Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe i identyfikacja małych peptydów ukierunkowanych na receptor czynnika wzrostu fibroblastów2 przy użyciu biblioteki peptydów wyświetlających fagi

DOI:

10.3791/60189

⸱

30 września 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedicine & Department of Cell Biology, Jinan University, National Engineering Research Center of Genetic Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Bioengineering Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania przesiewowego małych peptydów, które wiążą się z FGFR2, przy użyciu biblioteki peptydów wyświetlających fagi. Dalej analizujemy powinowactwo wybranych peptydów do FGFR2 in vitro i jego zdolność do hamowania proliferacji komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rodzina receptorów ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów (FGFR) składa się z czterech członków, a mianowicie FGFR1, FGFR2, FGFR3 i FGFR4, które są zaangażowane w różne działania biologiczne, w tym proliferację komórek, przetrwanie, migrację i różnicowanie. W różnych typach nowotworów zidentyfikowano kilka aberracji w szlaku sygnałowym FGFR, spowodowanych mutacjami lub zdarzeniami amplifikacji genów. W związku z tym ostatnie badania skupiły się na opracowaniu strategii obejmujących terapeutyczne ukierunkowanie na FGFR. Obecne inhibitory FGFR na różnych etapach rozwoju przedklinicznego i klinicznego obejmują albo małocząsteczkowe inhibitory kinaz tyrozynowych, albo przeciwciała monoklonalne, a w przygotowaniu jest tylko kilka inhibitorów opartych na peptydach. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystujący technologię wyświetlania fagów do badania przesiewowego małych peptydów jako antagonistów FGFR2. Krótko mówiąc, bibliotekę peptydów wyświetlanych przez fagi inkubowano na płytce pokrytej FGFR2. Następnie niezwiązany został zmyty przez TBST (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), a związany eluowano 0,2 M buforem glicyny-HCl (pH 2,2). Wymyty poddano dalszej amplifikacji i wykorzystano jako dane wejściowe do następnej rundy biopanowania. Po trzech rundach biopanacji sekwencje peptydowe poszczególnych klonów fagów zidentyfikowano za pomocą sekwencjonowania DNA. Na koniec przebadane peptydy zsyntetyzowano i przeanalizowano pod kątem powinowactwa i aktywności biologicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptory czynnika wzrostu fibroblastów (FGFR) odgrywają kluczową rolę w proliferacji komórek, gojeniu ran i angiogenezie in vivo1. Nieprawidłowa aktywacja sygnalizacji FGFR obserwowana w różnych nowotworach2,3,4,5 obejmuje amplifikację genu, mutacje genów, aberracje chromosomowe i nadmierne wydzielanie ligandów6. Wiele inhibitorów ukierunkowanych na FGFR wykazało obiecujące efekty terapeutyczne w badaniach klinicznych i dzieli się je głównie na trzy typy: (1) inhibitory kinaz drobnocząsteczkowych, które wiążą się z wewnątrzkomórkową domeną FGFR, (2) antagoniści ukierunkowani na segment zewnątrzkomórkowy oraz (3) pułapki ligandów FGF6. Chociaż kilka małocząsteczkowych inhibitorów kinaz ma dobre efekty terapeutyczne zarówno in vitro, jak i in vivo7, większość z nich ma słabą swoistość docelową i wykazuje działania niepożądane, takie jak nadciśnienie8. Większość antagonistów to przeciwciała monoklonalne9,10 i polypeptides11. Peptydy mają przewagę nad małymi cząsteczkami ze względu na ich specyficzność i mniejsze skutki uboczne. Zachowują również przepuszczalność komórek i nie kumulują się w określonych narządach w porównaniu z lekami białkowymi12. W związku z tym celowane małe peptydy są zarówno skutecznymi, jak i perspektywicznymi środkami terapeutycznymi.

