Metoda opisuje uwrażliwione na stan zapalne niedotlenieniowo-niedokrwienne i hiperoksyczne uszkodzenie mózgu u fretki P17, aby modelować złożoną interakcję między przedłużającym się stanem zapalnym a oksydacyjnym uszkodzeniem mózgu doświadczanym u wielu późnych wcześniaków.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model fretki uwrażliwionego na stan zapalny późnego wcześniaka niedotlenionego i niedokrwiennego mózgu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Istnieje ciągłe zapotrzebowanie na klinicznie istotne modele infekcji okołoporodowej i niedotlenienia-niedokrwienia (HI), w których można by testować interwencje terapeutyczne dla niemowląt z neurologicznymi następstwami wcześniactwa. Fretki są idealnymi kandydatkami do modelowania wcześniaka ludzkiego mózgu, ponieważ rodzą się lizencefaliczne i rozwijają mózgi gyrencefaliczne po urodzeniu. Po urodzeniu rozwój mózgu fretki jest podobny do 13-tygodniowego płodu ludzkiego, przy czym 17 kociąt po porodzie (P) uważa się za równoważne niemowlęciu w 32-36 tygodniu ciąży. Opisujemy model urazu u fretki P17, w którym po podaniu lipopolisacharydów następuje obustronne niedokrwienie mózgu, niedotlenienie i hiperoksja. Symuluje to złożoną interakcję przedłużającego się stanu zapalnego, niedokrwienia, niedotlenienia i stresu oksydacyjnego doświadczanego u wielu noworodków, u których dochodzi do uszkodzenia mózgu. Zranione zwierzęta wykazują szereg poważnych obrażeń, ze zmianami morfologicznymi w mózgu, w tym zwężeniem wielu zakrętów korowych i związanymi z nimi bruzdami. Ranne zwierzęta wykazują również spowolniony rozwój odruchów, wolniejszą i bardziej zmienną prędkość lokomocji na zautomatyzowanym wybiegu oraz zmniejszoną eksplorację na otwartym polu. Model ten stanowi platformę, na której można testować przypuszczalne terapie dla niemowląt z encefalopatią noworodkową związaną ze stanem zapalnym i HI, badać mechanizmy urazów, które wpływają na rozwój kory mózgowej, oraz badać szlaki zapewniające odporność u zwierząt zdrowych z chorobą.
Wprowadzenie
Istnieje ciągłe zapotrzebowanie na duże modele zwierzęce, które odzwierciedlają patofizjologię wcześniactwa i okołoporodowego niedotlenienia-niedokrwienia, w których można testować interwencje terapeutyczne dla niemowląt. W 2017 roku 9,93% z 382 726 niemowląt urodzonych w Stanach Zjednoczonych urodziło się przedwcześnie, a 84% tych niemowląt urodziło się między 32 a 36 tygodniem ciąży1. U wcześniaków powszechne jest okołoporodowe narażenie na infekcje lub stany zapalne, w których aktywacja immunologiczna matki spowodowana patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi może zainicjować przedwczesny poród. Wcześniaki po urodzeniu są narażone na wysokie ryzyko wystąpienia sepsy wcześnie lub późno2. Wcześniaki często doświadczają również okresów niedotlenienia, niedociśnienia i hiperoksji z powodu niedojrzałego układu krążeniowo-oddechowego, podwyższonego ciśnienia tlenu w atmosferze w porównaniu z tym, które występuje w macicy oraz ekspozycji jatrogennej. Dodatkowo, u wcześniaków, obrona antyoksydacyjna jest niedojrzała3, a czynniki proapoptotyczne są naturalnie regulowane w górę4. Stres oksydacyjny i śmierć komórki prowadzą do aktywacji układu odpornościowego i zapalenia nerwów. Uważa się, że te połączone czynniki przyczyniają się do rozwojowej i fizjologicznej podatności mózgu i powodują lub nasilają encefalopatię związaną ze złymi wynikami rozwojowymi u wcześniaków5,6,7.
