Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60123

⸱

4 września 2019

 ,  , 
1College of Osteopathic Medicine, Touro University California

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Streszczenie

Podstawowa projekcja wizualna kijanek żaby wodnej Xenopus laevis służy jako doskonały system modelowy do badania mechanizmów regulujących rozwój połączeń neuronalnych. Podczas ustanawiania projekcji siatkówkowo-tektalnej aksony wzrokowe rozciągają się od oka i przechodzą przez różne obszary mózgu, aby dotrzeć do tkanki docelowej, tektum nerwu wzrokowego. Gdy aksony wzrokowe wejdą do tectum, opracowują końcowe altany, które działają w celu zwiększenia liczby połączeń synaptycznych, które mogą utworzyć z docelowymi interneuronami w tectum. W tym miejscu opisujemy metodę ekspresji DNA kodującego białko zielonej fluorescencji (GFP) oraz konstrukty genów zysku i utraty funkcji w neuronach wzrokowych (komórkach zwojowych siatkówki) w zarodkach Xenopus. Wyjaśniamy, jak mikrowstrzykiwać połączony odczynnik DNA/lipofekcji do zawiązków ocznych jednodniowych zarodków, tak aby egzogenne geny uległy ekspresji w pojedynczej lub niewielkiej liczbie neuronów wzrokowych. Znakując geny GFP lub jednocześnie wstrzykując plazmid GFP, końcowe aksonalne altany poszczególnych neuronów wzrokowych ze zmienioną sygnalizacją molekularną można zobrazować bezpośrednio w mózgach nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus kilka dni później, a ich morfologię można określić ilościowo. Protokół ten pozwala na określenie autonomicznych mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw rozwoju arboryzacji aksonów wzrokowych in vivo.

Wprowadzenie

Podczas rozwoju układu nerwowego, aksony neuronów presynaptycznych poruszają się po różnych obszarach mózgu, aby dotrzeć do swoich docelowych obszarów. Kiedy aksony atakują tkanki docelowe, ustanawiają połączenia synaptyczne z postsynaptycznymi neuronami docelowymi. W wielu typach neuronów aksony zwiększają liczbę i zasięg przestrzenny połączeń synaptycznych, które mogą tworzyć, tworząc sieci końcowych gałęzi lub trzpieni1. Projekcja siatkówkowo-tektalna kijanek żaby wodnej Xenopus laevis to potężny model kręgowców do badania mechanizmów leżących u podstaw końcowej arboryzacji aksonów i łączności synaptycznej2,3,4. Indywidualne altanki aksonalne wzrokowe wyrażające GFP z normalną i zmienioną sygnalizacją molekularną można zaobserwować bezpośrednio w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus5,6,7,8. Aby wyrazić GFP samodzielnie lub w połączeniu z pełnowymiarowymi lub skróconymi wersjami genów w niewielkiej liczbie neuronów wzrokowych, używamy techniki polegającej na mikroiniekcji/lipofekcji DNA do zawiązków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus9,10. Technika ta została pierwotnie opracowana do badania mechanizmów odnajdywania ścieżki aksonu wzrokowego u młodych kijanek Xenopus i od tego czasu została zastosowana przez nas i innych do określenia autonomicznych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw arboryzacji aksonów wzrokowych w kijankach Xenopus5,6,7,8,9,10.

Alternatywne techniki ekspresji egzogennych genów w niewielkiej liczbie neuronów wzrokowych zostały opracowane w innych gatunkach modelowych, jak również u X. laevis. Jednak każde z tych podejść wiąże się z wyzwaniami i ograniczeniami w porównaniu z mikroiniekcją DNA/odczynnika do lipofekcji do zawiązków oczu zarodków Xenopus. U myszy transgeneza może być wykorzystana do ekspresji genów w niewielkiej liczbie neuronów wzrokowych, ale generowanie myszy transgenicznych jest kosztowne i czasochłonne, a myszy transgeniczne często wykazują niepożądane skutki uboczne11. Transgeniczne danio pręgowane, które wyrażają egzogenne geny w neuronach wzrokowych, mogą być również tworzone przez wstrzykiwanie plazmidów do zarodków we wczesnym stadium rozszczepienia12. Proces ten wymaga jednak sklonowania specyficznego promotora w celu ekspresji genów w mozaikowym wzorze w neuronach wzrokowych u larw danio pręgowanego12. Częstość ekspresji egzogennego DNA w neuronach wzrokowych u transgenicznych danio pręgowanego jest również nieco niższa (<30%) w porównaniu z kijankami Xenopus, którym mikrowstrzyknięto DNA/odczynnik liposomalny (30−60%)12. Elektroporacja in ovo została również wykorzystana do ekspresji genów w niewielkiej liczbie neuronów wzrokowych u piskląt13. Jednak procedura ta nie pozwoliła w pełni scharakteryzować mechanizmów, które ustanawiają projekcje optyczne, ponieważ arboryzacja aksonów wzrokowych nie może być zobrazowana w nienaruszonych, żywych zarodkach piskląt. Wreszcie, kilka laboratoriów wykorzystało elektroporację do transfekcji genów do niewielkiej liczby neuronów wzrokowych w kijankach Xenopus 14,15. Jednak elektroporacja wymaga optymalizacji sprzętu i protokołów (stymulator, elektrody, przestrzenne i czasowe wzorce impulsów falowych) poza tymi, które są używane do mikroiniekcji odczynnika DNA/lipofekcji do zawiązków oczu zarodków Xenopus.

