Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60215

⸱

4 października 2019

 , 
1Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital-Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany tutaj jest protokół charakteryzujący moduły biologicznie synergicznych miRNA i ich łączenie w krótkie transgeny, co pozwala na jednoczesną nadekspresję dla zastosowań terapii genowej.

Streszczenie

Biologiczne znaczenie mikroRNA (miRNA) w zdrowiu i chorobie w znacznym stopniu zależy od specyficznych kombinacji wielu jednocześnie zderegulowanych miRNA, a nie od działania pojedynczego miRNA. Charakterystyka tych specyficznych modułów miRNA jest podstawowym krokiem w maksymalizacji ich wykorzystania w terapii. Jest to niezwykle istotne, ponieważ ich kombinatoryczne atrybuty mogą być praktycznie wykorzystane. Opisano tutaj metodę definiowania specyficznej sygnatury miRNA istotnej dla kontroli onkogennych represorów chromatyny w glejaku. Podejście to najpierw definiuje ogólną grupę miRNA, które są rozregulowane w guzach w porównaniu z normalną tkanką. Analiza jest dodatkowo udoskonalana przez zróżnicowane warunki hodowli, podkreślając podgrupę miRNA, które ulegają jednoczesnej ekspresji podczas określonych stanów komórkowych. Wreszcie, miRNA, które spełniają te filtry, są łączone w sztuczne policistroniczne transgeny, które są oparte na rusztowaniu naturalnie istniejących genów klastrów miRNA, a następnie wykorzystywane do nadekspresji tych modułów miRNA do komórek odbiorczych.

Wprowadzenie

miRNA oferują niezrównaną możliwość rozwoju szerokiego podejścia terapii genowej do wielu chorób1,2,3, w tym raka4,5. Opiera się to na kilku unikalnych cechach tych biologicznych molekuł, w tym ich niewielkich rozmiarach6, prostej biogenezie7 i naturalnej tendencji do funkcjonowania w asocjacji8. Wiele chorób charakteryzuje się specyficznymi wzorcami ekspresji miRNA, które często zbiegają się w regulacji złożonych funkcji biologicznych9. Celem tej metody jest najpierw zdefiniowanie strategii identyfikacji grup miRNA, które są synergistycznie istotne dla określonych funkcji komórkowych. W związku z tym zapewnia strategię ponownego ustanowienia takich kombinacji miRNA w dalszych badaniach i zastosowaniach.

Ta metoda pozwala na funkcjonalną analizę wielu miRNA jednocześnie, wykorzystując ich jednoczesne celowanie w dużą liczbę mRNA, rekapitulując w ten sposób złożone krajobrazy chorób. Podejście to zostało niedawno zastosowane do zdefiniowania grupy trzech miRNA, które 1) są jednocześnie regulowane w dół w raku mózgu i 2) wykazują silny wzorzec koekspresji podczas różnicowania neuronalnego, a także w odpowiedzi na stres genotoksyczny przez promieniowanie lub środek alkilujący DNA. Kombinatoryczna reekspresja tego modułu trzech miRNA za pomocą opisanej poniżej metody grupowania powoduje głęboką ingerencję w biologię komórek nowotworowych i może być łatwo wykorzystana jako strategia terapii genowej w badaniach przedklinicznych10. Protokół ten może być szczególnie interesujący dla osób zajmujących się badaniami nad miRNA i jego zastosowaniami translacyjnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku

  1. Analiza szerokiej różnicowej ekspresji miRNA w glejaku a mózgu
    1. Po pierwsze, określ najbardziej znacząco rozregulowane miRNA w guzie. Można to osiągnąć za pomocą co najmniej trzech różnych metod:
      1. Przeszukaj atlas genomu raka, który znajduje się pod adresem https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, aby uzyskać dane sekwencjonowania11.
      2. Wykonaj analizę mikromacierzy ze świeżej próbki operacyjnej12.
      3. Użyj wcześniej opublikowanych zestawów danych13.
        nuta: Niezależnie od wybranej metody, wynik dostarcza masowy zestaw miRNA, których ekspresja jest statystycznie skorelowana (bezpośrednio lub odwrotnie) z biologią guza. Ta początkowa grupa stanowi pulę miRNA, które są dalej analizowane w celu identyfikacji podzbioru miRNA wykazujących najbardziej rygorystyczne powiązanie funkcjonalne poprzez przeprowadzenie bardziej dynamicznej analizy zmian ekspresji, jak omówiono poniżej.
  2. Analiza ekspresji miRNA specyficzna dla danego stanu
    1. Indukcja różnicowania komórek:
      1. Używaj wstępnie powlekanych plastikowych naczyń z poli-D-lizyny (PDL), aby sprzyjać tworzeniu kultury jednowarstwowej. W przypadku powlekania naczyń należy rozpuścić PDL w wodzie o stężeniu 100 μg/ml. Użyj 1 ml roztworu na 25cm2 powierzchni. Przepłukać 2x PBS 6 h po zastosowaniu roztworu PDL.
      2. Umieść ludzkie nerwowe komórki macierzyste w równych ilościach (100 000 komórek/5 ml) w pożywce z komórek macierzystych (podłoże neuropodstawowe + suplement B27 + 20 ng / mL EGF / FGF), pożywce do różnicowania astrocytów (DMEM + 10% FBS) lub pożywce różnicującej neurony (podłoże neuropodstawowe + suplement B27, + 2 μM kwas retinowy)14. Protokół różnicowania oligodendrocytów wymaga dodania IGF-1 (200 ng/mL) po usunięciu EGF/FGF14,15.
      3. Po posiewie komórek umieścić w inkubatorze na 1 tydzień w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    2. Ekstrakcja RNA:
      1. Po 7 dniach wyjmij komórki z inkubatora i usuń pożywkę.
      2. Umyj komórki PBS (5 ml). Następnie dodaj 1 ml odczynnika do lizy (patrz tabela materiałów) w celu lizy komórek i zeskrob komórki do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml za pomocą skrobaka do komórek. Probówki zawierające zlizowane komórki należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
      3. Przejdź do całkowitej izolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Analiza ekspresji miRNA:
      1. Określ ilościowo różnicową ekspresję specyficznych miRNA zidentyfikowanych w kroku 1.1 między trzema wzorcami różnicowania za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, przy użyciu sond TaqMan i zgodnie z protokołami producenta dotyczącymi odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR (Rysunek 1).
  3. Walidacja klastrów miRNA przez wyzwania specyficzne dla stresu
    1. Hodowla komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego G34 w podłożu neurobazalnym + suplement B27 + 20 ng / mL EGF / FGF. Zacznij od 1 x 106 komórek w 5 ml w kolbie o niskiej nasadce 25 cm2.
    2. Zaczynając 48 godzin po posiewie, co 5 dni dodawać podwajające stężenie czynnika alkilującego DNA temozolomidu (TMZ) w następujący sposób:
      1. Zacznij od 5 μM przez 5 dni. Po 5 dniach usuń pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką bez temozolomidu, aby komórki, które przeżyły, mogły się zregenerować. Po 48 godzinach dodać 10 μM TMZ i inkubować przez kolejne 5 dni.
      2. Powtórz krok 1.3.2.1, podwajając stężenie TMZ za każdym razem, aż do osiągnięcia stężenia co najmniej 100 μM i komórki staną się odporne na lek10.
