Pomiar aktywności chitynazy w próbkach biologicznych

Podsumowanie

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda pomiaru aktywności chitynazy w płynach biologicznych, takich jak płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe lub surowica.

Streszczenie

Chitynazy to enzymy, które rozszczepiają chitynę. Nawet przy braku chityny ssaki mają znaczne ilości chitynaz obecnych w organizmie, w tym na początku badania. Dokładna rola chitynazy nie jest znana, jednak uważa się, że odgrywa ona ważną rolę w trawieniu i obronie gospodarza odpowiednio przed żywnością i patogenami zawierającymi chitynę. Ostatnie prace, w tym nasze, wykazały ważną rolę chitynazy i białek chitynazopodobnych w odporności gospodarza i chorobach alergicznych. Co ważne, aktywność chitynazy służy jako ważne biomarkery ciężkości choroby w szerokim zakresie chorób, w tym w chorobach zapalnych typu 2, takich jak astma i zwłóknienie płuc. Podobnie pacjenci z zaburzeniami genetycznymi, takimi jak choroba Gauchera, mają znacznie podwyższony poziom chitynazy, który nie tylko koreluje z ciężkością choroby, ale także służy jako wiarygodny biomarker skuteczności terapeutycznej. Przedstawiony tutaj protokół opisuje prosty, szybki i nieskomplikowany sposób pomiaru aktywności chitynazy w próbkach BAL lub surowicy myszy i może być szeroko dostosowany do ludzi i innych organizmów modelowych ze względu na wysoce konserwatywny charakter enzymów.

Wprowadzenie

Chityna jest drugim najobficiej występującym polisacharydem na ziemi po celulozie, służąc jako główny składnik strukturalny różnych organizmów, w tym egzoszkieletu owadów, grzybów, drożdży i glonów; niektóre kręgowce mają również chitynę¹. Chitynazy to rodzina enzymów, które są zdolne do rozkładania chityny i są wysoce konserwatywne w trakcie ewolucji u gatunków od bakterii po ssaki^2,3. Oprócz chitynaz, ssaki mają również białka podobne do chitynaz, które są podobne do chitynaz pod względem zdolności do wiązania chityny, ale różnią się tym, że brakuje im enzymatycznej zdolności do rozszczepiania chityny⁴.

Chociaż chityna i chitynazy były badane od dawna - z badaniami sięgającymi początku XX wieku - główny nacisk położono na ich rolę u owadów i innych bezkręgowców. W rzeczywistości dopiero w latach 60. XX wieku odkryto, że kręgowce w ogóle mają chitynazy. Korzystając z testu opartego na chitobizie, wykazano, że chitynazy znajdują się w przewodzie pokarmowym wielu kręgowców, w tym jaszczurek i kosów – obserwacja ta przypuszczalnie jest spowodowana spożyciem organizmów zawierających chitynę, takich jak owady⁵.

Ssaki mają dwie enzymatycznie aktywne formy chitynazy: kwaśną chitynazę ssaków (AMCase; znaną również jako CHIT2 i CHIA) oraz chitotriozydazę (CHIT1)⁴. Oba te białka są zdolne do hydrolizy chityny. Jednak CHIT1 jest bardziej aktywny enzymatycznie u ludzi, gdzie prawie cała aktywność chitynazy pochodzi z CHIT1. ⁴ U myszy zarówno Chit1, jak i AMCase prawie w równym stopniu przyczyniają się do ogólnej aktywności chitynazy⁶. Z drugiej strony, białka podobne do chitynazy nie mają aktywności chitynazy.

Chit1 jest głównie wydzielany przez makrofagi i często uważany jest za odpowiedź immunologiczną na patogeny zawierające chitynę⁷. Wykazano również, że enzym ten bierze udział w dojrzewaniu monocytów zarówno do podtypów makrofagów M1, jak i M2, nawet bez obecności substratu chityna⁸. Co więcej, może być również zaangażowany w dojrzewanie innych komórek odpornościowych, w tym komórek pomocniczych T typu 2 (Th2) i eozynofili - jak wykazano w przypadku kryptokokowej infekcji płuc⁹. Badania te wskazują na złożoną rolę chitynaz w układzie odpornościowym.