My i inni wcześniej używaliśmy techniki mikroiniekcji/lipofekcji DNA do pąków oczu zarodków Xenopus w celu określenia autonomicznych mechanizmów sygnalizacji komórkowej, które ustanawiają arboryzację aksonów wzrokowych5,6,7,8. Początkowo zastosowaliśmy to podejście do analizy funkcji białka adaptora kadheryny i Wnt β-kateniny w arboryzacji aksonalnej optyku w kijankach Xenopus 5,6. W jednym z badań wykazaliśmy, że wiązanie β-kateniny z α-kateniną i PDZ jest wymagane odpowiednio do inicjowania i kształtowania aksonalnych altanów wzrokowych in vivo5. W drugim raporcie wykazaliśmy, że domeny wiążące β-kateninę dla α-kateniny i GSK-3β przeciwnie modulują wzorce projekcji brzusznych aksonów wzrokowych 6. Niedawno zidentyfikowaliśmy rolę czynnika Wnt, gruczolakowatej poliposis coli (APC), w regulacji cech morfologicznych altanek aksonalnych wzrokowych u kijanek Xenopus 7. Poprzez współekspresję N-końcowych i centralnych domen APC, które modulują stabilność β-kateniny i organizację mikrotubul wraz z GFP w poszczególnych neuronach wzrokowych, określiliśmy wspólne i odrębne role dla tych domen interakcji APC na numerze gałęzi, długości i kącie w altanach aksonalnych wzrokowych in vivo7. Inne laboratorium wykorzystało technikę mikroiniekcji/lipofekcji do określenia autonomicznych ról komórek do sygnalizacji przez receptor BDNF, TrkB, w wzrokowych altankach aksonalnych w kijankach Xenopus 8. Grupa ta wykazała, że ekspresja dominująco-ujemnego TrkB zaburzała rozgałęzianie i dojrzewanie synaptyczne w poszczególnych altanach aksonów wzrokowych in vivo8. Ogólnie rzecz biorąc, technika lipofekcji w Xenopus rzuciła już światło na specyficzne role różnych genów w rozgałęzianiu się aksonów wzrokowych w środowisku rodzimym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Touro w Kalifornii (protokół nr TUCA03TE01X).

1. Pozyskiwanie zarodków X. laevis

  1. Pozyskaj embriony X. laevis poprzez naturalne kojarzenie par dorosłych żab samców i samic stymulowanych ludzką gonadotropiną kosmórkową (HCG), poprzez zapłodnienie in vitro jaj zrodzonych przez dorosłe samice stymulowane HCG lub zamawiając je bezpośrednio (Tabela materiałów).
  2. Usuń otoczkę galaretowatą z embrionów przy użyciu 2% roztworu cysteiny w temperaturze pokojowej (Tabela materiałów)16.
    1. Zebierz 50−10 embrionów do dużej szalki Petriego. Usuń roztwór, w którym znajdują się embriony, poprzez zlanie go lub za pomocą plastikowej pipety transferowej. Do szalki z embrionami dodaj 25 mL 2% roztworu cysteiny (0,5 g cysteiny w 25 mL ddH2O, pH dostosowane do 8,0).
    2. Delikatnie zakręć szalką Petriego z embrionami w roztworze cysteiny, aż otoczki galaretowate embrionów odpadną, a embriony zbiorą się w grudce na środku szalki (5−10 min). W tym momencie powoli i ostrożnie zlej roztwór cysteiny do zlewki z odpadami. Uważaj, aby wraz z roztworem cysteiny do zlewki nie trafiło zbyt wiele embrionów.
    3. Przepłucz embriony w szalce Petriego 6x 10% zmodyfikowanym roztworem Ringera Marksa (MMR) lub innym odpowiednim roztworem (np. zmodyfikowanym roztworem Bartha, MBS), zakręcając szalką przy każdej wymianie roztworu.
  3. Hoduj embriony w 10% MMR, aż osiągną stadia rozwojowe 2−2417. Embriony Xenopus można inkubować w temperaturach od 15−25 °C. Szybkość rozwoju embrionów zależy od temperatury inkubacji17.
    UWAGA: Embriony Xenopus zamówione z katalogu zazwyczaj docierają do laboratorium w stadiach rozwojowych 20−24, więc można je od razu poddać usuwaniu otoczki galaretowatej i mikroiniekcji.

