Pożywka Preparat do hodowli mikroorganizmów w warunkach ściśle beztlenowych/beztlenowych

Andreas  O. Wagner; Rudolf Markt; Mira Mutschlechner; Nina Lackner; Eva  M. Prem; Nadine Praeg; Paul Illmer

doi:10.3791/60155

Artykuł metodologiczny

Pożywka Preparat do hodowli mikroorganizmów w warunkach ściśle beztlenowych/beztlenowych

DOI:

10.3791/60155

⸱

15 sierpnia 2019

Andreas O. Wagner^*¹ , Rudolf Markt^*¹ , Mira Mutschlechner^*¹ , Nina Lackner^*¹ , Eva M. Prem^*¹ , Nadine Praeg¹ , Paul Illmer¹

¹Department of Microbiology, Universität Innsbruck

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ organizmy beztlenowe nie są w stanie rosnąć po ekspozycji na tlen, niezbędne jest stosowanie technik hodowli beztlenowej. W tym miejscu demonstrujemy prostą i skuteczną metodę uprawy mieszanej kultury pochodzącej z biogazowni, od przygotowania pożywki do ilościowego oznaczania gazu i lotnych kwasów tłuszczowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przeciwieństwie do organizmów tlenowych, mikroorganizmy czysto beztlenowe wymagają braku tlenu i zazwyczaj niskiego potencjału redoks do zainicjowania wzrostu. Ponieważ tlen jest wszechobecny w powietrzu, utrzymanie warunków wolnych od_O2 na wszystkich etapach uprawy jest trudne, ale jest warunkiem wstępnym hodowli beztlenowej. Przedstawiony tutaj protokół pokazuje udaną uprawę beztlenowej kultury mieszanej pochodzącej z biogazowni przy użyciu prostej i niedrogiej metody. Podano dokładny opis całego procesu hodowli beztlenkowej, w tym przygotowanie pożywki, napełnianie kolb hodowlanych, suplementację wskaźnikiem redoks i środkami redukującymi w celu zapewnienia niskich potencjałów redoks, a także wymianę przestrzeni nad podłożem w celu utrzymania pożywki wolnej od tlenu. Ponadto przedstawiono szczegółowy przegląd aseptycznego zaszczepiania gazoszczelnych kolb surowicy (przy użyciu sterylnych strzykawek i igieł) oraz odpowiednich warunków inkubacji. Niniejszy protokół dodatkowo omawia pobieranie próbek gazów i cieczy w celu przeprowadzenia późniejszych analiz dotyczących składu gazu i stężeń lotnych kwasów tłuszczowych przy użyciu odpowiednio chromatografii gazowej (GC) i wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz obliczania uzysku biogazu i metanu z uwzględnieniem prawa gazu doskonałego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na Ziemi tlen cząsteczkowy w znaczących stężeniach jest dostępny w obszarach mających bezpośredni kontakt z atmosferą lub w obecności tlenowych fototrofów. Środowiska, w których nie ma tlenu, nazywane są beztlenowcami. Jednak konwersja energii jest nadal możliwa w warunkach beztlenowych poprzez dwa różne procesy metaboliczne, fermentację i oddychanie beztlenowe¹.

Podczas gdy organizmy poddawane oddychaniu tlenowemu używają tlenu jako końcowego akceptora elektronów, oddychanie beztlenowe wymaga alternatywnych akceptorów elektronów, takich jak azotany lub siarczany². W tak zwanej "wieży elektronowej" pary redoks są zorganizowane zgodnie z ich potencjałem redoks, przy czym najbardziej ujemne znajdują się na górze (donory elektronów), a najsilniejsze czynniki utleniające o dodatnim potencjale redoks na dole (akceptory elektronów). Transfer elektronów między donorami i akceptorami prowadzi do zachowania energii poprzez tak zwany łańcuch oddechowy, a elektrony mogą być wychwytywane przez akceptory elektronów - aby pozostać w obrazie - na różnych piętrach wieży. W związku z tym, im większy spadek elektronów przez wieżę elektronową, tym więcej energii można zachować w danej reakcji. Dlatego oddychanie jest również możliwe w siedliskach beztlenowych, na przykład z parami redoks, w tym NO₃^-/NO₂^-, kwas fumarowy/kwas bursztynowy, SO₃^2-/H₂S, S°/H₂S, Mn(IV)/Mn(II), Fe(III)/Fe(II)²^,³. Po pierwsze, uzyskana energia jest zachowywana jako potencjał błonowy, który jest następnie wykorzystywany przez fosforylację transportu elektronów do syntezy adenozyno-trifosforanu (ATP) przez syntazy ATP związanych z błoną. W przeciwieństwie do oddychania tlenowego, ilość energii, którą można zachować dzięki oddychaniu beztlenowemu, może zostać radykalnie zmniejszona; Jednak wydajność energetyczna większości oddychania beztlenowego jest nadal wyższa w porównaniu z fermentacją, beztlenową ścieżką oszczędzania energii w siedliskach pozbawionych tlenu i innych końcowych akceptorów elektronów².

