Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60199

⸱

19 stycznia 2020

 ,  , 
1Université de Bordeaux, CNRS, Bordeaux INP, LCPO, UMR 5629

W tym artykule

Podsumowanie

Celem protokołu jest wiarygodny pomiar właściwości mechanicznych membrany gigantycznych pęcherzyków za pomocą aspiracji mikropipet.

Streszczenie

Gigantyczne pęcherzyki uzyskane z fosfolipidów i kopolimerów mogą być wykorzystywane w różnych zastosowaniach: kontrolowane i ukierunkowane dostarczanie leków, rozpoznawanie biomolekularne w biosensorach do diagnozy, funkcjonalne błony dla sztucznych komórek oraz rozwój inspirowanych biologicznie mikro/nano-reaktorów. We wszystkich tych zastosowaniach charakterystyka ich właściwości membranowych ma fundamentalne znaczenie. Wśród istniejących technik charakteryzacji, aspiracja mikropipet, zapoczątkowana przez E. Evansa, umożliwia pomiar właściwości mechanicznych membrany, takich jak moduł ściśliwości powierzchniowej, moduł zginania oraz naprężenie i odkształcenie podczas lizy. W tym miejscu przedstawiamy wszystkie metodologie i szczegółowe procedury uzyskiwania gigantycznych pęcherzyków z cienkiej warstwy lipidu lub kopolimeru (lub obu), produkcję i obróbkę powierzchniową mikropipet oraz procedurę aspiracji prowadzącą do pomiaru wszystkich wcześniej wymienionych parametrów.

Wprowadzenie

Gigantyczne pęcherzyki uzyskane z fosfolipidów (liposomów) są szeroko stosowane od lat siedemdziesiątych jako podstawowy model błony komórkowej1. Pod koniec lat dziewięćdziesiątych XX wieku morfologie pęcherzykowe uzyskane w wyniku samoorganizacji kopolimerów, nazwane polimeromami w odniesieniu do ich analogów lipidowych2,3, szybko pojawiły się jako interesująca alternatywa dla liposomów, które mają słabą stabilność mechaniczną i słabą modułową funkcjonalność chemiczną. Jednak ich biomimetyczny charakter komórek jest raczej ograniczony w porównaniu z liposomami, ponieważ te ostatnie składają się z fosfolipidów, głównego składnika błony komórkowej. Co więcej, ich niska przepuszczalność błony może stanowić problem w niektórych zastosowaniach, takich jak dostarczanie leków, gdzie wymagana jest kontrolowana dyfuzja gatunków przez membranę. Ostatnio powiązanie fosfolipidów z kopolimerami blokowymi w celu zaprojektowania hybrydowych pęcherzyków i błon polimerowo-lipidowych jest przedmiotem coraz większej liczby badań4,5. Główną ideą jest zaprojektowanie jednostek, które synergistycznie łączą zalety każdego składnika (biofunkcjonalność i przepuszczalność dwuwarstw lipidowych ze stabilnością mechaniczną i wszechstronnością chemiczną membran polimerowych), które można wykorzystać w różnych zastosowaniach: kontrolowane i ukierunkowane dostarczanie leków, rozpoznawanie biomolekularne w biosensorach do diagnozy, funkcjonalne błony dla sztucznych komórek, rozwój mikro-/nano-reaktorów inspirowanych biologią.

Obecnie różne środowiska naukowe (biochemicy, chemicy, biofizycy, fizykochemicy, biolodzy) są coraz bardziej zainteresowane rozwojem bardziej zaawansowanego modelu błony komórkowej. Tutaj naszym celem jest przedstawienie, tak szczegółowo, jak to tylko możliwe, istniejących metodologii (elektroformacja, aspiracja mikropipet) w celu uzyskania i scharakteryzowania właściwości mechanicznych gigantycznych pęcherzyków oraz najnowszych "zaawansowanych" modeli błon komórkowych, które są hybrydowymi lipidowymi pęcherzykami gigantycznymi4,5.

