Wykorzystanie elastycznych ogniw reakcyjnych złoto-tytan do symulacji zależnej od ciśnienia aktywności mikrobiologicznej w kontekście biogórnictwa podpowierzchniowego

Podsumowanie

Ten protokół opisuje eksperymenty mikrobiologiczne pod podwyższonym ciśnieniem w celu zbadania procesów biogórniczych in situ. W podejściu eksperymentalnym wykorzystuje się kołyszący się reaktor wysokociśnieniowy wyposażony w komórkę reakcyjną złoto-tytanową zawierającą kulturę mikrobiologiczną w kwaśnym, bogatym w żelazo środowisku.

Streszczenie

Badania laboratoryjne badające podpowierzchniowe procesy mikrobiologiczne, takie jak wypłukiwanie metalu w głębokich złożach rudy (biogórnictwo), dzielą wspólne i trudne przeszkody, w tym specjalne warunki środowiskowe, które muszą być odtworzone, np. wysokie ciśnienie i w niektórych przypadkach kwaśne roztwory. Pierwsza z nich wymaga eksperymentalnego zestawu odpowiedniego do zwiększania ciśnienia do 100 barów, podczas gdy druga wymaga zbiornika na płyn o wysokiej odporności chemicznej na korozję i niepożądane reakcje chemiczne ze ścianką zbiornika. Aby spełnić te warunki do zastosowania w dziedzinie biogórnictwa in situ, w badaniach wykorzystano specjalną elastyczną komórkę reakcyjną złoto-tytanową wewnątrz kołyszącego się reaktora wysokociśnieniowego. Opisany system umożliwił symulację biogórnictwa in situ poprzez mikrobiologiczną redukcję żelaza za pomocą siarki w beztlenowym, kontrolowanym ciśnieniu, wysoce obojętnym chemicznie środowisku eksperymentalnym. Elastyczna cela reakcyjna złoto-tytanowa może pomieścić do 100 ml roztworu próbki, który może być próbkowany w dowolnym momencie, podczas gdy system utrzymuje żądane ciśnienie. Eksperymenty mogą być przeprowadzane w skalach czasowych od godzin do miesięcy. Montaż systemu reaktora wysokociśnieniowego jest dość czasochłonny. Niemniej jednak, gdy złożone i trudne (mikrobiologiczne) procesy zachodzące głęboko pod powierzchnią ziemi w chemicznie agresywnych płynach muszą być badane w laboratorium, zalety tego systemu przeważają nad wadami. Wyniki wykazały, że nawet przy wysokim ciśnieniu konsorcjum mikrobiologiczne jest aktywne, ale w znacznie wolniejszym tempie metabolizmu.

Wprowadzenie

W ciągu ostatniej dekady wzrosły wysiłki mające na celu zminimalizowanie wpływu górnictwa na środowisko. Górnictwo odkrywkowe w celu wydobycia rud (np. rud siarczkowych bogatych w miedź) wpływa na otaczający krajobraz poprzez działalność wydobywczą oraz duże ilości pozostałe skał płonnych i pozostałości przetworzonej rudy po wydobyciu metali szlachetnych, takich jak miedź. Wydobycie miedzi bezpośrednio z rudy znajdującej się pod powierzchnią znacznie zmniejszyłoby ten wpływ. Technologia biogórnictwa in situ jest obiecującym kandydatem do tego procesu¹. W niniejszej publikacji opisano zastosowanie stymulowanej aktywności mikrobiologicznej do ekstrakcji metali szlachetnych z rudy do roztworu wodnego znajdującego się pod powierzchnią. W ten sposób roztwór bogaty w miedź można łatwo przepompować z powrotem na powierzchnię, na przykład w celu dalszego zagęszczenia metalu.

Aktywność mikroorganizmów acidofilnych ługujących rudę została zbadana w wielu laboratoriach dla różnorodnych parametrów2^,3,4,5,6. Jednak wpływ ciśnienia na aktywność mikrobiologiczną wynikający z różnicy między warunkami laboratoryjnymi na powierzchni otoczenia (blisko 1 bara) a pod powierzchnią na głębokości 1000 m w warunkach hydrostatycznych (~100 bar), nie jest dobrze udokumentowany. W związku z tym wpływ ciśnienia na mikrobiologiczną redukcję żelaza został zbadany za pomocą różnych metod eksperymentalnych⁷. Tutaj szczegółowo opisano najbardziej odpowiednią technikę.

