Artykuł metodologiczny

Ektopowy model ekspresji chemokiny do badania rekrutacji makrofagów in vivo

DOI:

10.3791/60161

⸱

25 września 2019

 ,  , 
1Department of Developmental Biology, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, 2Division of Cell, Developmental and Integrative Biology, School of Medicine, South China University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przetestować wpływ chemokiny na rekrutację makrofagów in vivo, do wykrycia ektopowej ekspresji chemokiny użyto całej hybrydyzacji in situ, a do oznaczania makrofagów użyto barwienia immunologicznego. Obrazowanie na żywo wykorzystano do obserwacji migracji makrofagów w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany jest szeroko stosowany w badaniach podstawowych i biomedycznych. Obecnie dostępnych jest wiele linii transgenicznych danio pręgowanego do znakowania różnych typów komórek. Ze względu na przezroczyste ciało embrionalne danio pręgowanego wygodnie jest nam badać wpływ jednej chemokiny na zachowanie określonego typu komórek in vivo. W tym miejscu przedstawiliśmy przepływ pracy w celu zbadania funkcji chemokiny w migracji makrofagów in vivo. Skonstruowaliśmy specyficzny tkankowo plazmid nadekspresji w celu nadekspresji IL-34 i wstrzyknęliśmy plazmid do transgenicznych zarodków ryb w stadium jednokomórkowym, których makrofagi zostały specjalnie znakowane przez białko fluorescencyjne. Następnie zastosowaliśmy fluorescencyjną hybrydyzację in situ i barwienie immunologiczne w celu wykrycia wzorca ekspresji chemokin oraz liczby lub lokalizacji makrofagów. Wstrzyknięte zarodki WT zostały wyhodowane w celu wytworzenia stabilnej linii transgenicznej. Na koniec wykorzystaliśmy konfokalne obrazowanie na żywo, aby bezpośrednio obserwować zachowanie makrofagów w stabilnych rybach transgenicznych, aby zbadać funkcję IL-34 na makrofagach in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany to mała tropikalna ryba słodkowodna o twardych kościach, pochodząca z Indii. Jeśli chodzi o ochronę genów, danio pręgowany ma podobieństwo do human1. Może dostarczyć nam wglądu w powiązane tematy związane z człowiekiem, badając regulację genów, funkcję białek i zachowanie komórek, takie jak migracja, proliferacja et.al u danio pręgowanego. Zarodek danio pręgowanego może być wykorzystany do obserwacji rozwoju wczesnych zarodków na różnych etapach po zahamowaniu pigmentu. Tymczasem danio pręgowany potrzebuje tylko trzech miesięcy, aby osiągnąć dojrzałość płciową, wtedy danio pręgowany może produkować setki jaj co 4 dni. Miniaturowy rozmiar, prosta hodowla, silna zdolność reprodukcyjna, te zalety sprawiają, że hodowla danio pręgowanego jest bardzo oszczędzająca miejsce, sprzyja hodowli na dużą skalę. Tradycyjny model myszy ssaków ma wyższe koszty utrzymania niż danio pręgowany, co ogranicza skalę hodowli myszy. W aspekcie wczesnego rozwoju zarodka, zarodek myszy jest trudny do zaobserwowania w warunkach żywych ze względu na charakterystykę rozwoju zarodka myszy w łonie matki. Wręcz przeciwnie, zarodki danio pręgowanego rozwijają się zewnętrznie i są przezroczyste, dlatego łatwo je obserwować pod mikroskopem. Co więcej, danio pręgowany jest bardzo łatwy do skonstruowania różnych linii transgenicznych do badań nad funkcjami genów. Obecnie dostępne są różne linie transgeniczne danio pręgowanego do znakowania różnych typów komórek. Obecnie bardzo wygodne jest konstruowanie linii transgenicznych do nadekspresji chemokin w określonych lokalizacjach i badanie funkcji chemokin w zachowaniu komórek u danio pręgowanego.

