Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oparty na FACS protokół izolacji RNA z komórek wtórnych męskich gruczołów dodatkowych Drosophila

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60218

⸱

5 września 2019

 ,  , 
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół dysocjacji i sortowania określonej populacji komórek z męskich gruczołów dodatkowych (komórek wtórnych) Drosophila do sekwencjonowania RNA i RT-qPCR. Izolacja komórek odbywa się poprzez oczyszczanie FACS komórek wtórnych eksprymujących GFP po wieloetapowym procesie dysocjacji wymagającym sekcji, trawienia proteaz i dyspersji mechanicznej.

Streszczenie

Aby zrozumieć funkcję organu, często warto zrozumieć rolę jego składowych populacji komórek. Niestety, rzadkość występowania pojedynczych populacji komórek często utrudnia uzyskanie wystarczającej ilości materiału do badań molekularnych. Na przykład gruczoł dodatkowy męskiego układu rozrodczego Drosophila zawiera dwa odrębne typy komórek wydzielniczych. Komórki główne stanowią 96% komórek wydzielniczych gruczołu, podczas gdy komórki wtórne (SC) stanowią pozostałe 4% komórek (około 80 komórek na samca). Chociaż oba typy komórek wytwarzają ważne składniki płynu nasiennego, tylko kilka genów jest znanych jako specyficzne dla SC. Rzadkość występowania SC utrudniała do tej pory badania nad analizą transkryptomiczną tego ważnego typu komórek. W tym miejscu przedstawiono metodę, która pozwala na oczyszczanie SC do ekstrakcji i sekwencjonowania RNA. Protokół polega najpierw na wypreparowaniu gruczołów od muszek, w których następuje ekspresja specyficznego dla SC reportera GFP, a następnie poddaniu tych gruczołów trawieniu proteazowemu i dysocjacji mechanicznej w celu uzyskania pojedynczych komórek. Po wykonaniu tych kroków pojedyncze, żywe komórki oznaczone GFP są sortowane za pomocą sortera komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) w celu oczyszczenia RNA. Procedura ta pozwala uzyskać specyficzne dla SC RNA od ~40 samców na warunek do dalszego sekwencjonowania RT-qPCR i/lub RNA w ciągu jednego dnia. Szybkość i prostota procedury pozwala na określenie transkryptomów wielu różnych muszek, pochodzących z różnych genotypów lub warunków środowiskowych, w krótkim czasie.

Wprowadzenie

Narządy składają się z wielu typów komórek, z których każda ma odrębne funkcje i czasami wyraża bardzo różne zestawy genów. Aby dokładnie zrozumieć, jak funkcjonuje narząd, często kluczowe jest zbadanie każdego odrębnego typu komórki, który tworzy ten narząd. Jedną z podstawowych metod stosowanych do badania możliwych funkcji jest analiza transkryptomu. Ta potężna metoda zapewnia migawkę ekspresji genów w komórce, aby ujawnić aktywne procesy i szlaki. Jednak ten rodzaj analizy jest często trudny w przypadku rzadkich populacji komórek, które muszą zostać oczyszczone ze znacznie liczniejszych sąsiednich komórek. Na przykład męski gruczoł dodatkowy Drosophila jest narządem składającym się głównie z dwóch typów komórek wydzielniczych. Ponieważ rzadszy z dwóch typów komórek obejmuje tylko 4% komórek tego gruczołu, zastosowanie analizy transkryptomu specyficznej dla typu komórki nie zostało wykorzystane do określenia funkcji tych komórek.

Gruczoły dodatkowe (AG) to organy męskiego układu rozrodczego u owadów. Są one odpowiedzialne za produkcję większości białek płynu nasiennego (białka płynu nasiennego (SFP) i białka gruczołów dodatkowych (ACP)). Wiadomo, że niektóre z tych SFP wywołują reakcje fizjologiczne i behawioralne u krytych samic, powszechnie nazywane reakcją po kryciu (PMR). Niektóre z PMR obejmują: zwiększoną częstość owulacji i składania jaj, magazynowanie i uwalnianie plemników, zmianę diety kobiet oraz spadek podatności kobiet na wtórne zaloty samców1,2. Ponieważ owady wpływają na wiele ważnych problemów społecznych, od zdrowia ludzkiego (jako wektory śmiertelnych chorób) po rolnictwo (owady mogą być szkodnikami, ale mają kluczowe znaczenie dla zapylania i jakości gleby), zrozumienie rozmnażania się owadów jest ważnym obszarem badań. Badania nad AG i ACP poczyniły znaczne postępy dzięki organizmowi modelowemu Drosophila melanogaster. Badania te podkreśliły rolę AG i niektórych pojedynczych białek, które produkują, w tworzeniu PMR, wpływając na pracę u innych gatunków, takich jak wektor choroby Aedes aegypti3,4 i inne owady1,5. Ponadto, ponieważ AG wydzielają składniki płynu nasiennego1,6 są często uważane za funkcjonalny analog gruczołu krokowego ssaków i pęcherzyka nasiennego. To podobieństwo funkcji w połączeniu z podobieństwami molekularnymi między tymi dwoma typami tkanek sprawiło, że AG stały się modelem gruczołu krokowego u much7.

