Artykuł metodologiczny

Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/60145

⸱

6 sierpnia 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Nebraska, 2Nebraska Redox Biology Center, University of Nebraska, 3Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication, University of Nebraska, 4Fred & Pamela Buffett Cancer Center, University of Nebraska Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół prostej izolacji określonych grup żywych komórek neuronalnych wyrażających zielone białko fluorescencyjne z transgenicznych linii Caenorhabditis elegans. Metoda ta umożliwia różnorodne badania ex vivo skoncentrowane na konkretnych neuronach i ma zdolność izolowania komórek do dalszej krótkoterminowej hodowli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas procesu starzenia, wiele komórek akumuluje wysoki poziom uszkodzeń, co prowadzi do dysfunkcji komórek, która leży u podstaw wielu geriatrycznych i patologicznych schorzeń. Neurony postmitotyczne reprezentują główny typ komórek, na który wpływa starzenie się. Chociaż istnieje wiele ssaczych modeli starzenia się neuronów, ich ustalenie jest trudne i kosztowne. Glista Caenorhabditis elegans jest potężnym modelem do badania starzenia się neuronów, ponieważ zwierzęta te mają krótką długość życia, dostępny solidny zestaw narzędzi genetycznych i dobrze skatalogowany układ nerwowy. Przedstawiona w artykule metoda pozwala na bezproblemową izolację określonych komórek w oparciu o ekspresję transgenicznego białka zielonej fluorescencji (GFP). Transgeniczne linie zwierzęce wykazujące ekspresję GFP pod odrębnymi, specyficznymi dla typu komórek promotorami są trawione w celu usunięcia zewnętrznego naskórka i delikatnie mechanicznie przerywane w celu wytworzenia gnojowicy zawierającej różne typy komórek. Interesujące komórki są następnie oddzielane od komórek innych niż docelowe poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z anty-GFP. Wyizolowane komórki mogą być następnie hodowane przez ograniczony czas lub natychmiast wykorzystane do specyficznych dla komórek analiz ex vivo, takich jak analiza transkrypcyjna metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. W związku z tym protokół ten pozwala na szybką i solidną analizę odpowiedzi specyficznych dla komórek w różnych populacjach neuronów u C. elegans.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat, modelowy organizm metazoanowy Caenorhabditis elegans był ogromnym atutem w badaniach nad neuronami, obwodami neuronalnymi i ich rolą w reakcjach fizjologicznych i behawioralnych oraz chorobach neurodegeneracyjnych związanych ze starzeniem się. Unikalną cechą C. elegans jest to, że zwierzęta są przezroczyste, co pozwala na mapowanie linii wszystkich dorosłych komórek somatycznych1. C. elegans posiada również łatwą do opanowania ilość neuronów, co prowadzi do dobrego zrozumienia morfologii i połączeń układu nerwowego2. Niezmienna linia komórkowa, krótka długość życia i obfitość wysokoprzepustowych narzędzi genetycznych dostępnych dla C. elegans sprawiają, że jest to idealny organizm modelowy do badania starzenia się w różnych populacjach neuronów.

Starzenie się neuronów i zaburzenia neurodegeneracyjne są złożone, a każde zaburzenie ma unikalne patologiczne sygnatury z nim związane. Jednak w przypadku wielu z tych zaburzeń, takich jak choroba Parkinsona i choroba Alzheimera, wspólną cechą jest postępujące obciążenie nieprawidłowo sfałdowanych białek3,4,5. W obu tych chorobach białka nieprawidłowo fałdują się i agregują w komórce, powodując toksyczność, co ostatecznie prowadzi do śmierci komórki4,5. Dla prawidłowego starzenia się neuronów ważna jest homeostaza mitochondriów, a dokładniej homeostaza białek, ponieważ zaburzenia i dyshomeostaza mogą prowadzić do neurodegeneracji6,7,8. Komórki są wyposażone w różne mechanizmy utrzymania homeostazy białek, jednym z nich jest odpowiedź na niesfałdowane białko (UPR) - klasyczny szlak, w którym sygnały z retikulum endoplazmatycznego (ER) aktywują wewnątrzkomórkowe kaskady sygnałów, prowadząc do odpowiedzi transkrypcyjnej9. Podobnie jak w przypadkuUPR ER, metazoany wykazują podobną reakcję na utratę homeostazy białek mitochondrialnych, tzw. mitochondrialny UPR (UPRmt)7,8. C. elegans wydaje się być najbardziej podstawowym organizmem, który ma potwierdzoną i dobrze zdefiniowaną ścieżkęUPR mt7.

