Artykuł metodologiczny

Charakterystyka poszczególnych agregatów białkowych za pomocą nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych

DOI:

10.3791/60108

⸱

12 września 2019

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy zastosowanie nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji procesu samoorganizacji białek w agregaty oligomeryczne i fibryle amyloidowe, co jest ściśle związane z powstawaniem i rozwojem szerokiego zakresu ludzkich zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zjawisko nieprawidłowego fałdowania i agregacji białek powoduje powstawanie wysoce heterogenicznych agregatów białkowych, które są związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroby Alzheimera i Parkinsona. W szczególności wykazano, że agregaty o niskiej masie cząsteczkowej, oligomery amyloidowe, mają ogólne właściwości cytotoksyczne i są zaangażowane jako neurotoksyny w wielu formach demencji. Ilustrujemy zastosowanie metod opartych na mikroskopii sił atomowych (AFM) w celu sprostania trudnemu zadaniu, jakim jest scharakteryzowanie morfologicznych, strukturalnych i chemicznych właściwości tych agregatów, które są trudne do zbadania przy użyciu konwencjonalnych metod strukturalnych lub masowych metod biofizycznych ze względu na ich niejednorodność i przejściowy charakter. Mikroskopia skaningowa jest obecnie w stanie badać morfologię agregatów amyloidowych z rozdzielczością poniżej nanometrów. Pokazujemy tutaj, że nanospektroskopia w podczerwieni (IR) (AFM-IR), która jednocześnie wykorzystuje wysoką rozdzielczość AFM i moc rozpoznawania chemicznego spektroskopii IR, może pójść dalej i umożliwić scharakteryzowanie właściwości strukturalnych poszczególnych agregatów białkowych, a tym samym dać wgląd w mechanizmy agregacji. Ponieważ opisywane przez nas podejście może być również zastosowane do badań interakcji zespołów białkowych z małymi cząsteczkami i przeciwciałami, może ono dostarczyć podstawowych informacji do opracowania nowych związków terapeutycznych do diagnozowania lub leczenia chorób neurodegeneracyjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponad 40 milionów ludzi na całym świecie cierpi obecnie na choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera (AD)1 i Parkinsona (PD)2. Mówiąc bardziej ogólnie, ponad pięćdziesiąt patologii jest związanych na poziomie molekularnym z nieprawidłowym fałdowaniem i agregacją białek, procesem, który prowadzi do proliferacji nierozpuszczalnych agregatów białek fibrylarnych, znanych jako złogi amyloidu3,4. Molekularne pochodzenie neurodegeneracji i jej powiązania ze zmianami konformacyjnymi białek prowadzącymi do powstawania amyloidu pozostają jednak niejasne, w dużej mierze ze względu na wysoki poziom heterogeniczności, przejściowy charakter i nanoskalowe wymiary patologicznych agregatów4,5.

Wysoce udane badania struktur białkowych w ciągu ostatnich kilku dekad opierały się głównie na użyciu masowych metod, w tym krystalografii rentgenowskiej, mikroskopii krioelektronowej i spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego5,6,7,8,9. W tej klasie technik spektroskopia w podczerwieni (IR) stała się czułym narzędziem analitycznym do odkrywania właściwości chemicznych układów biologicznych, takich jak białka8. Metody IR pozwalają na ilościowe określenie drugorzędowych i czwartorzędowych zmian strukturalnych białek podczas ich nieprawidłowego fałdowania i agregacji. Ponadto, w celu dalszego rozszyfrowania na poziomie mikroskopowym szczegółów mechanistycznych związanych ze złożonymi krajobrazami swobodnej energii białek podczas ich agregacji, dużym postępem było opracowanie narzędzi kinetyki chemicznej, które rozszerzają się na złożone szlaki samoorganizacji, w tym tworzenie włókienek amyloidowych5,6,7,10,11,12. Jednak metody spektroskopowe dostarczają jedynie uśrednionych informacji na temat niejednorodnego zespołu gatunków obecnych w roztworze lub biorących udział w określonych krokach mikroskopowych, co sprawia, że badanie właściwości biofizycznych poszczególnych zagregowanych gatunków stanowi wyzwanie na poziomie nanoskali13,14.