Ze względu na fizyczne i rozwojowe podobieństwa, które mózg fretki dzieli z ludzkim mózgiem, fretka jest atrakcyjnym gatunkiem do modelowania uszkodzenia mózgu8,9,10,11,12. Fretki są również idealnymi kandydatkami do modelowania wcześniaka ludzkiego mózgu, ponieważ rodzą się lizencefaliczne i rozwijają mózg gyrencefaliczny po urodzeniu, co zapewnia okno, w którym można wystawić rozwijający się mózg na zniewagi, które naśladują te doświadczane przez wcześniaki. Po urodzeniu rozwój mózgu fretki jest podobny do 13-tygodniowego płodu ludzkiego, przy czym 17 kociąt po urodzeniu (P) uważa się za równoważne niemowlęciu w 32–36 tygodniu ciąży13.
Nasza grupa niedawno opublikowała model skrajnego wcześniaka (<28 tygodnia ciąży) uszkodzenia mózgu u fretki P10 poprzez połączenie uczulenia zapalnego z lipopolisacharydem Escherichia coli (LPS) z późniejszą ekspozycją na hipoksję i hiperoksję12. W poniższym protokole opisujemy teraz późny model wcześniaka u fretki P17, w którym po uczuleniu LPS następuje obustronne niedokrwienie mózgu, niedotlenienie i hiperoksja. Powoduje to poważniejsze urazy w podgrupie zwierząt i dokładniej modeluje złożoną interakcję przedłużającego się stanu zapalnego, niedokrwienia, niedotlenienia i stresu oksydacyjnego doświadczanego u wielu wcześniaków, u których rozwija się uraz mózgu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz jako część zatwierdzonego protokołu przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Waszyngtońskiego.
1. Przygotowanie i administracja LPS
UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 1, aby zapoznać się z harmonogramem procedur.
- Przed przystąpieniem do zabiegu należy uszczelnić, wysterylizować i autoklawować wszystkie narzędzia chirurgiczne i obłożenia chirurgiczne. Przygotuj leki przedoperacyjne w sterylnych fiolkach. Oblicz natężenie przepływu wymagane do zastąpienia powietrza w komorze hipoksji/hiperoksji gazem doświadczalnym w ciągu 8–10 minut.
- Przygotować lipopolisacharyd (LPS z E. coli 055:B5) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej do uzyskania stężenia 1 mg/ml. Usuń zestawy fretek P17 z ich skrzelów. Zważ je i policz. Losowo przydzielaj zwierzęta według miotu i płci do grup kontrolnych lub rannych (lub leczonych).
- Za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 300 μl należy podać dootrzewnowo 3 mg/kg LPS zestawom w grupie urazowej oraz równoważną objętość sterylnego nośnika soli fizjologicznej (3 μL/g) w celu kontroli zwierząt.
- Umieścić zwierzęta w komorze w łaźni wodnej w temperaturze 37–40 °C, aby utrzymać docelową temperaturę w odbycie na poziomie 36–37 °C przez cały czas trwania zabiegów chirurgicznych.
2. Znieczulenie
- Podczas zabiegu należy stale monitorować temperaturę, częstość oddechów i tętno zwierzęcia.
- Buprenorfinę (0,05 mg/kg) podawać podskórnie na 30 minut przed zabiegiem chirurgicznym. Wywołaj znieczulenie w mieszaninie 3% izofluranu zrównoważonej 100% tlenem. Wyjąć zestaw z komory indukcyjnej i położyć go na wznak na udrapowanym chirurgicznym kocu wodnym ustawionym na 37 °C. Przenieść znieczulenie do stożka nosowego i zmniejszyć poziom izofluranu do 2–3%.
3. Przygotowanie chirurgiczne
- Za pomocą maszynki do strzyżenia małych zwierząt usuń wszystkie włosy z brzusznej części szyi. Gol się w prostokątny wzór, ostrożnie, aby uniknąć nakłucia skóry lub wywołania wysypki po goleniu. Podać znieczulenie miejscowe na ogolone miejsce za pomocą śródskórnej lidokainy (4 mg/kg) i bupiwakainy (2,5 mg/kg).
- Przygotuj szyję, naprzemiennie stosując peeling z jodonem i 70% etanolem za pomocą sterylnych wacików. Powtórz peeling tak, aby powidon-jod i 70% etanol były nakładane 3x na przemian.
- Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu szczypania palców u stóp. Utrzymać poziom izofluranu na minimalnym poziomie procentowym wymaganym do znieczulenia chirurgicznego. Używając sterylnych jednorazowych zasłon z wycięciami, które odsłaniają okolice szyi, udrapuj zwierzę.