2. Przygotowanie plazmidów DNA i przygotowanie mieszaniny DNA/DOTAP

  1. Subklonuj konstrukty ekspresyjne DNA do wektorów ekspresyjnych Xenopus pCS2+ lub pCS2+MT lub ich pochodnych (pierwotnie skonstruowanych przez D. Turnera i R. Ruppa)5,6,7. Wektory pCS2+ zawierają zmodyfikowany promotor cytomegalowirusa (CMV), który ułatwia ekspresję genów u żab.
  2. Amplifikuj plazmidy pCS2 zawierające GFP i/lub geny zainteresowania za pomocą zestawów do miniprepu (Tabela Materiałów) zgodnie ze standardową procedurą. W końcowym etapie elucji protokołu miniprepu przeprowadź sekwencyjną elucję DNA do ddH2O, aby uzyskać końcowe stężenie >1 µg/µL.
  3. Przechowuj wszystkie plazmidy pCS2 w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia eksperymentu z mikroiniekcją/lipofekcją, tj. gdy embriony osiągną stadia rozwojowe 2−24.
  4. Rozmroź plazmidy DNA przeznaczone do lipofekcji w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed lipofekcją krótko odwiruj plazmidy DNA. Zapobiegnie to tworzeniu się osadu w mieszaninie DNA/DOTAP, który mógłby zapchać końcówkę mikrokapilary.
  5. Połącz plazmidy DNA z liposomalnym odczynnikiem do transfekcji DOTAP (Tabela Materiałów) w stosunku 1:3 (w/v)9,10. Na przykład, przenieś 2 µg DNA do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i dodaj 6 µL DOTAP, lub przenieś 3 µg DNA do probówki do mikrocentryfugi i dodaj 9 µL DOTAP.
  6. Po połączeniu DNA i DOTAP, delikatnie stuknij probówkę do mikrocentryfugi, aby wymieszać roztwór. Roztwór DNA/DOTAP po wymieszaniu powinien stać się lekko mętny.
  7. Jeśli do lipofekcji w neuronach wzrokowych mają zostać użyte dwa plazmidy (np. pCS2-GFP wraz z drugim plazmidem pCS2 zawierającym skróconą lub pełnowymiarową wersję genu), najpierw połącz oba plazmidy (po ich krótkim odwirowaniu) w stosunku 1:1, a następnie dodaj DOTAP w stosunku 1:3 (w/v). Na przykład, połącz 1 µg pCS2-GFP z 1 µg drugiego plazmidu pCS2, a następnie dodaj 6 µL DOTAP.
    UWAGA: Badania wykazały, że lipofekcja dwóch plazmidów do pączków optycznych embrionów Xenopus na tych stadiach rozwojowych prowadzi do ich koekspresji w poszczególnych neuronach wzrokowych9,10.