Reaktory wysokociśnieniowe były szeroko stosowane do badania reakcji przy ciśnieniach i temperaturach występujących pod powierzchnią ziemi. Takie reaktory składają się ze zbiornika reaktora umieszczonego na dnie, który może zawierać próbkę płynu z kulturą drobnoustrojów. Umieszczona na górze zbiornika reaktora głowica reaktora oferuje różnorodny zestaw połączeń i interfejsów dla środków bezpieczeństwa i czujników monitorujących (np. temperaturę lub ciśnienie). Większość reaktorów wysokociśnieniowych jest wykonana ze stali nierdzewnej. Materiał ten oferuje wysoką sprężystość i dobre właściwości obróbcze, ale odporność na korozję powierzchni ze stali nierdzewnej nie jest odpowiednia dla każdego zastosowania. Na przykład, jeśli badane są silnie kwaśne lub silnie redukujące roztwory wodne, mogą zachodzić znaczące reakcje interesujących związków ze ścianą reaktora. Jednym ze sposobów, aby tego uniknąć, jest włożenie wkładki do zbiornika reaktora, na przykład wkładki wykonanej ze szkła borokrzemianowego⁷. Jest łatwy do czyszczenia i może być sterylizowany w autoklawie. Ponadto nie jest atakowany przez kwaśne lub redukujące roztwory wodne. Mimo że wkładka może pomóc w zapobieganiu sztucznym reakcjom roztworu lub drobnoustrojom w roztworze ze ścianą reaktora ze stali nierdzewnej, pozostaje kilka problemów. Po pierwsze, jeśli powstanie gaz, taki jak siarkowodór wytwarzany przez bakterie redukujące siarczany, gaz ten może reagować z odsłoniętą powierzchnią głowicy reaktora znajdującą się nad wkładką. Kolejną wadą jest to, że nie jest możliwe pobranie próbki z reaktora przy zachowaniu ciśnienia.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano wyspecjalizowane elastyczne komórki reakcyjne wewnątrz reaktorów wysokiego ciśnienia do różnych zastosowań. Elastyczna komórka z politetrafluoroetylenu (PTFE) ⁸ została zaprojektowana do badań rozpuszczalności soli w solankach o wysokim stopniu zasolenia. Jednak ograniczeniem tego systemu jest to, że niektóre gazy mogą łatwo przenikać do PTFE. Ponadto materiał ten nadal ma stosunkowo niską stabilność temperaturową. W związku z tym system został ulepszony poprzez zaprojektowanie elastycznego złotego worka z tytanową głowicą⁹, który ma być umieszczony wewnątrz reaktora wysokociśnieniowego ze stali nierdzewnej. Powierzchnia złota jest odporna na korozję w stosunku do kwaśnych lub redukujących roztworów i gazów. Powierzchnia tytanu jest również wysoce obojętna po dokładnej pasywacji w celu utworzenia ciągłej warstwy dwutlenku tytanu. Podczas pobierania próbek z tej komórki reakcyjnej przez podłączoną tytanową probówkę do pobierania próbek, złoty worek kurczy się. Ciśnienie wewnętrzne systemu jest utrzymywane poprzez pompowanie tej samej objętości wody, która jest pobierana przez pobieranie próbek, do reaktora wysokociśnieniowego ze stali nierdzewnej, w którym znajduje się komórka reakcyjna. Próbka wewnątrz komory reakcyjnej jest utrzymywana w ruchu poprzez kołysanie lub przechylanie reaktora wysokociśnieniowego o ponad 90° podczas eksperymentu.

Komórka reakcyjna składa się z części przedstawionych na rysunku 1: złotego worka, tytanowego kołnierza, tytanowej głowicy, podkładki ze stali nierdzewnej, tytanowego pierścienia kompresyjnej, tytanowej rurki do pobierania próbek z nierdzewnymi dławikami i kołnierzami dla wysokociśnieniowych stożków i gwintowanych połączeń po obu stronach oraz tytanowego zaworu. Złoty worek to cylindryczne złote (Au 99,99) ogniwo o grubości ścianki 0,2 mm, średnicy zewnętrznej 48 mm i długości 120 mm.

Wszystkie części tytanu są wykonane na zamówienie przez warsztat z prętów tytanowych klasy 2. Wymiary kołnierza, łba, podkładki i pierścienia zaciskowej są widoczne na rysunku 2. Tytanowa rurka do pobierania próbek to kapilara z tytanu o średnicy zewnętrznej 6,25 mm i grubości ścianki 1,8 mm, co daje średnicę wewnętrzną 2,65 mm. Jest on mocowany w tytanowej głowicy i tytanowym zaworze za pomocą wysokociśnieniowych połączeń stożkowych i gwintowanych, zapewniających uszczelnienie powierzchni tytanowych względem tytanu. Wysokociśnieniowy zawór tytanowy jest wyposażony w trzpień o powolnym otwieraniu, który umożliwia bardzo kontrolowane otwieranie lub pobieranie próbek nawet przy wysokim ciśnieniu. System ten był używany w wielu badaniach^10,11,12.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki i inokulacja kultury drobnoustrojów

