Zachowanie związane z budowaniem gniazda jako wczesny wskaźnik deficytów behawioralnych u myszy

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określania zachowań związanych z budowaniem gniazd u myszy, o których wiadomo, że są upośledzone w kilku zaburzeniach i chorobach neurologicznych. Protokół ten bada użyteczność czterech materiałów i oferuje możliwość ilościowego określenia zgodności oceniającego w punktacji, poprawiając ważność i wiarygodność testu.

Streszczenie

Budowanie gniazd jest wrodzonym zachowaniem u samców i samic gryzoni, nawet gdy są hodowane w warunkach laboratoryjnych. W związku z tym wielu badaczy dostarcza gryzoniom materiały syntetyczne i/lub naturalne (takie jak sznurek, tkanka, bawełna, papier i siano) jako miernik ich ogólnego samopoczucia i jako ocenę pomocniczą w celu przewidywania możliwego pogorszenia funkcji poznawczych. Zazwyczaj zmiany w zachowaniach związanych z zagnieżdżaniem, takie jak niepowodzenie w tworzeniu gniazda, wskazują na zmianę zdrowia lub dobrostanu. Ponadto zachowania gniazdowe są wrażliwe na wiele wyzwań środowiskowych i fizjologicznych, a także na wiele mutacji genetycznych leżących u podstaw patologicznych stanów chorobowych. Poniższy protokół opisuje paradygmat zachowania zagnieżdżania, który bada użycie czterech rodzajów materiału do zagnieżdżania. Ponadto protokół wykorzystuje korelacje wewnątrzklasowe, aby wykazać, że niezawodność między oceniającymi jest wyższa, gdy gniazda są zbudowane z rozdrobnionego papieru w porównaniu z innymi popularnymi materiałami gniazdowymi, takimi jak bawełniane kwadraty, skręty papieru i miękka ściółka z kolb. Wybrana metodologia i względy statystyczne (tj. korelacja wewnątrzklasowa) dla tego testu mogą być interesujące dla osób przeprowadzających eksperymenty oceniające jakość życia myszy.

Wprowadzenie

Budowanie gniazd jest wrodzonym zachowaniem u wielu zwierząt, takich jak ptaki, ryby, gryzonie i małpy człekokształtne, i przyciąga coraz większą uwagę ze względu na swoją potencjalną użyteczność w badaniu chorób neurologicznych i zaburzeń charakteryzujących się pogorszeniem samopoczucia i upośledzonymi czynnościami życia codziennego¹. Myszy, zarówno samce, jak i samice, budują gniazda podobnej wielkości w celach reprodukcyjnych, ochrony ciepła i schronienia; Co ważniejsze, robią to nawet wtedy, gdy są wychowywane w warunkach laboratoryjnych2. Hess, Pietrowicz i Goodwin^{3 twierdzą,} że biologicznie odpowiednie bodźce są niezbędne do wywołania biologicznie odpowiednich zachowań, takich jak gniazdowanie; Jednak do oceny > Zmiany w tych zachowaniach zagnieżdżania (tj. niepowodzenie w tworzeniu gniazda z dostarczonego materiału) na ogół wskazują na zmianę zdrowia lub dobrostanu. W większości przypadków brak budowy gniazda przypisuje się kilku czynnikom, które negatywnie wpływają na samopoczucie. Takie przykłady, które skutecznie obniżyły jakość budowy gniazd u myszy, obejmują ekstremalne temperatury; bolesna stymulacja; wywołane choroby i infekcje; mutacje genetyczne; oraz uszkodzenia mózgu w przyśrodkowych obszarach przedwzrokowych, przegrodzie i hipokampie^4,5,6.