Podczas fermentacji, bogate w energię, organiczne substraty są rozkładane na różne produkty fermentacji, które często definiują nazwę całego procesu, na przykład fermentacja alkoholowa. W przeciwieństwie do procesów oddychania, wytwarzanie ATP podczas fermentacji jest ograniczone do fosforylacji na poziomie substratu, podczas której grupa fosforanowa jest przenoszona do difosforanu adenozyny (ADP) z bogatego w energię fosforylowanego substratu². Mikroorganizmy fermentujące odgrywają kluczową rolę w beztlenowej degradacji materii organicznej, ponieważ odgrywają kluczową rolę w rozkładzie substratu. Pierwotne produkty fermentacji, takie jak kwasy organiczne, alkohole, CO₂ i_H2, mogą być następnie wykorzystywane przez wtórne mikroorganizmy fermentacyjne do produkcji kwasu octowego, CO₂ i_H2. Przykłady produktów fermentacji obejmują kwas mlekowy, różne lotne kwasy tłuszczowe (kwas mrówkowy, octowy, propionowy, masłowy i walerianowy), n-butanol, 2,3-butandiol, aceton i etanol.

Hodowla mikroorganizmów w warunkach czysto beztlenowych wymaga zupełnie innych metod i sprzętu w porównaniu z hodowlą organizmów tlenowych. Podczas gdy organizmy tolerancyjne na tlen są często hodowane na szalkach agarowych, tak zwanych kulturach powierzchniowych, jest to - z kilkoma wyjątkami - prawie niemożliwe w przypadku mikroorganizmów ściśle beztlenowych. W związku z tym wzbogacanie mikroorganizmów ściśle beztlenowych odbywa się głównie w pożywkach płynnych przy użyciu naczyń hodowlanych uszczelnionych gazoszczelnymi przegrodami, które zapewniają atmosferę wolnej od tlenu⁴^,⁶^,⁷.

Obecny opis protokołu zapewni odpowiednie metody uprawy dla docelowych mikroorganizmów z mieszanej populacji pochodzącej z beztlenowej biogazowni. Izolacja i kultywacja czystych kultur jest jeszcze większym wyzwaniem, ale nie jest częścią tej pracy.

Tutaj pokazujemy procedurę hodowli beztlenowej społeczności mikrobiologicznej na podstawie badania dotyczącego tworzenia się kwasów fenylowych podczas beztlenowej fermentacji substratów białkowych⁸. Społeczność mikrobiologiczna składała się z członków ze wszystkich czterech faz fermentacji beztlenowej: hydrolizy, kwasogenezy, acetogenezy i metanogenezy. Zastosowano pożywkę z solą mineralną uzupełnioną źródłem węgla, wskaźnikiem redoks, roztworem witamin i pierwiastków śladowych oraz środkiem redukującym⁹. Pożywka została zmodyfikowana odpowiednimi białkowymi substratami prekursorowymi kwasu fenylowego⁸.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie podłoża