4. Obustronne podwiązanie tętnicy szyjnej
- Za pomocą jednorazowego ostrza skalpela #11 wykonaj 1,5 cm nacięcie w linii środkowej na środku szyi. Za pomocą cienkich hemostatów i zakrzywionych kleszczy tępo wypreparuj lewą tętnicę szyjną. Wyciąć tętnicę z dala od powiązanego pęczka nerwowo-naczyniowego.
- Za pomocą pary zakrzywionych cienkich kleszczy przełóż pod tętnicą zapętlony 10-centymetrowy sterylny jedwabny szew 5-0. Przeciąć szew na pół. Podwiązać tętnicę, bezpiecznie wiążąc obie długości szwu, pozostawiając co najmniej 2 mm między węzłami. Przeciąć lewą tętnicę szyjną między szwami, uważając, aby nerw pozostał nienaruszony.
- Powtórz sekcję po prawej stronie. Odwracalnie podwiązaj prawą tętnicę szyjną za pomocą pojedynczej sterylnej opaski pępowinowej 1/8 cala. Zamknij ranę chirurgicznymi klipsami do skóry.
- Pozwól zwierzęciu dojść do siebie w łaźni wodnej o kontrolowanej temperaturze przez co najmniej 30 minut przed niedotlenieniem.
nuta: Jeśli tętnice nie są w pełni odizolowane od reszty pęczka nerwowo-naczyniowego, można zaobserwować zwiększoną śmiertelność przed lub w trakcie późniejszej niedotlenienia.
5. Sekwencyjne niedotlenienie, hiperoksja i niedotlenienie
- Podczas niedotlenienia i hiperoksji należy zmienić temperaturę łaźni wodnej w razie potrzeby, aby utrzymać temperaturę odbytu podczas niedotlenienia na poziomie 37 °C u zwierzęcia wskaźnikowego(-ych).
- Umieść zwierzęta w grupie urazów w hermetycznej komorze w łaźni wodnej. Stale monitoruj stężenie tlenu w komorze, a także temperaturę w odbycie u co najmniej jednego zwierzęcia wskaźnikowego. Przepłukać komorę nawilżonym 9% tlenem (91% azotu), a następnie utrzymać natężenie przepływu 3–5 l/min, w zależności od wielkości komory. Gdy stężenie tlenu w komorze osiągnie 9%, kontynuuj przez 30 minut.
- Po 30 minutach przełącz dopływ gazu na 80% nawilżony tlen (20% azotu) i pozwól komorze osiągnąć docelowe stężenie w oparciu o natężenie przepływu i wielkość komory. Kontynuuj przez 30 minut hiperoksji. Otwórz komorę, aby umożliwić jej szybsze osiągnięcie normoksji poprzez zrównoważenie z powietrzem w pomieszczeniu.
- Uszczelnij komorę i przepłucz 9% nawilżonym tlenem. Stale monitoruj wizualnie wszystkie zwierzęta, zwracając uwagę na zwierzęta, które wykazują bradypne. Gdy stężenie tlenu w komorze osiągnie 9%, kontynuuj przez 30 minut. Jeśli śmiertelność śródtlenowa (zatrzymanie oddechu) u któregokolwiek ze zwierząt zostanie stwierdzona przed upływem 30 minut, należy natychmiast przerwać hipoksję.
6. Odwrócenie podwiązania prawej tętnicy szyjnej
- Zwróć zwierzęta na salę operacyjną i wywołaj znieczulenie w mieszaninie 3% izofluranu zbalansowanego 100% tlenem. Przenieś znieczulenie na stożek nosowy i zmniejsz poziom izofluranu do 2–3%. Zdjąć klipsy chirurgiczne do ran i ponownie przygotować obszar rany za pomocą jodu powidonu. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu szczypania palców u stóp. Utrzymać stężenie izofluranu na minimalnym poziomie procentowym wymaganym do znieczulenia chirurgicznego. Używając sterylnych jednorazowych zasłon z wycięciami, które odsłaniają okolice szyi, udrapuj zwierzę.
- Za pomocą zakrzywionych kleszczy zidentyfikuj i odwiąż taśmę pępowinową od prawej tętnicy szyjnej. Zamknij ranę chirurgicznymi klipsami do skóry.
