Method Article

Test oparty na fluorescencji do charakterystyki i kwantyfikacji tworzenia kropelek lipidów w organoidach jelitowych człowieka

DOI:

10.3791/60150

⸱

October 13th, 2019

 ,  , 
1Division of Pediatrics, Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Regenerative Medicine Center, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Science for Life Laboratory, Department of Medical Biochemistry and Microbiology, Uppsala University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje test do charakterystyki tworzenia się kropelek lipidowych (LD) w organoidach jelitowych człowieka po stymulacji kwasami tłuszczowymi. Omówiliśmy, w jaki sposób ten test jest używany do ilościowego oznaczania powstawania LD i jak można go wykorzystać do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które wpływają na tworzenie LD.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipidy dietetyczne są pobierane przez nabłonek jelitowy jako wolne kwasy tłuszczowe (FA). Te FA są przekształcane wewnątrzkomórkowo w cząsteczki trójglicerydów (TG), zanim zostaną upakowane w chylomikrony w celu transportu do limfy lub w cytozolowe kropelki lipidów (LD) do przechowywania wewnątrzkomórkowego. Kluczowym etapem tworzenia LD jest aktywność katalityczna acylotransferaz diacyloglicerolu (DGAT) w końcowym etapie syntezy TG. LD są ważne dla buforowania toksycznych form lipidów i regulowania metabolizmu komórkowego w różnych typach komórek. Ponieważ nabłonek jelitowy człowieka jest regularnie konfrontowany z wysokimi stężeniami lipidów, tworzenie LD ma ogromne znaczenie dla regulacji homeostazy. Tutaj opisujemy prosty test do charakterystyki i kwantyfikacji powstawania LD (LDF) po stymulacji najpowszechniejszym nienasyconym kwasem tłuszczowym, kwasem oleinowym, w ludzkich organoidach jelitowych. Test LDF opiera się na barwniku fluorescencyjnym LD540 specyficznym dla LD, który pozwala na ilościowe określenie LD za pomocą mikroskopii konfokalnej, czytnika płytek fluorescencyjnych lub cytometrii przepływowej. Test LDF może być wykorzystany do scharakteryzowania powstawania LD w ludzkich komórkach nabłonka jelitowego lub do badania ludzkich zaburzeń (genetycznych), które wpływają na metabolizm LD, takich jak niedobór DGAT1. Co więcej, test ten może być również stosowany w wysokoprzepustowym rurociągu do testowania nowych związków terapeutycznych, które przywracają defekty w tworzeniu LD w jelitach lub innych typach organoidów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipidy są kluczowym składnikiem diety człowieka i odgrywają ważną rolę w magazynowaniu energii i metabolizmie. Po spożyciu lipidy w diecie są rozkładane na wolne kwasy tłuszczowe (FFA) i monoglicerydy (MG) przez lipazy trzustkowe. Substraty te są następnie pobierane przez enterocyty nabłonka jelitowego, gdzie są najpierw reestryfikowane do diglicerydów (DG) przez enzymy acylotransferazy monoglicerydów (MGAT), a następnie do trójglicerydów (TG) przez acylotransferazę diacyloglicerolu 1 (DGAT1)1. Wreszcie, te TG są integrowane z chylomikronami w celu eksportu do układu limfatycznego lub cytozolowymi kropelkami lipidów (LD) do przechowywania wewnątrzkomórkowego2,3. Chociaż chylomikrony są potrzebne do dystrybucji lipidów dietetycznych do innych narządów, znaczenie wewnątrzkomórkowego magazynowania tłuszczu w LD nie jest do końca jasne. Wykazano jednak, że LD pełnią funkcję regulacyjną w jelicie, ponieważ powoli uwalniają lipidy do krążenia do 16 godzin po posiłku4. Ponadto wykazano, że LD chronią przed toksycznymi stężeniami kwasów tłuszczowych, na przykład w adipocytach myszy podczas warunków lipolitycznych5.