    3. W równoległym eksperymencie napromieniuj komórki G34 w następujący sposób:
      1. Rozpoczynając 48 godzin po posianiu 1 x 106 komórek w 5 ml w kolbie o niskim mocowaniu o średnicy 25cm2, naświetlić komórki energią 2 Gy (dopuszczalny jest każdy promiennik zapewniający emisję fotonów). Włóż komórki z powrotem do inkubatora i nie przeszkadzaj. Po 48 godzinach należy ponownie napromienić ogniwa dodatkowymi 2 Gy energii.
      2. Powtórz krok 1.3.3.1 4x, aż do uzyskania łącznie 10 Gy energii.
      3. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze i pozostawić je do odzyskania w świeżej pożywce przez co najmniej 5 dni przed dalszą analizą.
    4. Po indukcji oporności należy poddać komórki lizie za pomocą odczynnika do lizy i wyekstrahować całkowite RNA zgodnie z protokołem producenta.
    5. Przeanalizuj ekspresję specyficznych miRNA zidentyfikowanych w sekcjach 1.1-1.2, jak opisano w kroku 1.2.1 (Rysunek 2).
  4. Charakterystyka funkcjonalnej konwergencji zgrupowanych miRNA
    1. Uzyskaj przewidywany cel każdego miRNA zdefiniowanego w sekcjach 1.2-1.3 uzyskany za pomocą narzędzi do przewidywania celowania w miRNA.
      nuta: Zazwyczaj korzystamy z TargetScan, ponieważ jego algorytm jest okresowo aktualizowany16. Dodatkowymi narzędziami do przewidywania są: miRanda17, miRDB18 oraz DIANA-miRPath19. Wszystkie te programy są darmowymi aplikacjami internetowymi.
      1. Na pierwszej stronie Targetscan wybierz interesujące Cię miRNA z wstępnie wypełnionego menu rozwijanego. Kliknij przycisk Prześlij.
      2. Pobierz wynikową listę celów jako arkusz kalkulacyjny, korzystając z łącza Pobierz tabelę (Rysunek uzupełniający 1).
      3. Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wystąpienia wyników fałszywie dodatnich, w dalszych analizach uwzględniaj tylko cele w kolumnie Chronione witryny. Dalsze rygorystyczności można również uzyskać, stosując dodatkowe programy do przewidywania miRNA (patrz wyżej) i uwzględniając tylko cele, które są wspólne dla wszystkich algorytmów.
    2. Sklasyfikuj wynikowe cele zgodnie z kategoriami ontologii genów za pomocą ToppGene Suite20, aby ocenić wzbogacenie szlaków, które są wspólne dla każdego miRNA.
      1. Wklej listę celów uzyskanych z kroku 1.4.1 w oknie "Trening zestawu genów", używając symbolu HGNC jako typu wpisu. Kliknij przycisk Prześlij> Rozpocznij. Program dostarczy tabelę wyjściową pokazującą najważniejsze kategorie "Go" dla wprowadzonej listy genów (rysunek uzupełniający 2).
    3. Aby ostatecznie ustalić wkład każdego miRNA w regulację wspólnego szlaku lub procesu komórkowego (w tym przypadku regulacji chromatyny), sprawdź każdy cel uzyskany w kroku 1.4.1 z pełną listą genów zaangażowanych w określony proces komórkowy (tj. regulację chromatyny), korzystając z funkcji diagramu Venna dostępnej na stronie internetowej Bioinformatyki i Genomiki Ewolucyjnej http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
      nuta: Ten program pozwala na przecięcie wielu grup w tym samym czasie (Rysunek 3). Specyficzne unikalne cele dostarczane przez każdą miRNA są następnie opisywane i wybierane do dalszych eksperymentów funkcjonalnych.
      1. Na stronie głównej programu prześlij lub skopiuj/wklej listę, jeśli docelowe mRNA dla każdego miRNA lub zainteresowania w odpowiednich oknach. Nazwij każdą listę unikatowym identyfikatorem.
      2. Kliknij przycisk Prześlij. Program dostarczy wizualny wynik diagramu Venna z liczbą genów w każdym sektorze, a także pełną listę mRNA dla każdego podzbioru i kombinacji przecięć.