Tutaj udostępniliśmy przepływ pracy umożliwiający wykorzystanie linii transgenicznej danio pręgowanego do zbadania funkcji IL-34 na zachowanie makrofagów in vivo2,3,4,5,6,7. Po pierwsze, skonstruowaliśmy specyficzny dla wątroby plazmid nadekspresji genu il34 i wstrzyknęliśmy plazmid do zarodków ryb w stadium jednokomórkowym Tg (mpeg1: GFP), które specyficznie znakowały makrofagi za pomocą białka fluorescencyjnego GFP. Następnie użyliśmy fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i barwienia immunologicznego w celu wykrycia wzorca ekspresji il34 oraz liczby lub lokalizacji makrofagów. Wstrzyknięte zarodki WT zostały wyhodowane w celu wytworzenia stabilnej linii transgenicznej. Na tych etapach ustaliliśmy i zwalidowaliśmy linię produkującą cytokiny oraz wizualnie oceniliśmy wpływ, który można zaobserwować na rozmieszczenie makrofagów. Wreszcie, aby zbadać zachowanie makrofagów w odpowiedzi na cytokinę, użyliśmy konfokalnego obrazowania na żywo, aby bezpośrednio obserwować migrację makrofagów, aby potwierdzić funkcję il34 w migracji makrofagów in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie próbki zostały potraktowane wodą z jaj fenylotiomocznikowych(PTU) w celu zahamowania pigmentu.

1. Generowanie konstruktów transgenicznych Tg (fabp10a:il34) i wstrzykiwanie ryb

  1. Sklonuj 2,8 kb fabp10a promoter8 i regiony kodujące IL-34 (ENSDART00000126460.3) danio pręgowanego do wektora pTol2, aby wygenerować konstrukcję fabp10a-il34. Wstrzyknąć konstrukty do zarodków ryb w stadium jednokomórkowym Tg (mpeg1: GFP) i WT wraz z mRNA transpozazy. Podnieś zarodki WT z wstrzykniętymi fabp10a-il34 do dorosłego 9 i zidentyfikuj transgenicznego założyciela przez hybrydyzację in situ.
    nuta: Wstrzyknięcie konstruktu Tol2 bezpośrednio do innego transgenu może być problematyczne, jeśli druga linia transgeniczna jest wykonana przy użyciu tego samego układu transpozonowego. Powszechną praktyką byłoby stworzenie niezależnej linii transgenicznej, a następnie przecięcie nowej linii z inną linią reporterową. Gwarantuje to, że nie będzie żadnego wpływu nowej transgenezy na wcześniej wprowadzony transgen.

2. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (WISH) w połączeniu z barwieniem immunologicznym