W ostatnich dziesięcioleciach pojawiło się kilka technik mikroskopowych z możliwością operowania na skalach mniejszych niż limit dyfrakcji światła. Ta klasa metod obejmuje mikroskopię elektronową (EM) i mikroskopię sił atomowych (AFM). Podczas gdy skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) dostarczają dwuwymiarowych (2D) obrazów próbki, AFM pojawiła się w ostatnich dziesięcioleciach jako potężna i wszechstronna technika badania trójwymiarowych (3D) morfologii, a także nanomechanicznych właściwości próbki o rozdzielczości subnanometrowej13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Uzasadnieniem badania agregacji białek za pomocą AFM jest to, że podejście to umożliwia badanie morfologii poszczególnych gatunków obecnych w solution13,14,16,17,19,20,21,25,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37. W szczególności, monitorując próbkę w funkcji czasu, AFM umożliwia badanie ewolucji morfologii gatunku w próbce, co umożliwia śledzenie i wizualizację ścieżek powstawania amyloidu23,25,38,39,40,41,42. Ponadto AFM umożliwia ilościowe określenie parametrów strukturalnych, takich jak wysokości i długości przekrojów poprzecznych poszczególnych gatunków występujących w solution13,19,30,31,32,33,34,35, 36,37,40,43,44,45,46,47,48. Jednak badanie pojedynczej właściwości biofizycznej, takiej jak morfologia, często nie wystarcza w przypadku badania heterogenicznych i złożonych systemów biologicznych. Same metody obrazowania AFM, SEM lub TEM nie ujawniają łatwo właściwości chemicznych heterogenicznych gatunków agregatów amyloidowych w nanoskali.

Ostatnio dokonano znacznego postępu w analizie heterogenicznych próbek biologicznych w tej skali, dzięki opracowaniu i zastosowaniu w dziedzinie agregacji białek w nanospektroskopii w podczerwieni (AFM-IR)24,26,38,42,49,50,51,52. Ta innowacyjna metoda wykorzystuje połączenie rozdzielczości przestrzennej AFM (~1−10 nm) z mocą analizy chemicznej IR. Technika AFM-IR opiera się na pomiarze efektu rezonansu indukowanego fototermicznie napędzanego laserem IR oraz na pomiarze rozszerzalności cieplnej badanej próbki za pomocą końcówki AFM. Próbka może być oświetlona laserem IR bezpośrednio od góry lub od dołu w całkowitym odbiciu wewnętrznym, podobnie jak w konwencjonalnej spektroskopii w podczerwieni24,42,52,53. Laser IR może być impulsowany z typowymi częstotliwościami rzędu setek kiloherców (1−1000 kHz) i dostrojony w szerokim zakresie spektralnym, zwykle w zakresie 1000−3300 cm-1. Chociaż źródło lasera obejmuje obszar o średnicy ~30 μm, rozdzielczość przestrzenna techniki AFM-IR jest określana nominalnie przez średnicę końcówki AFM, która wykrywa lokalną rozszerzalność cieplną systemu. AFM-IR doskonale nadaje się do badania próbek biologicznych, ponieważ sygnał IR jest proporcjonalny do ich grubości do 1−1,5 μm, a wynikowe widma IR są na ogół zgodne z odpowiednimi widmami transmisji FTIR13,54,55. Z tego powodu można łatwo zastosować sprawdzone metody analizy w spektroskopii, takie jak badanie przesunięć chemicznych, zmiany kształtu pasma i dekonwolucji za pomocą analizy drugiej pochodnej52. Ogólnie rzecz biorąc, łącząc rozdzielczość przestrzenną AFM z możliwościami rozpoznawania chemicznego spektroskopii w podczerwieni, AFM-IR umożliwia jednoczesne uzyskanie szerokiego zakresu właściwości morfologicznych, mechanicznych i chemicznych próbki w nanoskali.

Tutaj ilustrujemy protokół charakteryzujący proces agregacji białek, który wykorzystuje połączenie testów fluorescencyjnych in vitro, obrazowania AFM o wysokiej rozdzielczości i AFM-IR w nanoskali. To połączone podejście przyniosło już doskonałe wyniki w badaniu właściwości chemicznych i strukturalnych pojedynczych mikrokropel tworzonych przez agregaty białkowe, w badaniu separacji faz białkowych ciecz-ciecz oraz w badaniu niejednorodności i właściwości biofizycznych poszczególnych zagregowanych gatunków w nanoskali23,26,38,45,50,53,56,57.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Testy agregacyjne na czytnikach płytek fluorescencyjnych

UWAGA: Opisany tutaj protokół jest przykładem jak badać agregację dowolnego białka lub peptydu za pomocą kinetyki chemicznej. W szczególności opisano zoptymalizowany protokół badania agregacji peptydu Aβ42, który bierze udział w wystąpieniu i progresji choroby Alzheimera58,59. Podobny protokół można dostosować i przyjąć do badania agregacji dowolnego białka lub peptydu.

