Znakowanie immunofluorescencyjne ludzkich i mysich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w tkance zatopionej w parafinie

Podsumowanie

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to trójwymiarowe struktury generowane przez stymulowane granulocyty neutrofilowe. W ostatnich latach stało się jasne, że sieci NET są zaangażowane w wiele różnych chorób. Wykrywanie NET w tkance może mieć znaczenie diagnostyczne, dlatego wymagane są standardowe protokoły znakowania składników NET.

Streszczenie

Granulocyty neutrofilowe, zwane również leukocytami wielojądrzastymi (PMN) ze względu na ich zrazikowane jądro, są najliczniejszym typem leukocytów. Dojrzewają w szpiku kostnym i są uwalniane do krwi obwodowej, gdzie krążą przez około 6-8 godzin; Jednak w tkance mogą przetrwać przez kilka dni. Poprzez diapedezę przez śródbłonek opuszczają krwioobieg, wnikają do tkanek i migrują w kierunku miejsca infekcji zgodnie z gradientami chemotaktycznymi. Neutrofile mogą zwalczać inwazyjne mikroorganizmy poprzez fagocytozę, degranulację i generowanie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET). Protokół ten pomoże w wykrywaniu NET w tkance zatopionej w parafinie. NET są wynikiem procesu zwanego NETosis, który prowadzi do uwolnienia składników jądrowych, ziarnistych i cytoplazmatycznych z żywych (vital NETosis) lub umierających (samobójcza NETosis) neutrofili. W warunkach in vitro NET tworzą struktury przypominające chmury, które zajmują przestrzeń kilkakrotnie większą niż komórki, z których pochodzą. Szkieletem NET jest chromatyna, z którą związany jest wybór białek i peptydów pochodzących z granulek i cytoplazmy. W ten sposób utrzymuje się wysokie lokalne stężenie związków toksycznych, dzięki czemu NET mogą wychwytywać i dezaktywować różne patogeny, w tym bakterie, grzyby, wirusy i pasożyty, przy jednoczesnym ograniczeniu dyfuzji wysoce aktywnych składników NET prowadzącej do uszkodzenia sąsiedniej tkanki. Niemniej jednak w ostatnich latach stało się jasne, że NET, jeśli są generowane w dużych ilościach lub są usuwane w niewystarczającym stopniu, mają potencjał patologiczny, od chorób autoimmunologicznych po raka. W związku z tym wykrycie NET w próbkach tkanek może mieć znaczenie diagnostyczne, a wykrycie NET w chorej tkance może wpłynąć na leczenie pacjentów. Ponieważ próbki tkanek osadzonych w parafinie są standardową próbką używaną do analizy patologicznej, starano się ustalić protokół barwienia fluorescencyjnego składników NET w tkance zatopionej w parafinie przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał.

Wprowadzenie

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili mają złożoną, trójwymiarową strukturę. Analiza mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości wykazała, że składają się one z gładkich włókien o średnicy 15−20 nm (chromatyna) wysadzanych domenami kulistymi o długości fali >25 nm, które prawdopodobnie składają się z asortymentu około 30 ziarnistych i cytoplazmatycznych białek i peptydów^1,2. W przypadku uzyskania in vitro z wyizolowanych neutrofili, NET można zidentyfikować poprzez barwienie dwóch lub więcej ich składników za pomocą immunofluorescencji (np. histonów i elastazy neutrofilowej [NE]). W niestymulowanych leukocytach wielojądrzastych (PMN) histony znajdują się wyłącznie w jądrze, podczas gdy NE jest zawarte w granulkach. Podczas NETosis, NE dostaje się do jądra, gdzie przetwarza histony^3,4. NET charakteryzują się kolokalizacją składników, które są wyraźnie oddzielone w niestymulowanych neutrofilach. Ponieważ obecnie nie istnieją przeciwciała, które wykrywałyby wyłącznie epitopy specyficzne dla NET (tj. Nie reagują z naiwnymi neutrofilami), wykrycie kolokalizacji białek neutrofilów w NET jest jedynym sposobem identyfikacji NET.