U samca Drosophila znajdują się dwa płaty gruczołów dodatkowych. Każdy płat może być postrzegany jako struktura przypominająca worek, składająca się z monowarstwy komórek wydzielniczych otaczających centralne światło i owiniętych mięśniami gładkimi. Jak wspomniano powyżej, istnieją dwa morfologicznie, rozwojowo i funkcjonalnie odrębne typy komórek wydzielniczych tworzących ten gruczoł: wielokątne komórki główne (stanowiące ~96% komórek) i większe, okrągłe komórki wtórne (SC) (stanowiące pozostałe 4% komórek, czyli około 40 komórek na płat). Wykazano, że oba typy komórek wytwarzają odrębne zestawy ACP w celu indukowania i utrzymywania PMR. Większość uzyskanych do tej pory danych podkreśla rolę pojedynczego białka w wyzwalaniu większości charakterystycznych zachowań PMR. To białko, peptyd płciowy, jest małym, 36-aminokwasowym peptydem, który jest wydzielany przez główne komórki8,9,10. Chociaż peptyd płciowy wydaje się odgrywać główną rolę w PMR, wykazano, że inne ACP, wytwarzane zarówno przez komórki główne, jak i wtórne, również wpływają na różne aspekty klasy PMR11,12,13,14,15,16,17. Na przykład, w oparciu o naszą obecną wiedzę, SC, poprzez białka, które produkują, wydają się być niezbędne do utrwalenia sygnalizacji SP po pierwszym dniu18.

Biorąc pod uwagę rzadkość SC (tylko 80 komórek na samca), cała nasza wiedza o tych komórkach i produkowanych przez nie białkach pochodzi z genetyki i podejść kandydujących. Do tej pory wykazano, że tylko stosunkowo niewielka lista genów jest specyficzna dla SC. Lista ta obejmuje białko homeodomenowe Defective proventriculus (Dve)19, lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 i 1921, CG1656 i CG1757511,15,21 oraz czynnik transkrypcyjny homeobox Abdominal-B (Abd-B)18. Wcześniej wykazaliśmy, że mutant z niedoborem zarówno ekspresji Abd-B, jak i lncRNA MSA w komórkach wtórnych (mutant iab-6cocuD1) skraca długość PMR z ~10 dni do zaledwie jednego dnia12,18,20. Ten fenotyp wydaje się być spowodowany niewłaściwym przechowywaniem SP w żeńskim układzie rozrodczym12,18,20. Na poziomie komórkowym komórki wtórne tego mutanta wykazują nieprawidłową morfologię, tracąc swoje charakterystyczne struktury przypominające wakuolę18,20,21. Korzystając z tej zmutowanej linii, wcześniej próbowaliśmy zidentyfikować geny zaangażowane w funkcję SC, porównując profile transkrypcyjne całych AG z gruczołów dodatkowych typu dzikiego lub zmutowanego12. Również inne laboratoria wykazały, że liczba SC, morfologia i zawartość wakuolarna zależą od diety samca, statusu krycia i wieku21,25,26.

Chociaż dzięki tym metodom osiągnięto pozytywny postęp, pełne osiągnięcie transkryptomu SC było dalekie od osiągnięcia. Rzadkość tych komórek w tym narządzie utrudniała dalszy postęp nawet z komórek typu dzikiego. Do badania ekspresji genów zmiany w tych komórkach po określonych bodźcach środowiskowych byłyby jeszcze trudniejsze. W związku z tym potrzebna była metoda izolowania i oczyszczania SC RNA, która byłaby wystarczająco szybka i prosta, aby można ją było zastosować w różnych tłach genetycznych i warunkach środowiskowych.