Choroba Alzheimera jest postępującą chorobą neurodegeneracyjną charakteryzującą się utratą tkanki mózgowej, nagromadzeniem zewnątrzkomórkowych blaszek β amyloidu i wewnątrzkomórkowych splątków neurofibrylarnych tworzących hiperfosforylowane białko związane z mikrotubulami, tau⁷. Dodatkowo choroba Alzheimera charakteryzuje się przede wszystkim deficytami w uczeniu się i pamięci oraz upośledzeniem czynności życia codziennego. U myszy czynności życia codziennego są zwykle badane za pomocą okołodobowego biegania na kołach^8,9,10,11, chociaż nowe alternatywy, takie jak zagnieżdżanie, zyskują na popularności. Wykazano, że zagnieżdżanie jest wrażliwe na manipulacje (np. mutacje genetyczne, stresory środowiskowe), które zostały zidentyfikowane jako czynniki ryzyka i/lub przyczyny choroby Alzheimera. W związku z tym zagnieżdżanie może być stosowane jako dodatkowy lub uzupełniający test w wielu szczepach myszy, które modelują te cechy choroby Alzheimera. Na przykład Deacon i współpracownicy¹² zmierzyli budowę gniazda myszy Tg2576 z mutacjami genetycznymi szwedzkiego białka prekursorowego amyloidu (APPswe) i preseniliny 1 (PS1). Jakość gniazd zbudowanych przez myszy Tg2576 trzymane w grupach była znacznie gorsza niż w grupie kontrolnej zarówno w wieku 3, jak i 12 miesięcy. Zgadzając się z tymi ustaleniami, Filali i in.^{13 stwierdzili,} że samce myszy trzymane pojedynczo z APPswe/PS1, którym podano dwa kawałki bawełny o wymiarach 5 x 5 cm, budowały znacznie uboższe gniazda, jak oceniono w skali od 1 do 5 (1 = gniazdo nietknięte, 5 = prawie idealne gniazdo). Transgeniczne myszy konsekwentnie budowały gorsze gniazda w wieku 6, 9 i 12 miesięcy w porównaniu z ich odpowiednikami typu dzikiego, a w niektórych przypadkach myszy Appswe/PS1 całkowicie nie zbudowały gniazda z dostarczonej bawełny.

Poprzednie badania z naszego laboratorium wykazały, że myszy C57BL/6J typu dzikiego budują znacznie lepsze gniazda z bawełnianych kwadratów w porównaniu do myszy CRND8 i CRND8/E4⁹. Jednak większość eksperymentów z użyciem prasowanych bawełnianych kwadratów wydaje się być zmienna, przy czym myszy typu dzikiego nie wykazują oczekiwanych wysokich wyników w porównaniu z myszami transgenicznymi, które powinny wykazywać bardzo niskie wyniki w nestinging², co może częściowo prowadzić do braku różnic w szacowanych parametrach (tj. średnich różnicach) i istotności statystycznej. Brak różnic może wynikać częściowo z nieodpowiedniego starzenia się myszy lub czasu przeznaczonego na gniazdowanie. Alternatywnie, materiał do zagnieżdżania może być dodatkowym wyzwaniem, powodując większą zmienność ze względu na preferencje metodologiczne badaczy dotyczące ilości i rodzaju materiału, który może nawet wchodzić w interakcje ze szczepem myszy. Na przykład Robinson-Junker i współpracownicy¹⁴ dostarczyli przetworzony lub nieprzetworzony materiał ściółkowy o różnych rozmiarach (tj. małe lub duże płatki) myszom C3H/HeNCrl i myszom BALB/cAnNCrl, które są powszechnie obserwowane, odpowiednio, jako słabi i silni budowniczowie gniazd. Po dostarczeniu nieprzetworzonej ściółki, myszy C3H zbudowały mniej złożone, ale podobnej jakości gniazda w porównaniu do gniazd myszy BALB/c. Podobnie, Martin i współpracownicy¹⁵ porównali złożoność gniazd różnych materiałów gniazdowych podawanych myszom jeleniowatym, dalekim krewnym gatunków Mus musculus, które mają wyraźne różnice ewolucyjne (tj. częściej grzebią się w drzewach i zaroślach oraz są bardziej aktywne w niewoli), ale otrzymują podobną opiekę hodowlaną jak zwykłe myszy laboratoryjne i budują gniazda z dowolnego dostępnego miękkiego, włóknistego materiału^16,17,18. Samice i hodowcy z młodymi w klatce domowej budowali bardziej złożone gniazda niż samce, a autorzy sugerują, że te różnice w zachowaniu mogą wynikać z powiązanych zmian w stężeniach progesteronu u myszy jeleni¹⁵. Co ważniejsze, myszy budowały bardziej złożone gniazda składające się z brązowego papieru, a następnie bawełnianych kwadratów i bawełnianych cylindrów, a najmniej złożone gniazda były budowane z białego papieru i rozproszonych mini-bawełnianych kwadratów.

Pomimo rosnącej popularności zagnieżdżania, rozważania dotyczące naukowo uzasadnionych, opłacalnych i wrażliwych na czas praktyk są minimalnie omawiane. Biorąc pod uwagę wyżej wymienione wyzwania metodologiczne i ekonomiczne, w niniejszym protokole zbadano użyteczność różnych materiałów do zagnieżdżania – kwadratów bawełnianych, skrętów papieru, rozdrobnionego papieru i przetworzonej ściółki – w zachowaniu gniazdowania. W szczególności dostarczyliśmy wszystkie materiały do gniazdowania zarówno starszym myszom C57BL / 6J typu dzikiego, jak i myszom APOE e4 z chorobą Alzheimera, w celu zbadania wszelkich potencjalnych interakcji genotypu przez materiał w jakości gniazdowania. Ponadto eksperyment miał na celu ocenę niezawodności gniazd zbudowanych z różnych materiałów. Podsumowując, protokół ten wykazuje wyższość jednego materiału zagnieżdżającego w tej próbce – rozdrobnionego papieru – pod względem jakości gniazda i zgodności punktora, z zamiarem poprawy ważności i wiarygodności testu zagnieżdżania.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu George'a Masona i są zgodne z wytycznymi określonymi przez Ocenę i Akredytację Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi.