Technologia wyświetlania fagów to łatwe, ale potężne narzędzie do identyfikacji małych peptydów, które mogą wiązać się z daną cząsteczką13,14,15. Użyliśmy biblioteki peptydów wyświetlających fagi, która jest oparta na prostym fagu M13 z ponad 109 różnych sekwencji peptydowych wyświetlanych na końcu do wiązania z cząsteczką docelową (patrz Tabela materiałów)16. Ze względu na wysokie powinowactwo fagów do danej cząsteczki, niezwiązane fagi mogą zostać wypłukane, a tylko ściśle związane fagi z pożądanymi krótkimi peptydami są zatrzymywane. Danymi celami molekularnymi mogą być unieruchomione białka17,18, węglowodany, hodowane komórki, a nawet materiały nieorganiczne19,20. Opisano ekscytujący przypadek, w którym peptydy specyficzne dla narządów zostały wybrane in vivo przy użyciu technologii wyświetlania fagów21. Zalety technologii wyświetlania fagów to wysoka przepustowość, łatwość obsługi, niski koszt i szeroki zakres zastosowań22.

W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół badania przesiewowego małych peptydów wiążących się z unieruchomionym białkiem (FGFR2) za pomocą biblioteki wyświetlania fagów. Skuteczność technologii jest również badana poprzez pomiar powinowactwa otrzymanego peptydu do FGFR2 za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC), a aktywność biologiczna za pomocą testu proliferacji komórek. Metoda może zostać rozszerzona o badania przesiewowe małych peptydów, które wiążą się z węglowodanami, hodowanymi komórkami, a nawet materiałami nieorganicznymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynnika

  1. LB (bulion lizogeniczny): Rozpuść 1 g tryptonu, 0,5 g ekstraktu drożdżowego i 0,5 g NaCl w 100 ml H2O. Autoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Bulion tetracyklinowy: Przygotować 20 mg/ml w 1:1 etanolu:H2O. Przechowywać w temperaturze -20 °C i przed użyciem przemieszać.
  3. Roztwór IPTG/X-gal: Zmieszać 0,5 g IPTG (izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd) i 0,4 g X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galaktozyd) w 10 ml DMF (dimetyloformamidu). Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C przez rok w ciemności.
  4. LB + Płytki tetracyklinowe (Tet): Rozpuść 1 g bakto-tryptonu, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g NaCl i 1,5 g agaru w 100 mlH2O. Autoklaw i schłodzić do < 70 °C. Dodać 100 μl bulionu tetracyklinowego i wlać płytki. Przechowywać talerze w temperaturze 4 °C w ciemności.
  5. Płytki LB + IPTG/X-gal: Rozpuść 1 g baktoonu-tryptonu, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g NaCl i 1,5 g agaru w 100 ml H2O. Autoklaw i ostudź do < 70°C. Dodać 100 μl roztworu IPTG/X-gal i wlać płytki. Przechowywać talerze w temperaturze 4 °C w ciemności.
  6. Bufor glicyna-HCI (0,2 M): Rozpuścić 1,5014 g glicyny i 100 mg BSA (albuminy surowicy bydlęcej) w 100 mlH2Oi dostosować pH do 2,2 za pomocą HCl. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Bufor Tris-HCl (1 M): Rozpuścić 12,11 g Tris (tris(hydroksymetylo)aminometanu) w 100 mlH2Oi dostosować pH do 9,1 za pomocą HCl. Autoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. Bufor powlekający (0,1 M): Rozpuścić 1,68 gNaHCO3 w 200 mlH2Oi dostosować pH do 8,6 za pomocą NaOH. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  9. Bufor blokujący: Przygotować 0,1 M NaHCO3 (pH 8,6) z 5 mg/ml BSA. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  10. TBS: Przygotuj 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) ze 150 mM NaCl. Autoklaw i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  11. 0,05%, 0,1% lub 0,5% TBST: Przygotuj TBS z 0,05%, 0,1% lub 0,5% (v/v) Tween-20. Przefiltrować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  12. PEG/NaCl: Przygotować 20% (w/v) glikolu polietylenowego–8000 z 2,5 M NaCl. Autoklaw i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  13. Roztwór TE: Wymieszaj 1 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0) i 2 ml 50 mM EDTA (pH 8,0) i dostosuj objętość do 100 ml za pomocą H2O. Autoklaw i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  14. Bufor jodkowy: Rozpuścić 30 g NaI w 50 ml TE, pH 8,0. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności.
  15. Agar górny: Rozpuść 1 g tryptonu, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g NaCl i 0,7 g agaryny w 100 ml H2O. Autoklaw i dozuj do 15 ml podwielokrotności. Przechowywać w temperaturze pokojowej do użycia.