Przygotować roztwór podstawowy wskaźnika redoks (0,1 g rezazuryny/100 ml roztworu wodnego).
Przygotować roztwór witaminowy (Tabela 1).
Przygotować roztwór pierwiastka śladowego (tabela 2).
UWAGA: Kolejność dodawania jest ważna; należy zapoznać się z tabelą 2 i odpowiednimi protokołami.
Przygotować roztwór podstawowy środka redukującego (60 g Na₂S/L roztworu wodnego).
Zważyć składniki pożywki (pożywka z solą mineralną, tabela 3) w odpowiedniej kolbie (np. kolbie laboratoryjnej o pojemności 1 l z nakrętką).
UWAGA: W zależności od konfiguracji eksperymentalnej może być konieczne dodanie oddzielnego źródła węgla.
Dodać połowę objętości wody destylowanej (tabela 3) i rozpuścić składniki.
Dodać 1 ml roztworu wskaźnika redoks zgodnie z tabelą 3.
Dodać roztwór witamin i pierwiastków śladowych zgodnie z tabelą 3.
Dostosuj pH zgodnie z wymaganiami pożywki/organizmu w tabeli 3.
UWAGA: Kolor wskaźnika redoks jest zależny od pH i może wymagać trochę czasu, aby się dostosować.
Doprowadzić do końcowej objętości 1 l wodą destylowaną.
UWAGA: Roztwory witamin i pierwiastków śladowych można również dodawać po autoklawowaniu poprzez aseptyczne dodawanie wysterylizowanej filtrem porcji (rozcieńczone roztwory, wielkość porów filtracyjnych < 0,2 μm) do uprzednio zamkniętych i autoklawowanych kolb surowicy. Takie podejście wiąże się jednak z podwyższonym ryzykiem zanieczyszczenia.

2. Napełnianie kolb uprawowych

Dokładnie wyczyść i osusz kolby na surowicę o pojemności 120 ml.
UWAGA: Kolby na surowicę są dostępne w różnych pojemnościach (np. 20, 60, 120, 250 ml).
Dokładnie oczyść i osusz septę z kauczuku butylowego.
Zważyć dodatkowe składniki pożywki (np. substraty prekursorowe kwasu fenylowego) w kolbach hodowlanych.
UWAGA: Dodatkowe składniki zależą od konfiguracji eksperymentu i hipotezy.
Napełnij kolby z surowicą 50 ml pożywki.

3. Redukcja/usuwanie tlenu w fazie ciekłej

Przygotuj łaźnię wodną o temperaturze ~100°C.
Wypełnione kolby surowicy umieścić w łaźni wodnej i inkubować przez ok. 20-30 min w celu zmniejszenia rozpuszczalności_O2 w fazie ciekłej.
Natychmiast przepłukać przestrzeń nad głową gazem_N2 lub alternatywnie innym gazem lub mieszaninami gazów, takimi jak N₂/CO₂,
UWAGA: Zadbaj o odpowiednią wentylację pomieszczenia.
Zamknąć kolby przegrodą z kauczuku butylowego i przymocować aluminiowymi nasadkami.
UWAGA: Przegrody gumowe mogą często lepiej pasować do szyjki kolby, dodając kroplę wody/podłoża podczas wiercenia.
Dodać 0,1 ml środka redukującego (roztworu podstawowego) do każdej kolby wypełnionej 50 ml pożywki, aby jeszcze bardziej zmniejszyć potencjał redoks (0,1 ml środka redukującego na 50 ml pożywki).
Autoklaw przez 20 min w temperaturze 121 °C.
UWAGA: Należy używać autoklawu certyfikowanego do sterylizacji zamkniętych naczyń. W przeciwnym razie nadciśnienie wynikające ze wzrostu temperatury może spowodować eksplozję kolb surowicy.

4. Inokulacja pożywki

Przygotować inokulum z beztlenowej komory fermentacyjnej.
1. Dodaj 400 ml wody destylowanej do kolby i doprowadź do wrzenia.
2. Schłodzić (< 30 °C), jednocześnie trwale przepłukując przestrzeń nad głową roztworem N₂.
3. Dodać ok. 100 g osadu pochodzącego z beztlenowej komory fermentacyjnej.
  UWAGA: Unikać nadmiernego kontaktu szlamu z tlenem.
4. Zanotować dokładną masę dodanego osadu w celu dokładnego określenia rozcieńczenia.
5. Zamienić przestrzeń nad kolbą na_N2 i zamknąć ją przegrodą z kauczuku butylowego.
6. Potrząsać kolbą przez 30 minut przy prędkości 120 obr./min.
Za pomocą strzykawki + kaniuli usunąć 5 ml inokulum i wstrzyknąć do przygotowanych kolb surowicy, jak opisano w kroku 1-3.