1. Zwierzęta i uwagi przed oceną

1. Do tego protokołu użyj dorosłych, 9-12-miesięcznych myszy C57BL / 6J (n = 10) (stock # 000664) wildtype i myszy APOE e4 (n = 11) z hemizygotycznej krzyżówki J20 (stock #006293) x homozygotycznej APOE e4 (stock #012307).
2. W pomieszczeniu trzymanym w domu grupowym myszy z rodzeństwem z miotu tej samej płci z odpowiednim urozmaiceniem (np. w tym protokole myszom zapewniono koło do biegania, igloo i małą nylonową zabawkę do żucia). Grupowy dom dla 4 - 6 samic myszy i 4 samców w klatce domowej o wymiarach 356 mm dł. x 485 mm szer. x 218 mm wys.
   UWAGA: Naukowcy mogą rozważyć wdrożenie strategii przed i/lub po zagnieżdżeniu, aby uniknąć agresji ze strony współlokatora, gdy myszy są ponownie wprowadzane po próbach gniazdowania. Takie strategie mogą obejmować, między innymi, codzienną obsługę przed testami behawioralnymi, aby lepiej przyzwyczaić myszy do obchodzenia się z nimi podczas testów behawioralnych, badaczy i personelu hodowlanego¹⁹, oddzielanie i indywidualne trzymanie agresywnych myszy lub zmniejszanie liczby myszy w klatce domowej²⁰, w zależności od intensywności walki w klatce, obserwowanych ran²¹, itd.

2. Konfiguracja pomieszczenia i zagnieżdżania

1. Upewnij się, że każda mysz ukończyła cztery próby (1 materiał na próbę). Losowo dobieraj kolejność materiału zagnieżdżającego dla każdej myszy, aby uniknąć efektu kolejności.
2. Przygotuj klatki w oddzielnym pomieszczeniu do badań. Rejestruj warunki środowiskowe (np. 22,2 – 22,3°C, wilgotność 45-47%, światła włączone w godzinach 9:00 – 21:00) tak, aby były spójne we wszystkich próbach i były identyczne z pomieszczeniem mieszkalnym. Zapewnij jedzenie i wodę ad libitum.
   1. Przypisz każdej myszy losowy numer identyfikacyjny (ID) lub literę. Przymocuj losową kartę identyfikacyjną do klatki o wymiarach 29,2 x 18,4 cm.
   2. Zapisz oryginalny identyfikator/identyfikator zwierzęcia i inne niezbędne dane identyfikacyjne w rejestrze kolonii, aby upewnić się, że asystenci i personel zajmujący się hodowlą zwierząt pozostają ślepi na warunki.
3. Losowo uporządkuj rozmieszczenie klatek w pomieszczeniu testowym w taki sposób, aby myszy typu dzikiego i transgenicznego nie były niewłaściwie oddzielone (tj. po przeciwnych stronach pomieszczenia, na oddzielnych półkach itp.).
4. Przygotuj materiały do zagnieżdżania, odpowiednio zakrywając dno klatki. Użyj około 100 g suchej masy ściółki z kolb kukurydzy do prób z papieru kwadratowego, skręconego i rozdrobnionego oraz około 100 g miękkiej ściółki z kolb do próby z miękkimi kolbami.
5. Jeśli używasz zlewki do rozproszenia materiału gniazdowego, napełnij zlewkę nie więcej niż 100 ml ściółką z kolb kukurydzy lub miękką ściółką z kolb.
6. Umieść pierwszy materiał do zagnieżdżania w sekwencji przed wprowadzeniem myszy do klatki. W protokole tym wykorzystano (1) pojedynczy sprasowany bawełniany kwadrat, (2) pojedynczy skręt papieru, (3) 100 g miękkiej ściółki z kolb (tj. bez dodatku dodatkowej ściółki lub materiału do zagnieżdżania) oraz (4) 2,5 g czystego (bez atramentu), rozdrobnionego białego papieru do drukarki pociętego na paski o długości 5 – 7 cm. Rozproszyć materiały zagnieżdżające, jak pokazano na Rysunek 1 (punkt odniesienia).