W tkance NET są prawie niemożliwe do wykrycia za pomocą konwencjonalnych barwników histologicznych (np. przez barwienie hematoksyliną/eozyną [H&E], która przedstawia NET jako rozproszony bladoniebieskawy odcień). Tylko wtedy, gdy są bardzo liczne, NET można wyraźnie odróżnić za pomocą barwienia H&E, takiego jak w thrombi⁵. Ponieważ NET są rozproszone per se, struktura tkankowa musi być optymalnie zachowana, więc kriopreparaty, które są podatne na wywoływanie artefaktów zamrażania, nie są optymalne do analizy NET w tkankach. Zamiast tego wykazano, że wiązanie formaldehydu i osadzanie parafiny dobrze zachowuje strukturę NET w tkance². Kontrola (immuno)histologiczna skrawków tkanki zatopionej w parafinie jest standardową metodą analizy patologicznej. Ponieważ tkanka w blokach parafinowych jest konserwowana nawet w temperaturze pokojowej (RT), próbki tkanek z codziennych prac diagnostycznych można porównać z próbkami, które zostały przygotowane wiele lat temu, z pytaniami i technikami, które pojawiły się niedawno. Do niedawna nie wykrywano NET w tkankach, a szczegółowa analiza powstawania i usuwania NET w przebiegu chorób może prowadzić do nowych informacji na temat patogenezy. Zastosowanie tkanki zatopionej w parafinie ma tę nieocenioną zaletę, że umożliwia analizę materiału archiwalnego i przeprowadzenie badań retrospektywnych⁶. Niezaprzeczalnie korzyści te mają swoją cenę. Przed zatopieniem w parafinie tkanka musi zostać utrwalona formaldehydem, odwodniona i podgrzana do temperatury powyżej 50 °C. Zabiegi te indukują autofluorescencję tkanek, a także maskowanie epitopów.

Aby ograniczyć artefakty fiksacji, czas fiksacji powinien być ograniczony do minimum, więc rozmiar próbek tkanek nie powinien przekraczać obszaru 20 mm x 30 mm o grubości ~3 mm. Próbki tej wielkości są całkowicie utrwalane po całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej w formaldehydzie, a następnie następnie bezpośrednim odwodnieniu i zatopieniu parafiny. Alternatywnie, utrwalone próbki mogą być przechowywane przez 1 lub 2 dni w buforze. W przypadku badań immunofluorescencyjnych utrwalacz powinien być świeżo przygotowany z paraformaldehydu rozpuszczonego w odpowiednim buforze (np. soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS] lub soli fizjologicznej buforowanej trisem [TBS]). Podczas przygotowania utrwalającego temperatura musi być utrzymywana poniżej 60 °C, aby zapobiec tworzeniu się kwasu mrówkowego. Formalina, która jest standardowym utrwalaczem patologii, nie powinna być stosowana, ponieważ zawiera metanol, inne aldehydy, ketony i kwas mrówkowy. Zanieczyszczenia te prowadzą do zwiększonego maskowania epitopów i znacznej autofluorescencji tkanek.

Aby uzyskać skuteczne immunoznakowanie, maskowanie epitopów musi zostać cofnięte w procesie zwanym odzyskiwaniem antygenu. Wycinki tkanek są podgrzewane w odpowiednim buforze, który, jak się uważa, przerywa mostki metylenowe, dzięki czemu epitopy stają się dostępne dla przeciwciał⁷. W przypadku wykrywania NET preferowane jest pobieranie epitopów indukowane ciepłem (HIER) w stosunku do innych metod, takich jak stosowanie enzymów proteolitycznych. Rutynowo znakowanie immunologiczne skrawków parafiny przeprowadza się za pomocą pojedynczego przeciwciała, po którym następuje przeciwciało drugorzędowe znakowane peroksydazą, które jest wykrywane za pomocą substratu wytrącającego. W porównaniu z immunofluorescencją, metody detekcji oparte na enzymach mają niższą rozdzielczość przestrzenną ze względu na dyfuzję osadu substratu i generalnie jednoczesne wykrywanie więcej niż jednego antygenu jest ograniczone⁶.