Zarówno geny Abd-B, jak i MSA wymagają specyficznego wzmacniacza 1,1 kb z kompleksu Drosophila Bithorax (zwanego wzmacniaczem D1) do ich ekspresji w SCs18,20. Ten wzmacniacz był wcześniej używany do tworzenia sterownika GAL4, który w połączeniu z UAS-GFP jest w stanie napędzać silną ekspresję GFP, szczególnie w SC. W związku z tym użyliśmy tej linii jako podstawy protokołu FACS do izolowania tych komórek zarówno od typu dzikiego, jak i iab-6cocuD1 AGs). Ponieważ SC z mutacją iab-6cocuD1 wykazują inną morfologię komórkową, pokazujemy, że protokół ten może być stosowany do izolowania komórek w celu określenia ich transkryptomu z tego rzadkiego typu komórek w bardzo różnych warunkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Używane linie Drosophila i kolekcja samców

  1. W tym protokole należy użyć samców wykazujących ekspresję GFP w SC, a nie w głównych komórkach. W tym przypadku używany jest sterownik AbdB-GAL4 (opisany w reference18), rekombinowany z UAS-GFP (na chromosomie 2). Można również użyć innych odpowiednich sterowników. W celu wyizolowania SC w różnych zmutowanych warunkach, należy skrzyżować mutację z liniami zawierającymi specyficzną dla SC linię GFP.
  2. Zbierz dwie partie po około 25 zdrowych, dziewiczych samców dla każdego genotypu i leżakuj je w temperaturze 25 °C przez 3-4 dni w fiolkach ze świeżo przygotowanym pokarmem Drosophila.
    nuta: Ponieważ wiek, stan krycia, odżywianie i środowisko społeczne wpływają na biologię rozrodu, należy przestrzegać ścisłych protokołów w celu kontroli tych parametrów. Samce dziewicze dojrzewają przez 3-4 dni po wykluciu poczwarki w temperaturze 25 °C z cyklem 12 godzin/12 godzin światła/ciemności, na standardowym pokarmie z mąki kukurydzianej, agaru i drożdży, w grupach po 20-25 samców na fiolkę.

2. Roztwory i przygotowanie materiałów

  1. Przygotuj następujące rozwiązania.
    1. Przygotuj pożywkę uzupełnianą surowicą (SSM): Pożywka Drosophila Schneidera uzupełniona 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną.
    2. Przygotuj porcje 1x enzymu trypsyny (np. TrypLE Express Enzyme) i przechowuj w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować porcje papainy [50 j./ml] (przechowywane w temperaturze -20 °C i rozmrożone tylko raz).
    4. Przygotować 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS, przechowywany w temperaturze pokojowej).
  2. Przygotuj wiele okrągłych końcówek pipet do fizycznej dysocjacji gruczołów dodatkowych.
    UWAGA:     Do obsługi dławików dodatkowych należy używać końcówek o niskiej retencji, ponieważ mają one tendencję do przylegania do nieprzetworzonego tworzywa sztucznego. Proces zaokrąglania płomieniem zmniejsza otwór końcówki i wygładza krawędzie końcówki. Zapewnia to skuteczną dysocjację po trawieniu peptydazy bez ścinania błon komórkowych.
    1. Odetnij jedną końcówkę o pojemności 200 μl ostrym ostrzem i delikatnie przełóż ją nad płomieniem, aby zaokrąglić jej końcówkę tak, aby otwór był szerszy, ale gładki do obsługi w kroku 3.7.
    2. Zawęź otwór wielu końcówek o pojemności 1,000 μl, przesuwając otwór końcówki w pobliżu płomienia na mniej niż jedną sekundę. Lekko obróć końcówkę, aby uniknąć nadmiernego stopienia lub zatkania. Posortuj końcówki od węższych do szerszych. Można to zrobić, mierząc czas prędkości aspiracji. Spróbuj oddzielić próbkę AG na małą skalę, aby przetestować skuteczność najwęższych końcówek.
      nuta: Te końcówki mają kluczowe znaczenie dla mieszania mechanicznego (kroki 5.2 i 5.3). Wysokiej jakości, zaokrąglone końcówki pipet pozwalają na całkowitą dysocjację przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek. W związku z tym końcówki te są dokładnie myte wodą pod koniec procedury w celu ponownego użycia. Pozwala to na powtarzalną dysocjację z dnia na dzień.