  1. Otrzymać wysoce czysty roztwór monomeryczny Aβ42 za pomocą technik chromatografii jonowymiennej i chromatografii wykluczającej wielkość w celu rozróżnienia frakcji białkowych zawierających Aβ42 i wyizolowania frakcji monomerycznej od innych zagregowanych form Aβ42 otrzymano58,59.
  2. Rozcieńczyć peptyd Aβ42 w 20 mM buforze fosforanu sodu, 200 μM EDTA przy pH 8,058 do pożądanego stężenia końcowego w zakresie 1−5 μM, w 1,5 ml probówek o niskim stopniu wiązania. Próbki pobrane do pomiarów AFM nie powinny zawierać barwnika fluorescencyjnego stosowanego w teście agregacji (tioflawina T, ThT), ponieważ może on wprowadzać artefakty podczas osadzania próbki do analizy AFM. W ten sposób należy przygotować trzy egzemplarze dwóch identycznych roztworów: i) pierwszy zawierający monomeryczny Aβ42, aby śledzić proces agregacji przez AFM; ii) drugi zawierający monomeryczny Aβ42 z dodatkiem 20 μM ThT jako znacznik do monitorowania kinetyki agregacji.
    UWAGA: Ważne jest, aby wykonać kroki 1.1 i 1.2 na lodzie. Procedura ta ma na celu zapewnienie, że monomeryczny roztwór Aβ42 nie agreguje się, dopóki nie zostanie zainicjowany w czytniku płytek. Podczas obchodzenia się z próbkami konieczne jest staranne pipetowanie, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza, które mogą mieć wpływ na próbkę białka.
  3. Pobrać pipetą 80 μl każdej próbki do każdej studzienki z 96-dołkowej, półpowierzchniowej płytki z czarnego polistyrenu z przezroczystym dnem i niewiążącymi powierzchniami.
  4. Uszczelnić płytkę folią, aby zminimalizować parowanie próbki w trakcie agregacji.
  5. Wyrównać temperaturę czytnika płytek do 37 °C.
  6. Skonfiguruj protokół agregacji, aby odczytywać pomiary fluorescencji w stałych odstępach czasu, przy długości fali wzbudzenia 440 nm i długości fali emisji 480 nm. Agregacja powinna być inicjowana w warunkach spoczynku.
  7. Włóż płytkę do czytnika płytek.
    UWAGA: Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas obchodzenia się z płytką, aby upewnić się, że agregacja nie zostanie uruchomiona przed uruchomieniem czytnika płytek. Użyj ustawień regulacji wzmocnienia, aby zapewnić optymalny odczyt fluorescencji każdej próbki.
  8. Rozpocznij pomiar.
    UWAGA: Eksperyment agregacji jest zakończony, gdy krzywa sigmoidalna fluorescencji ThT osiągnie plateau58.

2. Przygotowanie próbki do pomiarów AFM i nano-IR

  1. Przyklej najwyższej jakości krążek miki klasy V1 do wysokiej jakości magnetycznego dysku ze stali nierdzewnej za pomocą zakładek samoprzylepnych lub taśmy dwustronnej.
  2. Wytrawiaj mikę, umieszczając kawałek taśmy klejącej na powierzchni miki i ściągając wierzchnią warstwę miki. Ta procedura pozwoli uzyskać czystą, atomowo płaską powierzchnię, odpowiednią do osadzania próbki.
    UWAGA: Wytrawiona powierzchnia musi być jednolita i gładka.
    UWAGA: Nie dotykaj ani nie oddychaj bezpośrednio nad świeżo wytrawioną miką, ponieważ spowoduje to wprowadzenie artefaktów.
  3. Wstrzymaj/zatrzymaj pomiar czytnika płytek, aby zebrać punkt zainteresowania w czasie podczas procesu agregacji białka.
  4. Usunąć folię uszczelniającą i zebrać 10 μl porcji próbek bez ThT ze studzienki do probówek o niskim stopniu wiązania o pojemności 1,5 ml.
  5. Umieścić 10 μl próbki na świeżo wytrawionej mice. W przypadku pomiarów AFM-IR próbki należy umieścić na świeżo usuniętym złotym podłożu.
  6. Inkubować roztwór na mice przez 1 minutę, aby umożliwić fizsorbcję.
    UWAGA: Dłuższy czas inkubacji pozwoliłby na lepsze wchłanianie na powierzchni, ale może wywołać sztuczną samoorganizację i samoorganizację25. Aby uniknąć tych efektów, można zastosować osadzanie w sprayu25.
  7. Spłucz trzykrotnie 1 ml ultraczystej wody.
  8. Wysuszyć pod delikatnym strumieniem azotu, aby zmierzyć próbkę w środowisku powietrznym.