3. Napełnianie igły do mikroiniekcji DNA/DOTAP

  1. Ostrożnie odetnij końcówkę dociąganej szklanej mikropipety kapilarnej za pomocą precyzyjnej pęsety (Tabela Materiałów).
  2. Wypełnij szklaną mikropipetę kapilarną od tyłu olejem mineralnym za pomocą mikrofiltra, tak aby na odciętym końcu mikropipety pojawiła się mała kropla oleju mineralnego. Wypełnij mikropipetę kapilarną olejem mineralnym do połowy.
  3. Umieść dociąganą szklaną mikropipetę kapilarną wypełnioną olejem mineralnym w odpowiednim uchwycie wtryskiwacza połączonym z iniektorem. W przypadku użycia iniektora (Tabela Materiałów), wysuń tłok do połowy przed założeniem na niego mikropipety kapilarnej. Po bezpiecznym przymocowaniu mikropipety kapilarnej do iniektora, wysuń tłok całkowicie, aby potwierdzić, że mikropipeta jest mocno przymocowana i nie przesuwa się podczas wysuwania tłoka.
  4. Przenieś kroplę 3 μL mieszaniny DNA/DOTAP na wycięty kwadratowy (1 cal kwadratowy) arkusz papieru parafinowego.
  5. Pod stereomikroskopem sekcyjnym wprowadź końcówkę szklanej mikropipety kapilarnej do kropli DNA/DOTAP.
  6. Powoli wciągnij kroplę DNA/DOTAP do szklanej mikropipety kapilarnej, korzystając z funkcji wypełniania w urządzeniu do wtryskiwania. W miarę pobierania cieczy do mikropipety kapilarnej, kropla będzie się zmniejszać. Ze względu na lekką mętność roztworu DNA/DOTAP, granica między olejem mineralnym a roztworem DNA/DOTAP powinna być widoczna w szklanej mikropipetie kapilarnej (Rysunek 1). W razie potrzeby okresowo przerywaj wypełnianie mikropipety kapilarnej, aby umożliwić wyrównanie ciśnienia w szklanej mikropipetie.

Mikroskopia analizy końcówki igły; obraz A kontra B z czerwoną strzałką wskazującą defekty.
Rysunek 1: Zdjęcia pipety mikrokapilarnej. Zdjęcia przedstawiają pipetę mikrokapilarną w aparaturze wtryskowej przed (A), a następnie (B) wypełnianie DNA/DOTAP. Otwarte strzałki, końcówka tłoka w pipecie mikrokapilarnej (A,B). Zamknięta strzałka, linia między olejem mineralnym a DNA/DOTAP w wypełnionej pipecie mikrokapilarnej (B). Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Mikrowstrzykiwanie DNA/DOTAP do pączków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus

  1. Ręcznie usuń błonę witelinową (dewitellinizuj) z dziesięciu zarodków Xenopus w stadiach 20−24, używając precyzyjnych pęset w 10 mm szalce Petri wypełnionej 0,1x MMR. Chwyć błonę witelinową w miejscu zwężenia („talii”), aby uniknąć uszkodzenia zarodków. Używając pęset w obu dłoniach, przebij pęcherzyk błony witelinowej i uwolnij zarodek z błony. Należy uważać, aby nie uszkodzić zarodków podczas usuwania błony witelinowej.
    UWAGA: Począwszy od stadium 20, zarodki Xenopus wykształcają wcięcie lub „talię” pomiędzy przednią a tylną połową zarodka. To zwężenie umożliwia powstanie szczeliny między błoną witelinową a zarodkiem w tym miejscu.
  2. Za pomocą plastikowej pipety transferowej z odciętą końcówką przenieś 5−10 dewitellinizowanych zarodków w stadiach 2−24 do 10 mm szalki Petri wypełnionej 1x MMR.
    UWAGA: Wyższe stężenie soli w roztworze 1x MMR ułatwia gojenie ran nakłuciowych powstałych w wyniku mikroiniekcji.
  3. Pod stereomikroskopem chwyć jeden z dewitellinizowanych zarodków w szalce Petri pęsetami w obu dłoniach i ustaw zarodek tak, aby jego biegun przedni był skierowany do góry w polu widzenia. Zorientuj zarodek tak, aby leżał bokiem, a jeden z jego pączków ocznych (lewy lub prawy) był skierowany ku górze.
  4. Pod stereomikroskopem przytrzymaj zarodek pęsetą w niedominującej dłoni, a dominującą dłonią wprowadź końcówkę szklanej mikropipety do pączka ocznego (od strony brzusznej lub grzbietowej, w zależności od wstrzykiwanej połowy zarodka), tuż pod skórę (Rycina 2). Wstrzyknij od 70−210 nL roztworu DNA/DOTAP. Można to wykonać w kilku impulsach, w zależności od wielkości impulsu ustawionej w injektorze (zazwyczaj 70 nL).
    UWAGA: Głębokość iniekcji jest bardzo istotna dla lipofekcji neuronów wzrokowych. Jeśli końcówka mikrokapilary zostanie wprowadzona prawidłowo i bardzo powierzchownie do pączka ocznego, to po mikroiniekcji szara skóra pokrywająca pączek oczny spuchnie. Jeśli iniekcja zostanie wykonana zbyt głęboko, szary pączek oczny nie wykaże żadnych zmian, a częstotliwość ekspresji DNA w neuronach wzrokowych będzie niższa.
  5. Obróć zarodek i wykonaj taką samą mikroiniekcję do pączka ocznego po przeciwnej stronie zarodka.
  6. W każdym eksperymencie wykonaj iniekcję w oba pączki oczne 6−10 (lub więcej) zarodków.
  7. Po mikroiniekcji przechowuj zarodki w szalce Petri z 1x MMR przez około 30 min, aby ułatwić gojenie ran.
  8. Po 30 min przenieś wstrzyknięte zarodki do roztworu 0,1x MMR z dodatkiem 0,01% środka wybielającego (fenylotiomocznika) w celu zmniejszenia pigmentacji. Hoduj przykryte zarodki przez około pięć dni, aż rozwiną się w kijanki w stadiach 46−4716.