Rysunek 1: Ustawienie klatki dla każdego materiału. Wszystkie myszy ukończyły jedno badanie z każdym rodzajem materiału, co daje w sumie cztery próby. Ściółka z kolb kukurydzy wyściełała całe dno klatek, zawierała papierowy skręt, sprasowany bawełniany kwadrat i rozdrobniony papier. Miękka ściółka z kolb została równomiernie rozłożona po klatce, aby zachęcić myszy do oddzielenia małych bawełnianych kwadratów od kolby kukurydzy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Próba zagnieżdżania

1. Rozpocznij pierwszą próbę zagnieżdżania o tej samej porze dnia, na początku cyklu świetlnego (np. 9:00 rano).
2. Przynieś klatkę domową zawierającą myszy do pokoju testowego. Wyjmij każdą mysz z klatki domowej i umieść ją w przypisanej jej klatce gniazdowej z materiałem już umieszczonym w klatce. Zwróć klatki domowe do pomieszczenia mieszkalnego.
3. Pozwól myszom ukończyć 1 próbę przez 24 godziny bez zakłóceń.
4. Po 24 godzinach od rozpoczęcia pierwszej próby należy wrócić do pomieszczenia testowego.
5. Ostrożnie zdejmij pokrywę klatki i sfotografuj gniazdo każdej myszy, rejestrując przypisany identyfikator na zdjęciu i minimalizując wygląd wszelkich materiałów na zewnątrz klatki.
   UWAGA: Poczekaj, aż mysz odejdzie od gniazda, zanim spróbujesz wyjąć ją z klatki. Zdecydowanie zaleca się fotografowanie gniazda, gdy mysz znajduje się w klatce, ale poza gniazdem. Próba wyjęcia myszy z klatki przed sfotografowaniem może potencjalnie spowodować, że mysz zostanie zaskoczona, a tym samym przesunie się na materiał zagnieżdżony i rozproszy je.
6. Delikatnie wyjmij mysz z klatki lęgowej i umieść ją w tymczasowej klatce. Wyrzuć ściółkę i wszelkie materiały do gniazdowania, wymień ściółkę i zapewnij następny materiał do gniazdowania w sekwencji, a następnie włóż mysz z powrotem do klatki lęgowej.
7. W razie potrzeby powtórz tę czynność, aby uzyskać wyniki dla wszystkich 4 prób. Zaleca się stosowanie rozdrobnionego papieru i towarzyszących mu kryteriów punktacji, chociaż badacze mogą być zainteresowani wykorzystaniem alternatywnych materiałów omówionych w tym protokole.
8. Po zakończeniu wszystkich prób przywróć myszy do ich domowych klatek. Obserwuj myszy pod kątem potencjalnych agresywnych zachowań. Agresja może wystąpić u starszych samców typu dzikiego.
   UWAGA: Na potrzeby tego protokołu myszy testowano raz w wieku około 9 – 12 miesięcy. Zagnieżdżanie powinno być prowadzone w różnym wieku (tj. w młodszym wieku, w zależności od wybranego szczepu, przed wystąpieniem cech fenotypowych), aby udokumentować spadek zdolności do gniazdowania w czasie i wykazać prawdopodobną przyczynową rolę neurodegeneracji.

4. Punktacja i ocena wiarygodności między oceniającymi

1. Dostarcz obrazy wyjściowe dla każdego materiału gniazdowego dla co najmniej 2 osób niewidomych na badanie. Chociaż nie jest to wymagane, upewnij się, że osoby oceniające są zaznajomione z koncepcją zagnieżdżania. Podczas szkolenia osób oceniających należy podać serię przykładowych zagnieżdżeń (np. Rysunek 2 dla rozdrobnionego papieru), aby zapoznać osoby oceniające z każdym typem materiału (jeśli dotyczy) i kryteriami punktacji.
   1. Oceń każde gniazdo w skali od 1 do 5, korzystając z następujących informacji o skali (zaadaptowanych z Deacon, 2006)². Zobacz Rysunek 2 jako przykładowa punktacja przy użyciu rozdrobnionego papieru.
   2. Przyznaj wynik 1, gdy rozdrobniony papier lub małe kwadraty pozostały rozrzucone po klatce lub bawełniany kwadrat lub skręt pozostały nietknięte;
   3. Przyznaj wynik 2, gdy część materiału została skonstruowana w gnieździe, ale ponad 50% materiału nie zostało użyte do budowy gniazda (tj. pozostało rozproszone lub większość oryginalnego materiału pozostała nietknięta);
   4. Przypisz wynik 3, gdy zbudowano zauważalne gniazdo, ale kilka kawałków nadal było rozrzuconych;
   5. Przypisz wynik 4, gdy prawie cały materiał został użyty do budowy gniazda, ale niewiele kawałków materiału pozostało rozrzuconych lub znajdowało się w pobliżu gniazda;
   6. Przypisz punktację 5, gdy cały materiał został użyty do wykonania możliwego do zidentyfikowania gniazda.
      UWAGA: Osoby oceniające powinny robić przerwy i wracać do zdjęć bazowych, aby uniknąć zmęczenia i stronniczości podczas procedury oceniania. Osoby oceniające wyniki nie powinny omawiać wyników między sobą, aby uniknąć stronniczości. Osoby oceniające powinny omówić wyniki po zakończeniu oceniania lub jeśli potrzebna jest dalsza dyskusja w celu zmiany wyników, co może potencjalnie rozwiązać problemy z korelacjami wewnątrzklasowymi (ICC). Korelacje wewnątrzklasowe zostaną przeprowadzone przy użyciu kroków wymienionych w sekcji 4.2.