3. Obrazowanie AFM morfologii agregatów białkowych

UWAGA: Pomiary morfologii mogą być wykonywane zarówno w trybie kontaktowym, jak i dynamicznym, w poniższych krokach opisano ten drugi, ponieważ zmniejsza siły boczne, aby zmierzyć morfologię 3D próbki z wysoką rozdzielczością. Pomiary AFM-IR będą wykonywane w trybie kontaktowym w celu poprawy stosunku sygnału do szumu AFM-IR.

  1. Włącz system AFM co najmniej 30 minut przed pomiarami, aby system osiągnął stabilność termiczną. Kliknij Konfiguracja, a następnie Sonda. W oknie Zmiana sondy kliknij Dalej, aby przygotować Z, Focus Stage.
  2. Wyłącz przełącznik wiązki AFM (jeśli jest włączony). Odblokuj zamki na jaskółczy ogon, odłącz głowicę od systemu i w oknie Wymiana sondy kliknij Dalej.
  3. Zamontuj wspornik AFM na uchwycie sondy. Podłącz głowicę do systemu i zablokuj zamki na jaskółczy ogon.
    UWAGA: Optymalne wsporniki do badania próbek biologicznych w trybie dynamicznym AFM mają stałą sprężystości w zakresie od 2−40 N m-1 do promienia wierzchołka w zakresie 2−8 nm14.
  4. Włącz przełącznik wiązki laserowej AFM i w oknie Zmiana sondy kliknij Dalej.
  5. W wyskakującym okienku kliknij Nie, jeśli typ wspornika się nie zmienił. Wyreguluj pokrętła wyrównania optycznego, aby znaleźć wspornik. Dostosuj ostrość do wspornika i kliknij Dalej.
  6. W wyskakującym okienku kliknij Tak, jeśli fokus znajduje się na wsporniku.
  7. Ustaw wiązkę laserową na końcu wspornika za pomocą pokręteł kontrolujących położenie lasera detekcyjnego. Zmaksymalizuj całkowity sygnał mierzony przez fotodiodę czterokwadrantową do co najmniej >1 V za pomocą pokręteł kontrolujących położenie odchylonej wiązki laserowej na fotodiodzie czułej na położenie (PSPD). W oknie Zmiana sondy kliknij Dalej, a następnie Zamknij.
  8. Odczekaj 15 minut, aż wspornik osiągnie stabilność termiczną. W razie potrzeby wyreguluj położenie odchylonej wiązki laserowej na PSPD.
  9. Kliknij NCM SWEEP, wybierz żądaną amplitudę oscylacji, kliknij Użyj fazy, kliknij auto i dostrój wspornik blisko maksimum jego pierwszego swobodnego rezonansu oscylacji, który wynosi około 300 kHz dla wspornika o stałej sprężystości 40 N m-1.
    UWAGA: Dostrojenie wspornika do maksimum jego swobodnego rezonansu zapewnia większą stabilność pomiarów14.
  10. Umieścić próbkę w uchwycie na próbkę. Dobierz odpowiednie parametry obrazowania. Typowa częstotliwość skanowania wynosi 0,3–1,0 Hz dla obszaru skanowania od 1 x 1 μm2 do 5 x 5 μm2. Typowa wymagana rozdzielczość wynosi od 256 x 256 do 1024 x 1024 pikseli. Kliknij Obszar skanowania, aby wybrać rozmiar skanowania i liczbę pikseli.
  11. Ustaw ostrość widok optyczny na próbce. Kliknij Podejście, aby zbliżyć się do powierzchni próbki. Po zakończeniu podejścia kliknij Lift 100 μm, aby podnieść końcówkę AFM 100 μm ponad powierzchnię próbki. Kliknij przycisk Expand (Rozwiń) na obrazie optycznym próbki. Kliknij pasek Focus Stage (Etap ostrości), aby ustawić ostrość widoku na powierzchni próbki.
  12. Użyj strzałek, aby poruszać się w regionie interesującej Cię próbki. Zaangażuj powierzchnię, naciskając przycisk Podejdź. Kliknij przycisk Line Scan i sprawdź, czy końcówka dobrze podąża za powierzchnią, w razie potrzeby dostosuj nastawę.
  13. Rozpocznij obrazowanie powierzchni próbki, naciskając przycisk Skanuj. Podczas obrazowania, aby uniknąć dużej siły obrazowania i zachować spójność w niezależnych próbkach, utrzymuj stały reżim przemiany fazowej nieprzekraczający Δ20°42.
  14. Wprowadź nazwę pliku i wybierz katalog bazowy, w którym zostanie zapisany pozyskany obraz.

