Artykuł metodologiczny

Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów

DOI:

10.3791/60148

⸱

27 października 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Hospitalo-Universitaire (IHU) - Méditerranée Infection, 2Microbes, Evolution, Phylogeny and Infection (MEΦI), Aix-Marseille Université UM63, Institut de Recherche pour le Développement IRD 198, Assistance Publique - Hôpitaux de Marseille (AP-HM)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę mikroaspiracji pojedynczych komórek do separacji zainfekowanych ameb. W celu oddzielenia subpopulacji wirusów w Vermamoeba vermiformis zakażonych faustowirusami i nieznanymi gigantycznymi wirusami, opracowaliśmy protokół opisany poniżej i wykazaliśmy jego zdolność do oddzielania dwóch nowych wirusów gigantycznych o niskiej liczebności.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas procesu wspólnej hodowli ameby, więcej niż jeden wirus może być wyizolowany w jednej studzience. Wcześniej rozwiązaliśmy ten problem poprzez rozcieńczenie punktu końcowego i/lub sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) zastosowane w populacji wirusów. Jednakże, gdy wirusy w mieszaninie mają podobne właściwości morfologiczne, a jeden z wirusów namnaża się powoli, obecność dwóch wirusów jest wykrywana na etapie składania genomu i wirusów nie można rozdzielić w celu dalszej charakterystyki. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy procedurę mikroaspiracji pojedynczych komórek, która pozwala na separację i klonowanie bardzo podobnych wirusów. W niniejszej pracy przedstawiamy, w jaki sposób ta alternatywna strategia pozwoliła nam oddzielić małe subpopulacje wirusowe Clandestinovirus ST1 i Usurpativirus LCD7, gigantycznych wirusów, które rosną powoli i nie prowadzą do lizy amebalnej w porównaniu z litycznym i szybko rosnącym faustowirusem. Kontrolę czystości oceniano za pomocą specyficznej amplifikacji genów, a następnie wyprodukowano wirusy w celu dalszej charakterystyki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nukleocytoplazmatyczne wirusy dużego DNA (NCLDV) są niezwykle różnorodne, zdefiniowane przez cztery rodziny, które infekują eukarionty1. Pierwszymi opisanymi wirusami o genomach powyżej 300 kpz były Phydcodnaviridae, w tym Paramecium bursaria Chlorella virus 1 PBCV12. Izolacja i pierwszy opis Mimiwirusa wykazały, że rozmiar wirusów podwoił się zarówno pod względem wielkości cząsteczki (450 nm), jak i długości genomu (1,2 Mb)3. Od tego czasu opisano wiele gigantycznych wirusów, zwykle izolowanych przy użyciu procedury kohodowli ameby. Z komórek Acanthamoeba sp. można wyizolować kilka gigantycznych wirusów o różnej morfologii i zawartości genetycznej, w tym marsylewirusy, Pandorawirusy, Pitowirusy, Molliwirusy, Cedratwirusy, Pacmanwirus, Tupanwirus, a ostatnio Medusavirus4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16,17. Równolegle, izolacja Vermamoeba vermiformis pozwoliła na wyizolowanie i opisanie gigantycznych wirusów Faustovirus, Kaumoebavirus i Orpheovirus18,19,20. Inne gigantyczne wirusy zostały wyizolowane wraz z ich protistami gospodarza, takimi jak Cafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23 i Bodo saltans24. Wszystkie te izolacje były wynikiem rosnącej liczby zespołów pracujących nad izolacją i wprowadzeniem aktualizacji strategii o wysokiej przepustowości25,26,27,28, takich jak ulepszenie systemu kohodowli za pomocą cytometrii przepływowej.