1. Przygotuj podstawową pożywkę solną dla autotroficznych prokariontów zgodnie z opublikowanymi technikami¹³. Rozpuść i wymieszaj poniższe substancje chemiczne w wodzie destylowanej (mg/L): Na₂SO₄·10H₂O (150) (NH₄)₂SO₄ (450), KCl (50), MgSO₄·7H₂O (500), KH₂PO₄ (50) i Ca(NO₃)₂·4H₂O (7).
2. Dodać 1 ml/l 1000x stężonego roztworu pierwiastków śladowych zawierającego (g/L): ZnSO₄·7H₂O (10), CuSO₄·5H₂O (1), MnSO₄·H₂O (0,76), CoSO₄·7H₂O (1), CrK(SO₄)₂·12H₂O (0,4), H₃BO₃ (0,6), NaMoO₄·2H₂O (0,5), NiSO₄·6H₂O (1), Na₂SeO₄ (0,51), Na₂WO₄·2H₂O (0,1) i NaVO₃ (0,1). Dostosuj pH do 1,8, dodając 5 M kwasu siarkowego.
3. Wysterylizuj pożywkę w autoklawie w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 1,2 bara przez 20 minut, a następnie wysterylizuj roztwór żelaza przez filtrację przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,22 μm.
4. Przenieść 50 ml wysterylizowanej pożywki soli podstawowej do butelki z surowicą i dodać roztwór żelaza i siarkę elementarną do końcowego stężenia odpowiednio 50 mM i 10 g/l.
5. Zaszczep pożywkę mieszaną kulturą złożoną z kilku mezoacidofilnych prokariontów utleniających żelazo¹⁴.
6. Zakręć butelkę serum wysterylizowanymi korkami z kauczuku butylowego i zamknij aluminiowymi zaciskami.
7. Energicznie bąbelkować pożywkę hodowlaną_N2, aby usunąć rozpuszczony tlen przez 25 minut. Użyj dwóch igieł, umieść jedną głębiej w główce butelki, drugą blisko nakrętki.
8. Wstrzyknąć CO₂ w celu uzyskania atmosfery 90% N₂ i 10 % CO₂ w przestrzeni nad butelką z surowicą. Inkubować kulturę bez mieszania w temperaturze 30 °C w ciemności.

2. Przygotowanie komory reakcyjnej złoto-tytanowej i reaktora wysokociśnieniowego

1. Oczyść komórkę reakcyjną złoto-tytan.
   1. Zdemontuj komórkę reakcyjną na poszczególne części, aby uniknąć kontaktu kwasu z częściami ze stali nierdzewnej lub wystawienia zmontowanych części o różnych właściwościach rozszerzalności cieplnej na działanie ciepła.
   2. Oczyść powierzchnie, które będą miały kontakt z próbką podczas eksperymentu (tj. złotą torbę, tytanową głowicę, tytanową rurkę do pobierania próbek i tytanowy zawór).
      1. Umieść złotą torbę i tytanową główkę w szklanej zlewce.
      2. Dodaj tyle 10% HCl, aby pokryć wszystkie części.
      3. Podgrzej kwas na płycie grzewczej do temperatury 50 °C przez 3 godziny, mieszając go.
      4. Wyjmij części pęsetą PTFE z roztworu kwasu i spłucz je wodą dejonizowaną.
      5. Dokładnie spłucz wewnętrzną powierzchnię złotej torebki i tytanową głowicę 65% HNO₃, a następnie wodą dejonizowaną.
      6. Przepłukać wewnętrzną powierzchnię tytanowej rurki do pobierania próbek i tytanowego zaworu 10% HCl, a następnie wodą dejonizowaną, 65% HNO₃, a następnie ponownie wodą dejonizowaną.
      7. Oczyść wszystkie części z zanieczyszczeń organicznych, spłukując je acetonem.
      8. Suszyć wszystkie części w piekarniku w temperaturze 105 °C przez co najmniej 1 godzinę.
   3. Podgrzać powierzchnie złotej torby, tytanowej głowicy i tytanowej rurki do pobierania próbek, wystawiając je na działanie temperatury 450 °C przez 4 godziny w piecu muflowym w atmosferze powietrza.
      UWAGA: Ta procedura sterylizuje powierzchnie i powoduje powstanie pasywującej warstwy dwutlenku tytanu na wszystkich powierzchniach tytanowych. Części tytanowe po obróbce cieplnej powinny mieć kolor od żółtego do niebieskiego.
   4. Wyżarzaj złote ogniwo, aby zwiększyć elastyczność złota, resetując małe domeny krystalizacji poprzez zastosowanie ciepła za pomocą palnika propanowego. Podgrzej powierzchnię złota dookoła, aby zmniejszyć załamania w złocie, które mogły powstać podczas ostatniego kurczenia się objętości złotej torby w eksperymencie. Upewnij się, że nie podgrzewasz złota zbyt mocno w jednym miejscu, aby uniknąć jego stopienia.
      UWAGA: Czerwona poświata złotej powierzchni wskazuje na wystarczające nagrzanie.
   5. Zamontuj złotą torbę w tytanowym kołnierzu, a tytanową rurkę do pobierania próbek w tytanowej głowicy, używając momentu obrotowego 10 Nm dla dławnic.
2. Sprawdź reaktor wysokociśnieniowy.
   1. Sprawdź wzrokowo reaktor pod kątem ewentualnych uszkodzeń, korozji i luźnych części.
      UWAGA: Szczególną uwagę należy zwrócić na uszczelkę i szczelinę, w której odbywa się uszczelnienie. Jeśli uszczelka grafitowa była wcześniej używana do uszczelnienia reaktora, jej resztki mogą nadal znajdować się w szczelinie i powinny zostać usunięte plastikową szpilką przed następnym eksperymentem.
   2. Nałóż pastę siarczku miedzi na oporowe w głowicy reaktora wysokociśnieniowego. Upewnij się, że smar jest rozprowadzony na całym gwincie.
   3. Sprawdź przykręcaną uszczelkę zaciskową pod kątem długości pozostałego uszczelnienia grafitowego.