Rysunek 2: Przykład punktacji za pomocą kryteriów dla rozdrobnionego papieru, preferowanego materiału. Od lewej do prawej: 1 – rozdrobniony papier pozostał nietknięty; 2 – część papieru została skonstruowana w gniazdo, ale większość kawałków pozostała rozrzucona; 3 – zbudowano zauważalne gniazdo, ale kilka kawałków nadal było rozrzuconych; 4 – większość kawałków została użyta do budowy gniazda, ale niektóre kawałki zostały rozrzucone w pobliżu gniazda; 5 – wszystkie elementy zostały użyte do wykonania gniazda. Zwróć uwagę, że na zdjęciach pokazany jest przypisany zwierzęciu numer, aby uniknąć odślepienia. Kolor karty jest losowy. Naukowcy powinni pozwolić myszy pozostać w klatce, aby uniknąć spłoszenia myszy, co mogłoby potencjalnie rozproszyć gniazdo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Zbieraj i wprowadzaj wyniki oraz formatuj plik danych w taki sposób, aby wyniki każdego oceniającego dla każdego materiału znajdowały się w osobnych kolumnach.
   UWAGA: W przypadku korzystania z pliku uzupełniającego 1 należy pamiętać, że skrypt kodujący do tej analizy wymaga bezpłatnego oprogramowania typu open source (np. pakietu irr w RStudio)^22,23. Skrypt usuwa nagłówki i zmienne tematów (tj. górny wiersz i identyfikatory zwierząt) w celu przeprowadzenia korelacji wewnątrzklasowej (ICC). Uruchom skrypt, aby przeprowadzić dwukierunkowe, zgodne, uśrednione miary ICC, podświetlając wyznaczoną sekcję kodu i naciskając Ctrl+Enter lub Command+Enter.
3. Porównaj ICC z istniejącymi kryteriami^24,25,26. Zazwyczaj wartości ICC powyżej 0,80 odpowiadają dużej wiarygodności między oceniającymi, uzasadniając uśrednienie wyników w danym punkcie czasowym (Plik uzupełniający 2).
4. Stosuj te same kryteria ICC dotyczące wiarygodności wewnątrz oceniającego, które mogą być interesujące dla osób przeprowadzających punktację po raz pierwszy.
   UWAGA: Osoby oceniające powinny ocenić te same sfotografowane gniazda w ciągu tygodnia od wstępnej oceny. Zachowaj ostrożność przy uśrednianiu danych, gdy ICC jest niskie, ponieważ może to zniekształcić dane lub dać zerowe wyniki. Jeśli wartości ICC są niskie, wówczas (1) może być wymagane dodatkowe szkolenie dla osób oceniających, (2) osoby oceniające mogą być zmuszone do omówienia swojego uzasadnienia dla wyników zagnieżdżenia, (3) może być potrzebny inny niezależny recenzent, aby dokonać oceny wyników, lub (4) może być konieczna ocena wiarygodności wewnątrz oceniającego. Jeśli wiarygodność wewnątrz oceniającego jest niska, może być wymagane dodatkowe szkolenie lub inny oceniający.