Białko DGAT1 znajduje się na błonie retikulum endoplazmatycznego (ER) i odgrywa kluczową rolę w tworzeniu LD w nabłonku jelitowym. Homozygotyczne mutacje w DGAT1 prowadzą do ciężkiej biegunki i/lub wymiotów o wczesnym początku, hipoalbuminemii i/lub (śmiertelnej) enteropatii tracącej białko z niewydolnością jelit po spożyciu tłuszczu, co ilustruje znaczenie DGAT1 w homeostazie lipidowej nabłonka jelitowego człowieka6,7,8,9,10. Ponieważ występowanie niedoboru DGAT1 u ludzi jest rzadkie, dostęp do pierwotnych komórek pochodzących od pacjentów jest ograniczony. Co więcej, długotrwała hodowla komórek nabłonka jelitowego od dawna jest ograniczona do linii komórkowych pochodzących z nowotworów, które reprezentują normalną fizjologię tylko w ograniczonym zakresie. W związku z tym tworzenie LD za pośrednictwem DGAT1 badano głównie w fibroblastach lub liniach komórkowych pochodzenia zwierzęcego7,10,11,12. W związku z tym niedawno wykazano, że fibroblasty pochodzące od pacjentów z niedoborem DGAT1 gromadzą mniej LD w porównaniu ze zdrowymi komórkami kontrolnymi po stymulacji kwasem oleinowym (OA)8.

Poprzednio ustanowiono protokoły hodowli komórek macierzystych nabłonka z dowolnego narządu przewodu pokarmowego w postaci trójwymiarowych (3D) organoidów13. Te organoidy jelitowe mogą być przechowywane w kulturze przez długi okres czasu13 i umożliwiają funkcjonalne badanie cech nabłonka specyficznych dla pacjenta i lokalizacji jelita14. Są one stabilne genetycznie i fenotypowo i mogą być przechowywane, co pozwala na długoterminową ekspansję i biobanking13.

Niedawno pokazaliśmy, że formowanie LD można łatwo zmierzyć w ludzkich organoidach jelitowych w teście LDF (LDF)6. Po wystawieniu na działanie choroby zwyrodnieniowej stawów przez 16 godzin organoidy wytwarzają LD, aby chronić komórki przed toksycznością wywołaną przez lipidy. Gdy stężenie choroby zwyrodnieniowej stawów jest zbyt wysokie, komórki umierają w wyniku apoptozy za pośrednictwem kaspazy6. Wcześniej wykazano, że test LDF jest w dużej mierze zależny od DGAT1, na co wskazują organoidy pochodzące od pacjentów z mutacją DGAT1 oraz zastosowanie inhibitorów specyficznych dla DGAT16.

Dla szczegółowo opisanego tutaj testu LDF, organoidy 3D są hodowane z biopsji jelitowych i są co tydzień przenoszone przez rozpad na pojedyncze komórki, które łatwo tworzą nowe organoidy. Aby przeprowadzić test LDF, ~ 7,500 pojedynczych komórek pochodzących z organoidów jest posianych w każdym dołku 24-dołkowej płytki. Organoidy są formowane przez kilka dni, inkubowane przez noc z 1 mM OA i barwione LD540, fluorescencyjnym barwnikiem specyficznym dla LD, przepuszczalnym dla komórek, który ułatwia obrazowanie. Powstawanie LD jest następnie określane ilościowo za pomocą mikroskopii konfokalnej, czytnika płytek fluorescencyjnych lub cytometrii przepływowej.

Poprzez skalowanie tego testu tworzenia LD do formatu 96-dołkowego, test może być również używany do wysokoprzepustowej analizy powstawania LD w celu przesiewania nowych leków, które wpływają na powstawanie LD w hodowlach organoidów jelitowych ludzkich, lub do badania zaburzeń (genetycznych człowieka), które wpływają na metabolizm LD.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty z użyciem tkanek ludzkich zostały zatwierdzone przez komisję etyczną w Uniwersyteckim Centrum Medycznym w Utrechcie (UMCU). Świadomą zgodę na pobranie, wytwarzanie, przechowywanie i wykorzystanie organoidów uzyskano od pacjentów Szpitala Dziecięcego Wilhelmina (WKZ)-UMCU.

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych

UWAGA: Ten protokół powinien być wykonywany w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Z organoidami należy obchodzić się zgodnie ze standardowymi wytycznymi dotyczącymi hodowli komórkowych.