3. Rozwarstwienie gruczołów dodatkowych

  1. Umieść 20 do 25 samców Drosophila w szklanym naczyniu na lodzie.
  2. Wypreparuj 1 samca w SSM. Zdejmij jego układ rozrodczy i oczyść dodatkową parę gruczołów ze wszystkich innych tkanek poza przewodem wytryskowym.
    nuta: Usuń jądra, ponieważ uwolnione plemniki mogą tworzyć grudki i zakłócać proces dysocjacji. Wyjmij bańkę wytrysku, która utrudnia obsługę, gdy unosi się na wodzie.
  3. Za pomocą kleszczy przenieś dławiki pomocnicze na szklaną płytkę wypełnioną SSM w temperaturze pokojowej. Powtórz kroki 3.2-3.3 20 razy, aby uzyskać partię 20 par gruczołów w SSM.
    nuta: Kroki te zostaną osiągnięte w ciągu 15 do 20 minut. AG powinny wyglądać zdrowo, a ruchy perystaltyczne warstwy mięśniowej wokół gruczołów powinny być widoczne. GFP można monitorować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
  4. Przenieś dodatkowe dławiki do 1x PBS na 1-2 minutowe pranie w temperaturze pokojowej.
    nuta: Aby uzyskać lepszą dysocjację, konieczne jest przepłukanie gruczołów PBS. Czas trwania tego etapu powinien być jednak ograniczony, ponieważ komórki wykazują oznaki stresu w PBS; zdysocjowane komórki wtórne w PBS szybko pęcznieją i umierają.
  5. Rozcieńczyć 20 μl papainy [50 U/ml] w 180 μl 1x enzymu trypsyny, aby uzyskać roztwór dysocjacyjny (w celu zwiększenia lub zmniejszenia należy zachować 9 μl enzymu trypsyny i 1 μl papainy dla każdego mężczyzny). Za pomocą kleszczy przenieś dławiki dodatkowe do tego roztworu.
  6. Odizoluj końcówkę gruczołów dodatkowych (zawierających komórki wtórne) od części proksymalnej. Użyj cienkich kleszczy, aby mocno uszczypnąć środek płata gruczołowego i przeciąć ostrą końcówką drugiego płata kleszkowego. Usuń proksymalną część gruczołów dodatkowych i przewód wytryskowy, aby poprawić dysocjację i skrócić czas sortowania komórek.
    nuta: Wypreparowanie dystalnej części z 20 par gruczołów zajmie od 15 do 20 minut, a zatem trawienie przez peptydazy rozpocznie się w temperaturze pokojowej.
  7. Po wycięciu wszystkich końcówek gruczołów przenieś je do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą specjalnej końcówki do pipety o pojemności 200 μl przygotowanej w kroku 2.2.1. Powinien być szeroki, zaokrąglony i mokry przed kontaktem z gruczołami.
    nuta: Aby odpipetować tkankę dodatkowego gruczołu, końcówki powinny być zawsze wstępnie zwilżone odpowiednim roztworem (enzymem trypsyny lub SSM, w tym celu należy zachować jedną tubkę każdego z nich). Ostrożnie przepłucz końcówki między próbkami, aby uniknąć zanieczyszczenia.

4. Trawienie tkankowe

  1. Umieść mikroprobówkę w wytrząsarce o temperaturze 37 °C na 60 minut, kołysząc się z prędkością 1 000 obr.
    nuta: Zarówno czas pobudzenia, jak i trawienia mają kluczowe znaczenie dla udanej dysocjacji. Krótsze lub nieruchome trawienie spowoduje słabą dysocjację, prawdopodobnie dlatego, że zewnętrzna warstwa mięśniowa i wewnętrzny lepki płyn nasienny chronią dodatkowe komórki gruczołów przed peptydazami.
  2. Dodaj 1 ml SSM w temperaturze pokojowej, aby zatrzymać trawienie i natychmiast przejdź do kroku 5.