4. Pomiary nanospektroskopii w podczerwieni agregatów białkowych

  1. Włącz system AFM-IR i laser na podczerwień (IR)60 30−60 min przed pomiarami stabilizacji termicznej. Typowymi laserami dla instrumentów AFM-IR są optyczne oscylatory parametrów (OPO) i kwantowe lasery kaskadowe (QCL).
  2. Otwórz wbudowane oprogramowanie, aby sterować instrumentem. Kliknij plik, a następnie nowy, aby otworzyć nowy plik nanoIR. Naciśnij przycisk inicjalizacji, aby uruchomić system AFM-IR.
  3. Otwórz pokrywę przyrządu i zamontuj w systemie AFM-IR sondę pokrytą złotem krzemowym o promieniu nominalnym 30 nm i stałej sprężystości 0,2 N/m, aby zmierzyć próbkę w trybie kontaktowym.
  4. Kliknij Load w sekcji Sonda AFM, a następnie dalej. W sekcji ostrości na sondzie kliknij strzałki, aby ustawić ostrość kamery na wsporniku. W przykładowym ruchu XY w przekroju użyj strzałek, aby umieścić powietrze poprzeczne na końcu wspornika.
  5. Obróć pokrętła sterujące położeniem lasera wykrywającego, aby ustawić laser na końcu wspornika. Obróć pokrętła laserowe, aby wykryć i zmaksymalizować sumę zmierzoną przez czterokwadrantową fotodiodę do wartości >3 V. Obróć pokrętło odchylenia, aby wyregulować ugięcie wspornika na -1 V, a następnie kliknij dalej. Zamknij pokrywę instrumentu.
  6. W sekcji Ustawianie ostrości na próbce użyj strzałek, aby ustawić ostrość kamery na próbce. Następnie, w sekcji ruchu XY próbki, użyj strzałek, aby przesunąć się w obszarze zainteresowania próbki i kliknij na podejście i włącz się.
  7. W oknie mikroskopu wybierz jako dane wejściowe interesujące nas kanały, aby odwzorować właściwości biofizyczne próbki. W szczególności wybierz wysokość dla morfologii, amplitudę 2 dla absorpcji podczerwieni i częstotliwość PLL, aby odwzorować rezonans kontaktowy końcówka-próbka.
  8. W sekcji Skanowanie AFM w oknie kontrolnym użyj podobnych parametrów jak w sekcji 3 (tj. szybkość skanowania 0,1−1,0 Hz, od 256 x 256 do 1024 x 1024 pikseli). Jako wartość wzmocnień należy wybrać w zależności od chropowatości próbki: całkę I = 1−10 i proporcjonalną P = 10−30. Następnie kliknij skanowanie, aby uzyskać mapę morfologii.
    UWAGA: Morfologia może być podobnie mierzona w trybie dynamicznego stukania, ale pomiary AFM-IR są tutaj wykonywane w trybie kontaktowym, aby uzyskać wyższy stosunek sygnału do szumu.
  9. Po zakończeniu mapowania morfologii, w oknie mikroskopu kliknij mapę wysokości, aby umieścić sondę na szczycie jednego agregatu. Następnie w sekcji nanoIR w oknie sterowania kliknij uruchom IR, aby oświetlić próbkę laserem IR.
  10. Aby ustawić ostrość lasera na podczerwień na wsporniku, kliknij optymalizację. W tym oknie wpisz liczbę falową, w której próbka będzie miała wysoką absorbancję i kliknij przycisk dodaj. W przypadku białka typowa wartość to 1655 cm-1. Kliknij skanowanie, aby znaleźć pozycję lasera IR i kliknij aktualizację, aby wyrównać jego położenie z wspornikiem. Zamknij okno.