W ostatnich latach stwierdzono, że poziomy Chit1 służą jako ważny biomarker postępu dla ponad 40 różnych chorób ludzkich, w tym lizosomalnych chorób spichrzeniowych, chorób zakaźnych, chorób układu oddechowego, chorób endokrynologicznych, chorób sercowo-naczyniowych, chorób neurologicznych i innych (recenzowane¹⁰). W wielu z tych chorób poziomy Chit1 są silnym predyktorem ciężkości choroby i skuteczności terapeutycznej¹⁰.

Ponieważ chitynazy zyskały reputację jako biomarker dla wielu schorzeń, w tym choroby Gauchera, opracowano narzędzia i testy, które ułatwiają testowanie obecności chitynazy. Starsze metody obejmują procedurę Schalesa, protokół zaadaptowany z badania stężenia glukozy we krwi, oraz metodę kwasu 3,5 dinitrosalicylowego (DNS). Jednak te metody są często wrażliwe na czas i trudne technicznie¹¹. Procedura dla obu tych testów wymaga redukcji nieorganicznych utleniaczy, na przykład żelazocyjanku w przypadku procedury Schalesa, powodując zmianę koloru, którą można zmierzyć tylko spektrofotometrycznie. Dodatkowo, oba testy obejmują etap podgrzewania lub gotowania, który jest zarówno czasochłonny, jak i niezbędny do rozwinięcia koloru^12,13.

Tutaj opisano szybki i prosty test fluorymetryczny do określania poziomu chitynazy w próbkach ssaków^14,15. Dwie z użytych tu próbek to płyny z płukania surowicy i oskrzelowo-pęcherzyków płucnych (BAL); Aktywność chitynazy została również zmierzona w próbkach mleka matki i moczu, a technikę tę można przeprowadzić w tego typu próbkach, a także w każdym innym płynie biologicznym^16,17.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem w Yale University School of Medicine.

1. Pobieranie próbek myszy

1. Znieczulenie
   1. Znieczulenie myszy za pomocą ketaminy i ksylazyny (100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny).
2. Pobieranie próbek krwi
   1. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
   2. Chirurgicznie otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce.
   3. Wprowadzić igłę o sile 26,5 G do lewej komory i pobrać krew do strzykawki.
      nuta: Zazwyczaj około 0,5-1 ml krwi można pobrać od zdrowej myszy o wadze 20-25 g.
   4. Krew należy zebrać do probówek z heparyną w celu pobrania osocza lub probówek bez heparyny w celu pobrania surowicy.
3. Pobranie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL)
   1. Aby zebrać BAL, wykonaj pionowe nacięcie na szyi, aby odsłonić tchawicę.
   2. Osłonić tchawicę cewnikiem 22 G i mocno zabezpieczyć ją za pomocą sznurka, aby zapobiec wyciekowi z nosa myszy.
   3. Powoli wstrzyknąć dwie porcje sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, 0,75 ml każdy) do płuc przez tchawicę i pobrać z powrotem.
   4. Zebrać podwielokrotności i przechowywać na lodzie do dalszej analizy.
4. Przetwarzanie próbek biologicznych.
   1. Próbka krwi: Świeża (osocze) lub po pozostawieniu do koagulacji przez 4 godziny (surowica), odwirować przy 600 x g przez 10 minut. Weź supernatant i albo zamroź do przechowywania, albo użyj do eksperymentu.
   2. BAL: Odwirować próbkę o masie 350 x g przez 5 minut. Weź supernatant i albo zamroź do przechowywania, albo użyj do eksperymentu.