Funkcja/dysfunkcja określonych populacji neuronów w większej sieci może być trudna do oceny ze względu na ich wewnętrzną łączność i złożoność3. Jednak często istnieje potrzeba zbadania odrębnych populacji neuronów ze względu na choroby specyficzne dla typu komórki ze złożonymi patologiami, takimi jak te związane z upośledzoną homeostazą białek komórkowych. U C. elegans określone populacje neuronów mogą być genetycznie modyfikowane, co pozwala na łatwą obserwację in vivo. Układ nerwowy C. elegans składa się głównie z neuronów, z niewielkim odsetkiem komórek glejowych. U dorosłych robaków hermafrodytycznych znajdują się około 302 neurony, podzielone na ponad 100 różnych klas2,10. Neurony, takie jak neurony cholinergiczne, dominują w połączeniach nerwowo-mięśniowych, podczas gdy neurony dopaminergiczne są przede wszystkim zaangażowane w sensation10,11. Ponieważ zarówno aktywność motoryczna, jak i zdolności sensoryczne zmniejszają się wraz z wiekiem, ważne jest, aby szczegółowo zapoznać się z mechanistycznymi spostrzeżeniami na temat defektów w tych poszczególnych neuronach11,12. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na prostą i solidną metodę izolowania nienaruszonych komórek będących przedmiotem zainteresowania do kolejnych badań ex vivo.

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, skuteczną metodę szybkiej izolacji określonych komórek neuronalnych wyrażających zielone białko fluorescencyjne (GFP) od C. elegans. Ta metoda izolacji może być wykonywana na larwach, młodych lub dorosłych robakach. Izolacja komórek od larw robaków została wcześniej opublikowana przez Zhang et al.13 i nie będzie tutaj omawiana. Ważną uwagą jest to, że wszystkie robaki muszą znajdować się na tym samym etapie życia, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu zwierzęcia lub zakażeniu przez zwierzęta na różnych etapach życia. Poprzez zarówno enzymatyczne, jak i mechaniczne rozbicie naskórka nicienia, egzoszkieletu bogatego w kolagen i inne białka strukturalne, można wyizolować szeroką gamę komórek13,14. Komórki można następnie wyizolować za pomocą cytometrii przepływowej lub kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami. Zazwyczaj RNA jest izolowane metodą izotiocyjanianu fenolu i guanidyny, aby zapewnić wzbogacenie pożądanej populacji komórek15. Z dużą ostrożnością te wyizolowane komórki mogą być utrzymywane w kolbie hodowlanej lub naczyniu wielodołkowym. Metoda ta stanowi unikalne i potężne narzędzie w badaniu określonych neuronów i ma zdolność izolowania żywych i funkcjonalnych komórek do dalszej hodowli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i zbieranie starych robaków do izolacji komórek

UWAGA: Poniżej wyjaśniono izolację neuronów cholinergicznych z transgenicznego unc-17::GFP szczepu (OH13083) uzyskanego z repozytorium szczepu Caenorhabditis Genetics Center (CGC) na University of Minnesota. Konieczne jest utrzymanie sterylnych warunków, aby zapobiec zanieczyszczeniu grzybami lub bakteriami.