2. Pierwsza runda biopanowania: badanie przesiewowe klonów fagów, które wiążą się z zewnątrzkomórkową domeną FGFR2

UWAGA: Używaj odpornych na aerozole końcówek do pipet i noś rękawiczki do wszystkich protokołów, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteriofagami środowiskowymi.

  1. Przygotować 10 μg/ml roztworu FGFR2 (czystość > 97%; patrz tabela materiałów) w buforze powlekającym. Dodaj 1 ml przygotowanego roztworu do naczynia o powierzchni 35cm2 i kilkakrotnie mieszaj, aż powierzchnia będzie całkowicie mokra. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z wytrząsaniem.
    UWAGA: Aby uniknąć wyboru wabików docelowych wiążących, docelowe białko musi być wysoce oczyszczone.
  2. Zaszczepić 5 ml pożywki LB + Tet Escherichia coli (E. coli) ER2738 przez 5–10 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Amplifikowane komórki ER2738 zostaną użyte do miareczkowania w kroku 3.3.
  3. Odlej roztwór powlekający z naczynia (nadmiar roztworu należy usunąć) i dodaj roztwór blokujący. Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  4. Wyrzuć roztwór blokujący i szybko przemyj 6 razy TBST (TBS + 0,05% (v/v] Tween-20). Unikaj wysuszenia naczynia.
  5. Rozpuść oryginalną bibliotekę fagów w 1 ml TBST [końcowe stężenie 1011 jednostek tworzących płytkę nazębną (PFU)], dodaj do powlekanego naczynia i delikatnie kołysz przez 2 godziny na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
  6. Wyrzuć supernatant i umyj naczynie 10 razy TBST (TBS + 0,05% (v/v) Tween-20), jak wykonano w kroku 2.4.
    UWAGA: Niezwiązane fagi muszą być dokładnie usunięte przez energiczne mycie.
  7. Eluować związany, dodając 1 ml 0,2 M buforu glicynowo-HCl (pH 2,2) do naczynia i delikatnie kołysząc przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Przenieść eluat do wysterylizowanej probówki do mikrofuge i zneutralizować ją 100 μl 1 M Tris-HCl, pH 9.1.
    UWAGA: W kroku 2.6 usuń niezwiązany tak bardzo, jak to możliwe, energicznie myjąc naczynie 10 razy. To kluczowy krok. Wymyty można przechowywać w temperaturze 4 °C przez tydzień. Najlepiej jednak jak najszybciej przejść do następnego kroku.

3. Wyznaczanie miana eluowanych fagów

  1. Przed użyciem podgrzej płytki LB + IPTG/X-gal przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  2. Przygotować 100 μl 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń (tj. 101, 102, 103 i 104) eluatu z kroku 2.8 w LB. Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy użyć końcówek z wkładami filtrującymi.
  3. Niech kultura z kroku 2.2 osiągnie środkową fazę logarytmiczną (OD600 ≈ 0,5). Dozować 200 μl kultury do wysterylizowanych probówek do mikrofuge, po jednej na każde rozcieńczenie eluatu.
  4. Aby zainicjować infekcję, dodać 10 μl każdego rozcieńczenia z kroku 3.2 do pojedynczych probówek zawierających kulturę E. coli ER2738 z kroku 3.3. Szybko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  5. Pokryć 90 μl mieszaniny z kroku 3.4 na płytki LB + IPTG/X-gal patyczkami do powlekania.
  6. Opcjonalnie rozpuść górny agar w kuchence mikrofalowej, rozlej 3 ml do sterylnych probówek hodowlanych, po jednej na każde rozcieńczenie eluatu, i utrzymuj probówki w temperaturze 45 °C. Przenieść mieszaninę z kroku 3.4 do probówek hodowlanych zawierających górny agar o temperaturze 45 °C. Szybko wymieszaj i natychmiast wlej kulturę na wstępnie podgrzaną płytkę LB/IPTG/X-gal. Delikatnie przechyl i obróć płytkę, aby równomiernie rozprowadzić górny agar.
  7. Po 5 minutach odwrócić płytki i inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C.
  8. Policz tabliczki na tabliczkach z około 100 tabliczkami. Pomnóż każdą liczbę przez współczynnik rozcieńczenia dla tej płytki, aby uzyskać miano faga w PFU na 10 μl.
  9. Zaszczepić kolejne 5 ml pożywki LB + Tet E. coli ER2738 w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem w celu amplifikacji faga.
    UWAGA: Użyj kultury ER2738 w środkowej fazie logarytmicznej (OD600 ≈ 0,5) dla miana fagów. Jeśli większość blaszek na płytkach X-gal/IPTG jest biała, oznacza to, że pula fagów została skażona dzikimi bakteriofagami. Jeśli dojdzie do zanieczyszczenia, konieczne jest ponowne rozpoczęcie etapów płukania z niezanieczyszczonego roztworu podstawowego faga.