Celem tych metod jest uzyskanie wiarygodnego pomiaru obszaru ściśliwości i modułów zginania membrany, jak również ich naprężenia lizy i odkształcenia. Jedną z najpowszechniejszych technik pomiaru sztywności zginania gigantycznego pęcherzyka jest analiza fluktuacji6,7, oparta na bezpośredniej obserwacji mikroskopu wideo; Wymaga to jednak dużych widocznych fluktuacji błony i nie jest systematycznie uzyskiwane na grubych membranach (np. polimeromach). Moduł ściśliwości powierzchni można wyznaczyć doświadczalnie za pomocą techniki Langmuira Blodgetta, ale najczęściej na monowarstwie8. Technika aspiracji mikropipet pozwala na pomiar obu modułów na dwuwarstwie tworzącej gigantyczny pęcherzyk jednowarstwowy (GUV) w jednym eksperymencie.

Poniższa metoda jest odpowiednia dla wszystkich amfifilowych cząsteczek lub makrocząsteczek zdolnych do tworzenia dwuwarstw, a co za tym idzie, pęcherzyków przez elektroformację. Wymaga to płynnego charakteru dwuwarstwy w temperaturze elektroformacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wykonywanie mikropipet

UWAGA: W tym przypadku niezbędne są mikropipety o średnicy wewnętrznej od 6 do 12 µm i długości zwężenia około 3-4 mm. Szczegółowa metoda wykonania mikropipety została opisana poniżej.

  1. Umieść kapilarę z borokrzemianowego szkła w uchwycie wyciągacza i przymocuj jeden z końców, dokręcając pokrętło.
  2. Ostrożnie przesuń szkło przez otwory z boku komory grzejnej.
  3. Dokręć pokrętło zaciskowe po drugiej stronie.
  4. Kontroluj rozmiar końcówki oraz długość stożka, aby uzyskać pożądane parametry. W tym celu zoptymalizuj parametry techniczne, takie jak temperatura grzania, siła wyciągania (pull), prędkość (velocity), opóźnienie (delay) i ciśnienie (pressure). Poniżej znajduje się przykład użytego programu:
    Temperatura (Heat): 50 °C
    Wyciąganie (Pull): 10 (Zakres urządzenia: 0-25 w jednostkach arbitralnych)
    Prędkość (Velocity): 30 (Zakres: 0-25 w jednostkach arbitralnych)
    Opóźnienie (Delay): 1 (Zakres: 0-25 w jednostkach arbitralnych)
    Ciśnienie (Pressure): 50 (Zakres: 0-9 w jednostkach arbitralnych)
  5. Kliknij PULL, aby wykonać czynności zdefiniowane w programie. Kapilara zostanie wówczas rozdzielona na dwie mikropipety, których wymiary należy dopasować za pomocą mikrokuźni.
  6. Włóż mikropipetę do metalowego uchwytu pipet w mikrokuźni (patrz Rysunek 1). Używając obiektywu 10x, dostosuj stół mikroskopu i manipulator pipety (ruch pionowy i poziomy), aż końcówka pipety znajdzie się blisko powierzchni szklanej kuleczki.
  7. Naciśnij przełącznik nożny, aby stopić szklaną kuleczkę. Obniż końcówkę i doprowadź do kontaktu z roztopionym szkłem. Roztopione szkło wpłynie do pipety dzięki zjawisku kapilarnemu. Odczekaj kilka sekund, aż poziom roztopionego szkła osiągnie odpowiednią wysokość, jak pokazano na wstawce do Rysunku 1.
  8. Zatrzymaj grzanie, zdejmując nacisk z przełącznika nożnego, i szybko odsunij końcówkę za pomocą pionowego manipulatora pipety, aby uzyskać ostre przełamanie.
  9. Powtarzaj kroki 1.7 i 1.8, aż zostanie uzyskana pożądana średnica (6 do 12 µm).
    UWAGA: Aby zwiększyć dokładność pomiaru średnicy, w ostatnim kroku należy użyć obiektywu 32x wyposażonego w siatkę pomiarową.