W 2016 roku zastosowaliśmy strategię łączącą kokulturę i cytometrię przepływową, aby wyizolować gigantyczne wirusy27. Strategia ta została opracowana w celu zwiększenia liczby zaszczepianych próbek, zróżnicowania protistów wykorzystywanych jako podpory komórek oraz szybkiego wykrycia lizy podpory komórkowej. System został zaktualizowany poprzez dodanie dodatkowego kroku, aby uniknąć wstępnej identyfikacji biologii molekularnej i szybkiego wykrywania nieznanej populacji wirusa, jak w przypadku Pacmanvirus29. Sprzężenie cytometrii przepływowej z sortowaniem komórek pozwoliło na rozdzielenie mieszaniny Mimivirus i Cedratvirus A1130. Jednak później napotkaliśmy ograniczenia związane z separacją i wykrywaniem tych subpopulacji wirusowych za pomocą cytometrii przepływowej. Po sekwencjonowaniu, kiedy zestawiliśmy genomy Faustowirusa ST125 i Faustowirusa LCD7 (dane niepublikowane), zaskakująco znaleźliśmy w każdym zestawie dwa dodatkowe genomy dwóch nowych wirusów, które nie zostały zidentyfikowane w publicznych bazach danych genomów. Jednak ani cytometria przepływowa, ani transmisyjna mikroskopia elektroniczna (TEM) nie wykazały, że ameby były zakażone dwoma różnymi wirusami, Clandestinovirus ST1 i Usurpativirus LCD7. Zaprojektowaliśmy specjalne systemy PCR do amplifikacji markerów odpowiednio faustowirusa, uzurpatiwirusa i tajnego wirusa na podstawie ich genomów; naszym celem było posiadanie systemów opartych na PCR, które umożliwiają weryfikację czystości wydzielanych wirusów. Jednak rozcieńczenie punktu końcowego i cytometria przepływowa nie zdołały ich rozdzielić. Izolacja tej pojedynczej populacji wirusa była trudna, ponieważ nie scharakteryzowano ani morfologii, ani elementów replikacyjnych populacji Clandestinovirus i Usurpativirus. Za pomocą cytometrii przepływowej wykryliśmy tylko jedną populację wirusa ze względu na nakładanie się dwóch populacji (testowane po skutecznej separacji). Próbowaliśmy je rozdzielić za pomocą sortowania pojedynczych cząstek na 96-dołkowych płytkach, ale nie zaobserwowaliśmy żadnych efektów cytopatycznych i nie wykryliśmy ani Clandestinovirusa, ani Usurpatiwirusa przez amplifikację PCR. Wreszcie, dopiero połączenie rozcieńczenia punktu końcowego, a następnie mikroaspiracji pojedynczej ameby, umożliwiło oddzielenie tych dwóch gigantycznych wirusów o niskiej liczebności od faustowirusów. Ta metoda separacji jest przedmiotem tego artykułu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kultura ameby

  1. Użyj Vermamoeba vermiformis (szczep CDC19) jako wsparcie komórek.
  2. Dodać 30 ml pożywki glukozowej (PYG) (Tabela 1) i 3 ml ameb o stężeniu 1 x 106 komórek/ml w kolbie do hodowli komórek o długości 75 cm.
  3. Utrzymywać kulturę w temperaturze 28 °C.
  4. Po 48 godzinach oznacz ilościowo ameby za pomocą szkiełek do liczenia.
  5. Aby wypłukać, zebrać komórki w stężeniu 1 x 106 komórek/ml i zagnieździć ameby przez odwirowanie przy 720 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki głodowej, aby uzyskać 1 x 106 komórek/ml (Tabela 1).

2. Rozprzestrzenianie się wirusa w amebach

UWAGA: Przed rozcieńczeniem ważne jest, aby wyhodować próbkę podstawową, aby uzyskać wystarczającą ilość świeżej kultury, a następnie przejść do filtracji.

  1. Użyj 1 x 106 kultury ameby w pożywce głodowej.
  2. Inokulować mieszaninę wirusów wydzielonych z roztworu podstawowego (Faustowirus/Usurpativirus LCD7 lub Faustowirus/Clandestinovirus ST1) po procesie kohodowli na podporze komórkowej przy wielokrotności infekcji (MOI) 0,01,
    nuta: MOI jest ważny dla zmniejszenia liczebności głównej populacji wirusa i liczby zakażonych komórek.
  3. Inkubować w temperaturze 30 °C aż do wywołania efektów cytopatycznych (CPE), takich jak zaokrąglenie lub liza amebalu, około 10 do 14 godzin po zakażeniu.
  4. Zbierz pożywkę i przefiltruj przez filtr 5 μm, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.

3. Rozcieńczenie punktu końcowego

  1. Wykonać seryjne rozcieńczanie (10-1 do 10-11) próbki wirusa w pożywce głodowej (Tabela 1).
  2. Zaszczepić 2 ml 1 x 106 Vermamoeba vermiformis zawartych na każdej szalce Petriego za pomocą 100 μl inokulum mieszaniny.
  3. Umieścić szalki Petriego w zamykanej plastikowej torbie w temperaturze 30 °C.
  4. Rozpocznij obserwację szalek Petriego za pomocą odwróconej mikroskopii optycznej po 6 godzinach od infekcji i sprawdzaj morfologię komórek co 4 do 8 godzin.
  5. Po pojawieniu się efektu cytopatycznego charakteryzującego się zaokrągleniem komórek, rozpocznij proces mikroaspiracji pojedynczej komórki.