  1. Utrwalanie próbki
    1. Pobrać zarodki przejściowego wstrzyknięcia lub stabilnej linii transgenicznej IL-34, które krzyżowały się z Tg (mpeg1: GFP) w pożądanych stadiach.
      nuta: W tym przypadku zarodki pobrano w 4 dni po zapłodnieniu (dpf). (W razie potrzeby) usunąć kosmówkę za pomocą strzykawki.
    2. Utrwalić zarodki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C lub 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) (około 25 °C).
    3. Umyj zarodki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami i Tween 20 (PBST) 3x 5 min.
    4. Odwodnić zarodki oddzielnie za pomocą 50% metanolu w PBST (50% metanolu/PBST) i 100% metanolu, 1x 5 min każdy. Następnie zmień na świeży 100% metanol i przechowuj w temperaturze -20 °C (co najmniej 2 godziny).
      nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  2. Hybrydyzacja sondy (dzień I)
    1. Ponownie nawodnij zarodki w poprzednich krokach 50% metanolem w PBST (50% metanolu/PBST), a następnie przemyj PBST 3x 5 min.
    2. Trawić zarodki za pomocą proteinazy K w PBST w temperaturze pokojowej (stężenie końcowe: 10 μg/ml; 1:2000 w PBST).
      nuta: Czas trawienia zależy od stadium zarodka: mniej niż 36 godzin po zapłodnieniu (hpf), nie ma potrzeby; 36 zarodków HPF-2 DPF, 3-5 min; 2-3 dpf zarodek, 10 min; 3-4 dpf zarodek, 15 min; 4-5 dpf zarodek, 15-20 min; 5-6 dpf zarodek, 20-27 min; >6 dpf zarodek, 25-30 min w temperaturze pokojowej (około 25 °C).
    3. Wyrzucić roztwór wytrawiający i ponownie przeprowadzić utrwalanie z 4% PFA, przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Umyj zarodki PBST 2x 10 min.
    5. Odrzucić PBST, przeprowadzić wstępną hybrydyzację z podgrzanym buforem hybrydyzacyjnym (buforem HB) w temperaturze 65 °C przez 5 minut, zawracać bufor HB do oryginalnej probówki.
    6. Przeprowadzić wstępną hybrydyzację z nowym podgrzanym buforem HB w temperaturze 65 °C przez co najmniej 1 godzinę.
    7. Podgrzej sondę9 (w tym przypadku była to sonda il34, 1 ng/ml) w temperaturze 65 °C przez co najmniej 10 minut. Następnie należy załadować bufor HB do oryginalnej probówki. Przeprowadzić hybrydyzację z wstępnie podgrzaną sondą w temperaturze 65 °C przez noc.
  3. Leczenie przeciwciałami (dzień II)
    1. Podgrzej wstępnie 50% formamidu/2x sól fizjologiczną cytrynianu sodu plus Tween 20 (SSCT), 2x SSCT, 0,2x SSCT w temperaturze 65 °C.
    2. Umieść sondę z recyklingu w oryginalnej rurce i przechowuj ją w temperaturze -20 °C.
    3. Umyć zarodki oddzielnie 50% formamidem/2x SSCT; 2x SSCT; 0,2x SSCT, 3x 20 min lub 2x 30 min każdy w temperaturze 65 °C.
    4. Umyj zarodki PBST 3x 5 min.
    5. Próbki należy zablokować 600 μl buforu blokującego (5% przefiltrowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w PBST) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Dodać 400 μl roztworu przeciwciała anty-digoksygeniny-HRP (1:1 000-1:2 000 w buforze blokującym) i inkubować zarodki w temperaturze 4 °C przez noc. Jeśli sygnały są słabe, użyj rozcieńczenia przeciwciała w stosunku 1:500.
  4. Barwienie i inkubacja przeciwciał pierwszorzędowych (dzień III)
    1. Usunąć przeciwciało, przemyć zarodki PBST, 6 x 20 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przepłukać próbkę 30 μl rozcieńczalnika 1x Plus Amplification przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Wyrzucić rozcieńczalnik przez pipetowanie; rozcieńczyć roztwór podstawowy fluoroforu i tyramdu (odczynnik do amplifikacji cyjaniny 3 plus (Cy3) lub odczynnika do amplifikacji cyjaniny 5 plus (Cy5), w tym przypadku użyto Cy3) 1:50 w 1x rozcieńczalnik do amplifikacji Plus, aby uzyskać roztwór roboczy fluoroforu i tyramdu. Przygotować 50-100 μl roztworu roboczego dla każdej próbki.
    4. Inkubować próbkę w roztworze roboczym fluoroforu tyramidowego przez 5-15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Jeśli sygnały są słabe, wydłuż czas inkubacji do 30 minut.
    5. Zatrzymaj reakcję, zmieniając roztwór roboczy za pomocą PBST i zbadaj sygnały.
    6. Umyj zarodki PBST 3x 10 min w temperaturze RT.
    7. Inkubować próbkę z pierwszorzędowym przeciwciałem w temperaturze 4 °C przez noc. W takim przypadku należy użyć przeciwciała Goat-Anti-GFP jako przeciwciała pierwszorzędowego.
  5. Wtórne barwienie przeciwciałami (dzień IV)
    1. Myj zarodki PBST przez 4x 30 min.
    2. Inkubować zarodki z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze 4 °C przez noc. W takim przypadku użyj przeciwciała Alexa 488-Anti-Goat jako przeciwciała drugorzędowego.
  6. Robienie zdjęć (Dzień V)
    1. Umyj zarodki PBST 3x 10 min w temperaturze RT.
    2. Przechowuj zarodki w 70% glicerolu w ciemności w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.

