Ektopowy model ekspresji chemokiny do badania rekrutacji makrofagów in vivo

Danio pręgowany to mała tropikalna ryba słodkowodna o twardych kościach, pochodząca z Indii. Jeśli chodzi o ochronę genów, danio pręgowany ma podobieństwo do human¹. Może dostarczyć nam wglądu w powiązane tematy związane z człowiekiem, badając regulację genów, funkcję białek i zachowanie komórek, takie jak migracja, proliferacja et.al u danio pręgowanego. Zarodek danio pręgowanego może być wykorzystany do obserwacji rozwoju wczesnych zarodków na różnych etapach po zahamowaniu pigmentu. Tymczasem danio pręgowany potrzebuje tylko trzech miesięcy, aby osiągnąć dojrzałość płciową, wtedy danio pręgowany może produkować setki jaj co 4 dni. Miniaturowy rozmiar, prosta hodowla, silna zdolność reprodukcyjna, te zalety sprawiają, że hodowla danio pręgowanego jest bardzo oszczędzająca miejsce, sprzyja hodowli na dużą skalę. Tradycyjny model myszy ssaków ma wyższe koszty utrzymania niż danio pręgowany, co ogranicza skalę hodowli myszy. W aspekcie wczesnego rozwoju zarodka, zarodek myszy jest trudny do zaobserwowania w warunkach żywych ze względu na charakterystykę rozwoju zarodka myszy w łonie matki. Wręcz przeciwnie, zarodki danio pręgowanego rozwijają się zewnętrznie i są przezroczyste, dlatego łatwo je obserwować pod mikroskopem. Co więcej, danio pręgowany jest bardzo łatwy do skonstruowania różnych linii transgenicznych do badań nad funkcjami genów. Obecnie dostępne są różne linie transgeniczne danio pręgowanego do znakowania różnych typów komórek. Obecnie bardzo wygodne jest konstruowanie linii transgenicznych do nadekspresji chemokin w określonych lokalizacjach i badanie funkcji chemokin w zachowaniu komórek u danio pręgowanego.

Tutaj udostępniliśmy przepływ pracy umożliwiający wykorzystanie linii transgenicznej danio pręgowanego do zbadania funkcji IL-34 na zachowanie makrofagów in vivo^2,3,4,5,6,7. Po pierwsze, skonstruowaliśmy specyficzny dla wątroby plazmid nadekspresji genu il34 i wstrzyknęliśmy plazmid do zarodków ryb w stadium jednokomórkowym Tg (mpeg1: GFP), które specyficznie znakowały makrofagi za pomocą białka fluorescencyjnego GFP. Następnie użyliśmy fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i barwienia immunologicznego w celu wykrycia wzorca ekspresji il34 oraz liczby lub lokalizacji makrofagów. Wstrzyknięte zarodki WT zostały wyhodowane w celu wytworzenia stabilnej linii transgenicznej. Na tych etapach ustaliliśmy i zwalidowaliśmy linię produkującą cytokiny oraz wizualnie oceniliśmy wpływ, który można zaobserwować na rozmieszczenie makrofagów. Wreszcie, aby zbadać zachowanie makrofagów w odpowiedzi na cytokinę, użyliśmy konfokalnego obrazowania na żywo, aby bezpośrednio obserwować migrację makrofagów, aby potwierdzić funkcję il34 w migracji makrofagów in vivo.

UWAGA: Wszystkie próbki zostały potraktowane wodą z jaj fenylotiomocznikowych(PTU) w celu zahamowania pigmentu.

1. Generowanie konstruktów transgenicznych Tg (fabp10a:il34) i wstrzykiwanie ryb

1. Sklonuj 2,8 kb fabp10a promoter⁸ i regiony kodujące IL-34 (ENSDART00000126460.3) danio pręgowanego do wektora pTol2, aby wygenerować konstrukcję fabp10a-il34. Wstrzyknąć konstrukty do zarodków ryb w stadium jednokomórkowym Tg (mpeg1: GFP) i WT wraz z mRNA transpozazy. Podnieś zarodki WT z wstrzykniętymi fabp10a-il34 do dorosłego ⁹ i zidentyfikuj transgenicznego założyciela przez hybrydyzację in situ.
   nuta: Wstrzyknięcie konstruktu Tol2 bezpośrednio do innego transgenu może być problematyczne, jeśli druga linia transgeniczna jest wykonana przy użyciu tego samego układu transpozonowego. Powszechną praktyką byłoby stworzenie niezależnej linii transgenicznej, a następnie przecięcie nowej linii z inną linią reporterową. Gwarantuje to, że nie będzie żadnego wpływu nowej transgenezy na wcześniej wprowadzony transgen.

2. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (WISH) w połączeniu z barwieniem immunologicznym

1. Utrwalanie próbki
   1. Pobrać zarodki przejściowego wstrzyknięcia lub stabilnej linii transgenicznej IL-34, które krzyżowały się z Tg (mpeg1: GFP) w pożądanych stadiach.
      nuta: W tym przypadku zarodki pobrano w 4 dni po zapłodnieniu (dpf). (W razie potrzeby) usunąć kosmówkę za pomocą strzykawki.
   2. Utrwalić zarodki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C lub 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) (około 25 °C).
   3. Umyj zarodki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami i Tween 20 (PBST) 3x 5 min.
   4. Odwodnić zarodki oddzielnie za pomocą 50% metanolu w PBST (50% metanolu/PBST) i 100% metanolu, 1x 5 min każdy. Następnie zmień na świeży 100% metanol i przechowuj w temperaturze -20 °C (co najmniej 2 godziny).
      nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
2. Hybrydyzacja sondy (dzień I)
   1. Ponownie nawodnij zarodki w poprzednich krokach 50% metanolem w PBST (50% metanolu/PBST), a następnie przemyj PBST 3x 5 min.
   2. Trawić zarodki za pomocą proteinazy K w PBST w temperaturze pokojowej (stężenie końcowe: 10 μg/ml; 1:2000 w PBST).
      nuta: Czas trawienia zależy od stadium zarodka: mniej niż 36 godzin po zapłodnieniu (hpf), nie ma potrzeby; 36 zarodków HPF-2 DPF, 3-5 min; 2-3 dpf zarodek, 10 min; 3-4 dpf zarodek, 15 min; 4-5 dpf zarodek, 15-20 min; 5-6 dpf zarodek, 20-27 min; >6 dpf zarodek, 25-30 min w temperaturze pokojowej (około 25 °C).
   3. Wyrzucić roztwór wytrawiający i ponownie przeprowadzić utrwalanie z 4% PFA, przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Umyj zarodki PBST 2x 10 min.
   5. Odrzucić PBST, przeprowadzić wstępną hybrydyzację z podgrzanym buforem hybrydyzacyjnym (buforem HB) w temperaturze 65 °C przez 5 minut, zawracać bufor HB do oryginalnej probówki.
   6. Przeprowadzić wstępną hybrydyzację z nowym podgrzanym buforem HB w temperaturze 65 °C przez co najmniej 1 godzinę.
   7. Podgrzej sondę⁹ (w tym przypadku była to sonda il34, 1 ng/ml) w temperaturze 65 °C przez co najmniej 10 minut. Następnie należy załadować bufor HB do oryginalnej probówki. Przeprowadzić hybrydyzację z wstępnie podgrzaną sondą w temperaturze 65 °C przez noc.
3. Leczenie przeciwciałami (dzień II)
   1. Podgrzej wstępnie 50% formamidu/2x sól fizjologiczną cytrynianu sodu plus Tween 20 (SSCT), 2x SSCT, 0,2x SSCT w temperaturze 65 °C.
   2. Umieść sondę z recyklingu w oryginalnej rurce i przechowuj ją w temperaturze -20 °C.
   3. Umyć zarodki oddzielnie 50% formamidem/2x SSCT; 2x SSCT; 0,2x SSCT, 3x 20 min lub 2x 30 min każdy w temperaturze 65 °C.
   4. Umyj zarodki PBST 3x 5 min.
   5. Próbki należy zablokować 600 μl buforu blokującego (5% przefiltrowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w PBST) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   6. Dodać 400 μl roztworu przeciwciała anty-digoksygeniny-HRP (1:1 000-1:2 000 w buforze blokującym) i inkubować zarodki w temperaturze 4 °C przez noc. Jeśli sygnały są słabe, użyj rozcieńczenia przeciwciała w stosunku 1:500.
4. Barwienie i inkubacja przeciwciał pierwszorzędowych (dzień III)
   1. Usunąć przeciwciało, przemyć zarodki PBST, 6 x 20 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Przepłukać próbkę 30 μl rozcieńczalnika 1x Plus Amplification przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Wyrzucić rozcieńczalnik przez pipetowanie; rozcieńczyć roztwór podstawowy fluoroforu i tyramdu (odczynnik do amplifikacji cyjaniny 3 plus (Cy3) lub odczynnika do amplifikacji cyjaniny 5 plus (Cy5), w tym przypadku użyto Cy3) 1:50 w 1x rozcieńczalnik do amplifikacji Plus, aby uzyskać roztwór roboczy fluoroforu i tyramdu. Przygotować 50-100 μl roztworu roboczego dla każdej próbki.
   4. Inkubować próbkę w roztworze roboczym fluoroforu tyramidowego przez 5-15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Jeśli sygnały są słabe, wydłuż czas inkubacji do 30 minut.
   5. Zatrzymaj reakcję, zmieniając roztwór roboczy za pomocą PBST i zbadaj sygnały.
   6. Umyj zarodki PBST 3x 10 min w temperaturze RT.
   7. Inkubować próbkę z pierwszorzędowym przeciwciałem w temperaturze 4 °C przez noc. W takim przypadku należy użyć przeciwciała Goat-Anti-GFP jako przeciwciała pierwszorzędowego.
5. Wtórne barwienie przeciwciałami (dzień IV)
   1. Myj zarodki PBST przez 4x 30 min.
   2. Inkubować zarodki z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze 4 °C przez noc. W takim przypadku użyj przeciwciała Alexa 488-Anti-Goat jako przeciwciała drugorzędowego.
6. Robienie zdjęć (Dzień V)
   1. Umyj zarodki PBST 3x 10 min w temperaturze RT.
   2. Przechowuj zarodki w 70% glicerolu w ciemności w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.