  1. Przygotuj i zsynchronizuj robaki za pomocą metody wybielania, zgodnie z opisem T. Stiernagle16. W eksperymentach ze starzeniem robaki płytkowe umieszcza się na płytkach pożywki wzrostowej nicieni (NGM) zawierających 25 μM wodnego roztworu fluorodeoksyurydyny (FuDR) w celu zmniejszenia produkcji jaj i zatrzymania wylęgu jaj. Regularnie sprawdzaj płytki agarowe, aby zapobiec zanieczyszczeniu lub wykluwaniu się jaj, ponieważ spowoduje to niewiarygodne wyniki.
    UWAGA: W przypadku komórek unc-17::GFP, zazwyczaj używa się trzech płytek NGM o wymiarach 100 mm x 15 mm do wyizolowania wystarczającej ilości komórek będących przedmiotem zainteresowania16.
  2. Zbierz robaki i przygotuj do izolacji komórek.
    1. Zbierz robaki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Robaki należy przepłukać z płytki 1,5 ml buforu M9 (1 mM MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO, pH 7,0) i wirować przez 5 minut przy 1 600 x g. Odrzucić supernatant i przemyć robaki 1 ml buforu M9. Powtórz wirowanie i umyj w sumie pięć razy, aby usunąć jak najwięcej zanieczyszczeń E. coli.
      UWAGA: Dodanie antybiotyków (50 μg/ml), takich jak ampicylina, na tym etapie może pomóc w zmniejszeniu zanieczyszczenia bakteryjnego.
    2. Dla dwóch próbek należy przygotować 2 ml buforu do lizy dodecylosiarczanu sodu i ditiotreitolu (SDS-DTT): 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) i 3% (w/v) sacharozy.
    3. Przygotować 15 ml buforu izolacyjnego (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES [pH 7,3]) i przechowywać go na lodzie.
      UWAGA: Zarówno bufor do lizy SDS-DTT, jak i bufor izolacyjny muszą być świeże przed każdym eksperymentem.
  3. Przerwanie naskórka i izolacja pojedynczej komórki
    1. Odwirować zwierzęta zebrane w kroku 1.2.1 przez 5 minut przy 1 600 x g. Usunąć cały supernatant i zawiesić robaki w 1 ml pożywki M9 i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Robaki granulowane z odwirowaniem w ilości 1 600 x g przez 5 min.
    3. Dodać 200 μl buforu do lizy SDS-DTT do robaków i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Robaki powinny wydawać się "zmarszczone" wzdłuż ciała, jeśli są oglądane pod mikroskopem świetlnym.
      UWAGA: Długotrwałe narażenie na bufor do lizy SDS-DTT może spowodować śmierć robaków, co można monitorować, obserwując robaki. Robaki, które są martwe, wydłużają się i nie zwijają się.
    4. Dodać 800 μl lodowatego buforu izolacyjnego i wymieszać, delikatnie przesuwając probówkę.
    5. Robaki osadzać przez 1 minutę w temperaturze 13 000 x g w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i przemyć 1 ml buforu izolacyjnego.
    6. Powtórz krok 1.3.5 w sumie pięć razy, za każdym razem ostrożnie usuwając bufor izolacyjny.
    7. Dodać 100 μl mieszaniny proteazy ze Streptomyces griseus (15 mg/ml) (tabela materiałów) rozpuszczonej w buforze izolacyjnym do osadu i inkubować przez 10−15 min w temperaturze RT.
      UWAGA: Podobnie jak w przypadku buforu do lizy SDS-DTT, przedłużone trawienie proteazy może powodować nadmierne rozszczepienie białek wzdłuż błony plazmatycznej, uniemożliwiając izolację GFP odsłoniętej powierzchniowo za pomocą kulek magnetycznych.
    8. Podczas inkubacji z mieszaniną proteazy należy zastosować mechaniczne zakłócenie, pipetując próbki w górę iw dół do dna probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki mikropipety o pojemności 200 μl ~60−70 razy. Przyłóż końcówkę pipety do ścianki probówki mikrowirówki pod stałym ciśnieniem, aby prawidłowo oddzielić komórki.
    9. Aby określić etap trawienia, należy usunąć niewielką objętość (~1−5 μl) mieszaniny mineralizującej, upuścić ją na szkiełko podstawowe i sprawdzić za pomocą mikroskopu do hodowli tkankowych. Po 5-7 minutach inkubacji fragmenty robaka powinny mieć widocznie zredukowany naskórek, a zawiesina komórek będzie łatwo widoczna.
    10. Zatrzymaj reakcję z 900 μl dostępnej na rynku zimnej pożywki L-15 firmy Leibovitz uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną-streptomycyną (końcowe stężenie przy 50 μg/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny).
    11. Izolowane fragmenty i komórki osadów należy odwirowywać przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Umyć granulowane komórki jeszcze dwukrotnie 1 ml zimnej pożywki z dodatkiem L-15, aby upewnić się, że nadmiar zanieczyszczeń i naskórka zostały usunięte.
    12. Zawiesić granulowane komórki w 1 ml pożywki z dodatkiem L-15 i pozostawić na lodzie na 30 minut. Weź górną warstwę, około 700−800 μl, do probówki mikrowirówkowej. Warstwa ta zawiera komórki bez szczątków komórkowych i zostanie wykorzystana w późniejszej izolacji komórek będących przedmiotem zainteresowania.
    13. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, użyj automatycznego licznika komórek lub hemocytometru, aby zmierzyć gęstość komórek 10−25 μl izolowanych komórek.