2. Test chitynazy

UWAGA: Nauka stojąca za testem jest stosunkowo prosta. Niefluorescencyjny substrat jest rozszczepiany przez enzymatycznie aktywną chitynazę w celu wytworzenia produktu fluorescencyjnego, który jest następnie mierzony jako pośredni marker aktywności chitynazy. Chitynazy w próbkach rozkładają substrat 4-metylolumbelliferyl-D-N, N'-diacetylochitomitobiozę obecną w 1x buforze McIlvaina. Uwalniana jest cząsteczka fluorescencyjna 4-metylolumbelliferyl. Mierząc całkowitą fluorescencję każdego dołka, uzyskujemy dokładny pomiar aktywnej chitynazy w każdej próbce. Ponieważ rozkład chityny przez chitynazę jest reakcją hydrolityczną, bufor zatrzymujący, mieszanina 0,3 M glicyny i NaOH (12,0 g / l przy pH 10,6), kończy rozkład chityny, tworząc środowisko, które jest zbyt podstawowe, aby enzym mógł funkcjonować.

1. Przygotuj podłoża, wzorce i roztwory.
   1. Przygotuj bufor McIlvain. McIlvain Buffer składa się z 0,1 M cytrynianu i 0,2 M fosforanu o pH 5,2. Rozcieńczyć w stosunku 1:1 dla 1x bufor McIlvain.
   2. Rozpuścić zarówno 4-metylombliferyl-D-N, N'-diacetylochitobiozę, jak i 4-metyloubelliferyl ß-D-N, N', n"-triacetylochitotriozę w 1x Bufor McIlvaina do stężenia 500 μM każdy.
      nuta: Roztwór podstawowy może być przechowywany w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania; Najlepiej przechowywać w podwielokrotnościach.
   3. Rozpuścić wzorzec 4-metylomelufloryronu do stężenia 0,1 mM w buforze zatrzymującym (mieszanina 0,3 M glicyny i NaOH (12,0 g/l przy pH 10,6)) w celu uzyskania roztworu podstawowego krzywej wzorcowej.
2. Utwórz i unietrzymuj na płytach roztwór roboczy.
   1. Połącz 1x Bufor McIlvaina i chitynowy substrat 4-metylolumbelliferyl-D-N, N'-diacetylochitobiozę, aby stworzyć roztwór roboczy. Na każde 10 próbek zmieszać 100 μl substratu z 2,17 ml 1x buforu McIlvain. Patrz Tabela 1 w celu uzyskania dodatkowych obliczeń opartych na wielkości próby.
      nuta: Do próbek ludzkich należy użyć 4-metyloambiliferylu ß-D-N, N', N"-triacetylochitotriozy. Chociaż oba substraty mogą być rozszczepiane przez enzymy ludzkie lub mysie, zostały one przypisane do próbek ludzkich lub mysich na podstawie efektywności rozszczepienia⁶.
   2. Odpipetować 95 μl roztworu roboczego do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.
3. Dodaj próbki biologiczne do roztworu roboczego.
   1. Następnie dodać 5 μl badanej próbki (krew/BAL/lizat tkankowy/inny płyn biologiczny) do każdej studzienki.
   2. Wymieszaj próbkę z roztworem roboczym, aby uzyskać najdokładniejsze i najbardziej wiarygodne wyniki.
      nuta: Próbki należy badać w duplikatach/trzech egzemplarzach, zwracając szczególną uwagę na potencjalne efekty krawędziowe. Wszystkie próbki powinny być wstępnie podgrzane, aby zminimalizować efekt krawędzi. Ponieważ test obejmuje reakcję między chitynazami w próbce a substratem w roztworze roboczym, najlepiej jest pracować stosunkowo szybko, aby zminimalizować różnicę czasu między posiewem pierwszej próbki a posiewem ostatniej próbki. Zalecana jest pipeta wielokanałowa.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C.
   1. Przykryj talerz i krótko wstrząśnij (5 s).
   2. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Pozwala to na zaprowadzenie reakcji enzymatycznej.
5. Przygotuj krzywą standardową.
   1. Podczas inkubacji próbek należy przygotować seryjne rozcieńczenie 4-metylulumbelliferonu, standardu często stosowanego we fluorymetrycznym oznaczaniu aktywności enzymu.
   2. Rozcieńczyć podstawowy roztwór wzorcowy w buforze zatrzymującym do stężenia 5 μM.
   3. Wykonać serię rozcieńczeń, jak wskazano w Tabeli 2. Dodaj składniki we wskazanej ilości i dobrze wymieszaj.
      nuta: Krzywa standardowa pomaga zapewnić, że mierzone próbki mieszczą się w zakresie liniowym krzywej standardowej.
6. Zatrzymaj reakcję za pomocą buforu zatrzymującego.
   1. Dodać 200 μl buforu zatrzymującego do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję.
7. Uporządkuj standardy.
   1. Dodać 300 μl każdego wzorca na studzienkę w dwóch egzemplarzach na tej samej płytce.
8. Odczytać płytkę za pomocą czytnika fluorometrycznego.
   1. Odczytaj płytkę przy wzbudzeniu 360 nm i emisji 455 nm.