5. Inkubacja, pobieranie próbek i analiza

Inkubować zaszczepione kolby surowicy w temperaturze odpowiedniej dla danego doświadczenia.
UWAGA: Temperatura inkubacji zależy od konfiguracji eksperymentalnej i użytego inokulum.
1. Spuścić nadciśnienie wynikające ze wzrostu temperatury za pomocą strzykawki + kaniuli, gdy płyn w kolbach surowicy zrównoważy się z temperaturą inkubacji (około 15 – 30 min, w zależności od temperatury inkubacji).
  UWAGA: W zależności od zastosowanego substratu, jego stężenia, temperatury, czasu inkubacji, rodzaju inokulum i stężenia, nadciśnienie w kolbach może wzrosnąć nawet o > 2 bary i spowodować eksplozję płatków surowicy. Monitorowanie nadciśnienia za pomocą manometru, a następnie odprowadzanie nadciśnienia za pomocą kaniuli jest zatem obowiązkowe.
Ocena produkcji i składu biogazu w czasie inkubacji.
UWAGA: Okres inkubacji może trwać od kilku dni do kilku tygodni.
1. Zapisz aktualne ciśnienie atmosferyczne.
2. Przygotować manometr i ocenić ciśnienie w kolbach wynikające z aktywności mikrobiologicznej.
3. Potrząsnąć kolbami.
4. Usunąć 1 ml gazu w przestrzeni nadpowierzchniowej za pomocą strzykawki + kaniuli i zmierzyć stężenia_H2,_O2, CH4 i/lub_CO2 metodą chromatografii gazowej.
  UWAGA: Do kwalifikacji i oznaczania ilościowego_H2,_O2,_CH4 i CO 2 użyto chromatografu gazowego_, stosując temperatury robocze 160 °C (piec kolumnowy), 100 °C (wtryskiwacz) i 180 °C (detektor przewodności cieplnej, TCD). N₂ był używany jako gaz nośny. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z poprzednimi badaniami¹⁰.
Monitoruj stężenia lotnych kwasów tłuszczowych (LKT) i fenylowych kwasów. Do analizy LKT i kwasu fenylowego należy użyć systemu HPLC wyposażonego w detektor UV (przy 220 nm) pracujący z 5 mM H₂SO₄ jako fazą ruchomą. Szczegółowe informacje na temat metody i dodatkowe informacje na temat przechowywania próbek można znaleźć w poprzednich badaniach¹¹.
UWAGA: Analiza LKT jest wzorcowa dla wielu innych analiz fizykochemicznych lub ocen mikroskopowych. Ponadto przy użyciu opisanej procedury można zastosować metody biologii molekularnej ukierunkowane na liczebność określonych mikroorganizmów i/lub skład społeczności drobnoustrojów w określonym momencie eksperymentu.
1. Usunąć 1 ml płynu za pomocą strzykawki + kaniuli.
  UWAGA: Próbki można zamrozić (-20 °C) natychmiast po pobraniu i przeanalizować pod koniec eksperymentu¹¹.
2. Odwirować przy 15 000–20 000 x g i przepuścić przez filtry RC (regenerowana celuloza) 0,2 μm.
3. Wstrzyknąć 5-20 μl do systemu HPLC i przeanalizować skład VFA i stężenie kwasów fenylowych.
Opróżnij nadciśnienie kolby za pomocą kaniuli.
UWAGA: Po określeniu ciśnienia i składu gazu, a także pobraniu wszelkich niezbędnych próbek, należy ponownie ustawić kolbę hodowlaną na odpowiedniej temperaturze i nie spuszczać nadciśnienia, dopóki ciecz nie osiągnie temperatury inkubacji.
Oblicz produkcję biogazu i metanu V_CH4N z uwzględnieniem prawa gazu doskonałego, korzystając z równania 1-3. Proszę również zapoznać się z tabelą 4.
Równanie 1:
gdzie
Równanie 2:
oraz
Równanie 3:
UWAGA: W celu obliczenia całkowitej produkcji biogazu ilość CH_4% i CH_4%X w równaniach 2 i 3 musi być ustawiona na 100. NmL: znormalizowana objętość gazu w znormalizowanych warunkach (0 °C, 1 atm), w której molowa objętość gazu wynosi 22.414 NmL/mmol.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolby do uprawy zostały wypełnione podłożem w warunkach beztlenowych zgodnie z protokołem opisanym powyżej, sprawdzone pod kątem odpowiedniego koloru (Rysunek 1) i użyte jako miniaturowe bioreaktory wsadowe przeprowadzające fermentację beztlenową. Zostały one zmodyfikowane substratami potencjalnie powodującymi tworzenie się fenylu i inkubowane przy użyciu osadu z fermentacji beztlenowej jako inokulum (Rysunek 2). Tryptofan, tyrozyna i fenyloalanina, a także złożony białkowy prekursor ekstrakt mięsny i kazeina zastosowano odpowiednio w dwóch i trzech różnych stężeniach. Kontrole przygotowano bez dodatkowej suplementacji substratem. Różne stężenia substratów mające na celu symulację różnych etapów przeciążenia. Kolby inkubowano w temperaturze 37 °C (mezofilne) przez 4 tygodnie.