4. Mikroaspiracja pojedynczej komórki

  1. Przygotuj hosta.
    UWAGA:     Ten preparat jest przeznaczony do uwalniania zainfekowanych pojedynczych komórek do świeżej podpory komórkowej.
    1. Potraktuj ameby w hodowli środkiem przeciwdrobnoustrojowym zawierającym 10 μg/ml wankomycyny, 10 μg/ml imipenemu, 20 μg/ml cyprofloksacyny, 20 μg/ml doksycykliny i 20 μg/ml worykonazolu. Mieszanina ta służy do unikania skażenia bakteryjnego i grzybiczego.
      nuta: Zabieg odbywa się na ławce na zewnątrz stacji bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Dodać 2 ml ameb skoncentrowanych w proporcji 1 x 106 komórek/ml każda do 15 szalek Petriego. W celu przylegania ameby należy inkubować kulturę w temperaturze 30 °C przez 30 minut.
  2. Wybrać szalkę Petriego używaną do mikroaspiracji z rozcieńczenia granicznego zgodnie z następującymi kryteriami: 1) brak widocznego zanieczyszczenia czynnikami grzybowymi i bakteryjnymi, 2) dowody na cytopatyczne działanie ameb wywołane przez wirusy, oraz 3) faza prelizy i zaokrąglenia ameb (w celu uniknięcia aspiracji cząstek wirusa).
  3. Skonfiguruj stację roboczą z następującymi materiałami (patrz Rysunek 1A,B):
    Mikromanipulator, który umożliwia pozycjonowanie mikrokapilarne;
    Ręczne urządzenie sterujące ciśnieniem, służące do zasysania i uwalniania komórek do mikrokapilary;
    Mikroskop odwrócony;
    Moduły silnikowe typu plug and play;
    Aparat fotograficzny;
    Moduł komputerowy do wizualizacji manipulacji i robienia zdjęć.
  4. Wybierz mikrokapilarnę (patrz Rysunek 1C).
    nuta: Wielkość komórek, deformacja i przyleganie ich błon do powierzchni oraz ruchliwość komórek mogą mieć wpływ na płynny przebieg mikroaspiracji. Średnica mikrokapilary może być precyzyjnie dobrana i dostosowana do konkretnych typów komórek w zależności od ich wielkości i metod aspiracji. Do odessania okrągłej ameby (średnica ~10 μm) użyto mikrokapilary o średnicy wewnętrznej 20 μm. Pozwala to na utrzymanie pozycji wewnętrznej i łatwe zwolnienie ogniwa.
  5. Zamontuj system.
    1. Ustawić kąt roboczy systemu chwytania na module z napędem na 45°.
    2. Wykonaj podwójną instalację, najpierw na systemie chwytakowym, a następnie na mikrokapilarze.
    3. Skoncentruj się na komórkach po przepuszczeniu kilku kropel olejku przez mikrokapilę.
      nuta: Olej mineralny o kompatybilności biologicznej jest dostarczany przez urządzenie.
    4. Kompletny montaż zgodnie z zaleceniami producenta.
  6. Klonuj komórki (patrz Rysunek 2A,B).
    UWAGA: Ta procedura jest podobna do tej opisanej przez Fröhlicha i Königa31.
    1. Umieścić pod mikroskopem szalkę Petriego zawierającą 2 ml zakażonych ameb.
    2. Skoncentruj się najpierw na komórkach, a następnie na mikrokapilarze zanurzonej w kulturze.
    3. Wybierz zaokrągloną pojedynczą komórkę i zbliż mikrokapilę do mikromanipulatora.
    4. Wywieraj miękką aspirację z ręczną kontrolą nacisku na komórkę, wprowadzając ją do wnętrza mikrokapilary. Usunąć pojedynczą komórkę z pierwszej próbki i uwolnić ją w podłożu komórkowym, a następnie inkubować w temperaturze 30 °C.
    5. Przeprowadzaj codzienne obserwacje za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego, aby obserwować wygląd komórek i monitorować pojawienie się efektu cytopatycznego.