3. Obrazowanie na żywo

1. Wybór próbki
   UWAGA: Użyj obrazu na żywo, aby bezpośrednio zaobserwować, czy makrofagi ryb Tg (fabp10a: il34; fabp10a: DsRed; mpeg1: GFP) migrowałyby do wątroby pod wpływem indukcji IL-34 podczas 3-3,5 dpf. W tym przypadku linia transgeniczna Tg (fabp10a-DsRed) jest używana do oznaczania obszaru wątroby i uwidaczniania go, ułatwiania lokalizacji wątroby i określenia, czy makrofagi migrują do wątroby. Przed obrazowaniem użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby wybrać podwójnie dodatnie zarodki DsRed i GFP.
2. Montowanie ryb
   1. Za pomocą metalowej kąpieli podgrzej 1 ml 1% niskotopliwej agarozy do temperatury powyżej 90 °C, aby całkowicie ją stopić.
   2. Po schłodzeniu niskotopliwej agarozy do temperatury ciała należy dodać 50 μl 0,2% tricainy i równomiernie wymieszać tricainę z agarozą.
   3. Przenieś znieczulone zarodki do małego naczynia zamontowanego ze szkiełkiem zakrywającym na dnie, usuń otaczającą wodę, powoli upuść niskotopliwą agarozę na zarodki, ostrożnie ustaw pozycję ryby przed zestaleniem się agarozy, trzymaj obszar wątroby blisko szkiełka nakrywkowego na dnie naczynia.
   4. Po zestaleniu się niskotopliwej agarozy ostrożnie przykryj ją kolejną warstwą agarozy, aby ją wzmocnić.
   5. Umieść naczynie na stole nośnym mikroskopu konfokalnego, przykryj rybę roztworem E2¹⁰ trikainą i rozpocznij obrazowanie.
3. Obsługa oprogramowania mikroskopu konfokalnego
   1. Otwórz oprogramowanie ZEN black 2.3, zainstaluj stół warsztatowy z żywymi komórkami na stole nośnym mikroskopu.
   2. Kliknij przycisk Zlokalizuj | Inkubacja | Temperatura, aby ustawić temperaturę na 29 °C.
   3. Umieść naczynie na środku stołu warsztatowego z żywymi komórkami, przykryj rybę roztworem E2¹⁰ z trikainą.
   4. Kliknij menu Akwizycja, wybierz żądany tryb skanowania i lasery z menu Smart Setup, a następnie wybierz opcję Z-Stack and Position (Stos Z i pozycja).
   5. Kliknij menu Projektant eksperymentów, wybierz opcję Włącz eksperyment z wieloma blokami w pierwszym bloku, aby znaleźć próbkę w małym powiększeniu, a następnie przełącz się na wysokie powiększenie, niech obserwowany obszar znajdzie się w środku pola widzenia.
   6. Ustaw pozycję i informacje o Z-Stack, wybierz odpowiednią intensywność lasera, warstwy skanowania i prędkość obrazowania.
   7. Utwórz nowy blok i powtórz powyższe kroki. Po ustawieniu wszystkich bloków ustaw odpowiednią liczbę pętli i rozpocznij nagrywanie (Rysunek 1).

