Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja leukocytów z mleka matki do stosowania w zależnym od przeciwciał teście fagocytozy komórkowej celów HIV

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60149

⸱

6 września 2019

 , 
1Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Podsumowanie

Mleko matki przenosi ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), chociaż tylko ~15% niemowląt karmionych piersią przez matki zakażone wirusem HIV ulega zakażeniu. Niemowlęta karmione piersią spożywają ~105−108 leukocytów matki dziennie, chociaż komórki te są niedostatecznie zbadane. Tutaj opisujemy izolację leukocytów mleka matki i analizę ich zdolności fagocytarnej.

Streszczenie

Nawet przy braku leków antyretrowirusowych, tylko ~15% niemowląt karmionych piersią przez matki zakażone wirusem HIV ulega zakażeniu, co sugeruje silne działanie ochronne mleka matki (BM). Jeśli dostęp do czystej wody i odpowiedniego mleka modyfikowanego dla niemowląt nie jest niezawodny, WHO nie zaleca zaprzestania karmienia piersią matkom zakażonym wirusem HIV. Wiele czynników prawdopodobnie działa w tandemie w celu zmniejszenia transmisji BM. Niemowlęta karmione piersią spożywają ~105-10 8 leukocytów matki dziennie, chociaż to, co pozostaje w dużej mierze niejasne, to wkład tych komórek w przeciwwirusowe właściwości BM. Obecnie naszym celem było wyizolowanie komórek z ludzkiego BM w celu zmierzenia zależnej od przeciwciał fagocytozy komórkowej (ADCP), jednej z najważniejszych i najbardziej rozpowszechnionych wrodzonych odpowiedzi immunologicznych, przez fagocyty BM przeciwko celom HIV. Komórki wyizolowano z 5 ludzkich próbek BM uzyskanych na różnych etapach laktacji. Izolację przeprowadzono poprzez delikatne odwirowanie, a następnie ostrożne usunięcie tłuszczu mlecznego i wielokrotne mycie osadu komórkowego. Jako cele do analizy ADCP wykorzystano kulki fluorescencyjne pokryte epitopem otoczki HIV (Env). Komórki barwiono markerem powierzchniowym CD45 w celu identyfikacji leukocytów. Stwierdzono, że aktywność ADCP była istotna w porównaniu z eksperymentami kontrolnymi i możliwa do powtarzalnego zmierzenia przy użyciu przeciwciała 830A swoistego dla HIV.

Wprowadzenie

Mleko matki (BM) składa się z komórek matczynych, które są >w 90% żywotne1. Na skład komórek duży wpływ ma etap laktacji, stan zdrowia matki i dziecka oraz zmienność osobnicza, która pozostaje słabo poznana1,2,3,4. Biorąc pod uwagę, że BM zawiera ~103−105 leukocytów/ml, można oszacować, że niemowlęta karmione piersią spożywają ~105−108 leukocytów matczynych dziennie5. Różne badania in vivo wykazały, że leukocyty matki zapewniają krytyczną odporność niemowlęciu i funkcjonują znacznie poza tymi miejscami początkowego spożycia5,6,7,8,9,10,11. Wszystkie komórki pochodzące od matki pobrane przez niemowlę mogą potencjalnie pełnić funkcje immunologiczne równolegle z leukocytami niemowlęcia lub je kompensować12.

Przenoszenie wirusa HIV z matki na dziecko (MTCT) pozostaje kryzysem w krajach o ograniczonych zasobach. Ponieważ biegunka i choroby układu oddechowego są odpowiedzialne za znaczną śmiertelność niemowląt w krajach o ograniczonych zasobach, a choroby te są znacznie zmniejszone przez wyłączne karmienie piersią, korzyści dla matek zakażonych wirusem HIV z karmienia piersią znacznie przewyższają ryzyko13,14,15. O ile dostęp do czystej wody i odpowiedniego mleka modyfikowanego dla niemowląt nie jest niezawodny, WHO nie zaleca zaprzestania karmienia piersią matkom zakażonym wirusem HIV16. Rocznie dochodzi do około 100 000 MTCT za pośrednictwem BM; jednak tylko ~15% niemowląt karmionych piersią przez matki zakażone wirusem HIV ulega zakażeniu, co sugeruje silne działanie ochronne BM17,18,19,20,21. Wiele czynników prawdopodobnie działa w tandemie, aby zapobiec przenoszeniu się wirusa. Co ważne, przeciwciała swoiste dla HIV (Abs) w BM zostały skorelowane ze zmniejszonym MTCT i/lub zmniejszoną śmiertelnością niemowląt z powodu zakażenia wirusem HIV22,23. To, co pozostaje w dużej mierze niejasne, to udział frakcji komórkowej BM w jego właściwościach przeciwwirusowych.