4. Amplifikacja fagów

  1. Rozcieńczyć (1:100) nocną hodowlę z kroku 3,8 w 20 ml LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Dodać nieamplifikowany eluat i inkubować energicznie wytrząsając przez 4,5 godziny w temperaturze 37 °C.
  2. Przenieść kulturę do probówki wirówkowej i wirować przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do świeżej probówki, ponownie odwirować i wyrzucić osad.
  3. Przenieść górne 80% supernatantu do świeżej probówki i dodać do niej 1/6 objętości 20% PEG/2,5 M NaCl. Pozostawić faga do wytrącenia się w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Dobrze wymieszać supernatant kultury z PEG/2,5 M NaCl.
  4. Odwirować wytrącony przy stężeniu 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, ponownie odwirować i usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety.
  5. Zawiesić osad w 1 ml TBS i przenieść supernatant do probówki do mikrodmuchowania. Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrofuge i ponownie wytrącić, dodając 1/6 objętości 20% PEG/2,5 M NaCl. Inkubować na lodzie przez 15–60 minut. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, ponownie odwirować i usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety.
  7. Ponownie zawiesić osad w 200 μl TBS i odwirować przez dodatkową minutę w celu usunięcia zanieczyszczeń. Przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrofuge, aby otrzymać amplifikowany eluat.
  8. Mianować amplifikowany zgodnie z opisem w sekcji 3.
    UWAGA: Rozcieńczenie amplifikowanego eluatu jest wyższe w porównaniu z eluatem nieamplifikowanym; Zazwyczaj sugeruje się seryjne rozcieńczenia 108–1011.

5. Druga runda biopanowania

  1. Powtórz sekcje od 2 do 4.
  2. Mianować drugą rundę amplifikowanego eluatu na płytkach LB + IPTG/X-gal, jak opisano w sekcji 3.
    UWAGA: Zmniejsz stężenie otoczki białka FGFR2 do 5 μg/ml. Jako dane wejściowe należy użyć amplifikowanego faga z kroku 4.7 i utrzymywać miano takie samo jak w pierwszej rundzie (1011 PFU). Skróć czas inkubacji faga i naczynia pokrytego FGFR2 do 1 godziny i zwiększ stężenie Tween do 0,1% (v/v) na etapach mycia.

6. Trzecia runda biopanowania

  1. Powtórz kroki 2.1-2.6.
  2. Eluować związany, dodając 1 ml 20 μM roztworu bFGF (ligand dla FGFR2) do naczynia i delikatnie kołysząc przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Powtórz kroki 3.1-3.7.
    UWAGA: Zmniejszyć stężenie otoczki białka FGFR2 do 2,5 μg/ml. Jako dane wejściowe należy użyć drugiej rundy amplifikowanego faga z sekcji 5 i utrzymywać miano takie samo jak w pierwszej rundzie (1011 PFU). Skróć czas inkubacji faga i naczynia pokrytego FGFR2 do 30 minut i zwiększ stężenie Tween do 0,5% (v/v) na etapach mycia.