Ponieważ obecnie nie istnieją żadne przeciwciała, które wyłącznie wiążą się z NETs, ten protokół jest używany do oznaczania dwóch białek, histonu 2B, który jest jądrowy, i elastazy neutrofilowej, która jest zlokalizowana w granulkach. W neutrofilach niestymulowanych białka te są rozdzielone, ale są kolokalizowane w neutrofilach poddawanych NETozie i w NET. Jednoczesne wykrycie dwóch antygenów można osiągnąć za pomocą dwóch przeciwciał pierwszorzędowych wyhodowanych w różnych gospodarzach i dwóch specyficznych dla gatunku przeciwciał drugorzędowych znakowanych różnymi fluorochromami. Ten raport jest standaryzacją naszego wcześniej opublikowanego protocol⁸ i wykorzystuje kombinację dwóch dostępnych na rynku przeciwciał, które niezawodnie barwią składniki NET w tkance zatopionej w parafinie, zarówno świeżej, jak i archiwalnej, pochodzenia ludzkiego i mysiego.

Protokół

Protokoły tkankowe zostały zatwierdzone przez Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Niemcy (G0121/16). Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z europejską dyrektywą 2010/63/UE w sprawie opieki, dobrostanu i traktowania zwierząt.

1. Utrwalanie, odwadnianie, zatapianie parafiny, cięcie, montaż sekcji

1. Przygotować 2% roztwór formaldehydu, rozpuszczając paraformaldehyd w TBS (pH 7,4). Unikać podgrzewania powyżej 60 °C. Schłodzić do temperatury RT. Roztwór formaldehydu można przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Umieść świeżą tkankę (tutaj: płuco myszy) na szklanej szalce Petriego z TBS. Za pomocą skalpela rozciąć na kawałki o wymiarach nieprzekraczających 20 mm x 30 mm x 3 mm. Zanurzyć próbkę w 2% roztworze formaldehydu w TBS.
   UWAGA: Objętość utrwalacza powinna być co najmniej 20 razy większa niż objętość tkanki.
3. Fix w RT na 8−20 h. Przenieś próbki do TBS. Umieść w kasetach.
4. Odwodnić za pomocą serii etanolu (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), przy czym każdy krok trwa 1 godzinę.
5. Przezroczyste próbki 2x w 100% ksylenie (dimetylobenzen), każdy etap 1 h.
6. Moczyć w parafinie 2x w temperaturze 60 °C (temperatura topnienia 54−56 °C), co 1 h.
7. Zamontuj próbki za pomocą form do zatapiania, użyj dna kasety jako pokrywy.
8. Pozwól parafinie zestalić się i usuń pleśnie osadzające.
9. Przygotować skrawki tkanki o objętości 3 μm i pozostawić je na powierzchni łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
10. Unosić sekcje pływające na powierzchni wody na szkiełkach samoprzylepnych (tabela materiałów).
11. Inkubować skrawki na szkiełkach podstawowych przez noc w temperaturze 40 °C w celu związania tkanki ze szkłem.