Rozwój nerek: schemat i obraz embrionu z zaznaczeniem konkretnego regionu do badań biologicznych.
Rysunek 2: Wyznaczenie obszaru pąka oczkowego do mikroiniekcji. Schemat (A) oraz mikrofotografii (B) z X. laevis zarodki w stadiach rozwojowych 22/23 wykazują obszar pączka oka, który powinien zostać objęty mikroiniekcją (zaznaczenia na czerwono). Pasek skali = 1 mm. Panel A został zmodyfikowany na podstawie pracy Zahn i wsp.18. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.

5. Obrazowanie wyraziających GFP drzewek aksonalnych nerwu wzrokowego w nienaruszonych, żyjących kijankach

UWAGA: Gdy kijanki, którym wprowadzono DNA metodą lipofekcji, osiągną stadia rozwojowe 46−47, są gotowe do obrazowania.

  1. Przed obrazowaniem kijanki muszą zostać poddane anestezji. Aby znieczulić kijanki, przenieś lipofektowane osobniki do 0,02% roztworu trikainy w ddH2O w szalce Petriego o średnicy 10 mm. Odczekaj 5−10 min, aż kijanki przestaną się poruszać. Zweryfikuj, czy kijanki nadal żyją, obserwując bicie ich serc pod stereomikroskopem sekcyjnym.
  2. Umieść jedną znieczuloną kijankę w specjalnie wykonanej komorze silikonowej na szkiełku przedmiotowym i zabezpiecz szkiełkiem nakrywką. Kijanka powinna być lekko przechylona tak, aby jedna strona (lewa lub prawa) jej głowy była skierowana ku górze i ledwo dotykała szkiełka nakrywki.
  3. Przeskanuj przy niskim powiększeniu połowę grzbietowej części tektaum śródmózgia kijanki, która jest przechylona ku górze, w poszukiwaniu wykazujących ekspresję GFP drzewek aksonalnych nerwu wzrokowego.
    UWAGA: Do wyszukiwania fluorescencyjnych drzewek można użyć mikroskopu odwróconego w świetle przechodzącym z oświetleniem epifluorescencyjnym i obiektywem apochromatycznym (Tabela materiałów).
  4. Jeśli półkula tektaum zawiera od jednej do trzech wykazujących ekspresję GFP drzewek aksonalnych nerwu wzrokowego, wykonaj serię obrazów z-stack tych drzewek, używając wysokokontrastowego obiektywu powietrznego 40x o dużej odległości roboczej (Tabela materiałów). Dla każdego drzewka aksonalnego wykonaj 10−20 przekrojów z-stack w odstępach 1,5 µm.
  5. Aby obejrzeć drzewka aksonalne po drugiej stronie tektaum śródmózgia, ponownie ułóż kijankę w komorze silikonowej tak, aby była przechylona na drugą stronę, i zabezpiecz szkiełkiem nakrywką. Następnie powtórz kroki 5.3 i 5.4.