2. Składanie modułów miRNA w polistroniczny klaster transgeniczny

  1. Przygotowanie rusztowania transgenicznego na bazie locus klastra miR-17-92
    1. Uzyskaj sekwencję nukleotydową klastra miR-17-92 z przeglądarki genomu Ensembl 21. Wybierz sekwencję "rdzenia" ~ 800 par zasad obejmującą wszystkie sześć kodowanych spinek do włosów miRNA locus i co najmniej 200-nukleotydowe sekwencje flankujące zarówno przed (5'), jak i za (3') sekwencji rdzenia.
    2. Wklej powyższą sekwencję do dowolnego programu do edycji słów.
    3. Zdefiniuj sekwencję każdego z sześciu natywnych spinów do włosów, pobierając je w miRBase22. Zaznacz każdą z tych sekwencji w zakresie poprzednio zidentyfikowanej sekwencji "podstawowej". Wszelkie sekwencje między każdą spinką do włosów reprezentują sekwencje dystansowe, które są ważne dla prawidłowego przetwarzania transgenu.
    4. Usuń natywne sekwencje spinek do włosów z sekwencji "rdzenia", z wyjątkiem 3-5 nukleotydów na końcach 5' i 3' każdej spinki do włosów, które będą służyć jako akceptor dla nowych spinek do włosów.
  2. Budowa nowego transgenu kodującego wiele wybranych miRNA
    1. Uzyskaj sekwencje spinki do włosów miRNA, które mają być nadmiernie eksprymowane w transgenie z miRBazy. Uważnie zwróć uwagę na specyficzne nukleotydy, które są miejscami rozszczepienia mikroprocesora.
    2. Zastąp usunięte spinki do włosów (krok 2.1.4) sekwencjami spinek do włosów pożądanych miRNA uzyskanych w kroku 2.2.1.
    3. Dodaj pożądane sekwencje restrykcyjne w obu flankujących regionach transgenu, aby ułatwić subklonowanie do wybranych wektorów dostarczania. Sprawdź, czy wybrane sekwencje ograniczeń nie są obecne w samej sekwencji.
    4. W przypadku kontroli ujemnych należy użyć zaszyfrowanych sekwencji 20-nukleotydowych, aby zastąpić naturalną sekwencję 20-nukleotydową każdego dojrzałego miRNA. Wygeneruj te zaszyfrowane sekwencje za pomocą narzędzia online, takiego jak https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
  3. Weryfikacja dwuwymiarowej struktury transgenu
    1. Skopiuj pełną sekwencję transgeniczną do programu do przewidywania struktury RNA RNAweb Fold23.
    2. Korzystając ze standardowych ustawień programu, kliknij przycisk Kontynuuj.
    3. Przeanalizuj wynik graficzny, szczególnie pod kątem obecności dobrze zdefiniowanych spinek do włosów i obecności dwuniciowych struktur łodygowych co najmniej 11 nukleotydów proksymalnych do miejsca cięcia mikroprocesora. Zwróć również uwagę na brak punktów rozgałęzień w sekwencjach spinek do włosów (Rysunek 4).