7. Odzyskiwanie i zarządzanie temperaturą
- Umieść wszystkie kocięta z powrotem w ich skrzelkach na 60 minut, w celu pielęgnowania i rekonwalescencji. Po 60 minutach należy umieścić ranne zwierzęta z powrotem w łaźni wodnej w temperaturze 37–40 °C na 6 godzin, dostosowując temperaturę wody w razie potrzeby w celu utrzymania temperatury odbytu na poziomie 36–37 °C. Zestawy należy włożyć z powrotem do ich skrzelków.
- Klipsy chirurgiczne należy usunąć 10–14 dni po zabiegu (P27–P31).
8. Testy refleksyjne
- Wykonuj wszystkie testy odruchowe codziennie od P21 do P28 i co najmniej 3 razy w tygodniu od P28 do P42, pozostając w ślepocie na ekspozycję (lub leczenie) grupy. Przed przystąpieniem do próby odruchowej należy umieścić zestawy w komorze ze wspomaganiem cieplnym (łaźnia wodna o temperaturze 37 °C, poduszka grzewcza itp.) na 1 godzinę. Dla każdego testu ukończ wszystkie próby w każdym zestawie przed przetestowaniem następnego zestawu.
- Ujemna geotaksja (25°)
- Przyłóż płaską deskę (16 1/2 cala x 12 cali) owiniętą w chłonną osłonę blatu przy przedmiocie tak, aby deska tworzyła kąt 25° ze stołem. Umieść zestaw na desce leżąc i skierowany w dół, około 75% drogi w górę deski.
- Upewnij się, że korpus zestawu jest prosty i że wszystkie cztery łapy są przyciśnięte do deski przed jego zwolnieniem. Jak tylko zestaw zostanie umieszczony, rozpocznij ocenę czasu.
- Zapisz czas, w którym zestawowi udaje się obrócić korpus o 90° w stosunku do pozycji wyjściowej. Zapisz czas, w którym zestaw obraca swój korpus o 180° i wykonuje pełny krok w kierunku górnej części planszy. Wykonaj 3 próby pod kątem 25° przed przejściem do następnego testu.
- Ujemna geotaksja (45°)
- Wykonaj ponownie 3 próby opisanego wcześniej negatywnego testu geotaksji, tym razem z deską ustawioną pod kątem 45°.
- Niechęć do klifów
- Umieść wyściełaną platformę około 1 stopy poniżej półki, aby zminimalizować obrażenia kociąt, jeśli spadną.
- Umieść zestaw przodem i prostopadle do krawędzi stołu laboratoryjnego. Upewnij się, że korpus zestawu jest prosty, a przednie łapy zlicowane z krawędzią. Rozpocznij ocenę czasu od momentu umieszczenia zestawu. Zwróć uwagę, aby odróżnić świadome oddalanie się od klifu od innych spontanicznych ruchów, które nie obejmują skoordynowanego chodzenia.
- Zapisz czas, w którym zestaw odsuwa swoje ciało od krawędzi (zdefiniowany jako cofanie się, obracanie ciała lub odsuwanie przednich kończyn od krawędzi). Zapisz czas, w którym zestaw wykonuje swój pierwszy krok w kierunku przeciwnym do krawędzi (zdefiniowany jako dowolny kierunek lub kąt po obrocie o 90° od pozycji początkowej skierowanej w stronę krawędzi).
- Wykonaj 3 próby awersji do klifu w każdym zestawie, zanim przejdziesz do następnego testu.
- Odruch prostowania
- Połóż zestaw na wznak na ławce, delikatnie przytrzymując go w tej pozycji przed zwolnieniem i jednoczesnym uruchomieniem stopera. Rejestruj czas, w którym zestaw odpoczywa ze wszystkimi czterema łapami jednocześnie płasko opartymi o ławkę w pozycjach nośnych. Rejestruj czas, w którym zestaw wykonuje pełny krok w dowolnym kierunku (zdefiniowany jako ułożenie wszystkich czterech łap w celu osiągnięcia postępu w danym kierunku bez obracania lub przeciągania ciała).
- Wykonaj 5 prób testu odruchu prostującego na zwierzę.
- Po tym, jak każdy kociak ukończy 5 prób odruchu prostowania, włóż żwirek z powrotem do jill.
9. Testy na wybiegu
- Na P42 wyjmij zestawy ze skrzelki. Umieść zestawy w plastikowych klatkach na około 10 minut przed badaniem, aby mogły zaaklimatyzować się w środowisku. Wyłącz światła w pomieszczeniu testowym, aby upewnić się, że światło otoczenia nie wpływa na działanie wybiegu.