5. Badania przesiewowe PCR

UWAGA: Po kroku 4, systematyczne badanie metodą PCR jest kluczowe dla potwierdzenia separacji. Zarówno w przypadku Usurpativirus/Faustovirus, jak i Clandestinovirus/Faustovirus, projekt i zastosowanie specyficznych systemów starterów i sond wykonano przy użyciu Primer-BLAST online32 (Tabela 2).

  1. Ekstrahować DNA z części dodatnich próbek hodowli (tj. z miejsca, w którym obserwuje się efekt cytopatyczny przy użyciu zautomatyzowanego systemu ekstrakcji zgodnie z protokołem producenta.
  2. Używaj odpowiednio zaprojektowanych podkładów.
    nuta: Tutaj zaprojektowaliśmy startery do amplifikacji genów rdzeniowych oznaczonych jako RpB2 (Faustowirus), główne białko kapsydu LCD7 (Usurpatvirus) i mniejsze białko kapsydu (Clandestinovirus)
  3. Wykonaj standardowy PCR za pomocą termocyklera.
    1. Przeprowadź 20 μl reakcji PCR z 50 μM każdego startera (Tabela 2), 1x Master Mix i wodą wolną od RNazy.
    2. Aktywować polimerazę DNA Taq na 5 minut w temperaturze 95 °C, a następnie wykonać 45 cykli denaturacji trwającej 10 s w temperaturze 95 °C, wyżarzanie starterów przez 30 s w temperaturze 58 °C i przedłużanie przez 30 s w temperaturze 72 °C.
  4. Uruchom produkty PCR na 1,5% żelu agarozowym, wybarwij barwnikiem z żelu DNA (tabela materiałów) i zwizualizuj za pomocą UV.

6. Produkcja i oczyszczanie wirusów

  1. Resztę kultury z szalki Petriego umieścić z powrotem w małej kolbie.
  2. Do produkcji wirusa należy przygotować 15 kolb o powierzchni 145cm2, zawierających 40 ml Vermamoeba vermiformis w pożywce głodowej i 5 ml wyizolowanego wirusa już przeniesionego z płytki Petriego do małych kolb.
  3. Leczyć tą samą mieszaniną antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych, co w kroku 4.1.
  4. Inkubować w temperaturze 30 °C. Codziennie obserwować za pomocą odwróconej mikroskopii optycznej.
  5. Po całkowitej infekcji połącz wszystkie kolby. Użyj filtra 0,45 μm, aby wyeliminować zanieczyszczenia.
  6. Ultraodwirować wszystkie supernatanty przy 50 000 x g przez 45 minut.
  7. Po odwirowaniu usunąć supernatant z każdej probówki przez aspirację i ponownie zawiesić osad w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  8. Oczyść wytworzonego wirusa przy użyciu 25% sacharozy (27,5 g sacharozy w 100 ml PBS, sterylizowanej przez filtrację).
  9. Odwirować 8 ml sacharozy i 2 ml zawiesiny wirusa w temperaturze 80 000 x g przez 30 min. Zawiesić osad wirusa w 1 ml PBS. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

7. Barwienie ujemne i transmisyjna mikroskopia elektronowa

UWAGA: Bou Khalil et al. wcześniej opublikowali ten protokół27.

  1. Umieścić 5 μl supernatantu do lizy na siatce rozrzewniowej. Pozostawić na około 20 minut w temperaturze pokojowej.
    nuta: Wyładowanie jarzeniowe pozwala nam uzyskać hydrofilową siatkę poprzez aplikację plazmy.
  2. Ostrożnie wysusz siatkę i nałóż na nią niewielką kroplę 1% molibdenianu amonu na 10 s. Pozostaw siatkę do wyschnięcia na 5 minut.
  3. Przejdź do obserwacji mikroskopią elektronową przy 200 keV.