2. Rehydratacja, pobieranie epitopów pod wpływem ciepła, barwienie, montowanie, analiza mikroskopowa

1. Umieść skrawki na szkiełkach w stojakach i zanurz je w pożywce używanej do odwadniania i oczyszczania, w odwrotnej kolejności, z każdym krokiem przez 5 minut: 2x 100% ksylen, seria etanolowa (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).
2. Podgrzać łaźnię wodną z płytą grzejną o kontrolowanej temperaturze do 70 °C. Umieścić słoik wypełniony buforem do odzyskiwania epitopów indukowanym ciepłem (HIER) (pH 9; Tabela materiałów), zawierającej 10% glicerolu jako bufor temperatury, do łaźni wodnej. Gdy bufor HIER osiągnie temperaturę 70 °C, umieścić stojak ze szkiełkami w słoiku buforowym.
3. Inkubować szkiełka podstawowe przez 120 minut w temperaturze 70 °C.
4. Wyjmij słoik z łaźni wodnej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Przepłucz sekcje 3x wodą dejonizowaną i raz TBS (pH 7,4).
5. Ostrożnie usuń płyn ze szkiełek między sekcjami za pomocą zwijanej bibuły filtracyjnej lub wacika, pozostawiając sekcje nawilżone.
6. Utwórz barierę wokół odcinków za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.
7. Inkubować skrawki w buforze blokującym (1% albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 2% normalnej surowicy osła, 5% żelatyny z ryb zimnowodnych i detergentów [Tabela materiałów] w TBS) w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
8. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w stężeniu 1 μg/ml w buforze blokującym.
   UWAGA: W przypadku siatek u ludzi i myszy można zastosować kombinację przeciwciała królika przeciwko elastazie neutrofilowej i przeciwciała kurzego przeciwko histonowi 2B (tabela materiałów).
9. Umieść szkiełka w wilgotnej komorze. Usunąć bufor blokujący i dodać rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe bez przemywania do sekcji, używając wystarczającej objętości, aby zapobiec wysuszeniu. Uszczelnić wilgotną komorę folią parafinową i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
10. Myj sekcje 3x za pomocą TBS przez 5 min każda.
11. Przygotować roztwór roboczy przeciwciał drugorzędowych w buforze blokującym. Do wykrywania przeciwciał pierwszorzędowych należy użyć przeciwciał drugorzędowych wyhodowanych u osła i wstępnie wchłoniętych przeciwko białkom surowicy wielu gatunków (tabela materiałów). Przykryj skrawki tkanki roztworem roboczym przeciwciał drugorzędowych. Przenieś szkiełka do komory wilgotnej, uszczelnij folią parafinową. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze RT.
    UWAGA: Osioł anty królik sprzężony z Cy2 i osł anty kurczak sprzężony z Cy3 mogą być połączone z przeciwbarwnikiem DNA.
12. Przemyć sekcje 3x po 5 min TBS, następnie raz przez 5 min wodą dejonizowaną.
13. Przykryj sekcje medium montażowym (tabela materiałów) i nałóż szkło nakrywkowe, unikając tworzenia się pęcherzyków.
14. Poczekaj, aż podłoże montażowe zestali się, a następnie przeanalizuj immunofluorescencję za pomocą mikroskopu szerokokątnego z odpowiednimi filtrami pasmowoprzepustowymi lub mikroskopu konfokalnego.

Wyniki

Stosując niniejszy protokół, można z sukcesem wykryć składniki NET w tkankach zatopionych w parafinie pochodzenia ludzkiego i mysiego. W niepobudzonych neutrofilach H2B znajduje się wyłącznie w jądrze, a elastaza neutrofilowa w ziarnistościach; w konsekwencji ich sygnały fluorescencyjne nie nakładają się na siebie. W przeciwieństwie do tego, podczas NETozy i po utworzeniu NET, NE, H2B oraz DNA częściowo kolokalizują. W przypadku obrazowania sygnałów w kolorach zielonym, czerwonym i niebieskim, obszary kolokalizacji są przedstawione jako białawy nadkład (Ryc. 1G, Ryc. 2D oraz Ryc. 3D). Nadkład ten można również skwantyfikować przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Piksele z nakładających się sygnałów, które są dodatnie dla kolorów zielonego, czerwonego i niebieskiego, zostały wykorzystane do stworzenia fioletowego nadkładu przedstawiającego obszary NET na Ryc. 1G’, Ryc. 2D’ oraz Ryc. 3D’. Niektóre komórki na Ryc. 1 i Ryc. 2 mają jądra wielopłatowe, ale są ujemne pod kątem NE. Przypuszcza się, że są to granulocyty eozynofilne.

Jeśli skrawki tkanek mają grubość 2–3 µm, można je analizować za pomocą mikroskopii szerzenia z użyciem obiektywów 10x lub 20x. Przykład przedstawiono na Rysunku 1, który ukazuje skrawek tkanki z zapalenia wyrostka robaczkowego człowieka barwiony na NE (zielony), H2B (czerwony) i Hoechst 33342 (niebieski). Panele A, C, E i G pochodzą z obszaru skrawka zawierającego NETy, natomiast panele B, D, F i H pochodzą z innego obszaru tego samego skrawka, który zawiera liczne neutrofile (Rysunek 1B, NE), ale nie zawiera NETów. Obszary z masywnym tworzeniem NETów można łatwo zlokalizować nawet przy niskich powiększeniach, ponieważ wszystkie trzy składniki NET kolokalizują, często w postaci nitkowatych struktur zewnątrzkomórkowych, które w nałożeniu trzech kanałów jawią się jako białawe włókna zewnątrzkomórkowe (Rysunek 1G), a fioletowa nakładka widoczna jest na Rysunku 1G’.

