, stosując kolumnę wymiany anionów, znaną również jako kolumna Q. Jeśli wysoki poziom endotoksyn jest nadal obecny, sprawdź wszystkie materiały, które zostały użyte do przygotowania buforu. Pamiętaj, aby w tej metodzie używać wyłącznie szkła odpylonego i wyrobów z tworzyw sztucznych wolnych od endotoksyn.

Wyniki te wskazują, że udało nam się opracować metodę wytwarzania rdzenia SHB-SAPN, który może być wykorzystany do przedklinicznych badań immunizacji. Metoda ta, z niewielkimi modyfikacjami, jeśli takie istnieją, może być stosowana do oczyszczania SHB-SAPN po dodaniu antygenu będącego przedmiotem zainteresowania. Przyjmując tę metodę jako punkt wyjścia, jedną z głównych zmian jest etap elucji. Różne białka eluują przy różnych stężeniach imidazolu, które należy określić doświadczalnie. Inną istotną różnicą może być skład bufora do ponownego składania. Optymalizacja wymagałaby przetestowania różnych warunków pH, a także siły jonowej.

Biorąc pod uwagę przyszłe prace, potrzebne są tylko dwie niewielkie modyfikacje, aby umożliwić stosowanie SHB-SAPN przez ludzi. Pierwszym z nich jest to, że wektor ekspresji musi zostać zmieniony na marker selektywny oporności na kanamycynę z powodu alergii na ampicylinę u ludzi29. Innym ważnym wymogiem związanym z produkcją białek stosowanych u ludzi jest wytwarzanie SHB-SAPN w pożywkach niezawierających produktów zwierzęcych. Już badanie przeprowadzone na małą skalę wykazało rozsądną wydajność białka w pożywce roślinnej. Przedstawione tutaj prace są łatwo skalowalne w celu uzyskania ostatecznej produkcji GMP, jak wykazano na przykładzie kandydata na szczepionkę przeciwko malarii, FMP01416. Ta produkcja FMP014-SAPN na dużą skalę obejmowała zarówno etap wymiany anionowej, jak i kationowej w celu dalszej redukcji zawartości LPS i Ni2+ w produkcie końcowym. Ten SAPN z ekspresją bakteryjną został już zwiększony na potrzeby zbliżającego się badania klinicznego fazy 1/2a.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyrażone poglądy są poglądami autorów i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące stanowisko armii amerykańskiej lub Departamentu Obrony. Peter Burkhard ma udziały w firmie o nazwie Alpha-O Peptides AG i posiada patenty na tę technologię. Pozostali autorzy nie są powiązani ani zaangażowani finansowo z żadną firmą mającą interes finansowy w tematyce przedstawionej w niniejszym artykule.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez umowę o współpracy (W81XWH-11-2-0174) pomiędzy Fundacją Henry'ego M. Jacksona na rzecz Rozwoju Medycyny Wojskowej, Inc., a Departamentem Obrony USA. Przeciwciało anty-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV otrzymano od dr Susan Zolla-Pazner za pośrednictwem programu odczynnikowego NIH AIDS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x Tris/Glycine/SDSBioRad16107321 L
2-merkaptoetanolBioRad161071025 ml
2-propanolFisherBP261814 L
2x Laemmli Bufor do próbekBioRad161073730 ml
40ul Kuwet 100 sztuk z korkamiMalvern PanalyticalZEN0040opakowanie
100 szt.4– 20% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 10-dołkowe, 30 i mikro; lBioRad456109310 sztuk
AmpicillinFisherBP1760-2525 g
Przeciwciało anty-6X His tag [HIS. H8]AbCamab18184100 mg
anty-HIV-1 gp41 Monoklonalny (167-D IV)Repozytorium odczynników AIDS11681100 mg
BCIP/NBT Substrate, roztwórSouthern Biotech0302-01  100 ml
Corning  Jednorazowe systemy filtrów próżniowych / przechowywaniaFisher09-761-108Różne rozmiary
Siatka Formvar / Carbon 400, Miedź ok. Rozmiar otworu siatki: 42 i mikro; mTed Pella, Inc01754-F25 sztuk
GE Healthcare  5 ml HisTrap HP Paczkowane kolumnyGE HealthCare45-000-3255 sztuk
GlicerolFisherBP229-44 L
Kozia IgG Przeciw Myszom H& L (fosfataza alkaliczna)ABCamab970201 mg
ImidazolFisherO3196-500500 g
Instant beztłuszczowe mleko w proszkujakości biologiczneA614-100310 sztuk
Kinetic-QCL Kinetyczny chormogenny test LALLonza Walkersville50650U192 Zestaw testowy
LAL Odczynnik LAL Płytki wielodołkoweLonza Walkersville25-3401 talerz
Magic Media E. coli Expression MediumThermoFisherK68031 L
MilliporeSigma Millex Sterylna strzykawka 0,22 mm FiltryMilliporeSLGV033RB250 Opakowanie
Mysz Anti-Human IgG Fc-APSouthern Biotech9040-04  1,0 ml
One Shot BL21 Star (DE3) Chemicznie kompetentny E. coliThermoFisherC60100320 fiolek
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, rekombinowany ze znacznikiem Strep,BioRad16103631 mL
Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer, 10K MWCO, 12 mLThermoFisher668108
Chlorek soduFisherBP358-2122,5 kg
Fosforan sodu jednozasadowyFisherBP329-500500 g
Tris BaseFisherBP152-11 kg
Chlorowodorek tris-(2-karboksetylo)fosfinyBiosynth InternationalC-1818100 g
Octan uranylu, odczynnik, A.C.SUsługi mikokopii elektronowej541-09-325 g
MocznikFisherBP169-5002,5 kg
Bibuła filtracyjna jakościowa WhatmanSigma AldrichWHA10010155opakowanie 500
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Sprzęt
ChromLab Software ver 4Oprogramowanie BioRad12009390
Epoch 2 Spektrofotometr mikropłytekBioTekEPOCH2Czytnik płytek
Fiberlite F14-14 x 50cy Rotor o stałym kącie nachyleniaThermoFisher096-145075Rotor
Gel Doc EZ Gel Documentation SystemBioRad1708270Gel Imager do Żele bezplamiste
JEOL TEMJEOL1400Transmisyjny mikroskop elektronowy
Pionowe ogniwo elektroforetyczne Mini-PROTEAN Tetra do mini żeli prefabrykowanychBioRad1658004Do uruchamiania żeli
NanoDrop One Mikroobjętość Spektrofotometr UV-VisThermoFisherND-ONE-Wdo stężenia białka
NanoSight NS300Malvern PanalyticalParticle Wymiarowanie
Oprogramowanie NanoSight NTA NTAMalvern Panalytical ParticleSizing
New Brunswick Innova 44/44REppendorfM1282-0000Inkubator/wytrząsarka
System chromatograficzny NGC Quest 10BioRad7880001FPLC wspomagający oczyszczanie białek
System czyszczenia wyładowań PELCO easiGlowTed Pella, INC91000SDo czyszczenia kratek
Zasilacz uniwersalny PowerPacBioRad1645070Do uruchamiania żeli
Rocker ShakerDaiggerEF5536ADla Western
Sonifer 450Bransonznany również jako 096-145075 Sonifikacji
Wirówka Superspeed Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000Wirówka ThermoFisher75-006-580
Wirówka Trans-Blot Turbo Mini Zestawy transferowe nitrocelulozyBioRad1704158do systemu
Western Trans-Blot Turbo TransferBioRad1704150Dla Western
Vortex-Genie 2DaiggerEF3030AVortex
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalParticle Sizing
Oprogramowanie ZetasizerMalvern Panalytical PanalyticalParticle Sizing
wysokiej sztuk