3. Napełnianie i montaż komory reakcyjnej złoto-tytanowej w warunkach beztlenowych

1. Załaduj schowek na rękawiczki.
   1. Przygotować pożywkę hodowlaną w butelkach z surowicą zgodnie z sekcją 1.
   2. Owiń części komórki reakcyjnej goldtina, które później będą miały kontakt z próbką, w folię aluminiową, aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenie.
   3. Otwórz i odblokuj przedsionek schowka podręcznego, załaduj cały przychodzący materiał na ruchomą tacę, a następnie zamknij i zablokuj przednią pokrywę.
   4. Ewakuuj przedsionek 3x i zalej go azotem o wysokiej czystości.
   5. Załóż parę rękawiczek i zbliż się jak najbliżej wewnętrznej osłony. Odblokuj i otwórz pokrywę wewnętrzną, aby wyjąć materiał przychodzący z ruchomej tacy.
   6. Zamknij i zablokuj pokrywę wewnętrzną.
2. Napełnij złotą komórkę.
   1. Rozpakuj czystą złotą torbę i postaw ją na przykład ze szklaną zlewką. Otwórz butelkę serum zawierającą 100 ml kultury bakteryjnej i siarki elementarnej.
   2. Delikatnie wstrząśnij butelką serum i przenieś kulturę bakteryjną do złotej torebki.
3. Zmontować komórkę reakcyjną.
   1. Włóż tytanową głowicę z dołączoną tytanową rurką do pobierania próbek do tytanowego kołnierza otaczającego górną krawędź złotej torby.
      UWAGA: Upewnij się, że powierzchnia uszczelniająca stożkowej dolnej części tytanowej głowicy pasuje płynnie, obracając ją o 90° do przodu iz powrotem.
   2. Nasunąć podkładkę i pierścień zaciskowej na tytanową rurkę do pobierania próbek na tytanową głowicę.
      UWAGA: Obróć pierścień zaciskowej w tytanowym pierścieniu o 30°, aby wyrównać kołnierze tytanowego pierścienia i pierścienia oporowej.
   3. Dokręć sześć imbusowych w tym samym stopniu, aby zapewnić równomierny rozkład nacisku tytanowej główki na górnej krawędzi złotego worka w tytanowym kołnierzu (tj. powierzchni uszczelniającej komórki reakcyjnej).
      UWAGA: Dokręć imbusowe w pierścieniu zaciskowej do momentu ręcznego dokręcenia, tak aby moment obrotowy przeciwległych został najpierw zwiększony (skrzyżowanie), zanim będziesz kontynuować zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
4. Zamontuj ponownie zawór do pobierania próbek w górnej części tytanowej rurki. Dokręć połączenie ręcznie i upewnij się, że zawór jest zamknięty.
5. Wyjmij wszystkie części ze schowka na rękawiczki.