3. Obrazowanie na żywo

  1. Wybór próbki
    UWAGA:     Użyj obrazu na żywo, aby bezpośrednio zaobserwować, czy makrofagi ryb Tg (fabp10a: il34; fabp10a: DsRed; mpeg1: GFP) migrowałyby do wątroby pod wpływem indukcji IL-34 podczas 3-3,5 dpf. W tym przypadku linia transgeniczna Tg (fabp10a-DsRed) jest używana do oznaczania obszaru wątroby i uwidaczniania go, ułatwiania lokalizacji wątroby i określenia, czy makrofagi migrują do wątroby. Przed obrazowaniem użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby wybrać podwójnie dodatnie zarodki DsRed i GFP.
  2. Montowanie ryb
    1. Za pomocą metalowej kąpieli podgrzej 1 ml 1% niskotopliwej agarozy do temperatury powyżej 90 °C, aby całkowicie ją stopić.
    2. Po schłodzeniu niskotopliwej agarozy do temperatury ciała należy dodać 50 μl 0,2% tricainy i równomiernie wymieszać tricainę z agarozą.
    3. Przenieś znieczulone zarodki do małego naczynia zamontowanego ze szkiełkiem zakrywającym na dnie, usuń otaczającą wodę, powoli upuść niskotopliwą agarozę na zarodki, ostrożnie ustaw pozycję ryby przed zestaleniem się agarozy, trzymaj obszar wątroby blisko szkiełka nakrywkowego na dnie naczynia.
    4. Po zestaleniu się niskotopliwej agarozy ostrożnie przykryj ją kolejną warstwą agarozy, aby ją wzmocnić.
    5. Umieść naczynie na stole nośnym mikroskopu konfokalnego, przykryj rybę roztworem E210 trikainą i rozpocznij obrazowanie.
  3. Obsługa oprogramowania mikroskopu konfokalnego
    1. Otwórz oprogramowanie ZEN black 2.3, zainstaluj stół warsztatowy z żywymi komórkami na stole nośnym mikroskopu.
    2. Kliknij przycisk Zlokalizuj | Inkubacja | Temperatura, aby ustawić temperaturę na 29 °C.
    3. Umieść naczynie na środku stołu warsztatowego z żywymi komórkami, przykryj rybę roztworem E210 z trikainą.
    4. Kliknij menu Akwizycja, wybierz żądany tryb skanowania i lasery z menu Smart Setup, a następnie wybierz opcję Z-Stack and Position (Stos Z i pozycja).
    5. Kliknij menu Projektant eksperymentów, wybierz opcję Włącz eksperyment z wieloma blokami w pierwszym bloku, aby znaleźć próbkę w małym powiększeniu, a następnie przełącz się na wysokie powiększenie, niech obserwowany obszar znajdzie się w środku pola widzenia.
    6. Ustaw pozycję i informacje o Z-Stack, wybierz odpowiednią intensywność lasera, warstwy skanowania i prędkość obrazowania.
    7. Utwórz nowy blok i powtórz powyższe kroki. Po ustawieniu wszystkich bloków ustaw odpowiednią liczbę pętli i rozpocznij nagrywanie (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kroki związane z protokołem danio pręgowanego są zilustrowane w Rysunek 2. Najpierw wygenerowaliśmy konstrukcję pBLK-fabp10a-il34-sv40, w której il34 był sterowany przez promotor fabp10a (Rysunek 2). Konstrukt został mikrowstrzyknięty do jednokomórkowych zarodków danio pręgowanego Tg (mpeg1: GFP), które mogą oznaczać makrofagi zarodkami GFP i WT, które zostały wyhodowane do postaci dorosłych w celu wytwo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół pozwala nam zbadać funkcję chemokiny na zachowanie makrofagów in vivo, a procedura wymaga pewnej wiedzy technicznej. Podsumowując, istnieje kilka krytycznych kroków, aby uniknąć komplikacji w protokole: 1) wybierz odpowiednią linię transgeniczną, która wykazuje specyficzny i silny sygnał transgeniczny, aby oznaczyć komórkę będącą przedmiotem zainteresowania; 2) dobrać odpowiednią tkankę, która jest dostępna do obrazowania i nadekspresji genów transgenicznych; 3) wykonać czułą i specyficzną sondę RN...