5. Rozważania statystyczne

1. W razie potrzeby przeprowadzaj analizy statystyczne. W przypadku danych, które nie naruszają założeń normalności, ale wykorzystują wiele materiałów dla każdej myszy (tj. efekt wewnątrzobiektowy), należy użyć mieszanej analizy wariancji (ANOVA).
   1. Jeśli korzystasz z kodów dostarczonych jako pliki uzupełniające, pobierz dodatkowe pakiety dodatkowe, które są określone w skrypcie^27,28,29,30.
   2. Jeśli przeprowadzasz mieszaną analizę ANOVA przy użyciu dostarczonego skryptu, uruchom skrypt, aby przekonwertować dowolne pliki danych w formacie szerokoformatowym na długie (tj. zamiast zmiennych powtarzanych w kolumnach, przekonwertuj komórki tak, aby powtarzały się w wierszach). Przykładowy plik danych jest dołączony do tego manuskryptu, aby zademonstrować, jak przekonwertować plik danych z formatu szerokoformatowego na długi.
   3. Przeprowadź mieszaną analizę ANOVA, jak określono w skrypcie. Należy pamiętać, że jeśli test sferyczności Mauchly'ego zostanie naruszony, należy zastosować współczynniki korekcyjne, takie jak poprawka Greenhouse'a-Geissera.
   4. Przeprowadź wszelkie niezbędne testy post-hoc, aby zbadać różnice między czynnikami o więcej niż 2 poziomach, jak określono w skrypcie kodowania. W tym przykładzie przeprowadź testy post-hoc Bonferroni, aby porównać różne typy materiału do zagnieżdżania.
      UWAGA: Jeśli używasz tylko jednego materiału do zagnieżdżania, nie włączaj czynnika wewnątrzobiektowego. Jeśli jednak zbierasz dane w wielu punktach czasowych, uwzględnij te powtarzające się pomiary tak, jakby poziomy czynnika wewnątrzobiektowego.
      UWAGA: W niektórych przypadkach myszy typu dzikiego mogą mieć doskonałe wyniki, a zatem będą wykazywać efekt sufitu, co prowadzi do rozkładu nienormalnego². Podczas analizy danych należy rozważyć odpowiednie testy statystyczne (np. testy nieparametryczne z alternatywnymi miarami tendencji centralnej i dyspersji), metody normalizacji lub solidne podejścia (modelowanie efektów mieszanych dla powtarzanych pomiarów).

Wyniki

Wyniki z czterech różnych materiałów do gniazdowania dostarczonych myszom typu dzikiego i APOE e4 są wyjaśnione w następujący sposób. Opierając się na istniejących kryteriach, ICC wykazało silną zgodność między wszystkimi trzema koderami w odniesieniu do wszystkich czterech materiałów do zagnieżdżania (rozdrobniony papier ICC = 0,94; kwadrat ICC = 0,91; ICC ściółki = 0,87; skręt ICC = 0,87); W związku z tym trzy wyniki zostały uśrednione razem, aby utworzyć jeden wynik dla każdego dostarczonego materiału. Mieszana ANOVA 2 x 4 dała istotny główny efekt genotypu, F(1, 19) = 31,30, p < 0,01, ηp² = 0,62. We wszystkich czterech dostarczonych materiałach myszy typu dzikiego uzyskały wyższe wyniki w zakresie jakości gniazda (3,18 ± 0,20) w porównaniu z myszami APOE e4 (1,98 ± 0,16). Ponadto mieszana ANOVA dała istotny główny efekt materiału, F(3, 57) = 57,48, p < 0,01, ηp² = 0,75. Porównania parami z poprawką Bonferroniego wykazały, że rozdrobniony papier (4,11 ± 0,20) został oceniony znacznie wyżej (p < 0,05) pod względem jakości niż kwadrat (1,95 ± 0,21), pościel (2,21 ± 0,21) lub skręt (1,94 ± 0,20), przy czym nie zaobserwowano różnic między materiałami kwadratowymi, ściółkowymi i skręcanymi (wszystkie p > 0,99). Nie stwierdzono istotnej interakcji między genotypem a materiałem. Dane są pokazane w Rysunek 3.

Inne eksperymenty z naszego laboratorium przyniosły podobne wyniki w modelach choroby Alzheimera o wczesnym początku. Na przykład, jak pokazano na rysunku Rysunek 4, 5,5-miesięczne myszy P301L rTg4510 (htau) zbudowały znacznie gorsze gniazda z rozdrobnionego papieru w porównaniu z ich odpowiednikami typu dzikiego w tym samym wieku³¹. Podobnie, podwójne myszy J20 (hAPP)/htau i pojedyncze htau zbudowały uboższe gniazda z rozdrobnionego papieru w porównaniu z ich odpowiednikami typu dzikiego i tylko promotorem CAMKIIa, zarówno w wieku 3,5, jak i 7 miesięcy³² (dane nie pokazane).  