4. Montaż reaktora wysokociśnieniowego z komórką reakcyjną

1. Zamontuj komórkę reakcyjną w głowicy reaktora.
   UWAGA: Instalacja reaktora wysokociśnieniowego wiąże się z bardzo krótkim narażeniem otwartego końca rurki do pobierania próbek na otaczającą atmosferę, ponieważ zawór do pobierania próbek musi zostać usunięty, aby przeprowadzić rurkę przez uszczelkę śrubową w głowicy reaktora. Do instalacji głowica reaktora powinna być już umieszczona w imadle stołowym. Kąt 45° ułatwia obsługę. Złączka z uszczelnieniem zaciskowym (umieszczona w centralnym położeniu zespołu bloku przyrządów pomiarowych głowicy reaktora), która utrzymuje rurkę do pobierania próbek na miejscu, musi być otwarta.
   1. Zdemontować tytanowy zawór do pobierania próbek, i kołnierz na górze rurki do pobierania próbek.
   2. Przeprowadzić probówkę z zamocowaną komórką reakcyjną przez centralny otwór w głowicy reaktora, aż około 5 cm rurki przejdzie przez nią. Nasuń dużą na rurkę i zamocuj mały kołnierz.
      UWAGA: Teraz zespół komory reakcyjnej nie może przesunąć się z powrotem przez głowicę reaktora i obie ręce są wolne, aby ponownie zainstalować zawór do pobierania próbek.
   3. Ponownie zamocuj tytanowy zawór.
   4. Dokręcić złączkę uszczelki zaciskowej.
   5. Zdejmij głowicę reaktora z imadła stołowego, aby zainstalować ją na zbiorniku reaktora.
2. Przygotować się do uszczelnienia reaktora.
   1. Umieść uszczelnienie grafitowe na szczelinie zbiornika reaktora.
   2. Ostrożnie umieścić głowicę reaktora z dołączoną komórką reakcyjną na zbiorniku reaktora.
      UWAGA: Głowicę reaktora, w tym termoparę, należy ostrożnie umieścić na zbiorniku reaktora, aby nie uszkodzić złotej torby lub termopary.
3. Napełnij zbiornik reaktora mieszaniną wody dejonizowanej i wody z kranu (w przybliżeniu w stosunku 1:1).
4. Uszczelnij reaktor.
   1. Sprawdź kołnierz, aby upewnić się, że dolne końce zaciskowych nie wystają z gwintów. W przeciwnym razie zbiornik ciśnieniowy nie zostanie prawidłowo zainstalowany.
   2. Podnieś kołnierz i umieść go wokół wystających krawędzi interfejsu zbiornika czołowego reaktora. Delikatne przesuwanie na nim obroży zaowocuje odpowiednim dopasowaniem. Zamknij zatrzaski przytrzymujące obrożę na miejscu.
   3. Dokręć kompresyjne zgodnie z wzorem krzyżowym i zwiększaj moment obrotowy w umiarkowanych krokach, aż do osiągnięcia końcowej wartości zalecanej przez producenta.
      UWAGA: Różne systemy reaktorów wysokociśnieniowych mogą mieć różne wartości momentu obrotowego.
   4. Na koniec dokręć zaciskowe w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.
5. Zainstaluj reaktor wysokociśnieniowy w urządzeniu kołyszącym.
   UWAGA: Instalacja reaktora wysokociśnieniowego w urządzeniu kołyszącym jest opisana dla modelu wykonanego na zamówienie wyprodukowanego w Federalnym Instytucie Nauk o Ziemi i Zasobów Naturalnych w Hanowerze w Niemczech. Dlatego opisana instalacja jest ogólną wskazówką dla urządzeń o porównywalnej konstrukcji.
   1. Ostrożnie zamontuj reaktor w urządzeniu kołyszącym.
      UWAGA: Najlepiej jest trzymać reaktor wysokociśnieniowy za części montażowe bloku przyrządów pomiarowych (np. manometru lub rurki do pobierania próbek) podczas opuszczania go do urządzenia kołyszącego.
   2. Zamocuj reaktor za pomocą dwóch zacisków na parze długich.
   3. Umieść podkładki na każdej i dokręć zaciski za pomocą nakrętek śrubowych.
   4. Podłączyć jednostki sterujące termopary, przetwornika ciśnienia i elementu grzejnego.
      UWAGA: Ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie przewody mają wystarczającą długość do ruchu kołysania i zapobiegają kontaktowi z nagrzanymi powierzchniami.
   5. Nasuń element grzejny na zbiornik reaktora i dokręć jego.
      UWAGA: Woda do zwiększania ciśnienia w systemie jest pobierana ze zbiornika z pompą wysokociśnieniową. Jest przenoszony przez kapilary ze stali nierdzewnej do reaktora wysokociśnieniowego.
      UWAGA: Kołysanie reaktora wysokociśnieniowego gwarantuje dokładne wymieszanie zawartości komórki reakcyjnej (tj. gazu, płynu i wszystkich znajdujących się w nim faz stałych). Niska prędkość kołysania jest ważna, aby zapobiec uszkodzeniu worka ze złotem przez szybko poruszające się ciała stałe lub deformację spowodowaną wpływem grawitacji na elastyczne złoto w podwyższonych temperaturach. System bujania może obracać się o blisko 180°.