Wiele Abs ułatwia różnorodne działania przeciwwirusowe, w których pośredniczy 'stały' region cząsteczki immunoglobuliny, krystalizowalny fragment (Fc), poprzez interakcję z receptorami Fc (FcR) znajdującymi się na praktycznie wszystkich wrodzonych komórkach odpornościowych, z których praktycznie wszystkie znajdują się w ludzkim BM24. Wykazano, że fagocytoza komórkowa zależna od przeciwciał (ADCP) jest niezbędna do usunięcia infekcji wirusowych i była niedostatecznie zbadana w przypadku zapobiegania MTCT HIV25,26,27,28,29. Biorąc pod uwagę niedostatek wiedzy na temat potencjalnego udziału aktywności ADCP fagocytów BM w zapobieganiu MTCT HIV, naszym celem było opracowanie rygorystycznej metody izolacji komórek od ludzkiego BM w celu podjęcia badania ADCP za pośrednictwem komórek z BM uzyskanych na różnych etapach laktacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Każdy uczestnik tego badania został zrekrutowany i przeprowadzony z nim wywiad zgodnie z aprobatą komisji etycznej i instytucjonalnej (IRB) z wytycznymi i autoryzacją Programu Ochrony Ludzi (PPHS) Mount Sinai, przy użyciu zatwierdzonego przez IRB protokołu pobierania próbek mleka matki.

1. Przygotowanie docelowej mikrosfery

  1. Wybierz odpowiedni antygen docelowy.
    UWAGA: W tym przykładzie użyto rekombinowanego białka V1V2-2F5K, które zostało zaprojektowane tak, aby naśladować trimeryczny wierzchołek natywnej otoczki HIV 30.
  2. Wykonaj biotynylację za pomocą komercyjnego zestawu (Tabela Materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
    1. Obliczyć mmol odczynnika biotyny, który należy dodać do reakcji dla 5-krotnego nadmiaru molowego, korzystając ze wzoru: mmol, biotyna = mL białka x (mg białka/mL białka) x (mmol, biotyna/mg białka) x (5 mmol, biotyna/mmol białko)30,31. Następnie oblicz μl odczynnika biotyny do dodania według wzoru: μL biotyny = mmol biotyny x (1 000 000 μL/L) x (L/10 mmol).
    2. Przed otwarciem zrównoważyć biotynę do temperatury pokojowej. Rozpuść białko w 0,5−2,0 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zgodnie z powyższymi obliczeniami.
    3. Przygotować 10 mM roztwór odczynnika biotyny w dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodać odpowiednią objętość 10 mM odczynnika biotyny do roztworu białkowego i inkubować reakcję na lodzie przez 2 godziny lub w temperaturze pokojowej przez 30 min.
  3. Usunąć nadmiar biotyny za pomocą koncentratorów białek (membrany polieterosulfonowe [PES], odcięcie masy cząsteczkowej 3 kDa [MWCO], 0,5 ml; Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Umieścić próbkę w górnej komorze kolumny wirowej i dodać PBS do 400 μl. Nakrętka, a następnie włożyć tę komorę na próbkę do probówki zbiorczej. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    2. Odrzucić przepływ i dodać PBS do 400 μl. Powtórzyć wirowanie. Odrzucić przepływ i dodać PBS do 100 μl. Zmierzyć stężenie białka za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: Białko można podzielić na porcje i zamrozić w temperaturze -80 °C do momentu zużycia.

2. Przygotowanie płytki do oznaczania fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP)

  1. Sprzęgnięcie biotynylowanego białka z mikrosferami o wielkości 1 μm ("kulkami"; Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Na płytkę sprzężonych kulek inkubować 6 μg białka z 12 μl kulek podstawowych w 200 μl 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)-PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, delikatnie wirując co 20 minut.
    2. Wirować przy 13 000 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, delikatnie odwirować i ponownie zawiesić w 1200 μl 0,1% BSA-PBS. Powtórz krok wirowania i prania 2x. Zawiesić w 1200 μl 0,1% BSA-PBS.
  2. Podwielokrotność 10 μl roztworu kulek na dołek w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem. Przygotować rozcieńczenia przeciwciał lub surowic odpornościowych w 12 μl 2% HSA HBSS, zwykle zaczynając od 50 μg/ml przeciwciała lub rozcieńczenia surowicy 1:100.
    UWAGA: W próbkach zastosowano przeciwciało monoklonalne (mAb) 830A.
  3. Dodać 10 μl miareczkowanego przeciwciała/surowicy do płytki perełkowej i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Dodać 200 μl 2% HSA HBSS do każdego dołka i odwirować płytkę przy 2 000 x g przez 10 minut.
  4. Ostrożnie usuń supernatant poprzez szybkie przewrócenie i zdekantację cieczy z dołków talerzowych do zlewu, aby uniknąć zakłócenia niewidocznej granulki kulki.