  1. Przygotować podłoże do hodowli podstawowych.
    UWAGA:     Pożywka hodowlana bez czynników wzrostu jest określana jako pożywka podstawowa (BM).
    1. Dodaj 5 ml HEPES (1 M), 5 ml L-glutaminy (100x) i 5 ml penicyliny-streptomycyny (5 000 U/ml) do 500 ml zaawansowanej zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Dulbecco z mieszanką składników odżywczych Ham's F-12, aby przygotować pożywkę BM.
    2. Przygotowaną pożywkę BM przechowywać w temperaturze 4 °C i stosować maksymalnie przez 2 miesiące.
  2. Przygotować pożywkę kondycjonowaną R-spondyną i Noggin (CM) zgodnie z protokołem producenta.
    1. Krótko mówiąc, hoduj komórki do pożądanej ilości w hiperkolbach z 5 x 107 komórek w pożywce 555 ml bez selektywnego antybiotyku na kolbę.
    2. Hoduj komórki przez 4 dni, aż do zlewania się.
    3. Zastąp pożywkę BM i kulturą na dodatkowe 8 dni.
    4. Po 8 dniach hodowli w temperaturze 37 °C zebrać pożywkę hodowlaną i odwirowywać przez 5 minut przy 450 x g w celu osadzenia pozostałych komórek.
    5. Przesączyć, wysterylizować supernatant i przechowywać podwielokrotności R-spondyny lub Noggin CM w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy.
  3. Przygotuj Wnt3A-CM zgodnie z Boj et al.15.
    1. Krótko mówiąc, hoduj komórki do pożądanej ilości w szalkach o średnicy 145 mm z 2 x 106 komórek w pożywce 20 ml bez selektywnego antybiotyku na talerz. Owiń każde naczynie folią plastikową, aby uniknąć parowania pożywki hodowlanej.
    2. Po 8 dniach hodowli w temperaturze 37 °C zebrać pożywkę hodowlaną i odwirowywać przez 5 minut przy 450 x g w celu osadzenia pozostałych komórek.
    3. Przefiltrować, wysterylizować supernatant i przechowywać podwielokrotności Wnt3A-CM w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 miesiące.
  4. Przygotować podłoże do ekspandowania organoidów.
    UWAGA:     Pożywka ekspansywna organoidowa ludzkiego jelita cienkiego (patrz przepis w tabeli uzupełniającej 1) jest określana jako hSI-EM. Poniższe kroki spowodują uzyskanie końcowej objętości 1 L hSI-EM i można ją skalować w górę lub w dół zgodnie z wymaganiami.
    1. Rozpuścić 1,46 g nikotynamidu w 12 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do hodowli komórkowych, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1 M.
    2. Rozpuścić 245 mg n-acetylocysteiny w 3 ml PBS klasy hodowli komórkowej, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 500 mM.
      nuta: Aby przyspieszyć tworzenie się roztworu, nikotynamid i n-acetylocysteina mogą być inkubowane w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Oba roztwory można przygotować partiami, porcjować i przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
    3. Filtr wysterylizuj oba roztwory przez filtr 0,22 μm do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Dodać 167 ml BM do sterylnej kolby o pojemności 500 ml w pożywce hodowlanej. Dodać 200 ml R-Spondin-CM, 100 ml noggin-CM i 100 μl rekombinowanego mEGF (500 μg/ml) do końcowego stężenia 50 ng/ml.
    5. Dodać 10 ml wysterylizowanego roztworu nikotynamidu i 2,5 ml wysterylizowanego roztworu n-acetylocysteiny. Dodaj 20 ml suplementu witaminy B27 (50x).
      nuta: Na tym etapie pożywka jest określana jako hSI-EM bez WAS (Wnt3A-CM, A83-01 i SB202190) i może być porcjowana i przechowywana w temperaturze -20 °C. Jeżeli pożywkę dzieli się na mniejsze objętości, należy odpowiednio dostosować stężenia w poniższych krokach.
    6. Do 500 ml hSI-EM bez WAS dodać 10 ml Wnt3A-CM z ostatniej świeżo przygotowanej partii i 10 ml Wnt3A-CM z przedostatniej partii, aby zminimalizować zmiany zmienności w warunkach Wnt3A-CM.
    7. Dodać A83-01 do końcowego stężenia 500 nM, a następnie SB202190 do końcowego stężenia 10 μM.
    8. Przygotowany hSI-EM (z WAS) należy przechowywać w temperaturze 4 °C i stosować maksymalnie przez 2 tygodnie.
      nuta: Dodać dodatkowy Y-27632 do końcowego stężenia 10 μM (określanego jako hSI-EM+Y), gdy hoduje się krypty lub pojedyncze komórki lub rozpoczyna się tworzenie organoidów od krioprezerwacji.
  5. Przygotować bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
    1. Dodać 10 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS) do 40 ml PBS bez Ca2+/Mg2+, aby uzyskać końcowe stężenie 10% FCS.
      nuta: FCS zapobiega przywieraniu komórek do sprzętu laboratoryjnego.