2. Izolacja komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej lub kulek magnetycznych anty-GFP

UWAGA: Istnieją dwie metody, które można zastosować do izolowania określonych typów komórek. Pierwsza metoda polega na zastosowaniu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), podczas gdy druga metoda wykorzystuje kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami do łączenia komórek wyrażających wyraźne białka zlokalizowane w błonie plazmatycznej. Ta ostatnia metoda wymaga lokalizacji GFP w błonie plazmatycznej, dzięki czemu jest dostępna do interakcji z kulką magnetyczną sprzężoną z przeciwciałem.

  1. Izolacja komórek GFP-dodatnich metodą cytometrii przepływowej
    1. Z wyizolowanej zawiesiny komórek zebranej w kroku 1.3.12 odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i zawiesić granulowane komórki w pożywce z dodatkiem L-15 do gęstości komórek nie większej niż 6 x 106 komórek/ml, aby uniknąć przeciążenia cytometru przepływowego.
    2. Sortować komórki według ekspresji GFP-dodatniej przy użyciu cytometru przepływowego zdolnego do sortowania próbek. Komórki GFP-ujemne mogą być używane jako kontrola do analizy niespecyficznej dla typu komórki.
      UWAGA: Jak wspomniano powyżej, alternatywne podejście do izolacji komórek GFP-dodatnich może być zastosowane, jeśli białko znakowane GFP, będące przedmiotem zainteresowania, jest zlokalizowane w błonie komórkowej komórek. W takim przypadku można zastosować protokół opisany w sekcji 2.2.
  2. Izolacja komórek GFP-dodatnich za pomocą kulek magnetycznych anty-GFP
    1. Z wyizolowanej zawiesiny komórkowej zebranej w kroku 1.3.12 odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i zawiesić komórki w 485 μl pożywki z dodatkiem L-15. Do roztworu dodać 15 μl ddH2O wstępnie umytych kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami α-GFP.
    2. Inkubować komórki z zawiesiną kulek magnetycznych w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę z bardzo delikatnym obracaniem. Nadmierne obracanie się spowoduje uszkodzenie komórek.
    3. Po inkubacji odwirować próbkę przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C, a następnie przepłukać granulat 2x 1 ml pożywki z dodatkiem L-15 w celu usunięcia komórek GFP-ujemnych.
  3. Hodowla izolowanych komórek
    1. Umieść izolowane komórki na sterylnej 6-dołkowej płytce wielodołkowej.
      UWAGA: Płytki te mogą być pokryte lektyną z orzeszków ziemnych w celu zwiększenia przyczepności komórek; Jeśli jednak komórki mają być użyte natychmiast, ten krok może zostać pominięty.
    2. Umieścić płytkę w plastikowym pojemniku i inkubować komórki w temperaturze 20 °C za pomocą wilgotnej chusteczki lub miękkiej bibułki (dodać 50 μg/ml ampicyliny do ddH2O, aby upewnić się, że nie rozwijają się bakterie na chusteczce), aby dodać wilgoci do komórek. Nie inkubować w inkubatorze CO2 , ponieważ podwyższony poziom CO2 może uszkodzić komórki.