5. Rozpoczęcie eksperymentu

1. Sprawdź, czy limity temperatury i ciśnienia w oprogramowaniu monitorującym są ustawione na żądane wartości.
   UWAGA: W tym eksperymencie ustawiono je na 70 °C i 25 MPa.
2. Wykonaj kontrolę szczelności.
   1. Podłącz rurę ciśnieniową, kapilarnę ze stali nierdzewnej, do głowicy reaktora.
   2. Podnoś ciśnienie do ciśnienia docelowego w różnych odstępach czasu, stale sprawdzając, czy nie ma wycieków.
   3. Utrzymuj ciśnienie na stałym poziomie, aż natężenie przepływu pompy będzie bliskie zeru.
      UWAGA: Należy pamiętać, że ściśliwe, rozpuszczone powietrze w wodzie jest widoczne przez długi czas w subtelnych odczytach przepływu.
3. Rozpocznij ogrzewanie po pomyślnym sprawdzeniu szczelności.
   1. Rozpocznij rejestrowanie pomp ciśnieniowych.
   2. Dostosuj nastawę grzania do żądanej wartości i uruchom ogrzewanie za pomocą oprogramowania.
   3. Regularnie sprawdzaj wszystkie parametry i stan systemu.
   4. Odkręć rurę ciśnieniową po osiągnięciu temperatury docelowej.
   5. Uruchom urządzenie kołyszące.

6. Pobieranie próbek z reaktora wysokociśnieniowego w trybie operacyjnym

1. Aby pobrać próbkę, należy podłączyć strzykawkę o pojemności 5 ml do złącza Luer Lock zaworu do pobierania próbek w górnej części reaktora wysokociśnieniowego.
2. Ostrożnie otworzyć zawór i pozwolić, aby próbka płynu wepchnęła się do strzykawki pod wpływem ciśnienia wewnątrz reaktora wysokociśnieniowego. Zamknij zawór, gdy objętość próbki osiągnie 1 ml. Odłączyć strzykawkę.
3. Natychmiast przenieść próbki w strzykawce do probówki o pojemności 2 ml w dygestoriach w celu przetworzenia.

7 . Analiza próbki płynu

UWAGA: Tylko kroki dla mniej popularnego testu fotometrycznego ferrozyny (tj. sekcja 7.1) są tutaj szczegółowo opisane i są wymienione w filmie, ponieważ inne kroki są standardowymi procedurami operacyjnymi w mikrobiologii.

1. Użyj testu ferrozynowego, aby fotometrycznie określić stężenie rozpuszczonego żelaza żelazawego (Fe²⁺_(aq)) i całkowitego żelaza (Fe_tot)¹⁵.
   1. Przygotować serię roztworów wzorcowych żelaza żelaznego, rozpuszczając znane ilości FeSO₄·7_H2Ow wodzie.
   2. Zmieszać 50 μl tych standardowych poziomów z 1 ml 1 M roztworu ferrozyny.
      UWAGA: Reakcja ferrozyny z rozpuszczonym żelazem żelazawym tworzy fioletowy kompleks. Intensywność koloru koreluje ze stężeniem żelaza żelaznego.
   3. Ustalić krzywą kalibracyjną między stężeniem żelaza żelazawego a absorbancją kompleksu żelazo-ferrozyna.
   4. Obliczyć stężenie żelaza żelazawego w próbce z dwóch równoległych pomiarów zgodnie z ustaloną krzywą wzorcową.
2. Analizuj wartość pH i potencjał utleniania/redukcji (ORP) za pomocą cyfrowych mierników pH/redoks z półmikroelektrodami pH i elektrodą chlorku srebra.
3. Policz komórki planktonowe bezpośrednio za pomocą mikroskopu świetlnego z komorą Thoma.
4. Zbadaj morfologię komórki za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).
   1. Filtruj komórki planktonowe hodowane w różnych warunkach przez filtr o wielkości porów 0,1-0,2 μm.
   2. Próbki odwodnić acetonem i przechowywać je przez noc w temperaturze 4 °C w 90% acetonie.
   3. Wysuszyć próbki w krytycznym punkcie suszenia i pokryć je grafitem lub złotem.
   4. Zbadaj próbki za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z emisją polową (FE-SEM) przy napięciu 10 kV.