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Jingrong Peng za udostępnienie transgenicznej linii Tg (fabp10a: DsRed); Dr. Zilong Wen za udostępnienie linii transgenicznych Tg (mpeg1: GFP); Dr. Koichi Kawakami za dostarczenie wektora pTol2. Prace te były wspierane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (31771594), projekty Planu Nauki i Technologii Guangdong (2019A030317001) oraz Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (D2191450).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało
Alexa 488-Przeciwciało przeciwkozieInvitrogenA11055
Anty-Digoxigenin-HRP perkinelmerNEF832001EA
Przeciwciało kozie-anty-GFPAbcamab6658
odczynnik
CaCl2· 2H2OSigma21097
Cyjanina 3 Plus Odczynnik do amplifikacjiperkinelmeruNEL745001KT
E2 rozwiązanie15 mM  NaCl +0,5 mM KCl +1,0 mM MgSO4+150 &mikro; M  KH2PO4 + 50 & mikro; M  Na2HPO4 +1,0 mM CaCl2 + 0,7 mM NaHCO3 
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Life10099-133
Diament formamidowyA100314
glicerol SigmaV900860
Heparyna sodowaSigmaH3149
Bufor hybrydyzacyjny (HB)50% formamidu + 5 razy; SSC+9 mM cytrynian sodu+50 μ g/ml heparyny sodu+ 500 &m; g/mL tRNA+ 0,1% Tween20
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Agaroza niskotopliwaSigmaA9414
MetanolGHTECH1.17112.023
Błękit metylenowy SigmaM9140
MgSO4SigmaM2643
Na2HPO4SigmaS5136
NaClSigmaS5886
NaHCO3 SigmaS5761
Paraformaldehyd (PFA)Sigma158127Zawiesić 16 g PFA w 400 ml 1x PBS, podgrzewać w temperaturze 60 &; C  rozpuścić się ok. 30 min. Roztwór ten można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -4 stopni Celsjusza. Uwaga. Manipuluj za pomocą maski.
10 i razy; PBS14,2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2,4 g KH2PO4 in 1L ddH2O
Phenylthiourea (PTU)SigmaP7629
1&razy; Plus Amplifikacja RozcieńczalnikperkinelmeruNEL745001KT
Proteinaza K FermentasE00492
20 razy; Sól fizjologiczna cytrynian sodu (SSC)175,3 g NaCl + 88,2 g cytrynian sodu w 1 l ddH2O, pH 7,0
Cytrynian soduSigmaA5040
TrikaineSigmaE10521
tRNA SigmaR6625
Tween20SigmaP2287
Plasmid
pBLK-fabp10a-il34-sv40Dla generacji linii transgenicznej Tg (fab10a:il34) generacji linii transgenicznej
pBSK-il34Do przygotowania sondy il34
Fish
Tg (mpeg1: GFP)Znakuj makrofagi GFP
Tg (fabp10a: DsRed)Znakuj komórki wątroby DsRed
Tg (fab10a:il34)Nadekspresja IL-34 w komórkach wątroby

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  2. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
  3. Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
  4. Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
  5. Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045(2013).
  6. Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
  7. Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
  8. Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
  9. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. Eugene, OR. (2000).
  10. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: a practical approach. , Oxford University Press. New York. (2002).
  11. Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zebrafish ModelIL 34 OverexpressionFluorescent In Situ HybridizationImmunostainingConfocal Live ImagingTransgenic Fish EmbryosGFP Labeled MacrophagesTissue Specific Plasmid

Powiązane artykuły