8. Charakterystyka Clandestinovirus ST1 i Usurpativirus LCD7

  1. Scharakteryzuj czyste populacje Clandestinovirus ST1 i Usurpativirus LCD7 za pomocą sekwencjonowania genomu, składania genomu, analiz bioinformatycznych i badania ich cyklu replikacji, tak jak zrobiliśmy to dla innych wirusów10,20,29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroaspiracja pojedynczej komórki to proces mikromanipulacji zoptymalizowany w niniejszym opracowaniu (Rysunek 1). Technika ta umożliwia przechwycenie zaokrąglonej, zainfekowanej ameby (Rysunek 2A) i jej przeniesienie do nowej płytki zawierającej niezainfekowane ameby (Rysunek 2). Jest to funkcjonalny prototyp zastosowany w systemie kokultury, który pozwolił na pomyślną izolację nie litycznych wirusów olbrzymich. P...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czas obchodzenia się z pojedynczą komórką mikroaspiracji i jej prawidłowe funkcjonowanie zależy od operatora. Poszczególne etapy eksperymentu wymagają precyzji. Stosowanie komponentów mikromanipulacyjnych stanowiska pracy musi być pod stałą kontrolą poprzez obserwację procesu mikroaspiracji i uwalniania komórki. Kontynuacja poprzez obserwację mikroskopową jest niezbędna do wychwycenia i przeniesienia komórki. Doświadczony operator może potrzebować od 1 do 2 godzin, aby wyizolować 10 komórek i ponownie przenieść je jedna ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować zarówno Jean-Pierre Baudoin, jak i Olivierowi Mbarekowi za ich rady, a Claire Andréani za pomoc w poprawkach i modyfikacjach języka angielskiego. Prace te były wspierane przez grant państwa francuskiego zarządzany przez Narodową Agencję Badawczą w ramach programu "Investissements d'avenir (Inwestycje dla przyszłości)" o numerze referencyjnym ANR-10-IAHU-03 (zakażenie Méditerranée) oraz przez Région Provence Alpes Côte d'Azur i fundusze europejskie FEDER PRIMI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agaroza StandardEuromedexUnkownStandard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master MixApplied Biosystems4398876Standard PCR
CellTram 4r OilEppendorf5196000030Kontroluj komórki podczas procesu mikroaspiracji
Kolby do hodowli komórek Corning 150 cm2Sigma-aldrichCLS430825 Kultura
Kolby do hodowli komórek Corning 25 cm2Sigma-aldrichCLS430639Culture
Kolby do hodowli komórkowych Corning 75 cm2Sigma-aldrichCLS430641 Kultura DFC
425CLEICAUnkownObserwacja/Monitorowanie
Mikroskop odwrócony Eclipse TE2000-SNikonUnkownObserwacja/Monitorowanie
EZ1 zaawansowany XLQuiagen9001874ekstrakcja DNA
Glasstic Slide 10 z siatkami zliczającymiKova International87144ELiczba komórek
Mastercycler nexusEppendorf6331000017Standard PCR
Mikrokapila 20 i mikro; mEppendorf5175 107.004Mikroaspiracja i uwalnianie komórek
Mikromanipulator InjectMan NI2Eppendorf631-0210Pozycjonowanie mikrokapilarne
Woda wolna od nukleazThermoFischerAM9920Standardowa
ultrawirówka PCR Optima XPNBECKMAN COULTERA94469Oczyszczanie wirusów
szalka Petriego 35 mmIbidi81158Hodowla/obserwacja
Sterylne filtry strzykawkowe 5 i mikro; mSigma-aldrichSLSV025LSFiltracja
SYBR zielony Typ IInvitrogennieznanyFluorescencyjne sondy molekularne/cytometria przepływowa
SYBR SafeInvitrogenS33102Standardowy PCR; Barwienie żelem DNA
Tecnai G20FEIUnkownMikroskopia elektronowa
Typ 70 Ti Tytanowy wirnik o stałym kącieBECKMAN COULTER337922Oczyszczanie wirusów
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2BECKMAN COULTER344058Oczyszczanie wirusów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
  2. Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
  3. Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033(2003).
  4. Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
  5. Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
  6. Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
  7. Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
  8. Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285(2018).
  9. Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166(2018).
  10. Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300(2016).
  11. Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372(2018).
  12. Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
  13. Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
  14. Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76(2016).
  15. Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
  16. Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430(2019).
  17. Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749(2018).
  18. Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
  19. Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278(2016).
  20. Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779(2018).
  21. Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
  22. Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
  23. Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
  24. Deeg, C. M., Chow, C. -E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235(2018).
  25. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
  26. Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26(2016).
  27. Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104(2016).
  28. Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
  29. Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
  30. Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722(2017).
  31. Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
  32. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134(2012).
  33. Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wyodr bnianie wirus w olbrzymichkokultura z amebobserwacja efektu cytopatycznegoaspiracja mikrokapilarnaamplifikacja gen w metod PCRanaliza za pomoc mikroskopii elektronowejhodowla Vermamoeba vermiformiswykrywanie Faustovirusa

Powiązane artykuły