Wyniki

Wyniki eksperymentu z reaktorem wysokociśnieniowym ze specjalną komórką reakcyjną złoto-tytan pokazują, że mieszana kultura mikroorganizmów acidofilów utleniła siarkę i zredukowała żelazo do żelaza (Rysunek 3).

Zarówno przy ciśnieniu 1 bar, jak i 100 bar, kultury miały fazę opóźnienia podczas hodowli w komorze reakcyjnej złoto-tytan. Po tym okresie nastąpił gwałtowny wzrost stężenia żelaza żelazawego z około 9 mM do 31 mM w kulturze uprawianej w temperaturze 1 bara. W czasie inkubacji wynoszącym 22 dni w testach wykryto ~31 mM i 13 mM żelaza żelazowego odpowiednio przy 1 barze i 100 barze. To wyraźnie pokazuje, że komórki drobnoustrojów były aktywne przy ciśnieniu 100 barów, ale ich aktywność redukująca żelazo była znacznie niższa przy podwyższonym ciśnieniu. Abiotyczne eksperymenty kontrolne przeprowadzone w probówkach Hungate i butelkach z surowicą nie wykazały redukcji żelaza żelazowego przy 1 barze i 100 barach.

Obrazy ze skaningowej mikroskopii elektronowej (Rysunek 4) pokazują komórki w kształcie pręcików wyhodowane w eksperymentach pod niskim i wysokim ciśnieniem. Nie zaobserwowano istotnych zmian w morfologii komórek przy 1 barze w porównaniu do 100 barów. Jednak wzrost komórek był oczywiście zahamowany przez podwyższone ciśnienie, ponieważ liczba komórek wynosiła 1,3 x 10⁸ komórek/ml przy 1 barze w porównaniu do 4,5 x 10⁷ komórek/ml przy 100 barach⁷. Dane te są porównywalne z testami wykonanymi w probówkach Hungate⁷. W związku z tym elastyczna komórka reakcyjna złoto-tytanowa sama w sobie nie miała wpływu na wzrost komórek i nadawała się do testów wzrostu drobnoustrojów.

Wyniki pokazują, że mikroorganizmy ługujące biologicznie są aktywne nawet przy wysokim ciśnieniu 100 barów, co jest bardzo istotne dla biogórnictwa in situ, ponieważ takie warunki występują w głębokich złożach rudy na głębokości poniżej 1,000 m⁷.

Rysunek 1: Przegląd części komory reakcyjnej. Od dołu do góry: złota torba, tytanowy kołnierz, tytanowa głowica, podkładka, tytanowy pierścień zaciskowej, tytanowa rurka do pobierania próbek z dławikami ze stali nierdzewnej i kołnierzami do wysokociśnieniowych połączeń stożkowych i gwintowanych po obu stronach oraz tytanowy zawór z adapterem do podłączenia strzykawki Luer Lock. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Rysunki wymiarowe części tytanowych wykonanych z prętów tytanu klasy 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zmiany stężeń żelaza żelazawego w komorze reakcyjnej złoto-tytan z kulturą utleniającą żelazo żelazne. Komórki hodowano beztlenowo w temperaturze 30 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Morfologia kultury utleniającej żelazo uprawianej pod ciśnieniem 1 bar i 100 bar. Komórki hodowano beztlenowo w temperaturze 30 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawiona metoda wysokociśnieniowych eksperymentów reakcji mikrobiologicznych w roztworach kwaśnych była potężnym narzędziem do symulacji głębokich podpowierzchniowych procesów geomikrobiologicznych w środowisku laboratoryjnym.

W grę wchodzi wiele etapów pracy ręcznej, z których niektóre wymagają szczególnej uwagi. Ogólnie rzecz biorąc, nie wolno używać nadmiernej siły podczas montażu poszczególnych części elastycznego ogniwa złoto-tytanowego i głowicy reaktora (sekcje 3 i 4). Zignorowanie zaleceń producenta (np. dotyczących maksymalnego ciśnienia, temperatury, momentu obrotowego) może spowodować wyciek i/lub awarię materiału.

Czyszczenie części ze złota i tytanu (sekcja 2.2) jest niezbędnym etapem pracy, nie tylko w tym eksperymencie, ale przede wszystkim w eksperymentach obejmujących reakcje (nie)organiczne. Pozostałości po poprzednich eksperymentach w złotej kuwetce mogą powodować niepożądane reakcje, a tym samym zniekształcanie wyników. Gdy zmontowane ogniwo złoto-tytanowe jest zainstalowane w głowicy reaktora, najlepiej jest pracować szybko i precyzyjnie, ponieważ w tym czasie do złotego ogniwa mogą dostać się niewielkie ilości tlenu. Zamknięcie zaworu do pobierania próbek przed wyjściem ze schowka jest dobrym pierwszym środkiem mającym na celu zminimalizowanie wymiany między atmosferą otoczenia a wnętrzem złotej komórki.