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karch, C. P., Burkhard, P. Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies. Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).
  2. Snapper, C. M. Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens. Frontiers in Immunology. 9, 598(2018).
  3. Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines. Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).
  4. Yeates, T. O. Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials. Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).
  5. Marcandalli, J., et al. Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus. Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).
  6. Ross, J. F., et al. Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins. ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).
  7. Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development. Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).
  8. Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles). Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).
  9. Karch, C. P., et al. Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen. Nanomedicine. , (2018).
  10. Karch, C. P., et al. The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62(2017).
  11. Li, J., et al. A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus. PLoS One. 13 (9), e0203771(2018).
  12. Wahome, N., et al. Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine. Chemical Biology & Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).
  13. El Bissati, K., et al. Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice. Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).
  14. Kaba, S. A., et al. A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria. Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).
  15. Kaba, S. A., et al. Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine. PLoS One. 7 (10), e48304(2012).
  16. Seth, L., et al. Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants. Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).
  17. Kaba, S. A., et al. Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine. Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).
  18. El Bissati, K., et al. Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma. NPJ Vaccines. 2, 24(2017).
  19. Karch, C. P., et al. Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge. Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).
  20. Haynes, B. F., et al. Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial. New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).
  21. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).
  22. O' Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development. Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).
  23. Babapoor, S., et al. A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection. Influenza Research and Treatment. 2011, 126794(2011).
  24. Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design. Royal Society Open Science. 4 (4), 161092(2017).
  25. Indelicato, G., et al. Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles. Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).
  26. Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. Nanoscale assemblies and their biomedical applications. Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740(2013).
  27. Rey, F. A., Lok, S. M. Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines. Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).
  28. Bacterial Endotoxins. United States Pharmacopeia (USP). , Ch. 85 (2011).
  29. Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals. , Food and Drug Adminstration. Maryland. Available from: https://www.fda.gov/media/76255/download (1993).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Self Assembling Protein NanoparticlesE coli ExpressionProtein PurificationIsopropanol WashWestern Blot AnalysisDynamic Light ScatteringNanoparticle Tracking AnalysisTransmission Electron MicroscopySix Helix BundleTrimeric Antigen Presentation

Powiązane artykuły