- Utwórz nowy eksperyment w odpowiednim oprogramowaniu. Dostosuj ustawienia eksperymentalne tak, aby maksymalny czas trwania pracy nie przekraczał 10,00 s, a minimalny czas trwania nie był krótszy niż 1,50 s. Ustaw maksymalną zmianę prędkości tak, aby nie przekraczała 60%. Ustal minimalny wymóg trzech zgodnych biegów dla każdego zwierzęcia.
- Dostosuj szerokość chodnika w stosunku do wielkości zwierzęcia tak, aby było w stanie swobodnie poruszać się bez dotykania ścian, a jednocześnie pozostać na tyle wąskim, aby zniechęcić do skręcania. Dodaj nowe ustawienie wykrywania na karcie Profile ustawień wykrywania przy użyciu automatycznego wykrywania. Użyj tych samych ustawień wykrywania dla wszystkich miotów i zwierząt w danym wieku.
- Dokładnie wyczyść chodnik chusteczką papierową o niskiej zawartości kłaczków i 70% etanolem przed i po każdym zwierzęciu. Regularnie czyść łapy fretki, aby poprawić dokładność wykrywania i klasyfikacji. Po przygotowaniu chodnika i zwierzęcia rozpocznij próbne pozyskiwanie.
- Przerwij akwizycję, aby posprzątać wybieg, jeśli na szkle gromadzą się ślady stóp lub jeśli zwierzęta oddają mocz lub kał. Przerwij akwizycję, gdy oprogramowanie wybiegu rozpozna trzy zgodne przebiegi na podstawie wcześniej określonych ustawień eksperymentu.
10. Testy w otwartym polu (P42)
- Użyj nieporowatego pudełka akrylowego (55 cm x 55 cm x 40 cm wysokości) pomalowanego na matowo-biały kolor. Ustaw kamerę tak, aby była wyśrodkowana bezpośrednio nad ramką i wszystkie cztery ściany zostały przechwycone. Oczyść arenę testową 70% etanolem przed pierwszym użyciem i między zwierzętami.
- W odpowiednim oprogramowaniu wybierz opcję Nowy z szablonu i Zastosuj wstępnie zdefiniowany szablon. Kontynuuj procedurę konfiguracji, wybierając kolejno Typ tematu: Inny; Szablon areny: Otwarte pole, kwadrat; Szablon strefy: środek, obramowanie, rogi; Funkcje do śledzenia: Punkt centralny.
- Otwórz Ustawienia areny i chwyć obraz tła z wejścia kamery, upewniając się, że szczyty ścian areny są widoczne. Skalibruj wymiary areny za pomocą narzędzia do skalowania.
- Dostosuj wstępnie zdefiniowane strefy areny, zmieniając rozmiar konturów tak, aby pasowały do stref ścian (NW, NE, SW, SE) i stref podłogi (lewa góra, środkowa góra, prawa góra, lewa środkowa, lewa środek, środek, prawa środek, lewy dół, lewy dół, prawy dolny). Sprawdź poprawność konfiguracji, aby upewnić się, że żadne strefy nie nakładają się na siebie.
- Otwórz okno Pobieranie i naciśnij Rozpocznij pobieranie. Umieść fretkę na środku areny testowej zorientowaną w taki sposób, aby była spójna dla każdego badanego obiektu. Pozwól fretce swobodnie poruszać się po arenie przez okres 5 minut. Pod koniec okresu testowego naciśnij przycisk Zatrzymaj pobieranie. Powtórz procedurę z następną fretką.
nuta: Wszyscy eksperymentatorzy w pomieszczeniu powinni ustawić się tak, aby nie być obserwowanym przez fretkę i zachować ciszę podczas okresu testowania.
11. Fiksacja-perfuzja
- Na P42 należy głęboko znieczulić zestawy z 5% izofluranem. Przedawkować pentobarbital (120–150 mg/kg domięśniowo). Zapewnij głębokie znieczulenie poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i utratę ruchów oddechowych.
- Przenieś zwierzę do dygestoria. Otwórz klatkę piersiową i zaciśnij aortę zstępującą za pomocą drobnych hemostatów. Wytnij prawe atrium. Za pomocą pompy perfuzyjnej przepłukać lewą komorę 60 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej z szybkością 30 ml/min. Ukrwić z 60 ml formaliny (10% formaldehydu) z szybkością 30 ml/min.