6. Rekonstrukcja i kwantyfikacja morfologii drzewkowania aksonów nerwu wzrokowego

  1. Wybierz stos obrazów zawierający od jednego do trzech GFP-ekspresujących drzewek aksonalnych nerwu wzrokowego.
  2. użyj narzędzia do rysowania swobodnego w oprogramowaniu do edycji grafiki (Tabela materiałów) w celu wyrysowania części każdego drzewa aksonalnego nerwu wzrokowego widocznej na każdym przekroju z. Śledzenie fragmentów każdego drzewa widocznych w poszczególnych przekrojach z pozwoli na stworzenie dokładnej projekcji 2D drzewa aksonalnego. Do wyrysowywania różnych drzew aksonalnych nerwu wzrokowego wykazujących ekspresję GFP można użyć różnych kolorów.
  3. Wszystkie pomiary morfometryczne należy przeprowadzić na rekonstrukcjach 2D drzew axonalnych, odwołując się w razie potrzeby do oryginalnych serii obrazów w osi z.7Korzystając z oprogramowania ImageJ (Tabela materiałów), zmierz parametry morfologiczne, takie jak liczba rozgałęzień (tj. liczba końców gałęzi lub punktów rozgałęzień), całkowita długość gałęzi drzewa neuropilu, długość pojedynczej gałęzi, długość i szerokość drzewa neuropilu, ogólny kształt drzewa neuropilu (stosunek L/W, kolistość) oraz kąt rozgałęzień7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół opisany w tym artykule zapewnia skuteczność na poziomie 30−60% w przypadku embrionów Xenopus, w których po wstrzyknięciu GFP (samodzielnie lub wraz z dodatkowymi konstruktami DNA) ekspresja zachodzi w jednej do dziesięciu arborzacjach aksonów nerwu wzrokowego. Na Rysunku 3 przedstawiamy reprezentatywne obrazy konfokalne kontrolnych i zmutowanych arborzacji aksonów wzrokowych wykazujących ekspresję GFP u nienaruszonych kijank Xenopus z naszej niedawno opublikowanej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule pokazujemy, jak wyrażać egzogenne konstrukty DNA w pojedynczej lub małej liczbie neuronów wzrokowych oraz jak obrazować poszczególne GFP wyrażające aksonalne altanki wzrokowe z normalną i zmienioną sygnalizacją molekularną w nienaruszonych, żywych kijankach żaby X. laevis. Wyjaśniamy również, jak zrekonstruować i określić ilościowo morfologię GFP wyrażającego optyczne altanki aksonalne na podstawie obrazów uchwyconych in vivo. Aby uzyskać ekspresję egzogennych plazmidów DNA w niewielkiej liczbie n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Touro University California College of Osteopathic Medicine za wsparcie naszych badań. Dziękujemy poprzednim studentom w laboratorium (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim), którzy pomogli wdrożyć tę technikę mikroiniekcji w naszym laboratorium. Jesteśmy wdzięczni dr Christine Holt, w której laboratorium po raz pierwszy opracowano technikę mikroiniekcji/lipofekcji DNA w zarodkach Xenopus.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikropipety 3,5"Drummond Scientific3-000-203 - Oprogramowanie G/X
μ-manager (Wersja 1.4)Kamera CCD Vale Labwww.micro-manager.org
Scion CorporationCFW-1312 M
Chorulon (ludzka gonadotropina kosmówkowa)AtoZ Vet SupplyN/A
CysteinaSigma-Aldrich168149-100G
DOTAPSigma-Aldrich11202375001
Kleszcze Dumont #5Narzędzia do nauki pięknej11250-10
Mikroskop epifluorescencyjny Eclipse E800Obiektywy Nikon: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75
GNU Image Manipulation Program (wersja 2.10.10)GIMP
Illustrator (2017 Creative Chmura)Adobe
ImageJ (wersja 1.46r)NIH
MicrofilWorld Precision InstrumentsMF 34G-5
Mikromanipulator z uniwersalnym adapterem i podstawą nośnąDrummond Scientific3-000-024-R
3-000-025-SB
3-000-024-A
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentP-30
Zestaw do miniprepuQiagen27104
Zmotoryzowany stopień zStosowane oprzyrządowanie naukoweMFC-2000
Wtryskiwacz Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
Powerpoint (wersja 15.31)Microsoft
Xenopus laevis zarodkiNascoLM00490

Bibliografia

  1. Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
  2. Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
  3. Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
  4. Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
  5. Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
  6. Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
  7. Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
  8. Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
  9. Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
  10. Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
  11. Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
  12. Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
  13. Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
  14. Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
  15. Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107(2007).
  16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2000).
  17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , North Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
  18. Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
  19. Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
  20. Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
  21. Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290(2015).
  22. Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mikroiniekcja DNAarboryzacja akson w nerwu wzrokowegoekspresja GFPiniekcja zarodkaobrazowanie konfokalneautonomiczno kom rkowakom rki zwojowe siatk wkiwzg rze optycznetechnika lipofekcji
Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.