Rysunek 3: Oceniona jakość gniazd wykonanych z różnych materiałów dostarczanych myszom typu dzikiego i APOE e4. Główny efekt genotypu (*p < 0,01) wykazał, że myszy typu dzikiego konsekwentnie budowały lepsze gniazda wykonane z rozdrobnionego papieru, prasowanych bawełnianych kwadratów, skrętu papieru i miękkiej ściółki z kolb w porównaniu z myszami APOE e4. Główny efekt materiału (**p < 0,01) wykazał również, że gniazda zbudowane z rozdrobnionego papieru zostały ocenione jako wyższej jakości w porównaniu z trzema pozostałymi materiałami. Rozdrobniony papier miał najwyższą miarę wiarygodności między oceniającymi ocenionymi przez ICC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Gniazda z rozdrobnionego papieru zbudowane przez myszy typu dzikiego i htau, na lub bez wody cynkowej. (A) Reprezentatywne gniazda zbudowane przez 5,5-miesięczne myszy typu dzikiego i htau, na kontrolnej wodzie (z kranu) lub wodzie uzupełnionej 10 częściami na milion (biometal związany z chorobą Alzheimera). Gniazda oceniano w skali od 1 do 5 według określonych kryteriów. Od lewej do prawej: typ dziki + wodny (4,54±0,52); typ dziki + woda kontrolna (4,15±0,80); HTAU + woda kontrolna (3,08 ± 0,64); HTAU + woda (2,46±0,97). (B) Interakcja genotyp z wodą wykazała, że myszy htau na wodzie cynkowej budowały znacznie gorsze gniazda w porównaniu z innymi grupami (*); Ponadto proste efekty wykazały, że myszy HTAU na wodzie cynkowej budowały gorsze gniazda niż myszy HTAU na wodzie kontrolnej. Myszy typu dzikiego na wodzie kontrolnej i zbudowały gniazda o wyższej i podobnej jakości w porównaniu do ich odpowiedników htau. Przedruk z Journal of Alzheimer's Disease, tom 64, Craven, KM, Kochen WR, Hernandez CM, Flinn JM, zaostrza patologię tau w modelu myszy Tau, 671-630, Copyright (2018), za zgodą IOS Press³¹. Publikacja jest dostępna w IOS Press za pośrednictwem http://dx.doi.org/10.3233/JAD-180151. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Uzupełniający plik kodowania – zagnieżdżanie. R Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Zagnieżdżanie badania AD scores.csv Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Gniazdowanie jest ewolucyjnie ważnym zachowaniem gryzoni i zostało wykorzystane do oceny aktywności codziennego życia i ogólnego samopoczucia myszy². Łatwość przeprowadzenia testu, jego wiarygodność i trafność twarzy sprawiają, że zagnieżdżanie jest praktycznym uzupełnieniem wielu testów behawioralnych, takich jak kopanie, rytm okołodobowy i pielęgnacja. Jednak w miarę jak zagnieżdżanie staje się coraz powszechniej stosowane w laboratorium, zwiększa się liczba różnych kombinacji do przeprowadzania, ilościowego określania i interpretowania zagnieżdżania. W związku z tym potrzebne są dalsze badania w celu zbadania najlepszych metodologicznie i praktycznie uzasadnionych procedur zagnieżdżania, tak aby ważność i wiarygodność testu nie były poświęcane na rzecz kosztów, czasu testowania i innych procedur, które zmniejszają obciążenie testami.

Jakość budowy gniazda jest rzeczywiście wrażliwa na rodzaj dostarczanej ściółki, a także genotyp. Ogólnie rzecz biorąc, myszy typu dzikiego budowały znacznie lepsze gniazda w porównaniu z myszami APOE e4, niezależnie od materiału gniazdowego; jednak zarówno myszy typu dzikiego, jak i APOE e4 budują znacznie wyższej jakości gniazda z rozdrobnionego papieru w porównaniu z trzema innymi materiałami gniazdowymi. Inne badania dostarczają dowodów potwierdzających rozdrobniony papier: myszy zbudowały bardziej złożone gniazda z rozdrobnionych pasków papieru niż z prasowanych bawełnianych kwadratów, chusteczek higienicznych i osikowej ściółki^. Co więcej, gniazda zbudowane z rozdrobnionych pasków papieru zostały jakościowo ocenione jako bardziej "naturalistyczne" niż te wykonane z innych materiałów, które charakteryzują się kształtem samego gniazda i wysokością ścian wokół jamy gniazdowej w celu utworzenia kopuły ^6,33. W związku z tym wybór odpowiedniego materiału do tego testu ma kluczowe znaczenie dla lepszej obserwacji naturalnego zachowania w stosunkowo kontrolowanym środowisku, tj. w warunkach laboratoryjnych. Co ważniejsze, chociaż w tym protokole oceniano gniazdowanie raz w wieku 9 – 12 miesięcy, podkreślamy, że gniazdowanie powinno być prowadzone w kilku grupach wiekowych. Prostota tego protokołu pozwala na jego kilkukrotne przeprowadzenie, najlepiej przed wystąpieniem deficytów towarzyszących neurodegeneracji. Powtarzające się pomiary dają możliwość udokumentowania prawdopodobnej przyczynowej roli neurodegeneracji w zmniejszonej zdolności do gniazdowania.