Produkcja i skład biogazu (H₂, CH₄, CO₂) były regularnie monitorowane za pomocą chromatografii gazowej (GC TCD)¹⁰ i oceny ciśnienia w przestrzeni nad powierzchnią. Rysunek 3 pokazuje różnice w skumulowanej produkcji metanu pochodzącej z trawienia zastosowanych substratów w różnych stężeniach podczas 4 tygodni inkubacji beztlenowej. Poza tym metanogeny zwizualizowano poprzez napromieniowanie koenzymu F₄₂₀, nośnika elektronów w metanogenezie, wykazującego niebiesko-zieloną fluorescencję z maksimum absorpcji przy 420 nm (Rysunek 4).

Równolegle z analizą gazu, próbki do pomiarów stężenia VFA i kwasu fenylowego za pomocą HPLC¹¹ zostały pobrane i przechowywane w stanie zamrożonym do czasu dalszego przetwarzania. Rysunek 5 pokazuje efekt różnych etapów przeciążenia, odzwierciedlony przez nagromadzenie w wysoce przeciążonych próbkach, przykładowo przedstawionych dla octanu. Rysunek 6 przedstawia dynamikę stężeń octanu fenylu w okresie inkubacji.

figure-results-1
Rysunek 1: Wskaźnik redoks. Prawidłowy potencjał redoks w kolbach hodowlanych można kontrolować, dodając wskaźnik redoks. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Miniaturowe bioreaktory wsadowe. Miniaturowe bioreaktory wsadowe przygotowane w 120 ml kolbach hodowlanych do eksperymentów z fermentacją beztlenową. Kolby wypełniono pożywką i zaszczepiono rozcieńczonym osadem z fermentacji. Reaktory były szczelnie zamknięte korkami z gumy butylowej i aluminiowymi nasadkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Produkcja metanu. Skumulowana produkcja metanu w ciągu 28 dni inkubacji mezofilnej z reaktorów odzwierciedlających różne warunki przeciążenia (niskie, średnie, wysokie). Ciąg dalszy: kontrola; Tryp: tryptofan; Opona: tyrozyna; Phe: fenyloalanina; ME: ekstrakt mięsny; Cas: kazeina. Jest to zmodyfikowana figura pochodząca z wcześniejszego badania⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Fluorescencyjne metanogeny. Metanogeny emitują niebieskawe światło, gdy są wzbudzone światłem UV. Tutaj metanogeny są przyłączone do cząstek roślinnych (jasnozielony). Próbki pobrano z reaktora wsadowego, rozcieńczono do mikroskopii i natychmiast poddano analizie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Stężenie octanu. Stężenie octanu podczas 28 dni inkubacji mezofilnej w reaktorach odzwierciedlających różne warunki przeciążenia (niskie, średnie, wysokie). Ciąg dalszy: kontrola; Tryp: tryptofan; Opona: tyrozyna; Phe: fenyloalanina; ME: ekstrakt mięsny; Cas: kazeina. Jest to zmodyfikowana figura pochodząca z wcześniejszego badania⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Stężenie fenylooctanu. Stężenie octanu fenylu podczas 28 dni inkubacji mezofilnej w reaktorach odzwierciedlających różne warunki przeciążenia (niskie, średnie, wysokie). Ciąg dalszy: kontrola; Tryp: tryptofan; Opona: tyrozyna; Phe: fenyloalanina; ME: ekstrakt mięsny; Cas: kazeina. Jest to zmodyfikowana figura pochodząca z wcześniejszego badania⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Reakcja resazuryny. Rezazuryna o barwie niebieskiej ulega nieodwracalnej redukcji do rezorufiny (różowej) i dalszej odwracalnej redukcji do bezbarwnej dihydrorezorufiny zgodnie z Uzarski et al.¹². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Cyjanokobalamina	0,050 gr
Kwas 4-aminobenzoesowy	0,050 gr
D-biotyna	0,010 gr
Kwas nikotynowy	0,100 gr
pirydoksyna	0,250 gr
Kwas D-pantotenowy	0,025 gr
Chlorek tiaminy HCl	0,18 gr
woda destylowana	1000 ml