Kroki związane z protokołem danio pręgowanego są zilustrowane w Rysunek 2. Najpierw wygenerowaliśmy konstrukcję pBLK-fabp10a-il34-sv40, w której il34 był sterowany przez promotor fabp10a (Rysunek 2). Konstrukt został mikrowstrzyknięty do jednokomórkowych zarodków danio pręgowanego Tg (mpeg1: GFP), które mogą oznaczać makrofagi zarodkami GFP i WT, które zostały wyhodowane do postaci dorosłych w celu wytworzenia transgenicznej stabilnej linii (Rysunek 2). Ekspresję il34 analizowano za pomocą hybrydyzacji in situ fluorescencji całego wierzchowca ( Rysunek 2 i Figura 3). Makrofagi znakowane za pomocą GFP analizowano za pomocą barwienia immunologicznego (Rysunek 2 i Rysunek 3). Użyliśmy obrazowania na żywo, aby bezpośrednio zaobserwować, czy makrofagi będą migrować do wątroby pod wpływem indukcji il34 podczas 3-3,5 dpf (Rysunek 2, Rysunek 4, film uzupełniający 1 i film uzupełniający 2).

Rysunek 1: Działanie oprogramowania do obrazowania na żywo w mikroskopie konfokalnym. Otwórz oprogramowanie ZEN black 2.3, zainstaluj stół warsztatowy z żywymi komórkami na stole nośnym mikroskopu, a następnie kliknij Zlokalizuj (A) | Inkubacja | Temperatura (B), aby ustawić temperaturę na 29 °C. Umieść naczynie na środku stołu warsztatowego z żywymi komórkami, przykryj rybę roztworem E210 tricainą. Po wykonaniu wszystkich tych czynności kliknij menu Akwizycja (C), wybierz żądany tryb skanowania i lasery w menu Smart Setup (D), a następnie wybierz opcję Z-Stack and Position (E). Na koniec kliknij menu Experiment Designer (F), wybierz opcję Włącz eksperyment z wieloma blokami w pierwszym bloku, aby znaleźć próbkę w małym powiększeniu, a następnie przełącz się na wysokie powiększenie, pozwól, aby obserwowany obszar znalazł się w środku pola widzenia, ustaw pozycję i Z-Stack (G i H), wybierz odpowiednią intensywność lasera, warstwy skanowania i prędkość obrazowania. Utwórz nowy blok i powtórz powyższe kroki. Po ustawieniu wszystkich bloków ustaw odpowiednią ilość pętli (I) i rozpocznij nagrywanie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Proces pracy mający na celu zbadanie funkcji chemokiny w migracji makrofagów in vivo. Skonstruowaliśmy specyficzny tkankowo (wątroba) plazmid nadekspresji do nadekspresji IL-34 i wstrzyknęliśmy plazmid do transgenicznych zarodków ryb w stadium jednokomórkowym, których makrofagi były specyficznie znakowane białkiem fluorescencyjnym (Tg: (mpeg1: GFP)). Wstrzyknięte zarodki WT zostały wyhodowane w celu wytworzenia stabilnej linii transgenicznej. Następnie zastosowaliśmy fluorescencyjną hybrydyzację in situ i barwienie immunologiczne w celu wykrycia wzorca ekspresji genów oraz liczby lub lokalizacji makrofagów przejściowo wstrzykniętych zarodków lub zarodków w stabilnej linii (4 dpf). Na koniec wykorzystaliśmy konfokalne obrazowanie na żywo, aby bezpośrednio obserwować zachowanie makrofagów w stabilnych rybach transgenicznych (3-3,5 dpf), aby zbadać funkcję IL-34 na makrofagach in