- Odetnij głowę tuszy i usuń mózg z czaszki za pomocą nożyczek, kleszczy, rongeurów i szpatułki. Rób zdjęcia w wysokiej rozdzielczości grzbietowych, brzusznych i bocznych aspektów każdego mózgu. Po utrwaleniu mózgu w formalinie przez co najmniej 48 godzin.
12. Pomiar mózgu ex vivo
- Wyjmij mózg z formaliny (krok 11.3) i ułóż go na ręczniku papierowym, aby wchłonął nadmiar płynu.
- Za pomocą suwmiarki elektronicznej zmierz wysokość mózgu, umieszczając końcówki suwmiarki na grzbietowej i brzusznej części mózgu. Zmierz długość mózgu, umieszczając końcówki suwmiarki na opuszce węchowej i najbardziej tylnej granicy płata potylicznego. Zmierz szerokość mózgu, umieszczając końcówki suwmiarki w najbardziej bocznych częściach płatów skroniowych. Zważ mózg.
- Zmierz bruzdę podłużną (przednią i tylną w stosunku do bruzdy krzyżowej), bruzdy boczne, bruzdy nadsylwijskie, bruzdy koronalne, bruzdy pseudosylwijskie, bruzdy ansinate, bruzdy krzyżowe, bruzdy przedsylwijskie, zakręty boczne, zakręty nadsylwijskie, zakręty esowate (przednie i tylne), zakręty koronalne, zakręty ektosylwijskie (przednie i tylne) oraz zakręty oczodołowe. Zmierz wszystkie bruzdy od początku i końca najbardziej wyraźnej części odpowiedniej bruzdy. Zmierz wszystkie zakręty od najszerszego aspektu każdego odpowiadającego mu zakrętu.
- Zmierz ilość odsłoniętego móżdżku, umieszczając jedną końcówkę suwmiarki w najbardziej wysuniętym do tyłu punkcie szczeliny podłużnej i umieszczając drugą końcówkę suwmiarki w najbardziej tylnej części móżdżku.
nuta: Atlas mózgu fretki, znaleziony w Biology and Diseases of the Ferret14, został wykorzystany do opracowania pomiarów mózgu fretki ex vivo.
13. Punktacja za obrażenia brutto
- Korzystając ze zdjęć wykonanych w kroku 11.3., zastosuj kryteria punktacji z kroków 13.2–13.4, aby ocenić poważne uszkodzenie mózgu (skala 0-9), pozostając zaślepionym na grupy ekspozycji (lub leczenia).
- Oceń szczelinę podłużną. Jeśli wydaje się to normalne, przypisz wynik 0. Jeśli jest nieznacznie poszerzony (około 2x normalna szerokość), ale wzrost szerokości jest niepełny na całej długości szczeliny, przypisz wynik 1. Jeśli jest umiarkowanie poszerzony (około 2–3 razy normalnie), przypisz mu wynik 2. Jeśli jest wyraźnie poszerzony, z widoczną szczeliną >3x normalną szerokością na większości długości szczeliny, zastosuj nacięcie 3.
- Oceń bruzdy boczne. Jeśli wykazują normalną definicję, z oddzieleniem zakrętów bocznych i nadsylwiańskich, przypisz wynik 0. Jeśli obserwuje się łagodną jednostronną lub obustronnie obniżoną definicję bruzdy, szczególnie w części ogonowej, z minimalnym zwężeniem płatów czołowych i skroniowych w stosunku do płatów potylicznych, przypisz wynik 1.
- Jeśli obserwuje się umiarkowanie obniżoną definicję bruzd, z zagłębieniem zakrętu nadsylwijskiego, zwężeniem zakrętu czołowego i ektosylwiuszowego oraz łagodnym zwężeniem płatów czołowych i skroniowych w stosunku do płatów potylicznych, przypisz wynik 2. Jeśli widoczne jest jednostronne zwyrodnienie torbielowate, z minimalną zmianą półkuli przeciwległej, przypisz wynik 3. Jeśli występuje zła definicja bruzd bocznych, z obustronnym torbielowatym lub ciężkim zwyrodnieniem płatów potylicznych i skroniowych, przypisz wynik 4.