3. Otrzymywanie transgenów przez syntezę DNA

  1. Po zaprojektowaniu i walidacji in silico chimerycznego klastra miRNA, uzyskaj sekwencję roboczą za pomocą syntezy DNA od komercyjnych dostawców24 i przystąp do dalszego klonowania do wektorów i dostarczania transgenu. Użyliśmy wektorów lentiwirusowych do dostarczania in vitro10 oraz wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do dostarczania wewnątrzczaszkowego in vivo25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsza metoda pozwoliła na charakterystykę modułu trzech miRNA, które są konsekwentnie obniżone w guzach mózgu, współwyrażane specyficznie podczas różnicowania neuronalnego (Rysunek 1) i zaangażowane w odpowiedź przeżycia guza po terapii (Rysunek 2). Odbywa się to poprzez regulację złożonej onkogennej ścieżki represji chromatyny. Ten wzorzec współwyrażania sugerował silne synergistyczne działanie tych trzech miRNA (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opiera się na założeniu, że miRNA nie funkcjonują w izolacji, ale są biologicznie istotne poprzez pracę w grupach, a grupy te są determinowane transkrypcyjnie przez określone konteksty komórkowe26. Aby uzasadnić to podejście z perspektywy translacyjnej, wprowadzono protokół uzupełniający, który umożliwia odtworzenie tego wzorca multi-miRNA w komórkach/tkankach. Jest to możliwe dzięki wykorzystaniu stosunkowo prostej biogenezy miRNA, przy czym rozpoznanie charakterystycznej spinki do w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować członkom Laboratorium Neuroonkologii Harveya Cushinga za wsparcie i konstruktywną krytykę. Prace te były wspierane przez granty NINDS K12NS80223 i K08NS101091 dla P. P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,4% niska temperatura topnienia agarozy IBI ScientificIB70058
0,45 &mikro; M sterylna jednostka filtrującaMerck MilliporeSLH033RS
1,5 ml Probówka do mikrowirówekEppendorf22431081
6-dołkowe Greiner Bio-One657160
Myszy atymiczne (FoxN1 nu/nu)Envigo069(nu)/070(nu/+)
B-27 Suplement Termo Fisher Scientific12587010
Kolba do hodowli komórkowychSkrobak do komórek Greiner Bio-One660175
, 16cmSarstedt83.1832
Cez 137 JL Sheperd and AssociatesCore Facility (Harvard Medical School)
ChloroformSigma-Aldrich439142-4L
DMEM, wysoka glukoza, pirogronian Thermo Fisher Scientific11995040
Dulbecco" s sól fizjologiczna buforowana fosforanami Gibco14190144
Eozyna Y rozwiązanie Sigma-AldrichE4009
Surowica bydlęca dla płodu Sigma-AldrichF9665
Roztwór formalinySigma-AldrichHT501128
Suplement GlutaMAX Thermo Fisher Scientific35050061
HEK-293American Type Culture CollectiATCC CRL-1573
Roztwór hematoksylinySigma-Aldrich1051750500
Ludzkie pierwotne komórki macierzyste glejaka pierwotnego (GBM62)Dostarczone przez dr E. A. Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Ludzkie pierwotne komórki macierzyste glejaka (MGG4)Dostarczone przez Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)
Wektor lentiwirusowy pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPSystem BiosciencesCD511B-1
Lipofectamina 2000 Thermo Fisher Scientific 11668019
Mikrowirówka chłodzonaEppendorfmodel nr 5424 R, nr kat. 5404000138
Medium montażowe Thermo Fisher Scientific4112APG
Nalgene Szybkoobrotowe probówki wirówkowe z poliwęglanu okrągłodennego Thermo Fisher Naukowy 3117-0380PK
NanoDropThermo Fisher Scientific2000c
Neuronalne komórki progenitorowe (NPC)Dostarczone przez dr Jakuba Godlewskiego (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Neurobasel Medium Termo Fisher Scientific21103049
Nikon eclipse Ti zmotoryzowany mikroskop fluorescencyjnyNikon, Japonia14314
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985088
probówki PCR Sigma-AldrichCLS6571-960EA
Penicylina-Streptomycyna Thermo Fisher Scientific15140122
szalki Petriego 94/16 Greiner Bio-One632180
Poli-D-Lizyna Sigma- AldrichP4707
Rekombinowany ludzki EGF PeproTech AF-100-15
Rekombinowany ludzki FGF-podstawowy PeproTech AF-100-18B
Kwas retinowyGibco12587-010 
Zestaw do miniprzygotowania RNADirect-zolR2050
S1000 Termocykler Bio-Rad1852196
Mikropromiennik sterowany obrazem dla małych zwierząt Xstrahal Life Sciences, Wielka BrytaniaGłówny zakład (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Ultrawirówka Sorvall WX+ Thermo Fisher Naukowy 
StemPro Accutase Thermo Fisher ScientificA1110501
System PCR w czasie rzeczywistym StepOneBiosystemy stosowane 
Szafa bezpieczeństwa biologicznego SterilGARD The Baker CompanySG403A-HE
SacharozaSigma-AldrichS9378
T98-GKultura typu amerykańskiego CollectiATCC CRL-1690
Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqMan Thermo Fisher Scientific4366596
TaqMan Universal PCR Master MixThermo Fisher Scientific4324018
TemozolomidTocris Bioscience2706
Tissue-Tek optymalna temperatura cięcia Odczynnik Fisher ScientificNC9636948
TRIzol Thermo Fisher Scientific15596026Odczynnik do lizy
U251-MGAmerican Type Culture CollectiATCC HTB-17
U87-MG Kultura typu amerykańskiego CollectiATCC HTB-14
System ekspresji wektorowej ViraPower Thermo Fisher ScientificK4970-00
Woda, klasa HPLCFisherW54
Ksylen Sigma-Aldrich534056
750001004376357

Bibliografia

  1. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  2. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).
  3. Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767(2018).
  4. Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
  5. Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
  6. Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
  7. Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
  8. He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
  9. Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
  10. Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442(2019).
  11. Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
  12. Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
  13. Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
  14. Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044(2009).
  15. Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005(2015).
  17. Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
  18. Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
  19. Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
  20. Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
  21. Aken, B. L., et al. Ensembl 2017. Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).
  22. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
  23. Lorenz, R., et al. Vienna RNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).
  24. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812(2017).
  25. Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
  26. Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
  27. Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
  28. Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
  29. Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
  30. Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437(2011).
  31. Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Moduły mikroRNAterapia glejaka wielopostaciowegosztuczne transgeny policistronowerusztowanie miR-17-92analiza TargetScanpakiet ToppGenefunkcja diagramu Vennaprzewidywanie struktury RNAoporność na temozolomidneuralne komórki macierzyste
Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.