2. Procedury hodowli organoidów ludzkiego jelita cienkiego

UWAGA: Ten protokół powinien być wykonywany w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Z organoidami należy obchodzić się zgodnie ze standardowymi wytycznymi dotyczącymi hodowli komórkowych. Podczas pracy z organoidami lub komórkami pochodzącymi z organoidów, komórki te powinny być w miarę możliwości trzymane na lodzie. Komórki pozostaną żywe przez kilka godzin po zbiorach, jeśli będzie to zapewnione. Organoidy powinny być hodowane w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Warunki te mają zastosowanie do wszystkich etapów inkubacji z organoidami osadzonymi w macierzy błony podstawnej (BMM; tj. Matrigel) w całym tym protokole. Autorzy wykorzystali do tych testów organoidy pochodzące z dwunastnicy.

  1. Organoidy pasażujące
    UWAGA:     Każda kultura organoidów ma swój własny czas podwajania. Zwykle organoidy jelita cienkiego mogą być pasażowane 1:3−1:5 co 7−10 dni. W przypadku pasażowania jako pojedyncze komórki, wydajność pasażowania może wynosić do 1:20, w zależności od gęstości komórek. W celu założenia i utrzymania organoidy są hodowane na płytkach 24-dołkowych; do testu LDF, w płytkach 24- lub 96-dołkowych.
    1. preparat
      1. Wstępnie ogrzać rozpakowane 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 co najmniej przez noc, a najlepiej 5 dni wcześniej.
        nuta: Wstępne podgrzanie płytek do hodowli tkankowych w inkubatorze do hodowli komórkowych zapewnia prawidłowe tworzenie i przyłączanie kropelek BMM zawierających organoidy.
      2. W celu zmniejszenia liczby cykli zamrażania i rozmrażania, należy przygotować 1 ml porcji BMM i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić fiolkę BMM na lodzie co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem procedury pasażowania organoidów.
      3. Trzymaj probówkę BM o pojemności 50 ml na lodzie jako medium do mycia.
      4. Przygotować hSI-EM zgodnie z opisem w sekcji 1.4 i przygotować odpowiednią ilość hSI-EM+Y, na przykład 15 ml na pełną 24-dołkową płytkę.
    2. Zbieraj organoidy.
      1. Ostrożnie zassać pożywkę hodowlaną, nie naruszając kropelek BMM.
      2. Dodać 500 μl zimnego BM do pierwszego dołka organoidów i rozbić kropelki BMM z organoidami, delikatnie pipetując w górę iw dół pipetą P1000.
      3. Powtórz tę procedurę z tym samym podłożem w następnym dołku, zgodnie z wymaganiami, ale nie zbieraj więcej niż 2 studzienki na 500 μl BM.
      4. Zebrać organoidy w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o niskiej wiązalności i wirować w mini wirówce stołowej przez 15−20 s (maks. 2 000 x g). Całkowicie odessać supernatant i usunąć ostatnią część pożywki za pomocą pipety P200.
        nuta: Gdy hodowle organoidów wyglądają na czyste pod mikroskopem i nie zawierają żadnych martwych komórek ani innych zanieczyszczeń, krople BMM można zebrać bezpośrednio w trypsynie zamiast w BM w kroku 2.1.2.2. Po kroku 2.1.2.3 przejdź bezpośrednio do inkubacji w kroku 2.1.3.1.
    3. Rozdziel organoidy na pojedyncze komórki.
      1. Dodać 400 μl trypsyny do odwirowanych organoidów. Inkubować organoidy w temperaturze 37 °C przez 5 minut w łaźni wodnej.
      2. Rozbić pozostałe agregaty komórek, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety P200. Ponownie inkubować organoidy w temperaturze 37 °C przez 5 minut w łaźni wodnej.
      3. Sprawdź postęp dysocjacji komórek pod mikroskopem za pomocą 4-krotnego powiększenia. Powtórz ręczne przerywanie i inkubację, gdy pozostaną duże kępy komórek.
      4. Gdy pozostaną tylko pojedyncze komórki, dodaj 1 ml BM i odwiruj komórki w mini wirówce stołowej przez 15-20 s.
      5. Całkowicie odessać supernatant. Zawiesić pojedyncze komórki w 200 μl świeżego hSI-EM za pomocą pipety P200. Dodać dodatkowe 800 μl hSI-EM.
      6. Policz liczbę komórek w zawiesinie.
        nuta: W laboratorium autorów ręczne liczenie zdysocjowanych komórek organoidowych daje bardziej wiarygodne wyniki niż automatyczne liczenie komórek. W przypadku stosowania automatycznego licznika komórek, gęstość komórek do dalszych zastosowań powinna być testowana we własnym zakresie i dostosowywana, jeśli wyrasta zbyt mało lub zbyt wiele organoidów.
    4. Organoidy nasienne do utrzymania lub oznaczania tworzenia kropelek lipidów.
      1. Oblicz objętość komórek, która jest potrzebna do uzyskania końcowej gęstości komórek.
        nuta: Około 250 komórek/μl to odpowiednia gęstość. Na płytce 24-dołkowej 30 μl wysiewa się do każdej studzienki, a 5 μl wysiewa się do każdej studzienki 96-dołkowej.
      2. Wyjąć odpowiednią objętość zawiesiny i dostosować gęstość do 750 komórek/μl (lub odwirować i ponownie zawiesić, gdy gęstość jest zbyt niska).
      3. Dodaj BMM do zawiesiny komórek w stosunku 2:1. Końcowa gęstość komórek w tej mieszaninie wynosi 250 komórek/μl. Zawiesinę należy delikatnie wymieszać pipetując, ostrożnie unikając pęcherzyków.
      4. Na wstępnie podgrzanej płytce do hodowli tkankowej wysiać trzy krople po 10 μl na basenik na płytkę 24-dołkową lub pojedynczą kroplę o pojemności 5 μl na basenik na płytkę 96-dołkową.
      5. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 10−15 min w celu zestalenia kropelek BMM. W międzyczasie należy podgrzać odpowiednią ilość hSI-EM+Y w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      6. Ostrożnie dodać 500 μl wstępnie podgrzanego hSI-EM+Y do każdego dołka na płytce 24-dołkowej lub 100 μl na każdym dołku na płytce 96-dołkowej. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i po 2-3 dniach zmienić pożywkę na hSI-EM (bez Y) i odświeżać 2-3 razy w tygodniu.
        nuta: Po 7-10 dniach należy ponownie przejść hodowlę podtrzymującą organoidów.

3. Test tworzenia kropelek lipidów

  1. Przygotowanie koniugatu kwasu oleinowego
    UWAGA:     Ponieważ kwas oleinowy (OA) jest hydrofobowy i nierozpuszczalny w wodzie, jest sprzężony z albuminą surowicy bydlęcej (BSA). BSA może wiązać wiele cząsteczek kwasów tłuszczowych i w tym przypadku jest stosowany w stosunku 1:8, aby kwas oleinowy był dostępny dla komórek jelitowych. Zarówno wolne kwasy tłuszczowe, jak i BSA mogą wiązać się z plastikowymi naczyniami laboratoryjnymi. Aby zapewnić właściwe stężenie końcowe, należy w miarę możliwości używać szklanych fiolek i szklanych pipet.
    1. Odważyć 0,2 g ciekłego kwasu oleinowego w temperaturze pokojowej. Dodać 1,5 ml sterylnego PBS klasy hodowlanej i podgrzewać mieszaninę do temperatury 70 °C przez 1 godzinę. Wirować z przerwami.
    2. Odważyć 5,89 g BSA wolnego od kwasów tłuszczowych i rozpuścić w 33,9 ml PBS. Ogrzewać mieszaninę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozpuszczenia BSA.
    3. Ponownie przemieszać mieszaninę OA, aby uzyskać emulsję z drobnych kropelek i natychmiast dodać ją do roztworu BSA za pomocą szklanej pipety. Utrzymać końcowy roztwór w temperaturze zbliżonej do 37 °C po dodaniu OA. Ostateczna mieszanina składa się z 20 mM OA w 2,5 mM BSA.
    4. Utrzymywać mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aż pozostanie klarowny żółtawy roztwór.
    5. Koniugat OA-BSA można podakwotować i zamrażać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy. Po rozmrożeniu podwielokrotność należy inkubować w temperaturze 37 °C, aż zmętnienie zniknie i mieszanina znów będzie klarowna.
      nuta: Ze względu na wysoką zawartość białka i lipidów w roztworze końcowym, mieszanina nie może być sterylizowana filtrem ani autoklawowana. Gdy z komponentami obchodzono się ostrożnie, w miarę możliwości w okapie z przepływem laminarnym i przy użyciu sterylnego PBS, autorzy nie doświadczyli infekcji mikrobiologicznych.
  2. Test konfokalny LDF
    1. Przygotowanie próbki
      1. Organoidy pasażowe opisane w sekcji 2.1. Wysiewaj pojedyncze komórki pochodzące z organoidów na czarnej 96-dołkowej płytce z przezroczystym dnem.
      2. W 6 dniu hodowli na hSI-EM zastąpić pożywkę hodowlaną hSI-EM zawierającą 1 mM KONIUGAT OA-BSA.
      3. Inkubować komórki przez 16−17 godzin (przez noc) w temperaturze 37 °C w obecności lub bez 0,1 μM inhibitora DGAT1. Zawiera sterowanie pojazdem o mocy 2,5 mM BSA.
      4. Po 16−17 h odessać pożywkę, nie naruszając kropelek BMM. Utrwalić organoidy, dodając 100 μl 4% obojętnego buforowanego formaldehydu do studzienek przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
        nuta: Formaldehyd częściowo rozpuści BMM, podczas gdy organoidy opadną na dno i przylegają do dna płytki.
      5. Delikatnie usuń formaldehyd i ostrożnie umyj studzienki 150 μl PBS na studzienkę.
      6. Wybarwić komórki pod kątem LD 0,025 mg/ml LD540 i 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      7. Dokładnie umyj studzienki za pomocą PBS.
        nuta: W razie potrzeby w tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu. Próbki pokryte PBS należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C. Barwienie LD540 pozostanie stabilne przez okres do tygodnia. Test ten można również wykonać na żywych komórkach, aby monitorować tworzenie się LD w pewnym okresie czasu. W tym celu utrwalenie należy pominąć w protokole, a DAPI należy zastąpić barwieniem Hoechst. LD540 może barwić LD w żywych komórkach w tym samym stężeniu, jak opisano.
    2. Obrazowanie konfokalne
      nuta: Obrazowanie można przeprowadzić na przygotowanych próbkach organoidów na czarnej 96-dołkowej płytce z przezroczystym dnem.
      1. Aby uzyskać obrazy przeglądowe całych organoidów, użyj obiektywu 40x przystosowanego do konfokalnego obrazowania fluorescencyjnego.
      2. Ustaw mikroskop tak, aby obrazował kanał DAPI przy wzbudzeniu 405 nm i długości fali emisji ok. 410−535 nm. Dla barwnika LD540 wybierz laser wzbudzający o długości fali 540 nm (optymalnie 543 nm) i ustaw filtry emisyjne na 545−700 nm.
        nuta: W tym protokole zastosowano laserowo-skaningowy system konfokalny z laserem światła białego, akustyczno-optycznym rozdzielaczem wiązki (AOBS), obiektywem 10x/20x i systemem detekcji spektralnej. Pozwala to na dokładne dostrojenie do określonych długości fal. Jeśli porównywalny system nie jest dostępny, wybierz linie laserowe i filtry krótko/długoprzepustowe zbliżone do powyższych specyfikacji. W przypadku obrazowania całych organoidów rozdzielczość 512 x 512 lub 1024 x 1024 jest wystarczająca do dalszej analizy obrazu.
      3. Ustaw rozmiar otworka na 1 jednostkę przewiewną (AU), aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość osi z.
      4. Aby zobrazować jedną połowę sferycznego organoidu, ustaw stos z na około 85 μm.
    3. Analiza obrazu
      nuta: Do analizy obrazu użyto Fiji/ImageJ16,17 do wygenerowania maksymalnych projekcji. Analizę można przeprowadzić za pomocą dowolnego pakietu oprogramowania do analizy obrazu, który pozwala na maksymalną projekcję, ręczne progowanie i analizę cząstek.
      1. Korzystając z Fiji/ImageJ, przekształć stos z każdego organoidu do maksymalnej projekcji: Obraz | Stosy | Projekt Z.
      2. Ustawić próg projekcji maksymalnej na poziomie, w którym nie jest widoczny sygnał LD540 w próbce kontrolnej pojazdu BSA: Obraz | Dostosuj | Próg. Użyj tych ustawień, aby określić próg każdego obrazu.
      3. Zmierz całkowitą powierzchnię fluorescencji dla każdej maksymalnej projekcji za pomocą funkcji Analizuj | Analizuj cząstki.
        nuta: Chociaż rozdzielczość testu jest lepsza przy użyciu mikroskopu konfokalnego, test ten można również analizować za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych z podobnymi filtrami. Aby znormalizować liczbę organoidów na studzienkę, sygnał LD540 należy podzielić przez sygnał DAPI. Na koniec należy odjąć sygnał sterowania pojazdem BSA w celu normalizacji pomiarów. Takie podejście pozwala na skalowanie testu do formatu płytki 96-dołkowej.
  3. Test cytometrii przepływowej LDF
    1. Przygotowanie próbki
      1. Organoidy pasażowe opisane w sekcji 2.1. Wysiewaj pojedyncze komórki pochodzące z organoidów na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Do cytometrii przepływowej wystarczą dwie studzienki na warunek.
      2. W 10 dniu hodowli na hSI-EM zastąp pożywkę hodowlaną hSI-EM zawierającą 1 mM KONIUGAT OA-BSA.
        nuta: W przeciwieństwie do analizy konfokalnej, do testu cytometrii przepływowej wybrano 10 dni wzrostu EM zamiast 6 dni. Dodatkowe 4 dni ekspansji spowodują optyczne nakładanie się organoidów, co skomplikuje test oparty na mikroskopii. Jednak większa liczba komórek ułatwia analizę metodą cytometrii przepływowej.
      3. Inkubować komórki przez 16−17 godzin (przez noc) w temperaturze 37 °C w obecności lub bez 0,1 μM inhibitora DGAT1. Zawiera sterowanie pojazdem o mocy 2,5 mM BSA.
      4. Po 16−17 godzinach zebrać organoidy zgodnie z opisem w sekcji 2.1.2.
      5. Rozdzielić organoidy na pojedyncze komórki, jak opisano w sekcji 2.1.3.
        nuta: Chociaż nie jest to ściśle wymagane, zaleca się sprawdzenie liczby komórek w każdej próbce. Całkowita liczba 10 000 komórek na próbkę to absolutne minimum wymagane do uzyskania wystarczającej rozdzielczości. Dla uzyskania optymalnych rezultatów należy użyć ok. 50 000−100 000 komórek.
      6. Wiruj komórki w mini wirówce stołowej przez 15-20 s.
      7. Wybarwić każdą próbkę 500 μl 0,025 mg/ml LD540 i 1 μg/ml Hoechst w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      8. Odwiruj komórki w mini wirówce stołowej przez 15-20 s i umyj 3x PBS.
      9. Utrwal komórki, zawieszając je ponownie w 500 μl 4% obojętnego buforowanego formaldehydu na 15 minut w temperaturze pokojowej.
      10. Zakręć ogniwami i umyj 3x buforem FACS.
      11. Wstępnie przepłucz probówki FACS buforem FACS, aby zapobiec przywieraniu komórek do ścianki probówki.
      12. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS i przenieść zawiesinę komórek do wstępnie przepłukanych probówek FACS.
    2. Analiza cytometryczna przepływowa
      1. Ustaw parametry bramkowania, aby wykluczyć martwe komórki i skupiska komórek (patrz sekcja reprezentatywnych wyników).
      2. W końcowej populacji bramkowanej zmierz co najmniej 10 000 komórek, aby uzyskać wiarygodne wyniki.