- Oceń widoczną część móżdżku. Jeśli wydaje się normalny, z widocznymi (<75% robaków i <66% półkul, przypisz wynik 0. Jeśli widocznych jest 75–90% robaków i ≥66% półkul, przypisz wynik 1. Jeśli widoczna jest większość móżdżku, pokazująca wszystkie robaki i ≥66% półkul, przypisz wynik 2.
14. Analiza danych
- W przypadku danych z testów odruchowych przypisz niepowodzeniom wynik 61 s, aby umożliwić porównanie ich z sukcesami na koniec czasu (60 s), ale z gorszą pozycją w analizie statystycznej. Oblicz pole pod krzywą dla każdego zwierzęcia w czasie w każdym z testów odruchowych.
- Dostosuj dane wybiegu, które obejmują rozmiar łapy i nacisk na wagę zwierzęcia.
- Analizuj dane przy użyciu nieparametrycznych metod statystycznych, opisując dane za pomocą mediany i przedziału międzykwartylowego (IQR).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Z 34 zwierząt (n = 18 samców, n = 16 samic) z sześciu miotów poddanych urazowi, osiem zwierząt (24%; n = 4 samców, n = 4 samic) w grupie uszkodzonej padło podczas drugiego okresu hipoksji (n = 5), podczas kontroli temperatury (n = 2) lub w nocy po urazie (n = 1). W grupie uszkodzonej dziewięć z 26 ocalałych zwierząt (35%) wykazywało widoczne uszkodzenia makroskopowe. Pięć zwierząt (n = 5 samców) miało uszkodzenia umiarkowane, a cztery zwierzęta (n = 2 samców, n = 2 samic) uszkodzenia ciężkie, zdefiniowane odpowiednio jak...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ze względu na fizyczne i rozwojowe podobieństwa wspólne dla mózgu fretki i mózgu, fretka jest coraz częściej wykorzystywana do modelowania zarówno dorosłych, jak i rozwojowych uszkodzeń mózgu. 8,9,10,11,12. Jednak dotychczasowe badania sugerują, że mózg fretki jest zarówno odporny na początkowe urazy, jak i wysoce plastyczny, a deficyty behawioralne zmniejsza...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Rozwój modelu został sfinansowany przez Fundację Billa i Melindy Gatesów, a także przez grant NIH 5R21NS093154-02 (NICHD).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 80% tlenu | Praxair | ||
| 9% tlenu | Praxair | ||
| Chłonny ochraniacz stołowy | Kimtech | 7546 | |
| Automatyczny wybieg | Peeling | ||
| Betadine | |||
| Suwmiarki buprenorfiny | |||
| Produkty pomiarowe | ME-CAL-FP-200 | Zakres 200 mm, rozdzielczość 0,01 mm | |
| Bawełniana gąbka z gazy | Fisher Scientific | 22028556 | |
| Zakrzywiony drobny hemostat | Roboz | RS-7101 | |
| Zakrzywione kleszcze | World Precision Instruments | 501215 | |
| Zakrzywiony hemostat do wiązania szwów | Roboz | RS-7111 | |
| Ethovision | Noldus | ||
| Smar do oczu | Rugby | NDC 0536-1970-72 | |
| Fretki (Mustela putorius furo) | Marshall Biosciences | Outbred (bez określonego szczepu) | |
| Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% (bufor fosforanowy / certyfikowany) |
| Maszynki do strzyżenia włosów | Conair | GMT175N | |
| Strzykawki insulinowe | BD | 329461 | 0,3 cm³ 3 mm 31 g |
| Izofluran | Piramal | 66794-017-25 | |
| Lidokaina | Patterson Weterynaryjne | 07-808-8202 | |
| Lista LPS | Biologiczny | LPS Ultrapure # 423 | |
| Czujnik tlenu | BW Alarm gazowy | GAXT-X-DL-2 | |
| Pentobarbital | |||
| Komora plastikowa | Tellfresh | 1960 | 10 L; 373 x 270 x 135 mm3roztwór |
| soli fizjologicznej, 0,9% | Hospira | RL-4492 | |
| Ostrze skalpela | Integra Miltex | 297 | |
| Rękojeść skalpela | World Precision Instruments | 500236 | #3, 13 cm |
| Szew sterylny | Drobny Science Tools | 18020-50 | Pleciony jedwab, 5/0 |
| Aplikator do klipsów chirurgicznych | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| Chirurgiczny ściągacz do przycinania | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| Obłożenia chirurgiczne | Medline Unidrape | VET3000 | |
| Rękawice chirurgiczne | Ansell Perry Inc | 5785004 | |
| Klipsy surigical | Narzędzia do nauki | 12022-09 | |
| Termometr (doodbytniczy) | YSI | Precision 4000A | |
| Termometr (wodny) | Fisher Scientific | 14-648-26 | |
| Taśma pępowinowa | Grafco | 3031 | Sterylna |
| kąpiel wodna | Thermo Scientific | TSCOL19 | 19 L |
Bibliografia
- Martin, J. A., Hamilton, B. E., Osterman, M. J. K., Driscoll, A. K., Drake, P. Births: Final Data for 2017. National Vital Statistics Report. 67 (8), 1-49 (2018).