Wzory barwienia obu obszarów tkanki są wyraźnie różne: NE znajduje się w ziarnistościach (Rycina 1B), a DNA w jądrach komórkowych (Rycina 1F). Co ciekawe, barwienie na H2B jest raczej słabe w obszarach bogatych w neutrofile (Rycina 1D) w porównaniu do tkanki zawierającej NET (Rycina 1C). Może to wynikać z wielkości przeciwciała (IgY ma 180 kD w porównaniu do 150 kD dla IgG), co może uniemożliwiać wiązanie z kompaktem chromatyny w nienaruszonych jądrach, podczas gdy dostęp do H2B jest ułatwiony, jeśli chromatyna jest zdekondensowana, jak ma to miejsce w NET (Rycina 1C).

Aby uzyskać wyższą rozdzielczość, należy zastosować mikroskopy konfokalne lub mikroskopy szerokopolowe z dekonwolucją w celu zminimalizowania rozmycia poza ogniskową. Rysunek 2 przedstawia obszar bogaty w NET z tego samego preparatu wyrostka robaczkowego człowieka. Jest to projekcja maksymalna stosu konfokalnego. NE (zielony, Rysunek 2A) występuje w ziarnistościach, ale jest również obficie obecny zewnątrzkomórkowo, gdzie kolokalizuje z H2B (czerwony, Rysunek 2B) oraz DNA (niebieski, Rysunek 2C). Zewnątrzkomórkowa kolokalizacja skutkuje białawą kombinacją kolorów (Rysunek 2D). Piksele dodatnie dla kolorów zielonego, czerwonego i niebieskiego zostały wykorzystane do stworzenia fioletowej nakładki prezentującej NET na Rysunku 2D’.

Rysunek 3 przedstawia szczegół centralnej sekcji płuca myszy zainfekowanego Mycobacterium tuberculosis (M. tb). Warunki odzyskiwania antygenu i barwienia są takie same jak dla Rysunku 1 i Rysunku 2. Ponownie wyraźnie widoczna jest kolokalizacja wszystkich trzech komponentów NET w postaci białawych obszarów między neutrofilami, co zostało wykorzystane do stworzenia fioletowej warstwy wskazującej NET na Rysunku 3D’.

Specyficzność barwienia została wykazana na Rysunku uzupełniającym 1, który przedstawia pomijalne barwienie z zastosowaniem przeciwciał kontrolnych, a Rysunek uzupełniający 1A,B przedstawia nieimmunologiczną surowicę królika (zielony) oraz kurze przeciwciała IgY przeciwko GFP (czerwony). Rysunek 1C,D pokazuje barwienie przy użyciu samych przeciwciał wtórnych; zastosowano taką samą kombinację, jak na Rysunku 1, Rysunku 2, oraz Rysunku 3. Rysunek uzupełniający 1A,C przedstawia przekrój wyrostka robaczkowego człowieka, podobnie jak na Rysunku 1 i Rysunku 2. Rysunek uzupełniający 1B,D przedstawia tkankę płuca myszy, podobnie jak na Rysunku 3. DNA wybarwiono Hoechst 33342. Pasek skali odpowiada 25 µm.