Tabela 1: Roztwór witamin.

25% (w/v) HCl	10,0 ml
FeCl₂ x 4 H₂O	1,50 gr
ZnCl₂	0,070 gr
MnCl₂ x 4 H₂O	0,100 gr
H₃BO₃	0,006 gr
CoCl₂ x 6 H₂O	0,190 gr
CuCl₂ x 2 H₂O	0,002 grama
NiCl₂ x 6 H₂O	0,024 gr
Na₂MoO₄ x 2 H₂O	0,036 gr
woda destylowana	990,0 ml
Zalecenia dotyczące przygotowania	Dodać HCl i rozpuść FeCl₂, dodać 100 ml wody destylowanej, rozpuść pozostałe składniki i uzupełnić do 1000 ml.

Tabela 2: Roztwór pierwiastków śladowych.

Zawartość NaCl	1,0 gr
MgCl₂ x 6 H₂O	0,4 grama
KH₂PO₄	0,2 grama
Kcl	0,5 grama
CaCl₂ x 2 H₂O	0,15 grama
L-cysteina	0,5 grama
Ekstrakt drożdżowy	1,0 gr
Roztwór resazuryny	1 ml
Roztwór witaminowy	1 ml
Roztwór pierwiastków śladowych	1 ml
woda destylowana	1000 ml
ph	7.2

Tabela 3: Minimalna zawartość soli.

zmienna	jednostka	opis
_{t Y}	[d]	Punkt czasowy pomiaru
t_X	[d]	Punkt czasowy poprzedniego pomiaru
p_M	[mbar]	Zmierzone nadciśnienie przy t_Y
p_A	[mbar]	Ciśnienie otoczenia przy t_Y
p_AX	[mbar]	Ciśnienie otoczenia przy t_X
p_S	[mbar]	Ciśnienie standardowe, 1013,25 mbar zgodnie z DIN 1343
T_I	[K]	Temperatura inkubacji
T_S	[K]	Temperatura standardowa, 273,15 K (odpowiada 0° C) zgodnie z DIN 1343
V_H	[ml]	Objętość przestrzeni nad_{roztworem przy t Y}
V_HX	[ml]	Objętość przestrzeni nad głową przy t_X
CH_4%	[vol%]	Stężenie metanu zgodnie z pomiarem GC w t_Y
CH_4%X	[vol%]	Stężenie metanu zgodnie z pomiarem GC w temperaturze t_X
V_CH4T	[Nml]	Całkowita ilość metanu w butelce surowicy w temperaturze t_Y
V_CH4R	[Nml]	Ilość metanu resztkowego w przestrzeni nad roztworem przy t_X
V_CH4N	[Nml]	Nowo wytworzony metan od t_Xdo t_Y