- Vanhaesebrouck, P., et al. The EPIBEL study: outcomes to discharge from hospital for extremely preterm infants in Belgium. Pediatrics. 114 (3), 663-675 (2004).
- Raju, T. N., et al. Long-Term Healthcare Outcomes of Preterm Birth: An Executive Summary of a Conference Sponsored by the National Institutes of Health. Journal of Pediatrics. , (2016).
- Raju, T. N. K., Buist, A. S., Blaisdell, C. J., Moxey-Mims, M., Saigal, S. Adults born preterm: a review of general health and system-specific outcomes. Acta Paediatrica. 106 (9), 1409-1437 (2017).
- Bennet, L., et al. Chronic inflammation and impaired development of the preterm brain. Journal of Reproductive Immunology. 125, 45-55 (2018).
- Reich, B., Hoeber, D., Bendix, I., Felderhoff-Mueser, U. Hyperoxia and the Immature Brain. Developmental Neuroscience. 38 (5), 311-330 (2016).
- Galinsky, R., et al. Complex interactions between hypoxia-ischemia and inflammation in preterm brain injury. Developmental Medicine & Child Neurology. 60 (2), 126-133 (2018).
- Empie, K., Rangarajan, V., Juul, S. E. Is the ferret a suitable species for studying perinatal brain injury. International Journal of Developlemental Neuroscience. 45, 2-10 (2015).
- Snyder, J. M., et al. Ontogeny of white matter, toll-like receptor expression, and motor skills in the neonatal ferret. International Journal of Developlemental Neuroscience. , (2018).
- Schwerin, S. C., et al. Progression of histopathological and behavioral abnormalities following mild traumatic brain injury in the male ferret. Journal of Neuroscience Research. 96 (4), 556-572 (2018).
- Rafaels, K. A., et al. Brain injury risk from primary blast. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 73 (4), 895-901 (2012).
- Wood, T., et al. A Ferret Model of Encephalopathy of Prematurity. Developlemental Neuroscience. , (2019).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of Brain Development in the Ferret via Magnetic Resonance Imaging. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Kroenke, C. D., Mills, B. D., Olavarria, J. F., Neil, J. J. Biology and Diseases of the Ferret. , WIley. (2014).
- Eklind, S., et al. Bacterial endotoxin sensitizes the immature brain to hypoxic--ischaemic injury. European Journal of Neuroscience. 13 (6), 1101-1106 (2001).
- Falck, M., et al. Neonatal Systemic Inflammation Induces Inflammatory Reactions and Brain Apoptosis in a Pathogen-Specific Manner. Neonatology. 113 (3), 212-220 (2018).
- Osredkar, D., et al. Hypothermia Does Not Reverse Cellular Responses Caused by Lipopolysaccharide in Neonatal Hypoxic-Ischaemic Brain Injury. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 390-397 (2015).
- Nakata, M., Itou, T., Sakai, T. Quantitative analysis of inflammatory cytokines expression in peripheral blood mononuclear cells of the ferret (Mustela putorius furo) using real-time PCR. Veterinary Immunology and Immunopathology. 130 (1-2), 88-91 (2009).
- Christensson, M., Garwicz, M. Time course of postnatal motor development in ferrets: ontogenetic and comparative perspectives. Behavioral Brain Research. 158 (2), 231-242 (2005).
- Li, Y., Dugyala, S. R., Ptacek, T. S., Gilmore, J. H., Frohlich, F. Maternal Immune Activation Alters Adult Behavior, Gut Microbiome and Juvenile Brain Oscillations in Ferrets. eNeuro. 5 (5), (2018).
- Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurolology. 9 (2), 131-141 (1981).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