2. Powlekanie końcówek pipet BSA (albuminą surowiczą bydlęcą)

  1. Przygotowanie 0,1 M roztworu glukozy zawierającego 1% masowo BSA w czystej wodzie.
    1. Odważenie 180 mg proszku glukozy, umieszczenie go w 15 mL polipropylenowej probówce stożkowej i dopełnienie do 10 mL czystą wodą.
    2. Dodanie 0,1 g proszku BSA i delikatne mieszanie za pomocą rotacyjnego mieszadła do probówek aż do całkowitego rozpuszczenia (około 4 h).
  2. Pobrać roztwór za pomocą jednorazowej strzykawki Luer 10 mL z igłą. Po napełnieniu usunąć igłę i założyć filtr z octanu celulozy 0,2 μm. Napełnić kilka polipropylenowych probówek do mikrocentryfugi (1,5 mL), które posłużą do zanurzenia końcówki.
  3. Umieścić kapilary pionowo w uchwytach. Obniżyć uchwyt i zanurzyć końcówkę w roztworze glukozy/BSA na noc. Roztwór powinien podnieść się na wysokość około 1 cm w wyniku działania kapilarnego.
  4. Wyjąć końcówkę pipety z roztworu glukozy/BSA. Przygotować 5 mL 0,1 M roztworu glukozy (rozpuścić 90 mg proszku glukozy w 5 mL czystej wody) i przefiltrować przez filtr z octanu celulozy 0,2 μm.
  5. Napełnić pipetę roztworem glukozy, używając szklanej strzykawki 50 µL wyposażonej w elastyczną kapilarę z topionej krzemionki. Następnie usunąć cały roztwór glukozy poprzez wciągnięcie go z powrotem i odrzucić (Rycina 2). Powtórzyć ten krok kilka razy, aby usunąć niezwiązaną BSA.

3. Tworzenie GUV i GHUV metodą elektroformowania

UWAGA: Elektroformowanie jest powszechnie stosowaną techniką opracowaną przez Angelovą9. Poniżej opisano procedury przygotowania komory do elektroformowania, nanoszenia filmu lipidowego lub polimerowego (lub obu dla GHUVs (Giant Hybrid Unilamellar Vesicles)) oraz hydratacji filmu w zmiennym polu elektrycznym. Opisano również procedurę zbierania otrzymanych GUV.

  1. Przygotowanie roztworów amfifila, sacharozy i glukozy
    1. Przygotować roztwór amfifila o stężeniu 1 mg/mL. Odważyć 10 mg amfifila i rozpuścić w 10 mL chloroformu. Przechowywać roztwór w szczelnie zamkniętych fiolkach, aby zapobiec odparowaniu rozpuszczalnika.
    2. Przygotować roztwór zapasowy 1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolaminy-N-(lissaminy rhodaminy B sulfonylowej) (DOPE-Rhod) o stężeniu 1 mg/mL w chloroformie.
    3. Dodać 10 µL roztworu fluorescencyjnego lipidu do roztworu amfifila. Przechowywać roztwory w szczelnie zamkniętych fiolkach, aby zapobiec odparowaniu rozpuszczalnika.
    4. Przygotować roztwory sacharozy i glukozy o stężeniu 0,1 M. Odważyć odpowiednio 342 mg sacharozy i 180 mg glukozy, a następnie rozpuścić je w 10 mL czystej wody.
  2. Przygotowanie komory elektroformowania
    UWAGA: Do budowy urządzenia do elektroformowania można użyć różnych materiałów przewodzących (np. drutów platynowych10, igieł ze stali nierdzewnej1). Komora do elektroformowania składa się z dwóch szkiełek ITO oddzielonych gumową przekładką w kształcie pierścienia O-ring, która została przecięta z jednej strony w celu utworzenia otworu. Szkiełka są połączone z generatorem napięcia za pomocą dwóch przewodów elektrycznych (Rysunek 3 i Rysunek 4A).
    1. Oczyścić szkiełka ITO rozpuszczalnikiem organicznym (np. chloroformem). Zidentyfikować powierzchnię przewodzącą za pomocą omomierza.
    2. Przymocować przewody elektryczne po stronie przewodzącej za pomocą taśmy klejącej.
    3. Nakładanie roztworu amfifila
      1. Zanurzyć kapilarę w roztworze, aż poziom cieczy podniesie się w wyniku działania kapilarnego, i pobrać około 5 μL roztworu.
      2. Przystawić kapilarę do środka szklanej płytki ITO i delikatnie rozprowadzić roztwór. Odczekać 10 sekund, aby zapewnić całkowite odparowanie rozpuszczalnika (Rysunek 4A).
      3. Powtórzyć tę procedurę 3 razy dla każdej strony.
    4. Nałożyć warstwę smaru bezsilikonowego po obu stronach otwartej przekładki O-ring. Umieścić go wokół obszaru nakładania roztworu. Położyć przewodzącą stronę drugiej szklanej płytki ITO na górze przekładki.
    5. Umieścić komorę do elektroformowania w próżni na 3 godziny, aby usunąć wszelkie ślady rozpuszczalnika organicznego.
  3. Procedura elektroformowania
    1. Podłączyć przewody elektryczne do generatora.
    2. Ustawić generator według następujących parametrów:
      Napięcie sinusoidalne zmienne
      Częstotliwość: 10 Hz
      Amplituda: 2 Vpeak-to-peak
      UWAGA: Dla każdego układu należy dobrać optymalną częstotliwość i czas trwania przyłożonego napięcia.
    3. Upewnić się, że napięcie jest przyłożone przed wstrzyknięciem roztworu do komory.
    4. Wstrzyknąć 1 mL roztworu za pomocą strzykawki z igłą o średnicy wewnętrznej 0,8 mm, aby wypełnić komorę. Usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza.
    5. Pozostawić komorę pod przyłożonym napięciem i częstotliwością przez 75 min (Rysunek 4B).
  4. Zbiór GUV
    1. Wyłączyć generator.
    2. Za pomocą strzykawki 1 mL z igłą o średnicy wewnętrznej 0,8 mm odessać niewielką część roztworu, aby wytworzyć pęcherzyk powietrza wewnątrz komory. Lekko przechylić komorę, aby pęcherzyk poruszał się w jej wnętrzu. Może to pomóc w oddzieleniu GUV od powierzchni ITO (Rysunek 4C).
    3. Odessać cały roztwór i przenieść go do plastikowej probówki o pojemności 1 mL.
    4. Usunąć przewody i oczyścić szkiełka ITO rozpuszczalnikami organicznymi (najpierw toluenem, potem chloroformem).