Rycina 1: Szerokopolowa mikroskopia fluorescencyjna przekroju parafinowego próbki z zapalenia wyrostka robaczkowego u człowieka.
Panele A, C, E i G przedstawiają obszar tkanki z NETs, podczas gdy panele B, D, F i H pokazują inny obszar tego samego przekroju, który jest bogaty w neutrofile, ale bez formowania się NETs. Barwienie wykonano przeciwko NE (A,B; zielony), H2B (C,D; czerwony) i DNA (E,F; niebieski). Rycina 1G,H przedstawia nałożenie wszystkich trzech kanałów. Piksele o intensywności od 80 do 256 we wszystkich kolorach reprezentują obszary nakładającego się barwienia NE, H2B i DNA i są uznawane za pochodzące z NETs lub neutrofili podlegających procesowi NETosis. Piksele te zostały pseudo-pokolorowane na fioletowo w panelu G’, gdzie tworzą obszar rozległy, oraz w panelu H’, gdzie znaleziono jedynie małe punkty. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu szerokopolowego z użyciem obiektywu 20x, a pasek skali reprezentuje 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 2: Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna komponentów NET w próbce wyrostka robaczkowego człowieka.
Wykorzystano ten sam przekrój tkanki, co na Rycini 1. (A) Barwienie przeciwko NE, (B) obrazowanie H2B oraz (C) barwienie DNA Hoechst 33342. (D) Nałożenie wszystkich trzech kanałów. Kolokalizacja wszystkich trzech sygnałów została zaznaczona pseudokolorem fioletowym na panelu D’. W tym celu za pomocą oprogramowania Volocity 6.3 wykryto piksele o intensywności >80 we wszystkich trzech kolorach. Obszar fioletowy przedstawia NETy lub neutrofile podlegające procesowi NETozy. Obrazy zostały wykonane za pomocą mikroskopii konfokalnej jako stosy Z (Z-stacks) i przedstawione jako projekcja maksymalna. Pasek skali reprezentuje 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna komponentów NET w płucu myszy zainfekowanym M. tb.
Jest to szczegół z centralnej części przekroju całego płuca z masywną infiltracją neutrofili. (A) barwienie NE, (B) barwienie H2B oraz (C) barwienie DNA. (D) Nałożenie wszystkich trzech kanałów. Purpurowa nakładka na panelu D’ wskazuje piksele o wartościach intensywności >80 we wszystkich trzech kolorach, co oznacza neutrofile przechodzące NETozę, a także NET. Obrazy zostały wykonane jako stosy Z (Z-stacks) przy użyciu mikroskopu konfokalnego i przedstawione jako projekcja maksymalna. Pasek skali reprezentuje 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Kontrola barwienia z użyciem niezwiązanych przeciwciał pierwszorzędowych. Tkanka ludzka (A,C) oraz mysia (B,D), użyte odpowiednio do Ryciny 1, Ryciny 2 oraz Ryciny 3, zostały zabarwione z użyciem niezwiązanych przeciwciał pierwszorzędowych (A,B) lub bez przeciwciał pierwszorzędowych (C,D). Jako kontrolne przeciwciała pierwszorzędowe w panelach A i B zastosowano surowicę z nieimmunizowanego królika oraz przeciwciało IgY z kurczaka przeciwko GFP. Przeciwciała drugorzędowe były takie same, jak pokazane we wszystkich pozostałych barwieniach i użyte również w panelach C i D. Zgodnie z oczekiwaniami, we wszystkich warunkach wykryto pomijalne barwienie tła, co ilustruje swoistość przeciwciał użytych do Ryciny 1, Ryciny 2 oraz Ryciny 3. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu konfokalnego, DNA zabarwiono Hoechst 33342, a pasek skali reprezentuje 25 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Dyskusja

Wraz z rosnącą świadomością roli NET podczas patogenezy⁹, coraz większego znaczenia nabiera ich wykrywanie w tkankach pobranych od pacjentów lub zwierząt doświadczalnych. Próbki tkanek zatopione w parafinie mają szereg zalet w porównaniu z innymi preparatami tkankowymi (np. skrawkami próbek kriokonserwowanych). Konserwacja tkanek w próbkach zatopionych w parafinie jest wyraźnie lepsza, a po osadzeniu próbki są przechowywane przez dziesięciolecia, co umożliwia badania wsteczne. W przypadku wykrywania NET, które są filigranowymi strukturami, dobra konserwacja próbki jest warunkiem wstępnym wykluczającym stosowanie materiału kriokonserwowanego, który jest podatny na uszkodzenia tkanek w wyniku tworzenia się kryształków lodu, które mogą powodować powstawanie artefaktów morfologicznie przypominających NET.