  11. W sekcji ogólnej ustawienia nanoIR wpisz liczbę falową, w której spodziewana jest wysoka absorbancja w polu względnym. Następnie wyłącz opcję Band Pass Filter i spójrz na odczyt licznika oraz na szybką transformację Fouriera (FFT) odpowiedzi wspornikowej. W oknie FFT przesuń zielony kursor, aby odczytać częstotliwość rezonansową wspornika. Typowa wartość FFT rezonansu wsporników wynosi około 300 kHz. Zapisz tę wartość częstotliwości rezonansowej w sekcji ogólnej w środkowym polu częstotliwości i użyj okna częstotliwości 50 kHz.
    UWAGA: Wybierz moc lasera, która jest wystarczająco niska, aby nie nasycić odczytu miernika i nie spowodować zniekształceń w odpowiedzi wspornika oraz nie przegrzać próbki.
  12. Kliknij okno dostrajania impulsu laserowego, aby skorzystać z trybu wzmocnionego rezonansu. Wybierz centrum częstotliwości 300 kHz, zakres strojenia 50 kHz i cykl pracy lasera 5%. Kliknij na nabycie, aby przesunąć tętno lasera. Za pomocą kursora na wykresie dostosuj impuls laserowy do częstotliwości reakcji mechanicznej rozszerzalności cieplnej próbki pochłaniającej światło podczerwone. Następnie wybierz opcję PLL, aby monitorować rezonans kontaktowy między próbką a końcówką. Naciśnij przycisk zerowania w oknie PLL i zaznacz opcję włącz, aby śledzić rezonans kontaktowy końcówki próbki. Wybierz wzmocnienie całkowe I = 0,5 i wzmocnienie proporcjonalne P = 10. Zamknij okno.
  13. Otwórz ponownie okno optymalizacyjne i znajdź pozycję lasera IR dla co najmniej 3 liczb falowych odpowiadających głównym pasmom absorbancji próbki (pasmo amidowe I-II-III) i dla co najmniej jednej liczby falowej dla każdego chipa lasera.
  14. Kliknij Narzędzia | Kalibracja tła IR | Nowy. W oknie wybierz interesujący nas obszar spektroskopowy (1800−1200 cm-1 do badania próbek białek); wybierz tę samą częstość impulsów, jak określono w kroku 4.12 i cykl pracy 5%; Kliknij na Szybka akwizycja i wybierz prędkość lasera, typowy zakres dla kwantowego lasera kaskadowego wynosi od 20−500 cm-1. Kliknij pobierz, aby zmierzyć tło lasera IR. To widmo tła zostanie wykorzystane do normalizacji mierzonych widm zlokalizowanych w nanoskali. Zamknij okno.
    UWAGA: Jeśli szybki tryb laserowy i wzmocniony rezonans nie jest dostępny, pomiń krok 4.12 i wybierz widma schodkowe zamiast szybkich zarówno w oknie akwizycji widm tła, jak i podczerwieni. Nie zostanie jednak osiągnięta czułość pojedynczego agregatu.
  15. W ustawieniach widm IR wybierz rozdzielczość widma IR między 1−4 cm-1 a liczbą współśrednich co najmniej 64x. Kliknij na acquire, aby zmierzyć zlokalizowane widmo IR w nanoskali w zakresie białek (1800−1200 cm-1).
  16. Aby uzyskać mapę chemiczną w rozdzielczości nanoskali, wybierz opcję obrazowania w podczerwieni, wybierz liczbę falową będącą przedmiotem zainteresowania (np. 1655 cm-1 dla pasma amidowego I) i kliknij skanuj w oknie skanowania AFM.
  17. Po zakończeniu mapowania przejdź do pliku i zapisz pomiary. Do analizy uzyskanych map morfologii, rezonansu kontaktowego i chemii, a także widm zlokalizowanych w nanoskali, należy skorzystać z wbudowanego oprogramowania do przetwarzania obrazów AFM. Widma i obrazy można zapisać jako pliki .csv lub .axz w celu dalszej szczegółowej analizy za pomocą komercyjnego oprogramowania.