7. Pozyskiwanie DNA płytki nazębnej do sekwencjonowania

  1. Wzmocnienie płytki nazębnej
    1. Rozcieńczyć (1:100) nocną hodowlę ER2738 w LB. Dozować 1 ml rozcieńczonej kultury do probówki o pojemności 2 ml, po jednej dla każdego klonu, który ma być scharakteryzowany.
    2. Za pomocą końcówki pipety pobrać jedną dobrze oddzieloną niebieską blaszkę z płytki mianowej z sekcji 6 i przenieść do probówki zawierającej rozcieńczoną kulturę. Wybierz łącznie 15 tabliczek.
      UWAGA: Płytki powinny mieć < 1–3 dni, przechowywać w temperaturze 4 °C i mieć < 100 blaszek.
    3. Inkubować probówki, energicznie wstrząsając przez 4,5 godziny w temperaturze 37 °C.
    4. Przenieść kultury do probówek wirówkowych i wirować przy 12 000 x g przez 30 s. Przenieść supernatant do świeżej probówki i ponownie odwirować.
    5. Za pomocą pipety przenieść górne 80% supernatantu do świeżej probówki. Oznacz to jako amplifikowany zapas fagów.
      UWAGA: Rozcieńczyć amplifikowany równą objętością 100% sterylnego glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.
  2. Ekstrakcja DNA płytki nazębnej
    1. Przenieś 500 μl amplifikowanego faga do świeżej probówki do mikrofuge i dodaj 1/6 objętości 20% PEG/2,5 M NaCl. Odwróć do wymieszania i odstaw na 10–20 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odlać supernatant.
      UWAGA: Osad faga może nie być widoczny.
    3. Ponownie odwirować. Ostrożnie usunąć pozostały sklarowany szwaczek.
    4. Dokładnie zawiesić osad w 100 μl buforu jodkowego, energicznie stukając w probówkę.
    5. Dodać 250 μl 100% etanolu i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Umyj granulat 0,5 ml 70% etanolu, szybko ponownie odwiruj, usuń supernatant i krótko wysusz pellet.
    7. Zawiesić osad w 30 μl buforu TE i użyć go do sekwencjonowania.
      UWAGA: Wstępnie schłodzić 70% etanol w temperaturze -20°C przed krokiem 7.2.6. Osad fagowy musi być dokładnie zawieszony w buforze jodkowym przed dodaniem etanolu.

8. Identyfikacja sekwencji peptydowej

  1. Do sekwencjonowania należy użyć startera sekwencjonowania -96 gIII (5'-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG –3').
  2. Przeanalizuj sekwencje peptydowe wyświetlane na fagu na podstawie wyników sekwencjonowania DNA.
  3. Zsyntetyzuj małe peptydy i przeanalizuj je za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i spektrometrii mas, aby potwierdzić ich czystość (≥98%).

9. Wykrywanie powinowactwa otrzymanego małego peptydu i białka zewnątrzkomórkowego FGFR2 przez ITC

  1. Odgazuj sterylną wodę za pomocą przyrządu ultradźwiękowego. Rozpuść mały peptyd i białko zewnątrzkomórkowe FGFR2 w sterylnej wodzie. Odwirować te próbki, aby usunąć resztki osadu.
  2. Przeprowadzić doświadczenie miareczkowania ITC w temperaturze 25 °C. Miareczkować 40 μM małego peptydu w komórce za pomocą 1,5 μM białka FGFR2 ze strzykawki, z prędkością mieszania 750 obr./min. Dodać białko FGFR2 w 2 μl podwielokrotności (w sumie 19 wstrzyknięć) w odstępach 5-minutowych.
  3. Analizowanie danych ITC przy użyciu modelu powiązań z jedną lokacją.
    UWAGA: Sterylna woda musi zostać odgazowana, a wszystkie próbki muszą zostać odwirowane w celu usunięcia pęcherzyków powietrza i resztkowych zanieczyszczeń. Doświadczenie musi być przeprowadzone w stałej temperaturze 25 °C.