3. Analiza danych

1. Odejmij puste miejsca
   1. Uśrednić wartości zduplikowanych roztworów wzorcowych, które nie zawierają 4-metylolumbelliferonu. Odejmij tę wartość od wszystkich innych zarejestrowanych wartości.
2. Weź średnią z replik technicznych i wykreśl standardy.
   1. Uśrednij dwa odczyty dla każdego stężenia i wyświetl wykres średniego odczytu według stężenia.
      nuta: Wynikowy wykres powinien wyglądać liniowo i mieć wartość R² bliską 1. Jeśli tak się nie stanie, może być konieczne ponowne wykonanie norm i ponowne odczytanie tabliczki w celu zapewnienia jakości analizy danych.
3. Ustandaryzuj wartości odczytu.
   1. Utwórz linię najlepiej dopasowaną dla wykreślanych danych standardów. Podzielić odczyty próbek przez nachylenie linii o najlepszym dopasowaniu.
4. Porównaj wartości z grupy kontrolnej i grupy zmiennych.
   1. Użyj testu t lub ANOVA dla więcej niż dwóch grup, aby określić, czy różnica między grupami jest statystycznie istotna. Wartości będą przyjmowane w jednostkach nmol/mL·h.

Wyniki

Przedstawione tutaj wyniki pochodzą z badania mierzącego aktywność chitynazy w próbkach surowicy i BAL myszy typu dzikiego (C57BL/6) oraz myszy transgenicznych Chit1 (na tle C57BL/6), które wykazują nadekspresję genu Chit1 pod promotorem doksycyliny. Nasze dane wykazują, że zarówno w próbkach surowicy, jak i BAL stwierdzono aktywność chitynazy w wartościach bazowych wynoszących odpowiednio 698,2 ± 189,9 nmol/mL·h oraz 485,7 ± 14 nmol/ml·h. Nadekspresja genu Chit1 przy zastosowaniu doksycyliny w wodzie pitnej przez 4 tygo...

Dyskusja

Aktywność chitynazy stała się ważnym biomarkerem do przewidywania ciężkości choroby, postępu choroby, skuteczności terapeutycznej i obecności określonych patogenów¹⁸. Chociaż wiele z długo postulowanych teorii na temat roli chitynaz nie zostało udowodnionych eksperymentalnie¹⁹, nowe badania dostarczyły ważnych informacji na temat roli chitynaz i białek podobnych do chitynaz w różnych chorobach ^2,9,20

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4-metylolumbelliferon	Sigma	M1381	Standard: powszechnie stosowany w testach fluorometrycznych do oznaczania aktywności enzymatycznej
4MU-GlcNAc2	Sigma	M9763	fluorescencyjny substrat chitynazy do stosowania w próbkach mysich
4MU-GlcNAc3	Sigma	M5639	fluorescencyjny substrat chitynazy do stosowania w próbkach ludzkich
Kwas cytrynowy - monohydrat			do stosowania w McIlvain Buffer
Glycine			do stosowania w Stop Buffer w stężeniu 0,3 M
Na2HPO4xH2O			do stosowania w McIlvain Buffer
NaOH			do stosowania w Stop Buffer w stężeniu 12 g/L
Płytka wizyjna: Niesterylna, nieobrobiona płytka 96-dołkowa	4titude	4ti-0224