4. Konfiguracja mikromanipulacji

UWAGA: Zasada aspiracji mikropipetą polega na zassaniu pojedynczego pęcherzyka przez szklaną mikropipetę poprzez wytworzenie podciśnienia. Długość „języka” wewnątrz pipety jest mierzona jako funkcja ciśnienia ssania. Powlekanie pipety BSA, opisane wcześniej, jest niezbędne, aby zapobiec lub zminimalizować jakąkolwiek adhezję między błonami pęcherzyków a pipetą.

Protokół został przedstawiony poniżej.

  1. Połączenie pipety z rezerwuarem wypełnionym wodą
    UWAGA: Zbiornik wypełniony wodą oraz mikrometr są przymocowane do płytki przesuwnej. Licznik cyfrowy z głowicą mikrometryczną umożliwia przemieszczanie urządzenia w pionie w zakresie od 0 do 2,5 cm z dokładnością do 1 µmPrzesunięcie wzdłuż aluminiowej szyny optycznej jest możliwe na długości do 1 metra. Silikonowa rurka łączy zbiornik z uchwytem kapilary (Rysunek 5A).
    1. Napełnić zbiornik czystą wodą. Podłączyć jednorazową strzykawkę o pojemności 5 ml do metalnego uchwytu kapilary. poprzez przewody silikonowe i aspirator w celu stworzenia przepływu wody ze zbiornika do uchwytu.
    2. Lekko dotknąć probówki, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Jednocześnie podnieść zbiornik z wodą, aby wytworzyć nadciśnienie. Strzykawka 5 ml pozostaje przymocowana do uchwytu.
    3. Po etapach powlekania i czyszczenia opisanych wcześniej (patrz krok 2), należy napełnić kapilarę roztworem glukozy, aż do momentu utworzenia się kropli na jej końcu. Należy wyjąć rurkę strzykawki z metalnego uchwytu, aby wywołać niewielki przepływ wody na jej końcu.
    4. Odwrócić kapilarę do góry nogami i połączyć kroplę glukozy z przepływem wody z uchwytu. Przymocować kapilarę i uchwyt, skręcając je ze sobą.
  2. Ustawienie pipety
    UWAGA: Podczas tej operacji zbiornik z wodą pozostaje umieszczony na aluminiowej szynie w celu utrzymania nadciśnienia.
    1. Należy wziąć wykonany samodzielnie aluminiowy stolik wyposażony w dwa szkiełka przedmiotowe (wcześniej oczyszczone etanolem) i przykleić je za pomocą smaru próżniowego po obu stronach. Zamontować go na stoliku mikroskopu i utworzyć menisk między dwoma szkiełkami, używając strzykawki o pojemności 1 ml zawierającej 0,1 M glukozy, jak pokazano w Rysunek 5B,C.
    2. Umieść pipetę wraz z uchwytem na jednostce napędowej mikromanipulatora i dokręć pokrętło mocujące.
    3. Użyj joysticka panelu sterowania w trybie grubym, aby opuścić mikropipetę w pobliże menisku glukozy. W trybie precyzyjnym dostosuj pozycję końcówki tak, aby znajdowała się ona w centrum menisku.
    4. Zanurz końcówkę w glukozie na kilka minut, aby oczyścić jej powierzchnię zewnętrzną i wewnętrzną (dzięki utrzymaniu nadciśnienia przepływ wody wypłucze wewnętrzną powierzchnię pipety, usuwając niepowleczone BSA).
    5. Zapisz pozycję końcówki na klawiaturze mikromanipulatora i wycofaj ją z menisku.
    6. Usuń menisk glukozy i zastąp go nowym. Odsącz 2 μL GUV w 0,1 M sacharozie przy użyciu 20 μL mikropipetę i zanurz ją w świeżym menisku glukozy. Obserwuj w trybie DIC (kontrast różnicowy interferencyjny) GUV-y znajdujące się na dnie, co wynika z różnicy gęstości między sacharozą (znajdującą się głównie wewnątrz GUV-ów) a glukozą (znajdującą się głównie na zewnątrz GUV-ów).