10. Weryfikacja aktywności biologicznej otrzymanego małego peptydu za pomocą testu proliferacji komórek

  1. Wysiewaj BALB/c 3T3 komórki (3,0 × 103 komórki/dołek, 100 μl) na 96-dołkowej płytce ze zmodyfikowanym podłożem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Zastąp supernatant świeżym DMEM z 0,5% FBS i głodz komórki przez 12 godzin.
  3. Wykonać seryjne rozcieńczenia małego peptydu (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 i 100 μM) świeżym DMEM uzupełnionym 0,5% FBS (6 zduplikowanych studzienek / stężenie). Usunąć supernatant z płytki 96-dołkowej i dodać 100 μl roztworu małego peptydu do dołka. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Zastąp supernatant świeżym DMEM zawierającym 10% roztwór zestawu do liczenia komórek (CCK)-8 i inkubuj przez 2 godziny.
  5. Zmierz absorbancję każdej studzienki przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek i przeanalizuj żywotność komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzyskanie małego peptydu o wysokim powinowactwie ukierunkowanego na FGFR2.

Do badania przesiewowego fagów ukierunkowanych na FGFR2, w tym badaniu użyto biblioteki Ph.D.-7. Schematyczne przedstawienie przepływu pracy jest pokazane w Rysunek 1. W tym procesie liczba wejściowych fagów (PFU) pozostała niezmieniona, podczas gdy stężenie otoczki białka FGFR2 było stopniowo zmniejszane. Wyniki miana faga sugerowały, że liczba odzyskanych fagów wzrastała ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kombinatoryczna biblioteka fagów jest potężnym i skutecznym narzędziem do wysokoprzepustowych badań przesiewowych nowych peptydów, które mogą wiązać cząsteczki docelowe i regulować ich funkcję13. Obecnie biblioteki peptydów wyświetlających fagi mają szeroki zakres zastosowań. Na przykład można je wykorzystać do selekcji bioaktywnych peptydów związanych z białkami receptorowymi23, celami niebiałkowymi 24,25, naśladow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Program Nauki i Technologii w Kantonie (nr 2016201604030039).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m FiltrMerck MilliporeMPGP002A1
35 cm2 Małe naczynieThermo150460
70% etanolufabryka odczynników chemicznych Guangzhou64-17-5-96
StarterSynteza z Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Płytka 96-dołkowaNest701001-2
AgarBeyotimeST004D
Oksoidbakto-tryptonowyL0037
BALB/c Komórki 3T3ATCCCRL-­ 6587
BSABiodragonBD-M10110
CCK-8 zestawDOJINDOCK04
DMEMHyclonsh30243.01
DMFNewprobePB10247
EDTAInvitrogen15576028
FGF2 ProteinSino Biological Inc.10014-HNAECzystość >95%
glicynySigmaG8898-1KG
IPTGBeyotimeST097
ITC200 systemMicroCal Omega
NaClSigmaS6191
NaHCO3Guangzhou fabryka odczynników chemicznych144-55-8
NaIBidepharm
Fabrykaodczynników chemicznych NaOH Guangzhou1310-73-2
PEG– 8000SigmaP2139-250
Ph.D.-7 zestaw biblioteki peptydów do wyświetlania fagówNew England BioLabsE8100SZawierający bibliotekę fagów Ph.D.-7, E. coli Szczep gospodarza ER2738 i kontrolny M13KE
Rekombinowane białka domeny zewnątrzkomórkowej FGFR2Sino Biological Inc.10824-H08HCzystość > 97%
Synteza małych peptydówz GL Biochem Ltd. (Szanghaj, Chiny)
TetracyklinaSigmaS-SHS-5
TrisSigma SLF-T1503
Tween-20BeyotimeST825
X-galBeyotimeST912
Ekstrakt drożdżowyOxoidZobacz materiał LP0021
sekwencjonowania gIII BD40879

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
  2. Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
  3. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  4. Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
  5. Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93(2010).
  6. Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
  7. Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
  8. Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
  9. French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713(2012).
  10. Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
  11. Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
  12. Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
  13. Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8(2016).
  14. Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
  15. Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
  16. Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
  17. Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
  18. Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
  19. Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
  20. Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
  21. Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
  22. Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
  23. Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
  24. Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
  25. Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
  26. Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
  27. Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85(2008).
  28. Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478(2014).
  29. Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
  30. Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiew FGFR2biblioteka phage displaypeptydowe antagoni ciprocedura biopanninguelucja glicyn HClanaliza ITCtest proliferacji fibroblast wzestaw CCK 8liczenie plam p ywkowychamplifikacja miana faga

Powiązane artykuły