W celu optymalnego zakonserwowania, tkanki pochodzące od zwierząt doświadczalnych powinny być utrwalone wkrótce po śmierci, najlepiej przez perfuzję, aby uniknąć autolizy. Jako utrwalające, świeżo przygotowane lub świeżo rozmrożone roztwory paraformaldehydu w odpowiednim buforze, takim jak TBS lub PBS lub optymalny. Jest to zdefiniowane chemicznie w przeciwieństwie do preparatów formaliny stosowanych w standardowej histologii i indukuje mniejszą autofluorescencję tkanek. W przeciwieństwie do tego, tkanka ludzka często nie jest utrwalana bezpośrednio po wycięciu, a jako utrwalacz zwykle stosuje się 10% rozcieńczenie formaliny, która zawiera od 10% do 15% metanolu jako stabilizatora zapobiegającego polimeryzacji, a także kwas mrówkowy, inne aldehydy i ketony. Często tkanka jest przechowywana w tym utrwalaczu przez dłuższy czas przed osadzeniem. Rezultatem może być autoliza (w zależności od czasu między wycięciem a utrwaleniem) i nadmierne tworzenie się mostków metylenowych z powodu nadmiernego utrwalenia. Wiązanie formaldehydu indukuje zmiany w trzeciorzędowej strukturze białek poprzez tworzenie wewnątrz- i międzycząsteczkowych mostków metylenowych¹⁰. Niebiałkowe składniki komórek, takie jak kwasy nukleinowe, węglowodany i lipidy, nie są unieruchomione bezpośrednio, ale unieruchomione w trójwymiarowej sieci białkowej. Aby znakowanie było skuteczne, wiązania metylenowe muszą zostać zerwane, aby odsłonić epitopy w procesie pobierania antygenu. Osiąga się to poprzez podgrzanie skrawków tkanek zamontowanych na szkiełkach mikroskopowych w odpowiednim buforze do odzyskiwania antygenu indukowanym ciepłem (bufor HIER)¹¹. W naszym poprzednim badaniu analizowaliśmy wpływ pH i temperatury HIER na wykrywanie składników NET w tkance parafinizowanej i stwierdzono, że skuteczna wstępna obróbka tkanek dla jednego składnika często jest nieoptymalna dla drugiego składnika⁸.

W międzyczasie stwierdzono, że podgrzanie tkanki do 70 °C w buforze HIER przy pH 9 jest dobrym kompromisem dla wielu składników NET i pozwoli zachować dobrą konserwację tkanek, która często jest zagrożona w wyższych temperaturach. Proponuje się wykorzystanie czasu pobierania wskazanego jako punkt wyjścia, ale szczególnie w przypadku okazów archiwalnych o nieznanych parametrach utrwalania intensywność barwienia może być niezadowalająca. W takim przypadku przedłużenie lub wyższa temperatura podczas procedury pobierania może poprawić skuteczność barwienia. Może to również wpływać na barwienie histonami 2B przeciwciała IgY stosowanego w naszym protokole. Jak pokazano na rycinie 1, zdekondensowaną chromatynę można znaleźć w neutrofilach poddawanych NETozy, a także w NET, które są znacznie silniejsze tym przeciwciałem w porównaniu z chromatyną w spoczynkowych neutrofilach. Wynika to prawdopodobnie z ograniczonego dostępu cząsteczki IgY 180 kDa do zwartych jąder i może się różnić po zwiększonej regeneracji epitopów. Może to zintensyfikować skuteczność wiązania nawet w obszarach skondensowanej chromatyny, co spowoduje silniejszą fluorescencję w normalnych jądrach neutrofili i innych komórek. Różnica w skuteczności barwienia między neutrofilami przechodzącymi NETozę a neutrofilami niestymulowanymi może być mniej wyraźna niż pokazano na rycinie 1. Obszary powstawania NET nadal byłyby identyfikowane przez kolokalizację NE, H2B i DNA.

Procedura utrwalania może również wywołać znaczną autofluorescencję tkanki, głównie w niebieskawej/zielonkawej części widma. Ważne jest, aby uniknąć większości tej autofluorescencji poprzez stosowanie odpowiednich zestawów filtrów fluorescencyjnych wąskopasmowych (szerokopolowych) lub ustawień detektora (konfokalnych), które odpowiadają maksimum emisji fluorochromu używanego ze wzbudzeniem niebieskim, np. Cy2, Alexafluor 488. W skrajnych przypadkach autofluorescencji należy unikać niebieskawej/zielonkawej części widma. Zamiast tego sygnały fluorescencyjne mogą być łatwiej wykrywane w dalekiej czerwonej części widma (np. przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Cy 5 lub Alexafluorem 635), ale wymaga to bezfiltrowych czarno-białych kamer lub mikroskopów konfokalnych. Ponieważ ludzkie oko jest raczej niewrażliwe powyżej 600 nm, sygnały fluorescencji dalekiej czerwieni są prawie niemożliwe do wykrycia za pomocą okularów. W każdym przypadku ważne jest, aby stosować kontrole ujemne (np. nieimmunologiczne kontrole surowic/izotypu zamiast przeciwciał pierwszorzędowych lub pomijanie przeciwciał pierwszorzędowych) w celu określenia odpowiednich czasów ekspozycji lub ustawień detektora.