3. Obrazowanie fluorescencyjne izolowanych komórek GFP-dodatnich

  1. Włącz żarówkę fluorescencyjną mikroskopu odwróconego z nasadką fluorescencyjną i pozwól jej się rozgrzać przez około 10 minut.
  2. Wyjmij kulturę komórkową z inkubatora i umieść na stoliku mikroskopu odwróconego z nasadką fluorescencyjną. Wsuń filtr GFP w rowki pod stolikiem mikroskopu.
  3. Zobacz komórki w powiększeniu 50x. Pomyślnie wyizolowane komórki GFP-dodatnie będą łatwo widoczne. Rób zdjęcia za pomocą nasadki aparatu na mikroskopie.

4. Ekstrakcja RNA z izolowanych komórek

UWAGA: Ekstrakcja RNA powinna być przeprowadzona natychmiast po izolacji komórki, aby zapewnić wysoką jakość materiału. Wyizolowane RNA można wykorzystać do produkcji cDNA, a następnie pomiaru poziomów transkryptów za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Wszystkie probówki, końcówki i odczynniki powinny być wolne od RNaz, a miejsce pracy powinno być umyte etanolem przed ekstrakcją RNA.

  1. Z wyizolowanych komórek pobranych w kroku 2.1.2 odwirować komórki w sterylnej, wolnej od RNaz probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Jeśli komórki są izolowane za pomocą kulek magnetycznych, postępuj zgodnie z pobieraniem komórek, jak podano powyżej.
  2. Za pomocą mikropipety usunąć supernatant z odwirowanej probówki do mikrowirówek i dodać 100 μl pożywki M9, aby zmyć pożywkę uzupełnioną L-15. Odwirować komórki przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Aby upewnić się, że wszystkie media zostały usunięte, powtórz w sumie trzy prania, za każdym razem ostrożnie usuwając supernatant.
  3. Dodać 1 ml roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny (tabela materiałów) do komórek i ostrożnie pipetować zawiesinę w górę i w dół. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  4. Po inkubacji dodać 250 roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny
  5. Odwirowywać roztwór przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze 25 °C.
  6. Ostrożnie usunąć jak najwięcej górnej warstwy wodnej za pomocą mikropipety, nie naruszając dolnych warstw organicznych, a następnie przenieść dolną warstwę do nowej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz. Do nowej probówki dodać 500 μl izopropanolu i wymieszać, odwracając probówkę. Inkubować ten roztwór w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  7. Odwirować probówkę o stężeniu 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 25 °C.
  8. Trzymając próbki na lodzie, usuń jak najwięcej izopropanolu za pomocą mikropipety i delikatnie dodaj 1 ml 70% (v/v) etanolu w wolnym od RNaz ddH2O do probówki. Należy pamiętać, aby nie wyrzucać roztworu bezpośrednio na dno probówki; Nałóż mieszaninę etanolu i wody na bok rurki.
  9. Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C.
  10. Usuń większość etanolu i wysusz na powietrzu na lodzie przez 3−5 min.
    UWAGA: Etanol należy usunąć po tym kroku; Jednak dokładna kontrola dna rurki jest ważna, aby upewnić się, że nie pozostał etanol.
  11. Po wysuszeniu probówki na powietrzu dodaj 15−20 μl ddH2O bez RNaz i zmierz stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru o długości fali 260 nm. Czystość próbki powinna być mierzona w stosunku 260 nm/280 nm. Stosunek ten powinien wynosić około >2,
    UWAGA: Wyizolowane RNA można zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C. Wysoce korzystne jest jednak użycie zestawu do syntezy cDNA tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić wysoką jakość produkcji cDNA. Ilościowy PCR może być przeprowadzany zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta termocyklera używanego w laboratorium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół pozwala na specyficzną izolację neuronów cholinergicznych unc-17::GFP-dodatnich od glisty C. elegans do kolejnych badań ex vivo, takich jak profilowanie ekspresji genów specyficznych dla typu komórki i ewentualna krótkoterminowa hodowla do pomiarów elektrofizjologii patch-clamp.