Tabela 4: Opis zmiennych w równaniu 1 - 3.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najważniejszym i krytycznym etapem hodowli mikroorganizmów beztlenowych jest zapewnienie warunków beztlenowych w podłożach uprawowych i przestrzeni nad kolbami. Wskaźnik, taki jak rezazuryna, może być używany do pośredniego sprawdzania prawidłowego beztlenowego napełniania kolb. Rezazuryna jest powszechnie stosowanym barwnikiem redoks, ponieważ jest niedroga, nietoksyczna i już skuteczna w niskich dawkach i krótkich czasach inkubacji ¹². Po włączeniu do pożywki niebieska rezazuryna najpierw przechodzi nieodwracalny etap redukcji do rezorufy, która jest różowa przy neutralnych wartościach pH. Ta pierwsza reakcja może wystąpić, gdy media są podgrzewane ¹³. Następnie rezorufina jest redukowana do bezbarwnej dihydrorezorufiny w odwracalnej reakcji wtórnej (ryc. 7)¹². Układ redoks rezorufin/dihydrorezorufina staje się całkowicie bezbarwny przy standardowym potencjale utleniająco-redukcyjnym około E_h = -110 mV i zmienia kolor na różowy powyżej potencjału redoks -51 mV ¹³.

W celu dalszego zmniejszenia potencjału redoks, na przykład w celu ułatwienia wzrostu mikroorganizmów metanogennych, o których wiadomo, że wymagają mniej niż -200 mV¹⁴, można dodać roztwór Na₂S. Alternatywnie powszechnie stosuje się cysteinę-HCl, tioglikolan sodu lub ditionian sodu. Jednak to, który środek redukujący jest odpowiedni do zastosowania, zależy od odpowiedniej konfiguracji eksperymentalnej i może wymagać szczególnej uwagi. Na przykład tioglikolan sodu wymaga aktywacji temperaturowej (np. przez autoklawowanie).

Dobrze zbilansowane konsorcjum mikrobiologiczne, składające się z różnych rodzajów bakterii i archeonów, oraz wydajnie działająca kaskada degradacji beztlenowej mogą być dalej oceniane poprzez określenie składu gazu w przestrzeni nadbrzeżnej w kolbach hodowlanych za pomocą chromatografii gazowej. W przypadku pracy ze związkami takimi jak kwasy fenylowe pochodzące z różnych prekursorów, ocena przestrzeni nad roztworem jest szybkim sposobem sprawdzenia procesu metanogenezy⁸. Stężenie CH₄ w przestrzeni nad powierzchnią ok. 50-60% w kontrolach pod koniec okresu inkubacji wskazuje na pomyślne wykorzystanie zastosowanych składników odżywczych, a tym samym mineralizację materiału organicznego w warunkach beztlenowych. Teoretyczną produkcję metanu i przewidywane stężenia metanu podczas procesu mineralizacji można wyznaczyć ex ante zgodnie z równaniem Buswella-Boyle'a po elementarnej analizie substratu lub poprzez oszacowanie zawartości węglowodanów, białek i tłuszczów w podłożu. Zgodnie z VDI 4630 ¹⁵ węglowodany mogą prowadzić do teoretycznej produkcji biogazu na poziomie 750 l ^kg-1 VSS (50% CH₄ i 50% CO_{2 ),} białka do 800 L ^kg-1 VSS (72% CH₄ i 28 % CO₂), a tłuszcze do 1 390 L ^kg-1 VSS (60% CH₄ i 40% CO₂ ).

Ponadto monitorowano powstawanie i ewentualną późniejszą degradację LKT i fenylowo-kwasów. Proces degradacji można ocenić, analizując stężenia LKT (np. octanu, propionianu) w różnych punktach czasowych. Nagromadzenie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, takich jak octan i/lub propionian, może wskazywać na zaburzenia w składzie zbiorowiska metanogennego i ogólne przeciążenie reaktora. Jednak dobrze zrównoważona kaskada degradacji mikrobiologicznej może poradzić sobie nawet z bardzo wysokimi stężeniami LKT i octanu⁹. Poza tym stosunek octanu do propionianu może dostarczyć dalszych informacji na temat ogólnego stanu reaktora¹⁶. Istnieje jednak wiele parametrów odpowiednich do monitorowania procesu, które należy dobrać zgodnie z zaproponowanymi hipotezami eksperymentalnymi. W niniejszym przykładzie zmiennymi docelowymi były stężenia kwasu fenylowego (ryc. 6).