        nuta: Z tej populacji średnia intensywność fluorescencji (MFI) LD540 i średni sygnał SSC-A razem stanowią miarę całkowitej objętości tworzenia LD na komórkę.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla prawidłowej analizy powstawania LD, organoidy nie powinny być zbyt gęsto wysiewane przed stymulacją OA i późniejszym barwieniem. Jest to szczególnie ważne dla odczytu konfokalnego i czytnika płytek, ponieważ nakładające się na siebie organoidy mogą zakłócać fluorescencję. Pokazano przykład prawidłowej gęstości wysiewu organoidów (Rysunek 1A) oraz kulturę z nakładającymi się organoidami (Rysunek 1B). Aby zminimal...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół określający tworzenie LD w organoidach jelitowych człowieka podczas inkubacji z kwasem oleinowym. Metoda ta opiera się na barwniku fluorescencyjnym LD LD54018, który pozwala na scharakteryzowanie i ilościowe określenie całkowitej objętości kropelek lipidów w kulturze organoidów. Procedury tworzenia i utrzymywania kultur organoidów jelitowych człowieka zostały opublikowane przed13 rokiem, a wizualny przewodnik po tym protokole jest równie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy B. Spee za hojne dostarczenie LD540. Prace te były wspierane przez grant Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) do S.M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zaawansowany DMEM/F12Gibco12634-028
B27 suplement Gibco17504-044
Macierz błony podstawnej (matrigel)BD Biosciences356231
DAPISigma-AldrichD9542-1MG
Inhibitor DGAT1 (AZD 3988)Tocris Bioscience4837/10
Bez kwasów tłuszczowych BSASigma-AldrichA7030
FormaldehydKlinipath4078-9001
Glutamina (GlutaMAX, 100x)Gibco15630-056
HEPES (1 M)Gibco15630-080
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyLeicaSP8X
LD540dzięki uprzejmości dostarczonej przez Dr. B. Spee, Uniwersytet w Utrechcie
mEGFPeprotech315-09_500ug
N-acetylocysteinaSigma-AldrichA9165-100G
NikotynamidSigma-AldrichN0636-500G
Komórki produkujące nogginę (komórki HEK293-mNoggin-Fc)MTA z J. den Hertog, Instytut Hubrechta
Kwas oleinowySigma-AldrichO1008-5G
p38 Inhibitor MAPK (p38i) (SB202190)Sigma-AldrichS7067-25MG
PBSSigma-AldrichD8662-500ML
PBS bez Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537-500ML
Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/mL)Gibco15070-063
Komórki wytwarzające R-spondynę (komórki Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T)R& Systemy D3710-001-01
24-dołkowe płytki z TCGreiner-One662160
czarne płytki 96-dołkowe z przezroczystym dnem poddane TCCorning Life Sciences353219
Inhibitor receptora TGFb typu I (A83-01) Tocris Bioscience2939/10
Trypsyna (TrypLE Express)Life Technologies12604021
Komórki wytwarzające WNT-3A (komórki L-Wnt-3A)MTA z J. den Hertog, Hubrecht Institute
Y-27632 dichlorowodorek (inhibitor kinazy Rho)Abcamab120129-10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
  2. Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
  3. D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
  4. Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
  5. Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
  6. van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
  7. Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
  8. Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
  9. Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
  10. Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
  11. Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
  12. Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
  13. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  14. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  15. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159(2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  18. Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
  19. Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lipid Droplet FormationHuman Intestinal OrganoidsOleic Acid StimulationConfocal MicroscopyFlow CytometryFluorescent Plate ReaderLD540 DyeDGAT1 InhibitorOrganoid CultureLipid Droplet Quantification

Related Articles