5. Przetwarzanie obrazów i analiza wymiarów przekroju poprzecznego

  1. Spłaszcz surowe obrazy14,17,19,41,42,59 przy użyciu wbudowanego oprogramowania do przetwarzania obrazów AFM lub oprogramowania komercyjnego.
    UWAGA: Agregaty powinny być zamaskowane w obliczeniach, aby uniknąć artefaktów analizy i niedoszacowania ich zmierzonej wysokości.
  2. Spłaszcz obraz o 0 kolejności dopasowania płaszczyzny odejmowania.
  3. Spłaszcz obraz według płaszczyzny, a następnie linia po linii w 1. kolejności regresji, drugi krok jest powtarzany, aż zostanie osiągnięta płaska linia bazowa w profilu liniowym obrazu.
  4. Jeśli próbka jest bardzo zatłoczona, zawiera wyjątkowo wysokie agregaty lub występuje artefakt łuku skanera, spłaszcz obraz, używając dopasowania 2. kolejności regresji.
  5. Zmierz wysokość i szerokość agregatu od profilu linii prostopadłego do osi włókien14,17,19,41,42,59.
  6. Zmierz długość włókienka równolegle do osi włókienka14,17,19,41,42,59.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywny przebieg czasowy agregacji Aβ42, mierzony za pomocą testu fluorescencji ThT, jest pokazany w Rysunek 1. Proces agregacji jest zwykle charakteryzowany przez krzywą sigmoidalną, w której początkowo obserwuje się fazę opóźnienia, po której następuje stroma faza wzrostu, zanim krzywa osiągnie plateau, gdy osiągnięty zostanie stan równowagi 6,7,58. Konieczne jest zapewnienie, że zoptymali...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwszym krytycznym krokiem w tym protokole jest przygotowanie białek monomerycznych, takich jak w przypadku roztworu Aβ42 opisanego w krokach 1.1 i 1.2. Konieczne jest rozpoczęcie procesu agregacji od wysoce czystego, monomerycznego roztworu, ponieważ obecność gatunków oligomerycznych lub zagregowanych może skutkować słabą odtwarzalnością kinetyki agregacji58 i indukować artefakty w pomiarach AFM (np. gatunki fibrylarne będą widoczne na początkowych etapach agregacji), co może prowadzić do błędn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (SNF) za wsparcie finansowe (grant numer P2ELP2_162116 i P300P2_171219), Darwin College, programowi Erasmus+ za wsparcie finansowe (numer grantu 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) oraz badaniom prowadzącym do tych wyników, które otrzymały finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) za pośrednictwem grantu ERC PhysProt (numer umowy) 337969), Newman Foundation (T.P.J.K.) oraz Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V. i T.P.J.K.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System AFM-IRAnasys InstrumentsnanoIR 2 lub 3Systemy do pomiaru rozszerzalności cieplnej w trybie kontaktowym i rezonansowym
Corning 96-dołkowy polistyren o połowie powierzchni/przezroczysty polistyren NBS Microplate Corning3881
Corning Microplate Aluminiowa taśma uszczelniającaCorning6570
Dwustronne krążki samoprzylepneAGAR ScientificAGG3347N
FLUOstar OmegaBMG Labtech415-101Czytnik płytek
Mica Disc 10mm V1AGAR ScientificAGF7013
Park NX10 System AFMPark SystemsN/AMikroskop sił atomowych
Platypus Ultra-Flat Gold ChipsPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 wspornikiPark SystemsPPP-NCHR-10
Probówki białkowe LowBind, 2,0 mlEppendorf30108132
Wsporniki pokryte złotemsilikonowym Anasys InstrumentsPR-EX-nIR2
SPM Krążki do próbek 12mmAGAR ScientificAGF7001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926(2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541(2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. , London, UK. 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101(2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225(2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9(2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. New York, NY. 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903(2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. Frewin, C. L. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

AFM IRMorphological AnalysisStructural PropertiesChemical PropertiesNeurodegenerative DiseasesAmyloid OligomersSingle Molecule Methods

Powiązane artykuły