Po umieszczeniu reaktora w urządzeniu kołyszącym ważne jest, aby ustawić prędkość ruchu kołysania na ~170°/min. Jeśli reaktor wysokociśnieniowy porusza się zbyt szybko, może dojść do pęknięcia złotej komórki z powodu efektów grawitacyjnych lub ostrych krawędzi osadów lub próbek skał podczas użytkowania.

Metoda ta może być stosowana w dodatkowych dziedzinach badawczych. Elastyczna komórka reakcyjna złoto-tytanowa może być wykorzystywana do różnorodnych badań naukowych⁹ Badanie reakcji pod podwyższonym ciśnieniem i temperaturą oraz w wysoce korozyjnych cieczach lub gazach.

Mikroorganizmy znajdujące się głęboko pod powierzchnią w temperaturach powyżej 70 °C w obecności powierzchni mineralnych mogą stymulować produkcję wodoru cząsteczkowego lub kwasów organicznych, takich jak octan, nawet pod podwyższonym ciśnieniem¹⁶. Produkty te, jak i inne związki, mogą indukować podwyższoną aktywność mikrobiologiczną podczas procesów bioługowania in situ, oprócz związków siarki badanych w tym badaniu.

Zastosowania obejmują oznaczanie rozpuszczalności gazów i jonów w cieczach wodnych, reakcje geochemiczne w warunkach systemów kominów hydrotermalnych¹⁷, oznaczanie ilościowe frakcjonowania izotopów¹⁸, reakcje geochemiczne podczas sekwestracji CO_{2 19}, procesy abiotyczne podczas tworzenia się ropy i gazu w skałach źródłowych²⁰ oraz reakcje mikrobiologiczne przy podwyższonym ciśnieniu pod powierzchnią²¹, jak w niniejszym badaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aceton	Merck	100013
CaN2O6	Fluka	31218
Złączki z uszczelnieniem zaciskowym Conax	Technologies	PG2-250-B-G	można dobrać w zależności od temperatur w eksperymencie
Pasta miedziana	Caramba	691301
Pasta miedziana	CRC	41520
CoSO4x7H2O	Sigma	10026-24-1
CrKO8S2x12H2O	Roth	3535.3
CuSO4x5H2O	Riedel de Haen	31293
Kuwety jednorazowe	Sigma	z330388
Absolutny etanol	Roth	9065.3
FE-SEM	JEOL	nr modelu JSM-6330F
Ferrozine	Aldrich	180017
Fe2(SO4)3x7H2O	Alfa Aesar	33316
FeSO4x7H2O	Merck	103965
Gold cell	Hereaus GmbH		wyprodukowany zgodnie z wymiary dostarczone przez klienta
reaktor wysokociśnieniowy	PARR Instruments	model nr 4650	Reaktory serii innych dostawców
Wysokociśnieniowa pompa strzykawkowa	Teledyne ISCO	DM-100
HCl	Roth	6331.3
HNO3	Fluka	7006
H3BO3	Sigma	B6768
KCl	Sigma	P9541
KH2PO4	Merck	104873
L-(+)-Askorbinowy/Witamina C	Applichem	A1052
Mikroskop świetlny	Leica DM3000
MgSO4x7H2O	Merck	105886
(NH4)2SO4	Sigma	A4418
NaMoO4x2H2O	Sigma	331058
NaO3Sex5H2O	Sigma	00163
NaO3V	Sigma	590088
Na2SO4	Merck	106649
Na2WO4x2H2O	Sigma	72069
NiSO4x6H2O	Sigma	31483
Omnifix Luer	BRAUN	4616057V
pH-metr	Mettler Toledo
Miernik potencjału redoks	Przenośny miernik		WTW
Probówki Safe-Lock, 2 ml	Eppendorf	0030120094
Butelka surowicy	Sigma	33110-U
Spektrofotometr	Thermo Scientific	model nr. GENESYS 10S
Sterican Igła podskórna	BRAUN	4657519
Korki	Sigma	27234
Siarka w proszku	Roth	9304
Thoma Chamber	Hecht-Assistent
Tytanowe części komory reakcyjnej	Titan-Halbzeug GmbH	121-238	wyprodukowane przez warsztat BGR zgodnie z wymiarami dostarczonymi z prętów tytanowych klasy 2 firmy Titan-Halbzeug GmbH
Zawór tytanowy	Nova Swiss Technologies	ND-5002
Filtry membranowe Whatman nylon	Sigma	WHA7402004
ZnSO4x7H2O	Sigma	Z4750