Rysunek 1 pokazuje unc-17::GFP-dodatnie neurony cholinergiczne w ich nor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glista C. elegans jest dobrze ugruntowanym i potężnym modelem do badania zdrowia i chorób neuronów2. Dzięki licznym narzędziom genetycznym do manipulowania tymi zwierzętami i możliwej do opanowania ilości precyzyjnie zmapowanych różnych typów neuronów, można zebrać wiele danych przy użyciu stosunkowo niewielkiej ilości materiału. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę izolowania odrębnych neuronów od całych zwierząt. Poprzez zakłócenie zewnętrznych białek naskórka robaka można...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Jennifer Fox i członkom laboratorium Khalimonchuk za wnikliwe komentarze. Doceniamy wsparcie ze strony National Institutes of Health (R01 GM108975 do O.K. i T32 GM107001-01A1 do E.M.G.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 6-dołkowaFisher Scientific12-556-004
Agar, klasa biologii molekularnejVWRA0930
CaCl2SigmaC5670
ChloroformSigma496189
Contess Automatyczny licznik komórekInvitrogenZ359629
DTTUSBiologicalD8070
EtanolDecon Labs2701
FBSOmega ScientificFB-02
FluorodeoksyurydynaSigmaF0503
HEPESSigmaH3375
IzopropanolVWRBDH1133
KClAmrescoO395
KH2PO4USBiologicalP5110
KimwipesKimberly-Clark Professionals7552
Leibovitz's L-15 MediumGibco21083027
MgCl2SigmaM8266
MgSO4USBiologicalM2090
Na2HPO4· 7H2OUSBiologicalS5199
NaClVWRX190
NaOCl (Bleach)Clorox
NaOHAmrescoO583
Penicylina-StreptomicenFisher Scientific15140122
Pepton YUSBiologicalP3306
Pronase EMieszanina7433ze Streptomyces griseus
SDSAmrescoO227
SMT1-FLQC fluorescencyjny stereomikroskopTritech Research
SacharozaUSBiologicalS8010
SuperScript IV One-Step zestaw do syntezyThermoFisher12594025
TRIzolInvitrogen15596026roztwór izotiocyjanianu fenolu i guanidyny
Trypan Blue StainInvitrogenT10Z82
α-GFP kulki magnetyczneMBLD153-11
proteaz Sigma

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).
  2. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
  3. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
  4. Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
  5. Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
  6. Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
  7. Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
  8. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
  9. Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
  10. Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2005).
  11. Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
  12. Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956(2018).
  13. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505(2011).
  14. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2007).
  15. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
  16. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
  17. Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja neuron w C eleganssortowanie kom rek aktywowane fluorescencjseparacja kom rek GFP dodatnichprotok ekstrakcji RNAanaliza ilo ciow PCRmarkery neuron w cholinergicznychtechniki hodowli kom rkowejmetoda fenolowo guanidynowasortowanie cytometrycznetrawienie tkanek nicieni

Powiązane artykuły