3. Izolacja komórek mleka matki

  1. Pozyskuj mleko matki od zdrowych kobiet karmiących, odciągane za pomocą podwójnych laktatorów elektronicznych lub ręcznych. Wyizoluj komórki w ciągu ~4 godzin od odciągu, utrzymując mleko w temperaturze pokojowej.
  2. Używając probówek o pojemności 50 ml, odwiruj 50 ml mleka o stężeniu 800 x g przez 15 minut. Ostrożnie odlej odtłuszczone mleko i tłuszcz, pozostawiając osad komórkowy w spokoju. Wytrzyj wnętrze tubki niestrzępiącą się ściereczką, aby usunąć cały tłuszcz ze ścianki tuby.
  3. Dodaj 10 ml 2% białka surowicy ludzkiej do zbilansowanego roztworu soli Hanka (2% HSA HBSS [bez Ca2+ lub Mg+]). Zawiesić osad przez delikatne pipetowanie, aby uniknąć aktywacji komórek i apoptozy. Przenieść do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 450 x g przez 10 minut.
  4. Odlewać supernatant i powtórzyć krok 1.3. Następnie delikatnie ponownie zawieś komórki w 1-2 ml 2% HSA HBSS w zależności od oczekiwanej liczby komórek i policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, zwracając również uwagę na żywotność komórek.

4. Test ADCP

UWAGA: Opisane tutaj metody są zaczerpnięte z Ackerman et al.32.

  1. Dodaj 50 000 świeżo wyizolowanych komórek BM do każdej płytki testowej ADCP w 200 μl 2% HSA-HBSS. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    1. W przypadku eksperymentów kontrolnych należy wstępnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C z inhibitorem aktyny 10 μg/ml (cytochalazyna-D), środkiem blokującym FcR o stężeniu 50 μg/ml (FcBlock) lub kombinacją obu tych czynników przed ich dodaniem do płytek.
  2. Płytka wirówkowa o masie 930 x g przez 10 min. Dodać 200 μl 2% HSA HBSS i powtórzyć wirowanie. Ostrożnie usunąć supernatant jak w kroku 2.7 i powtórzyć mycie.
  3. Ostrożnie usunąć sklarowany sklarat i komórki barwiące pod kątem żywotności za pomocą 0,5 μg/ml (stężenie końcowe) utrwalonej barwie żywotności 450 na studzienkę w 50 μl 2% HSA HBSS. Inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Odwirować płytkę o masie 930 x g przez 10 minut i usunąć supernatant jak w kroku 2.7. Dodać 200 μl 2% HSA HBSS i ponownie odwirować płytkę, a następnie usunąć supernatant, jak w kroku 2.7.
  4. Po barwieniu żywotności wybarwić komórki pod kątem markerów leukocytów będących przedmiotem zainteresowania, minimalnie zawierających barwnik specyficzny dla CD45, taki jak PE-mysz anty-ludzka CD45 (klon HI30) w zoptymalizowanym stężeniu (1 μg/μL w 50 μL 1% BSA HBSS w przykładowych danych).
    UWAGA: Można dołączyć dowolne markery specyficzne dla danej linii.
  5. Inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Odwirować płytkę o masie 930 x g przez 10 minut i usunąć supernatant jak w kroku 2.7. Dodać 200 μl 1% BSA HBSS i powtórzyć wirowanie. Usunąć supernatant. Utrwalić komórki w 200 μl 0,5% formaldehydu w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub przez noc w temperaturze 4 °C. Przechowywać w lodówce w ciemności do czasu analizy.