    7. Gdy pęcherzyki są lekko odpompowane, ponownie włóż pipetę ssącą i ustaw ostrość na jej końcówkę. Ustaw wysokość H0 zbiornika z wodą, dla którego ciśnienie wynosi prawie 0. W tym celu należy wykorzystać małe pęcherzyki lub cząstki naturalnie występujące w roztworze i regulować wysokość zbiornika z wodą do momentu zatrzymania ruchu tych cząstek.
    8. W tym momencie należy otoczyć menisk olejem mineralnym, aby zapobiec parowaniu wody, patrz Rycina 5D.
      UWAGA: Temperatura w pomieszczeniu powinna być utrzymywana w zakresie 20-22 °C poprzez zastosowanie klimatyzacji.
  3. Eksperyment z aspiracją mikropipetą
    1. Obniżyć końcówkę pipety (6-12 µm o średnicy) i wytworzyć niewielkie podciśnienie (-1 cm), aby odessać pęcherzyk (15-30 µm o średnicy). Membrana wybranej pęcherzyka powinna lekko fluktuować i nie może wykazywać żadnych widocznych defektów (brak wypustek lub filamentów) (Rycina 6).
    2. Za pomocą mikromanipulatora podnieś pipetę na wyższy poziom, aby odizolować aspirowany pęcherzyk od pozostałych pęcherzyków, i utrzymuj tę pozycję przez cały czas trwania eksperymentu.
    3. Wstępnie naprężyć pęcherzyk, obniżając wypełniony wodą zbiornik do poziomu około -10 cm, a następnie zmniejszyć ciśnienie, aby powróciło do wartości początkowej (-1 cm). Powtórzyć ten krok kilkakrotnie w celu usunięcia nadmiaru błony oraz niewielkich defektów błony.
    4. Z wysokości -0,5 cm, określonej przez położenie zbiornika z wodą, powoli zmniejszać ciśnienie ssania za pomocą mikrometru, aż do osiągnięcia stanu, w którym membrana zacznie fluktuować. Następnie zwiększyć ciśnienie, aby wyraźnie zwizualizować język wierzchołku o znacznej długości projekcji (kilka mikrometrów).
      UWAGA: Najniższe przyłożone ciśnienie (P0), która pozwala na wciągnięcie najmniejszej długości wypustki błonowej (L0) zdefiniuje punkt odniesienia α0 (Rysunek 7A). Wszystkie punkty krzywej będą mierzone zgodnie z tym punktem odniesienia (ΔL = L-L0 oraz ΔP = P-P0).
    5. Stopniowo zwiększaj ciśnienie ssania za pomocą mikrometru, aż do osiągnięcia wartości 0,5–0,8 mN/m. Po każdym kroku odczekaj 5 s i wykonaj zdjęcie języczka. Procedura ta przy niskim napięciu umożliwia wyznaczenie modułu giętności.
    6. Stopniowo zwiększaj ciśnienie ssania od 0,5 mN/m aż do napięcia krytycznego, regulując wysokość wypełnionego wodą naczynia przesuwnego na szynie (w zakresie od -2 do -50 cm) (Rycina 7B-D). Na podstawie tego eksperymentu w reżimie wysokiego napięcia zmierzone zostaną moduł ściśliwości powierzchniowej, napięcie lizy oraz odkształcenie lizy.
    7. Rozciągnij około 15–20 pęcherzyków, aby uzyskać istotne statystycznie wyniki. Każdy eksperyment z aspiracją za pomocą mikropipety trwa od 7 do 10 minut. Przeprowadź analizę obrazu przy użyciu oprogramowania LASAF w celu zmierzenia długości projekcji języczka, średnicy pęcherzyków oraz promienia kapilary.
  4. Pomiar modułu sprężystości przy zginaniu, modułu ściśliwości powierzchniowej, napięcia lizy i odkształcenia lizy
    1. Aby uzyskać dostęp do tych parametrów, należy zastosować formalizm opracowany przez E. Evansa12Oblicz ciśnienie ssania przyłożone do membrany, korzystając z równania 1:
      Δ P = ρwg (h−h0) (1)
      gdzie g to przyspieszenie grawitacyjne (9,8 m∙s−2), ρW tej chwili nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia. Proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski. czy gęstość wody (ρ = 1 g∙cm−3), h jest położeniem zbiornika wody i h0 jest pozycją początkową, w której ciśnienie wynosi zero.
    2. Oblicz napięcie błony na podstawie równania Laplace'a:
      Równanie stabilności płynów, σ= ΔP/2 [RP/(1-(RP/Rv))]; wzór do analizy stanu równowagi. (2)
      gdzie ΔP jest ciśnieniem ssania w mikropipecie, Rp oraz Rv odpowiednio promienie mikropipety i pęcherzyka (na zewnątrz mikropipety). Odkształcenie powierzchniowe (α) błony definiuje się jako:
      Wzór na współczynnik absorpcji, α=(A-A0)/A0, równanie w kontekście analizy naukowej. (3)
      Schemat równowagi statycznej z równaniami ΣFx=0, MA=0, obrazujący zasady równowagi sił. będąc polem powierzchni błony pęcherzyka przy niższym ciśnieniu ssania.
    3. Oblicz α na podstawie przyrostu długości projekcji ΔL pęcherzyka wewnątrz końcówki kapilary zgodnie z równaniem 412:
      Wzór równowagi statycznej, α=1/2(Rp/Rv)^2(1-Rp/Rv)ΔL/Rp, równanie symboliczne dla pojęć fizycznych. (4)
    4. W reżimie bardzo niskiego napięcia dominuje wygładzanie termicznych fal zgięć, co wpływa na pozorną ekspansję. Narysuj wykres ln(σ) kontra α. Przy niskich wartościach σ (zazwyczaj 0,01–0,5 mN.m−1 13), co daje linię prostą, której nachylenie jest powiązane z modułem giętkości, Kb (pierwszy wyraz równania 5)14:
      Równanie równowagi statycznej; α=kT/8πKb ln(1+A0σ/24πKb)+σ/Kσ; wzór fizyczny. (5)
      UWAGA: Przy wysokim napięciu (> 0,5 mN.m−1), fluktuacje błony są całkowicie stłumione, a powierzchnia błony zwiększa się w wyniku zwiększenia odstępów między cząsteczkami. W tym reżimie dominuje drugi człon równania 5, co pozwala na wyznaczenie modułu ściśliwości powierzchniowej Ka (Rysunek 8 i Rysunek 9).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Z wykorzystaniem powyższego protokołu zbadano różne syntetyczne wielkie pęcherzyki jednowarstwowe (GUV), otrzymane z fosfolipidu: 2-oleoylo-1-palmitoylo-sn-glicerylo-3-fosfocholiny (POPC), trójblokowego kopolimeru: poli(tert-etylenowe)-b-poli(dimetylosiloksanowe)-b-poli(tert-etylenowe) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) wytworzonego w poprzednim badaniu13, oraz kopolimeru dwublokowego poli(dimetylo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powłoka mikropipety jest jednym z kluczowych punktów umożliwiających uzyskanie wiarygodnych pomiarów. Należy zapobiegać przywieraniu pęcherzyka do mikropipety, a w literaturze 17,18,19,20,21 powszechnie stosuje się powlekanie BSA, β-kazeiną lub surfasilem. Rzadko wspomina się o szczegółach procedury powlekania.

Rozpuszczanie BSA pow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują ANR za wsparcie finansowe (ANR Sysa).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wymagany sprzęt i materiały do projektowania mikropipet
kapilary ze szkła borokrzemianowegoWorld Precision Instruments1B100-4średnica zewnętrzna i wewnętrzna odpowiednio 1 mm i 0,58 mm.
Zainstalowany filamentSutter Instrument Co.FB255B2,5 mm * 2,5 mm Pudełko z filamentem
Płonący / brązowy ściągacz do mikropipetSutter Instrument Co.Model P-97
MicroforgeNARISHGE Co.MF-900wyposażony w dwa obiektywy (10x i 32x)
Materiały do powlekania końcówek pipet BSA
Albumina surowicy bydlęcej frakcji V (BSA)Sigma-Aldrich10735078001
Jednorazowa strzykawka 1 ml Luer TipCodan62.1612
Jednorazowa strzykawka 10 ml Luer TipCodan626616
Jednorazowa strzykawka 5 ml Luer TipCodan62.5607
Jednorazowy filtr z celulozy octanowejCluzeau Info LaboL5003SPAWielkość porów: 0,22 i mikro; m, średnica: 25mm
Elastyczne rurki kapilarne ze stopionej krzemionkiPolymicro Technologies.TSP530660Średnica wewnętrzna 536 i mikro; m, Średnica zewnętrzna 660 i mikro;
GlukozaSigma-AldrichG5767
500 i mikro; L luer Lock GAZSZCZELNAHamilton Seringe Company1750
Mieszalnik rotacyjny probówekLabinco28210109
Micromanipulation Zestaw
Aluminiowa szyna optyczna, 1000 mm Długość, gwinty M4, seria X48Newport
Służy jako podpora mikroskopu w celu zapobiegania wibracjom zewnętrznym.
MikromanipulatorEppendorfPatchman NP 2Moduł (jednostka silnikowa do ruchu X, Y i Z) jest montowany na mikroskopie odwróconym za pomocą adaptera.
MikrometrMitutoyo Corporation350-354-10Digimatic LCD Głowica mikrometryczna 25,4 mm Zakres 0,001 mm
Zbiornik na wodę z pleksi (100 ml)Domowy
odwrócony mikroskop konfokalny TCS SP5 (DMI6000) wyposażony w skaner rezonansowy i obiektyw do zanurzenia w wodzie (HCX APO L 40x/0,80 WU-V-I).Leica
X48 Rail Carrier o długości 80 mm, z gwintem 1/4-20, 8-32 i 4-40Newport
Materiały do przygotowania roztworu sacharozy i amfifilu
2-Oleoilo-1-palmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinaSigma-Aldrich
ChloroformVWR22711.244
L-&alfa;-fosfatydyloetanoloamina-N-(lisamina rodamina B sulfonyl)Sigma-Aldrich810146CRodamina tagowane lipid
SacharozaSigma-AldrichS7903
Elektroformacja konfiguracja
10 &mikro; L szklane kapilarne pierścieniepierścieniowe Hirschmann9600110
Jednorazowa strzykawka 1 ml Luer TipCodan62.1612
H SmarApiezonApiezon H SmarSmar bezsilikonowy
Szkiełka szklane powlekane tlenkiem indu i cynySigma-Aldrich703184
IgłaTerumoAN2138R10,8 x 38 mm
Ohmmeter (Multimetr)VoltcraftVC140
ToluenVWR28676.297
Generator napięciaKeysight33210A
m,Strzykawka Tłumiony stół optyczny Newport

Bibliografia

  1. Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
  2. Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
  3. Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
  4. Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
  5. Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
  6. Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
  7. Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
  8. Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
  9. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  10. Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
  11. Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
  12. Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
  13. Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
  14. Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
  15. Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate'' membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
  16. Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
  17. Longo, M. L., Ly, H. V. Methods in Membrane Lipids. Dopico, A. M. , Humana Press. 421-437 (2007).
  18. Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
  19. Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
  20. Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
  21. Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:  A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
  22. Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

gigantyczne p cherzyki jednowarstwowetechnika elektroformowaniamechaniczne w a ciwo ci b onymodu ci liwo ci powierzchniowejmodu gi tko cinapr enie i odkszta cenie podczas lizypolimerowo lipidowe p cherzykiprzygotowanie szkie ek ITOroztw r glukozy i sacharozy
Wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.