vivo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Fluorescencyjne WISH w połączeniu z barwieniem immunologicznym. Ten rysunek został zmodyfikowany z Jiang et al.11. Łącznie 1,8 nL (30 ng/μL) konstruktu pBLK-fabp10a-il34-sv40 poddano mikroiniekcji do jednokomórkowych zarodków zebry w stadium Tg (mpeg1: GFP). (A) WISH ekspresji il34 (czerwony) i barwienie całych przeciwciał o ekspresji GFP (zielony) w zarodku 4 dpf (6x). Zdjęcie całego ciała ryby składa się z dwóch oddzielnych obrazów wykonanych konfokalnie i zszytych razem w Photoshopie. Wstawki to duże powiększenie (20x) odpowiednich obszarów w ramkach (pomarańczowe obszary kropkowane). (B) Analiza ilościowa liczby komórek makrofagów w wątrobie i wątrobie zarodków, którym wstrzyknięto i które zostały wstrzyknięte, (pokazanej w białym obszarze kropkowanym) i okolicy ogona (w przybliżeniu między 13. a 17. somitem, pokazanym między dwiema białymi przerywanymi liniami). Dane analizowano za pomocą testu U Manna Whitneya, ** p < 0,01 w porównaniu z kontrolą. n = 5,5 dla 4 dpf wstrzykniętych i kontrolnych ryb. Paski: 200 μm (biała linia); 50 μm (żółta linia). (C) ŻYCZENIE ekspresji il34 i barwienie całego ciała przeciwciała o ekspresji GFP w zarodku 4 dpf stabilnej linii (6x). Zdjęcie całego ciała ryby składa się z dwóch oddzielnych obrazów wykonanych konfokalnie i zszytych razem w Photoshopie. Wstawki to duże powiększenie (20x) odpowiednich obszarów w ramkach (pomarańczowe obszary kropkowane). (D) Analiza ilościowa liczby komórek makrofagów w wątrobie zarodków Tg (mpeg1: GFP) i Tg (fabp10a: il34; mpeg1: GFP) (pokazanych w białym obszarze kropkowanym) i okolicy ogona (w przybliżeniu między 13. a 17. somitem, pokazanym między dwiema białymi przerywanymi liniami). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Konfokalne obrazowanie na żywo w celu bezpośredniej obserwacji zachowania makrofagów w stabilnych rybach transgenicznych. Ten rysunek został zmodyfikowany z Jiang et al.11. Mikrofotografie obrazowania na żywo pokazują proces przechodzenia makrofaga (zielony, oznaczony białymi strzałkami) przez wątrobę (czerwony) w ciągu 28 minut u ryb kontrolnych (A) oraz proces migracji makrofaga (zielony, oznaczony białymi strzałkami) do wątroby (czerwony) w ciągu 28 minut u ryb z nadekspresją IL-34 (B). Podziałka = 40 μm (biała linia). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film uzupełniający 1: Obrazowanie na żywo pokazujące proces migracji makrofagów (zielonych, oznaczonych białymi strzałkami) do wątroby (czerwonych) w ciągu 2 godzin u ryb z nadekspresją IL-34. Podziałka = 20 μm (biała linia). Ten film został przedrukowany z Jiang et al.11. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Film uzupełniający 2: Obrazowanie na żywo pokazujące proces wędrówki makrofagów (zielonych, oznaczonych białymi strzałkami) wokół wątroby (czerwony) w ciągu 2 godzin u ryb kontrolnych. Podziałka = 20 μm (biała linia). Ten film został przedrukowany z Jiang et al.11. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.