Wykazano, że naturalne budowanie gniazd różni się między myszami o różnym tle tła³⁴, a zatem ogólna jakość i kształt gniazda mogą się różnić nie ze względu na interesujący nas transgen, ale ze względu na szczep tła. Na przykład przodkowie myszy C57BL/6 byli uważani za gniazdowników "dziurowych", podczas gdy przodkowie myszy BALB/C byli uważani za gniazdowników "powierzchniowych"³⁵. Myszy na tle C3H lub krzyżówki z tym szczepem, takie jak hybryda C3H/He-C57BL/6 z E4 użyta w Graybeal et ^al.9 , są również uważane za słabe gniazdowniki; W związku z tym naukowcy powinni zdecydowanie rozważyć użycie myszy kontrolnych na tym samym tle, co myszy transgeniczne, co ogólnie poprawiłoby bezpośrednią, sprawczą rolę transgenu (transgenów), a nie tła, w neurodegeneracji i późniejszych deficytach w zachowaniach związanych z budowaniem gniazd.

Niektóre eksperymenty często wykorzystują jednego punktora, aby jakościowo ocenić złożoność gniazda; Argumentujemy jednak, aby uwzględnić więcej strzelców, a co ważniejsze, strzelców ślepych na warunki eksperymentalne. Dzięki takiemu podejściu wykorzystaliśmy trzech niezależnych, ślepych punktatorów i korelację wewnątrzklasową, aby ocenić zgodność między punktatorami, którzy po podstawowym szkoleniu uzyskali wysokie korelacje wewnątrzklasowe, które wskazywały na wysoką wiarygodność między oceniającymi i silną zgodność dotyczącą jakości gniazda. Co więcej, dziesiątki gniazd składających się z rozdrobnionego papieru i kwadratów bawełny miały najwyższe korelacje wewnątrzklasowe, co wskazuje na większą zgodność i większą spójność wśród osób oceniających. Silna zgodność stanowi również uzasadnienie dla uśredniania wielu wyników razem, strategii przypadkowo wdrażanej w badaniach behawioralnych. Chociaż strategia ta wymaga większej liczby osobników i, przypuszczalnie, więcej czasu na ocenę gniazd, skutecznie zmniejsza stronniczość w ocenach jakościowych, takich jak zagnieżdżanie.

Materiały gniazdowe użyte w tym teście były w przybliżeniu równe pod względem ceny, z wyjątkiem miękkiej ściółki z kolb. Komercyjna ściółka do gniazdowania może być ekonomicznie opłacalna dla niektórych eksperymentatorów; jednak Martin i ^wsp.15 zauważają, że kwadraty bawełniane, w porównaniu z innymi materiałami, takimi jak papier marszczony, są jednym z najdroższych materiałów dostępnych do kupienia. Może to wynikać z łatwej dostępności, przechowywania i administracji, ale inni badacze mogą zdecydować się na podobnie ważne i niezawodne materiały, zwłaszcza gdy wyzwaniem jest duża liczba zwierząt w obiekcie, liczba prób gniazdowania, ograniczenia czasowe dotyczące punktacji gniazd i wysokie koszty klatek. W związku z tym rozdrobniony papier może być bardziej wykonalną i odpowiednią opcją. Ponadto zbieranie danych dla naszej metody może być przeprowadzone natychmiast (tj. ocena osobista), chociaż fotografie powinny być bardzo przemyślane w celu zarejestrowania, zapisania i ponownego ilościowego określenia gniazd, jeśli jest to pożądane w celu oceny wiarygodności między i wewnątrz oceniających w późniejszym czasie. Jak już wspomniano, zdecydowanie kładziemy nacisk na włączenie wielu osób punktujących do praktyk "test, ponowny test" w celu oceny pod kątem zgodności, ponieważ te metodologicznie poprawne procedury są często pomijane.

Podsumowując, uważamy, że metodologia i względy statystyczne (tj. korelacja wewnątrzklasowa) dla tego testu mogą być interesujące dla eksperymentów oceniających jakość życia, ogólne samopoczucie i czynności codziennego życia u myszy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ściółka z kolb kukurydzy	Envigo	7092	1/8 cala pościel do kwadratów bawełny, rozdrobnionego papieru i prób skręcania papieru
Kwadraty bawełniane	Envigo	Iso-Blox
Diamond Twists	Envigo	7979C.CS	Skręty papieru używane w protokole
Mysz - APOE4 e4	Jackson Laboratories	#012307	Homozygotyczna mysz APEO4 e4 wyhodowana z myszą
Mysz - C57BL/6J	Jackson Laboratories	#000664	Mysz typu dzikiego do sterowania
Mysz - J20	Jackson Laboratories	#006293	Mysz hemizygoczna wyhodowana z homozygotyczną myszą APOE e4 w celu wygenerowania krzyżówki
Rstudio	R Core Team	V1.1.463	Uruchom z wersją R 3.5.3 (2019-03-11) - "Wielka prawda". Uwaga: dodatkowe pakiety R są zawarte w dostarczonym kodzie i można je zainstalować z CRAN
Soft Cob	Envigo	7087C