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF): numery projektów P 29360 i P 29143. Publikacja była wspierana przez Publikationsfonds der Universität Innsbruck. Wielkie uznanie dla EIG.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
kolby hodowlane (120 mL, N20)	Ochs, Niemcy	102046
buty gumowe septy (N20)	Ochs, Niemcy	102049
kapsle aluminiowe (N20)	Ochs, Niemcy	102050
N2 gaz	Messer, Austria		czystość 5.0
strzykawki + kaniule	różne
zaciskarki	Ochs, Niemcy
odtłuszczanie	Ochs, Niemcy	102052
GC2010	Shimadzu
Shin-carbon GC	kolumna Restek		chromatograficzna separacja H2, O2, CH4 i CO2
HPLC Promencja	Shimadzu
Fast Fruit Kolumna HPLC	Fenomenex		chromatograficzna separacja VFA, fenylowych kwasów, itd.

102051

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiebe, W. J., et al. Anaerobic Respiration and Fermentation. The Ecology of a Salt Marsh. Pomeroy, L. R., Wiegert, R. G. , Springer New York. New York, NY. 137-159 (1981).
Kim, B. H., Gadd, G. M. Anaerobic fermentation. Bacterial physiology and metabolism. Kim, B. H., Gadd, G. M. , Cambridge University Press. Cambridge. 252-297 (2008).
Stolz, J. F., Oremland, R. S. Bacterial respiration of arsenic and selenium). FEMS Microbiology Reviews. 23 (5), 615-627 (1999).
Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic Methanogenesis and Autotrophic Growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).
Mutschlechner, M., Praeg, N., Illmer, P. The ecological importance of grazing to methane fluxes and engaged microbial communities in alpine forest soils. FEMS Microbiology Ecology. , (2018).
Prem, E. M., Reitschuler, C., Illmer, P. Livestock grazing on alpine soils causes changes in abiotic and biotic soil properties and thus in abundance and activity of microorganisms engaged in the methane cycle. European Journal of Soil Biology. 62, 22-29 (2014).
Praeg, N., Wagner, A. O., Illmer, P. Effects of fertilisation, temperature and water content on microbial properties and methane production and methane oxidation in subalpine soils. European Journal of Soil Biology. 65, 96-106 (2014).
Wagner, A. O., Prem, E. M., Markt, R., Kaufmann, R., Illmer, P. Formation of phenylacetic acid and phenylpropionic acid under different overload conditions during mesophilic and thermophilic anaerobic digestion. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 359(2019).
Lins, P., Malin, C., Wagner, A. O., Illmer, P. Reduction of accumulated volatile fatty acids by an acetate-degrading enrichment culture. FEMS Microbiology Ecology. 71 (3), 469-478 (2010).
Wagner, A. O., Hohlbrugger, P., Lins, P., Illmer, P. Effects of different nitrogen sources on the biogas production - a lab-scale investigation. Microbiological research. 167 (10), 630-636 (2012).
Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).
Uzarski, J. S., DiVito, M. D., Wertheim, J. A., Miller, W. M. Essential design considerations for the resazurin reduction assay to noninvasively quantify cell expansion within perfused extracellular matrix scaffolds. Biomaterials. 129, 163-175 (2017).
Costilow, R. N., Breznak, J. A., et al. Physicochemical Factors in Growth. Methods for General and Molecular Microbiology. Marzluf, G. A. , Third Edition, 309-329 (2007).
Le Mer, J., Roger, P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: a review. European Journal of Soil Biology. 37 (1), 25-50 (2001).
Verein deutscher Ingenieure VDI 4630: Fermentation of organic material. VDI Richtlinien. , (2006).
Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hodowla beztlenowa warunki beztlenowe wska nik redoks rodki redukuj ce przygotowanie kolb z surowic p ukanie azotem chromatografia gazowa analiza HPLC obliczanie wydajno ci biogazu lotne kwasy t uszczowe

Pożywka Preparat do hodowli mikroorganizmów w warunkach ściśle beztlenowych/beztlenowych

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły