Artykuł metodologiczny

Ustanawianie kokultur opartych na pojedynczych komórkach w sposób deterministyczny za pomocą chipa mikroprzepływowego

DOI:

10.3791/60202

⸱

27 września 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, 2Ph.D. Program in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University, 3National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport opisuje metodę opartą na chipie mikroprzepływowym, która pozwala na przeprowadzenie eksperymentu z pojedynczą hodowlą komórkową, w którym można uzyskać wysokowydajne parowanie i mikroskopową analizę wielu pojedynczych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy kohodowli komórkowych były szeroko stosowane do badania interakcji komórka-komórka między różnymi typami komórek, aby lepiej zrozumieć biologię chorób, w tym raka. Wyjaśnienie złożonego mechanizmu interakcji międzykomórkowych w wysoce heterogenicznych populacjach komórek przy użyciu konwencjonalnych systemów kohodowli jest jednak trudne, ponieważ niejednorodność subpopulacji komórek jest przesłonięta średnimi wartościami; Konwencjonalne systemy kohodowli mogą być używane tylko do opisywania sygnału populacji, ale nie są w stanie śledzić zachowania poszczególnych komórek. Co więcej, konwencjonalne metody eksperymentalne z pojedynczymi komórkami mają niską skuteczność w manipulacji komórkami ze względu na rozkład Poissona. Mikrofabrykowane urządzenia są nową technologią do badań jednokomórkowych, ponieważ mogą dokładnie manipulować pojedynczymi komórkami przy wysokiej przepustowości i mogą zmniejszyć zużycie próbek i odczynników. W tym miejscu opisujemy koncepcję i zastosowanie chipa mikroprzepływowego do wielu kokultur jednokomórkowych. Chip może skutecznie wychwytywać wiele typów pojedynczych komórek w komorze hodowlanej (~46%) i ma wystarczającą przestrzeń do hodowli przydatną do badania zachowania komórek (np. migracji, proliferacji itp.) w interakcji komórka-komórka na poziomie pojedynczej komórki. Komórki śródbłonka limfatycznego i raka płaskonabłonkowego jamy ustnej wykorzystano do przeprowadzenia eksperymentu z kohodowlą pojedynczych komórek na platformie mikroprzepływowej do badań interakcji wielu pojedynczych komórek na żywo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efektywne przechwytywanie różnych typów pojedynczych komórek i zapewnienie wystarczającej przestrzeni do hodowli jest potrzebne do eksperymentów z kokulturą pojedynczych komórek wielu typów pojedynczych komórek1. Ograniczenie rozcieńczenia jest najczęściej stosowaną metodą przygotowania pojedynczych komórek do takich eksperymentów, ze względu na niski koszt wymaganego sprzętu. Jednak ze względu na ograniczenie rozkładu Poissona, maksymalne prawdopodobieństwo przejęcia pojedynczej komórki wynosi tylko 37%, co sprawia, że operacja eksperymentalna jest pracochłonna i czasochłonna2. W przeciwieństwie do tego, użycie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) może przezwyciężyć ograniczenie rozkładu Poissona, aby wysoce efektywnie przygotować pojedyncze komórki3. Jednak FACS może nie być dostępny dla niektórych laboratoriów ze względu na drogie oprzyrządowanie i koszty konserwacji. Mikrofabrykowane urządzenia zostały niedawno opracowane do chwytania pojedynczych komórek4, parowania pojedynczych komórek5 i hodowli pojedynczych komórek. Urządzenia te są korzystne ze względu na ich zdolność do dokładnego manipulowania pojedynczymi komórkami6, przeprowadzania eksperymentów o wysokiej przepustowości lub zmniejszania zużycia próbek i odczynników. Jednak przeprowadzanie eksperymentów z kokulturą pojedynczych komórek z wieloma typami komórek za pomocą obecnych urządzeń mikroprzepływowych jest nadal trudne ze względu na ograniczenia rozkładu Poissona1,7,8, lub niezdolność urządzeń do przechwytywania więcej niż dwóch typów pojedynczych komórek4,5,6,9,10.

Na przykład, Yoon et al. opisali urządzenie mikroprzepływowe do badania interakcji komórka-komórka11. To urządzenie wykorzystuje metodę probabilistyczną do parowania komórek w jednej komorze. Jednak może osiągnąć parowanie tylko dwóch różnych typów ogniw ze względu na ograniczenia geometryczne w strukturze urządzenia. W innym raporcie Lee i in. zademonstrowano deterministyczną metodę przechwytywania i parowania pojedynczych komórek12. To urządzenie zwiększa wydajność parowania metodą deterministyczną, ale jest ograniczona przez wydłużony czas pracy wymagany do sparowania komórek. W szczególności przechwycenie drugiej komórki można przeprowadzić dopiero po przyczepieniu pierwszej przechwyconej komórki do powierzchni po 24 godzinach. Zhao i in. opisali urządzenie mikroprzepływowe oparte na kropelkach, które wychwytywało dwa typy pojedynczej komórki13. Możemy stwierdzić, że urządzenie mikroprzepływowe oparte na kropelkach jest nadal ograniczone do rozkładu Poissona i może być stosowane tylko na komórkach nieprzyłączonych i nie jest możliwa zmiana roztworu hodowlanego podczas procesu hodowli.

Poprzednio opracowaliśmy mikroprzepływowy "hydrodynamiczny układ wahadłowy", który wykorzystuje deterministyczne siły hydrodynamiczne do przechwytywania wielu typów pojedynczych komórek do komory hodowlanej, a następnie może przeprowadzać eksperyment z kokulturą komórkową w celu analizy indywidualnych zachowań migracji komórek w interakcjach komórka-komórka14. Hydrodynamiczny układ wahadłowy składa się z ustawionych w szeregu zestawów jednostek, z których każda zawiera serpentynowy kanał obejściowy, miejsce przechwytywania i komorę hodowlaną. Wykorzystując różnicę w oporach przepływu między kanałem obejściowym serpentyny a komorą hodowlaną oraz specjalnie zaprojektowaną procedurę operacyjną, różne typy pojedynczych komórek mogą być wielokrotnie wychwytywane w komorze hodowlanej. Warto zauważyć, że duża przestrzeń w komorze hodowlanej może nie tylko zapobiec wypłukaniu komórki podczas wychwytywania komórki, ale także zapewnić wystarczającą przestrzeń dla komórek do rozprzestrzeniania się, proliferacji i migracji, co pozwala na obserwację żywych interakcji pojedynczych komórek. W tym artykule skupimy się na produkcji tego urządzenia i szczegółowych krokach protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wykonanie formy waflowej metodą miękkiej litografii

UWAGA: Dane dotyczące wzoru maski są dostępne w naszej poprzedniej publikacji14.

  1. Odwodnić 4-calową wafel krzemową w piekarniku o temperaturze 120 °C przez 15 minut.
  2. Wiruj 4 g ujemnego fotorezystu SU-8 2 na 4-calowej płytce krzemowej z prędkością 1,000 obr./min przez 30 s, aby utworzyć warstwę o grubości 5 μm (warstwa #1).
  3. Piecz miękką warstwę #1 na płycie grzejnej o temperaturze 65 °C przez 1 minutę, a następnie przenieś warstwę #1 na płytę grzejną o temperaturze 95 °C na 3 minuty.
  4. Schłodź warstwę #1 do temperatury pokojowej, umieść ją na uchwycie półautomatycznego wyrównywacza maski i wyrównaj z chromowaną fotomaską z warstwy #1 (warstwa miejsca przechwytywania).
  5. Warstwę #1 naświetlić światłem UV o długości fali 365 nm w dawce 150 mJ/cm2.
  6. Usuń warstwę #1 z nakładki i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 65 °C przez 1 minutę. Przenieś warstwę #1 na płytę grzejną o temperaturze 95 °C na 1 minutę.
  7. Schłodzić warstwę #1 do temperatury pokojowej. Zanurzyć w roztworze octanu eteru monometylowego glikolu propylenowego w celu zmycia nieusieciowanego fotorezystu na 2 minuty. Delikatnie osusz azotem, aby odsłonić znak wyrównania warstwy #1.
  8. Przykryj znak wyrównania warstwy #1 taśmą samoprzylepną, obróć 4 g negatywnego fotorezystu SU-8 10 na warstwę #1 z prędkością 1,230 obr./min przez 30 sekund, aby utworzyć warstwę #2 o grubości 25 μm.
  9. Zdejmij taśmę, delikatnie ułóż warstwę #2 na płycie grzejnej o temperaturze 65 °C przez 3 minuty, a następnie przenieś warstwę #2 na płytę grzejną o temperaturze 95 °C na 7 minut.
  10. Schłodzić warstwę #2 do temperatury pokojowej, umieścić warstwę #2 na uchwycie półautomatycznego wyrównywacza maski i wyrównać chromowaną fotomaskę warstwy #2 (warstwa kanału obejściowego) do znaku wyrównania warstwy #1.
  11. Nasyć warstwę #2 światłem UV o długości fali 365 nm w dawce 200 mJ/cm2.
  12. Usuń warstwę #2 z nakładki i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 65 °C przez 1 minutę, a następnie przenieś warstwę #2 na płytę grzejną o temperaturze 95 °C na 3 minuty.
  13. Schłodzić warstwę #2 do temperatury pokojowej i przykryć znak wyrównania warstwy #1 taśmą klejącą. Przędzić 4 g negatywnego fotorezystu SU-8 2050 na warstwę #2 z prędkością 1,630 obr./min przez 30 s, aby utworzyć warstwę #3 o grubości 100 μm.
  14. Zdejmij taśmę, delikatnie upiecz warstwę #3 na płycie grzejnej o temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie przenieś warstwę #3 na płytę grzejną o temperaturze 95 °C na 20 minut.
  15. Schłodzić warstwę #3 do temperatury pokojowej, umieścić warstwę #3 na uchwycie półautomatycznego wyrównywacza maski i wyrównać chromowaną fotomaskę warstwy #3 (warstwa komory hodowlanej) do znaku wyrównania warstwy #1.
  16. Wystaw warstwę #3 ze światłem UV o długości fali 365 nm w dawce 240 mJ/cm2.
  17. Usuń warstwę #3 z nakładki i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 65 °C przez 5 minut. Przenieś warstwę #3 na płytę grzejną o temperaturze 95 °C na 10 minut.
  18. Schłodzić warstwę #3 do temperatury pokojowej. Zanurzyć w roztworze octanu eteru monometylowego glikolu propylenowego w celu wypłukania nieusieciowanego fotorezystu na 10 minut i delikatnie osuszyć gazowym azotem.

2. Przygotowanie urządzenia PDMS do przechwytywania wielu pojedynczych komórek

  1. Umieścić formę waflową i naczynie wagowe zawierające 100 μl trichlorosilanu w eksykatorze (tylko do silanizacji) i zastosować podciśnienie (-85 kPa) przez 15 min.
    UWAGA: Sylianizować powierzchnię wafla za pomocą trichlorosilanu, aby uzyskać hydrofobowe właściwości powierzchni przed odlaniem PDMS, aby można ją było bez wysiłku oderwać od formy PDMS wafla
    2. .
  2. Zatrzymać podciśnienie, a następnie sylianizować formę waflową w eksykatorze (tylko do silanizacji) w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  3. Wymieszać bazę PDMS i utwardzacz PDMS w stosunku 10:1. Wlej łącznie 20 g zmieszanego PDMS na foremkę waflową w naczyniu o średnicy 15 cm.
  4. Umieścić 15-centymetrowe naczynie w eksykatorze i stosować podciśnienie (-85 kPa) przez 1,5 minuty. Następnie wyjąć 15 cm naczynie z eksykatora. Przechowywać przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec usuń resztki pęcherzyków powietrza w PDMS za pomocą gazowego azotu.
  5. Naczynie o średnicy 15 cm wstawić do piekarnika w temperaturze 65 °C na 2-4 godziny, aby utwardziło PDMS.
  6. Wyjmij replikę PDMS z formy waflowej, a następnie przebij wlot 1,5 mm i wylot 0,5 mm na PDMS za pomocą dziurkacza o średnicy wewnętrznej 1,5 mm i średnicy wewnętrznej 0,5 mm (Rysunek 1C).
  7. Oczyść replikę PDMS i powierzchnię prowadnicy taśmą usuwalną, a następnie potraktuj powierzchnię plazmą tlenową (100 W przez 14 s).
  8. Ręcznie wyrównaj repliki PDMS z zamkiem i doprowadź je do kontaktu ze sobą.
  9. Umieść szkiełko PDMS w piekarniku o temperaturze 65 °C na 1 dzień.
    UWAGA: Trwałe połączenie zamka z repliką PDMS uzyskuje się w celu uformowania urządzenia.
  10. Zanurzyć urządzenie PDMS w pojemniku wypełnionym solą fizjologiczną buforowaną fosforanami i umieścić w eksykatorze. Następnie zastosuj podciśnienie (-85 kPa) przez 15 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
  11. Umieść urządzenie PDMS w kapturze do hodowli komórkowych i sterylizuj urządzenie światłem UV (długość fali światła: 254 nm) przez 30 minut.
  12. Zastąp bufor urządzenia PDMS pożywką (pożywka podstawowa DMEM-F12 zawierająca 1% antybiotyku i 10% płodowej surowicy bydlęcej) i inkubuj urządzenie PDMS w temperaturze 4 °C przez 1 dzień. Zapobiega to przyleganiu komórek do powierzchni PDMS.

3. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej

UWAGA: Typy komórek obejmują ludzkie komórki śródbłonka limfatycznego (LEC), ludzkie komórki OSCC TW2.6 wyrażające shRNA specyficzne dla WNT5B (WNT5B sh4) i kontrolę wektorową (pLKO-GFP), które uzyskano z naszego poprzedniego badania15. Zapoznaj się z naszą poprzednią publikacją, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat etapów uprawy.

  1. Usuń pożywkę hodowlaną, gdy komórki osiągną 70-80% zbieżności. Następnie delikatnie umyj komórki trzykrotnie 5 ml sterylnego PBS.
  2. Dodać 1 ml pożywki DMEM-F12 zawierającej 1 μM barwnika fluorescencyjnego do komórek WNT5B sh4 i pLKO-GFP (użyć pożywki MV2 dla LEC), a następnie inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: LEC barwiono zielonym barwnikiem dioctanu chlorometylofluoresceiny (CMFDA), komórki sh4 WNT5B barwiono niebieskim barwnikiem 7-amino-4-chlorometylokoumaryny (CMAC), a komórki pLKO-GFP barwiono czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym Dil.
  3. Delikatnie umyj komórki trzykrotnie 5 ml sterylnego PBS.
  4. Usuń PBS i dodaj 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA (0,05% trypsyny-EDTA dla LEC).
  5. Inkubuj komórki przez 4 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie postukaj w naczynie do hodowli tkankowej, aby przyspieszyć oderwanie komórek.
  6. Dodaj 4 ml pożywki DMEM-F12, aby zdyspersjonować komórki WNT5B sh4 i pLKO-GFP (w przypadku LEC użyj 3 ml pożywki MV2 i 1 ml roztworu neutralizatora trypsyny). Następnie przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 300 x g przez 3 minuty.
  7. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki DMEM-F12. Policz liczbę żywych komórek w hemocytometrze, używając standardowej metody wykluczania błękitu trypanowego16. Przygotuj 1 ml zawiesiny komórek o stężeniu 3 x 105 komórek/ml w pożywce DMEM-F12, a następnie utrzymuj komórki na lodzie, aby zapobiec agregacji komórek.
    UWAGA: Aby poprawić skuteczność wychwytywania pojedynczych komórek, wymagane jest staranne przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki z dobrze zdysocjowanymi.

4. Wielokrotne przechwytywanie pojedynczych komórek i potrójna hodowla jednokomórkowa

  1. Podłącz rurkę z politetrafluoroetenu (PTFE) między wylotem urządzenia a pompą strzykawkową. Usunąć pożywkę i dodać 1 μl zawiesiny komórek o stężeniu 3 x 105 komórek/ml do wlotu urządzenia PDMS.
  2. Załaduj zawiesinę komórek do urządzenia za pomocą pompy strzykawkowej o natężeniu przepływu 0,3 μL/min (Rysunek 2A). Kierunek przepływu odbywa się od wlotu do wylotu.
    UWAGA: Załaduj natychmiast po dodaniu zawiesiny komórek do wlotu, aby zapobiec sedymentacji komórek.
  3. Dodać 1 μl pożywki DMEM-F12 do wlotu urządzenia PDMS po kroku 4.2.Załaduj pożywkę DMEM-F12 do urządzenia za pomocą pompy strzykawkowej o natężeniu przepływu 0,3 μL/min (Rysunek 2B). Kierunek przepływu płynął od wlotu do wylotu.
  4. Załaduj 0,3 μl medium DMEM-F12 do urządzenia za pomocą pompy strzykawkowej o natężeniu przepływu 10 μL/min (Rysunek 2C). Kierunek przepływu płynął od wylotu do wlotu.
  5. Powtórz kroki od 4.1 do 4.4, aby załadować inne typy komórek do urządzenia.
  6. Po zakończeniu przechwytywania komórek użyj mikroskopu z soczewką 4x, aby zobrazować każdą komorę hodowlaną.
    UWAGA: Emisje fluorescencji komórek wykorzystano do identyfikacji i policzenia liczby pojedynczych komórek w każdej komorze hodowlanej.
  7. Wyjmij rurkę PTFE i uszczelnij wlot i wylot taśmą poliolefinową, aby stworzyć zamknięty system hodowli.
  8. Przenieś urządzenie PDMS do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm i dodaj 10 ml sterylnego PBS wokół urządzenia PDMS, aby uniknąć parowania pożywki z urządzenia.
  9. Przenieś naczynie hodowlane do inkubatora (37 ° C, 5% CO2 i 95% wilgotności) w celu potrójnej hodowli jednokomórkowej.
  10. Obserwuj pod mikroskopem i fotografuj wzrost komórek co 12 godzin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urządzenie ma strukturę trójwarstwową, jak pokazano na zdjęciu przekroju poprzecznego urządzenia PDMS (Rysunek 1A). Pierwsza warstwa zawiera miejsce wychwytywania (6,0 μm szerokości i 4,6 μm wysokości), które łączy komorę hodowlaną i kanał obejściowy. Różnica w oporach przepływu między komorą hodowlaną a kanałem obejściowym powoduje, że komórki przepływają do pozycji wychwytywania i wypełniają wejście małej ścieżki. Po przechwyceniu komórki w miejscu p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje międzykomórkowe różnych komórek w mikrośrodowisku guza odgrywają ważną rolę w progresji guza17. Aby zrozumieć mechanizm interakcji komórka-komórka, jako powszechną metodę analityczną stosuje się systemy kohodowli. Jednak mnogość typów komórek i niejednorodność samych komórek doprowadziły do złożoności eksperymentalnej i trudności analitycznych.

Hydrodynamiczny chip wahadłowy umożliwia wielokrotne ładowanie pojedynczych komórek w komorze hodowlanej metodą dete...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant z Ministerstwa Nauki i Technologii (105-2628-E-400-001-MY2) oraz program doktorancki z inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej, National Chung Hsing University i National Health Research Institutes.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zaawansowana mikroprzepływowa taśma medyczna 3M do diagnostyki poliolefin3M Company9795R
AntybiotykiBiowestL0014-100Glutamina-penicylina-streptomycyna
Oprogramowanie AutoCADAutodeskAutoCAD LT 2011Nr części 057C1-74A111-1001
Niebieski barwnik CMAC CellTrackeInvitrogenC2110
CellTracker Zielony barwnik CMFDAInvitrogenC7025
Piec konwencjonalnyYEONG-SHIN firmaovp45
EksykatorBel-Art ProductsF42020-0000Oszczędzający miejsce eksykator próżniowy 190 mm biała podstawa
DiIC12(3) barwnik błony komórkowejBD Biosciences354218Używany jako tracker komórek
DMEM-F12 mediumGibco11320-082
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV 2PromoCellC-22022
Surowica bydlęca płodu HycloneThermoSH30071.03HI
Hamilton 700 series Szklana strzykawka ( 0,1 ml )Hamilton80630100 µ L, Model 710 RN SYR, Mały zdejmowany NDL, 22s ga, 2 cale, styl punktowy 2
Dziurkacz Harris Uni-CoreTed Pella Inc.15075z
dziurkaczem Harris Uni-CoreTed Pella Inc.15071o średnicy wewnętrznej 0,5 mm
Firma YOTECYS-300S
Msak alignerDeya Optronic CO.A1K-5-MDA
Plazma tlenowaNORDSON MARCHAP-300
Środek do czyszczenia plazmowegoNordsonAP-300Stacjonarny system obróbki plazmowej
Zestaw polidimetylosiloksanu (PDMS)Dow corningSylgard 184
Politetrafluoroeten (PTFE)Ever Sharp Technology, Inc.TFT-23Tśrednica wewnętrzna, 0,51 mm; średnica zewnętrzna, 0,82 mm
Taśma usuwalna3M CompanyScotch Remizable Tape 811
Wafel silikonowySPE0039
Powlekarka wirowaEltech Synrex Co., Ltd.SC-HMI 2" ~ 6"
Mikroskop stereoskopowyLeica MicrosystemsLeica E24
SU-8 10 fotorezystor ujemnyMicroChemY131259
SU-8 2 fotorezystu ujemnyMicroChemY131240
SU-8 2050 fotorezystuMicroChemY111072
SU-8 deweloperGrand Chemical CompaniesGP5002-000000-72GCOctan eteru monometylowego glikolu propylenowego
Pompa strzykawkowaAparat Harvarda703007
TrichlorosilaneGelest, IncSIT8174.0Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktyl. Niebezpieczny. Działa żrąco na drogi oddechowe, gwałtownie reaguje z wodą.
Roztwór neutralizatora trypsynyGibcoR-002-100
o średnicy wewnętrznej 1,5 mm z płytą grzejną

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  2. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
  3. Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804(2008).
  4. Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
  5. Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
  6. Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
  7. Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340(2015).
  8. Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
  9. Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
  10. Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
  11. Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
  12. Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
  13. Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
  14. He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
  15. Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503(2016).
  16. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  17. Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
  18. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
  19. Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
  20. Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Single Cell Co CultureCell Capture EfficiencyPDMS DeviceLymphatic Endothelial CellsOral Squamous Cell CarcinomaSyringe Pump LoadingCell Suspension PreparationTriple Single CultureDynamic Live Imaging

Powiązane artykuły