5. Analiza metodą cytometrii przepływowej

  1. Wykonaj wstępne bramkowanie, aby wyeliminować dublety na wykresie rozrzutu do przodu (FSC) w porównaniu z rozproszeniem bocznym (SSC) i szczątkami (materiał mniejszy niż FSC = 5000) (patrz Rysunek 1). Użyj wykresu SSC w porównaniu z barwieniem żywotności (w tym przypadku V450), aby wyeliminować martwe komórki (te, które są dodatnie pod względem barwienia żywotności).
  2. Użyj wykresu SSC i CD45, aby rozróżnić główne klasy leukocytów (granulocyty, monocyty, limfocyty) zgodnie z obszernym opisem33,34.
    UWAGA: Ta klasyfikacja jest tylko sugestywna, a do potwierdzenia typu komórki potrzebne są markery specyficzne dla linii.
  3. Dla wszystkich komórek CD45 + lub dla każdego podzbioru leukocytów będącego przedmiotem zainteresowania, zmierz aktywność ADCP poprzez bramkowanie markerem na komórkach dodatnich koralików na histogramie kanału izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), w którym wykrywane są kulki fluorescencyjne.
    UWAGA: Studzienki kontroli ujemnej, w których nie dodano koralików, wskażą, gdzie na histogramie widoczne są komórki dodatnie z koralikami, a zatem gdzie umieścić znacznik bramkowania.
  4. Obliczyć wyniki ADCP jako (mediana intensywności fluorescencji [MFI] komórek dodatnich pod względem koralików) x (% całkowitych komórek CD45 + w populacji dodatniej). Użyj oprogramowania graficznego, aby wykreślić wyniki dla każdego stężenia Ab/surowicy i przeprowadzić analizę obszaru pod krzywą (AUC).
    UWAGA: ADCP uważa się za dodatnie, jeśli AUC jest większe niż 3x odchylenie standardowe AUC wyniku ADCP niespecyficznego mAb kontroli ujemnej (w tym przypadku 3865).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mleko można przechowywać w temperaturze pokojowej lub niższej (choć nie zamrażać); jednakże, biorąc pod uwagę zaobserwowany przez nas spadek żywotności przy bardzo niskich temperaturach przechowywania mleka (dane nie pokazano) oraz fakt, że pobieranie, krótkotrwałe przechowywanie i transport w temperaturze otoczenia są prostsze, zaleca się, aby próbek nie chłodzić w celu zmniejszenia zmienności między próbkami. W mleku pobranym od 7 do 183 dni po porodzie stężenie komórek określone za pom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana w niniejszym dokumencie technika pomiaru aktywności ADCP oparta na cytometrii przepływowej została po raz pierwszy opisana w 2011 r.30 i od tego czasu została udowodniona i cytowana w ponad 80 badaniach. Opisany tutaj protokół po raz pierwszy dostosowuje tę technikę do użycia z pierwotnymi komórkami BM. Wcześniejsze badania nad funkcjonalnością komórek BM za pośrednictwem Fc były w dużej mierze ograniczone do pomiaru wybuchów oksydacyjnych lub testów fagocytozy opartych na histologii przy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Susan Zolla-Pazner z Wydziału Medycyny i Wydziału Mikrobiologii w Icahn School of Medicine w Mount Sinai za przejrzenie manuskryptu. NIH/NICHD zapewniło finansowanie tego projektu w ramach grantu nr R21 HD095772-01A1. Ponadto R. Powell był wspierany przez fundusze z Wydziału Medycyny Wydziału Chorób Zakaźnych Icahn School of Medicine w Mount Sinai.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 &mikro; m FluoSpheres Mikrosfery znakowane neutrAwidyną Thermo FisherF8776
BD Pharmingen PE Mysz Anti-Human CD45BD560975
Surowica bydlęca AlbuminaMP Biomedicals8810025
Corning Polistyren V-bottom 96-dołkowa płytka Corning 3894
Cytochalazyna DSigma22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Zestaw biotyny Thermo Fisher21338
Falcon 15 mL stożkowe probówki wirówkoweCorning 
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml Corning 352070
Możliwa do naprawienia plama żywotności 450 BD562247
Roztwór formaldehyduSigma252549 
HBSS bez wapnia, magnezu i fenolu RedLife Technologies14175-095
Ludzki blok BD Fc BD564219
Albumina ludzkiej surowicyMP Biomedicals2191349
Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki do zadańKimberly-Clark Professional 34120
PBS 1x pH 7,4Thermo Fisher10010023
Polistyren 10 ml Pipety serologiczne Corning 4488
Koncentratory białka PES, 3K MWCO, 0,5 mlPierce88512
352196

Bibliografia

  1. Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
  2. Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
  3. Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
  4. Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
  5. Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
  6. Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
  7. Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
  8. Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
  9. Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
  10. Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
  11. Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762(2016).
  12. Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29(2011).
  13. Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
  14. Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
  15. WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
  16. World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).
  17. Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
  18. Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
  19. Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150(2015).
  20. Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
  21. Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143(2012).
  22. Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
  23. Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
  24. Ackerman, M., Nimmerjahn, F. Antibody Fc. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
  25. Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
  26. Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
  27. Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
  28. Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
  29. Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
  30. Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
  31. Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
  32. Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618(2013).
  33. Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
  34. Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580(2015).
  35. Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
  36. Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja leukocyt wkom rki mleka kobiecegocytometria przep ywowamarker CD45przemywanie kom rekwirowaniekulki fluorescencyjnebarwienie ywotno ci
Izolacja leukocytów z mleka matki do stosowania w zależnym od przeciwciał teście fagocytozy komórkowej celów HIV
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.