Skrawki tkanek o wielkości 1−2 μm można analizować za pomocą mikroskopów szerokokątnych przy użyciu obiektywów 10x lub 20x. Soczewki te zapewniają dużą głębię ogniskowej, więc (prawie) cała sekcja tkanki będzie w centrum uwagi. Można to wykorzystać do szybkiego skanowania skrawków tkanek w poszukiwaniu obszarów tworzenia NET, jeśli są one wystarczająco duże (jak na rysunku 1). Kolokalizacja kanałów zielonego (NE), czerwonego (H2B) i niebieskiego (DNA) powoduje białe zabarwienie wskazujące na obszary tworzenia NET (ryc. 1G). W przypadku większych powiększeń niezbędne są mikroskopy konfokalne lub szerokokątne z dekonwolucją. Rysunek 2 przedstawia szczegóły próbki ludzkiego zapalenia wyrostka robaczkowego, która została również wykorzystana na rysunku 1. Na rysunku 2A NE lokalizuje się w małych kropkach (granulkach), ale duża część jest pozakomórkowa, często tworząc paski, które nakładają się na H2B (figura 2B) i DNA (figura 2C). Ta kolokalizacja powoduje powstanie białawej nakładki wskazującej sieci NET (rysunek 2D). Bardzo podobny wzór można znaleźć w części płucnej myszy zakażonej M. tuberculosis (ryc. 3).

Prezentowane tu okazy charakteryzują się obszarami o wysokim stopniu tworzenia siatki, które można zidentyfikować nawet przy małym powiększeniu. W zależności od gęstości tkanki i odpowiedniego bodźca, tworzenie NET może być znacznie mniej wyraźne, aż do tworzenia NET małych grup neutrofili (na przykład w zapaleniu mięśnia sercowego, patrz poprzednia publikacja¹²). Uważa się, że protokół ten pomoże w promowaniu większej liczby badań nad NET w tkankach i miejmy nadzieję, że pomoże w rozwikłaniu nierozpoznanej roli NET w powstawaniu lub zapobieganiu chorobom.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A7906
przeciwciało anty histonowe 2B kurczaka	Abcam	ab 134211
żelatyna z ryb zimnowodnych	Sigma-Aldrich	G7765
przeciwciało przeciwko kurczakowi osła, sprzężone Cy3, do wielokrotnego znakowania	Jackson Immuno Research	703-165-155
przeciwciało przeciwko królikowi osła, Cy2 sprzężone, dla wielokrotne etykietowanie	Jackson Immuno Research	711-225-152	alternatywnie koniugat Cy5, 711-175-152
kasety do zatapiania Formy do zatapiania	Roth	K116.1
Stacja zatapiania
	Roth	9065.4
kleszcze	Dumont	7a szklany
cylinder o średnicy 20 cm	VWR	216-0075
glicerol	Roth	3783.1
HIER bufor pH 9	Scytek	TES999
Hoechst 33342	Inkubator Sigma	14533
(suchy, do 40 ° C)	Komora wilgotnościowa Memmert	MMIPP30
(plastikowe pudełko ze szczelną pokrywą)	Emsa	508542
Mowiol 40-88	Aldrich	32.459-0
normalna surowica osła	Merck	S30
PAP-pen ImmEdge	Vector Lab	H-4000
mikrotom parafinowy	Microm	355S	wodna w zestawie
paraformaldehyd	Aldrich	16005
szalki Petriego	Schubert /Weiss	7020051
królik przeciwciało anty ELANE	Atlas	HPA068836
stojaki, słoiki na szkiełka mikroskopowe	Skalpel Roth	H554.1 H552.1
	Braun	Rys.22
Szkiełka Superfrost Plus	Thermo Scientific
płyta grzejna z regulacją temperatury	NeoLab	D6010
procesor tkankowy do zatapiania parafiny	Leica	TP1020
Tris buforowana sól fizjologiczna TBS	VWR	788
Triton X100	Roth	3051.4
Tween 20	Fluka	93773
wodna 37 ° C	GFL	1052
mikroskop szerokokątny lub konfokalny	Leica	DMR, SP8
ksylen (dimetylobenzen)	Roth	9713.3

Sakura 4162 Bateria filtracyjna Microm AP280 , walcowana OCB kąpiel J1800AMNZ kąpiel