5. Mechaniczna dysocjacja komórek

  1. Używając szerokiej, zaokrąglonej końcówki o pojemności 1 000 μl, wstępnie zwilżonej SSM, przenieś próbkę na 24-dołkową płytkę. Monitoruj fluorescencję GFP pod mikroskopem: większość końcówek gruczołów powinna wyglądać na nienaruszoną, a kilka SC powinno być odłączonych.
  2. Używając zaokrąglonej, wąskiej końcówki pipety wygenerowanej w kroku 2.2.2, pipetuj w górę i w dół 3 do 5 razy, aby naruszyć tkankę dodatkowego gruczołu.
    nuta: Monitoruj fluorescencję, aby upewnić się, że duże plamy tkanki zostały rozbite. Powtórz krok 5.2, jeśli tak nie jest.
  3. Używając bardzo wąskiej, zaokrąglonej końcówki pipety (wygenerowanej w kroku 2.2.2), pipetuj w górę i w dół 1-2 razy.
    nuta: Po kroku 5.3 powinny być widoczne tylko pojedyncze komórki. Zaleca się stosowanie płytek 24-dołkowych, ponieważ umożliwiają one łatwe monitorowanie procesu. Gdy kilka próbek zostało przetworzonych i dało zadowalający wynik (zdrowo wyglądające komórki wtórne doskonale zdysocjowane), etapy pipetowania zostaną przeprowadzone w mikroprobówce.
  4. Odczekaj co najmniej 15 minut, aby komórki osiadły na dnie studzienki i usunęły nadmiar SSM, aby skrócić czas sortowania.
    nuta: Pozostawienie komórek do osiadania okazało się lepsze od alternatywnych metod, takich jak wirowanie, i pozwala na ostatnią wizualną inspekcję komórek tuż przed FACS.
  5. Odpipetować komórki do czystej probówki o pojemności 1,5 ml i zebrać identyczne próbki (dwie partie po 20 samców dla każdego stanu). Przepłukać studzienki SSM w celu odzyskania ostatnich komórek i odpipetować je do probówki (użyć małej objętości).
  6. W mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml dodaj 300 μl roztworu do lizy komórek i 1 μl proteinazy K [50 μg/μl] (roztwory dostarczone w zestawie do oczyszczania RNA, patrz krok 7). Przygotować dwie probówki dla każdej próbki (jedną dla MC i jedną dla SC).

6. FACS (Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją)

  1. Dodaj marker żywotności do każdej próbki, która ma być sortowana, na kilka minut przed sortowaniem (0,3 mM Draq7).
    ostrożność: Z Draq7 należy obchodzić się ostrożnie.
  2. Sortuj jednorodną populację żywych komórek wtórnych (komórki GFP-dodatnie, Draq7-ujemne). W innej mikroprobówce posortuj populację głównych komórek (mniejsze, GFP-ujemne, Draq7-ujemne). Użyj następującej strategii bramkowania FACS:
    UWAGA:     Ustaw ciśnienie sortownika komórek na 25 PSI i przepuść komórki przez dyszę 100 μm. Szybkość sortowania wynosi około 2 000 komórek/s.
    1. Wyklucz zanieczyszczenia i wybierz łączną liczbę komórek na podstawie FSC-SSC (Rysunek 2E), aby wykluczyć zanieczyszczenia.
    2. Wyklucz martwe komórki. Wzbudz Draq7 laserem o długości fali 640 nm i zbierz emitowaną fluorescencję za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 795/70. Bramka Draq7-dodatnich komórek (Rysunek 2F).
    3. Usuń dublety za pomocą podwójnego bramkowania na SSC-H vs SSC-W i FSC-A vs FSC-H (Rysunek 2H).
      nuta: Rygorystycznie wykluczaj dublety komórek za pomocą podwójnego bramkowania, aby zmniejszyć zanieczyszczenie głównej komórki.
    4. Sortuj ~ 550 komórek GFP-dodatnich do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml z buforem do lizy i proteinazą K. Ta populacja jest uważana za komórki drugorzędowe (SC, Rysunek 2G). Wzbudzić GFP przy długości fali 488 nm i zebrać emitowaną fluorescencję za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 526/52.
    5. Sortuj ~ 1,000 komórek GFP-ujemnych, jednorodnych i małych rozmiarów, do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml z buforem do lizy i proteinazą K. Ta populacja jest uważana za główne komórki (MC, Rysunek 2G).
    6. Wiruj wszystkie próbki.
      nuta: Z 40 samców (~40 x 80 SC = 3,200 komórek wtórnych) uzyskuje się od 600 do 800 żywych komórek wtórnych singletów (około 20-25% pobrania). Przestań sortować około 550 SC i 1,000 MC, aby znormalizować próbki.

7. Ekstrakcja RNA

UWAGA: Użyliśmy zestawu do oczyszczania RNA Epicentre MasterPure do ekstrakcji RNA, z następującymi adaptacjami. Inne zestawy mogą być używane, o ile wydajność jest wystarczająco wysoka, aby przygotować bibliotekę do sekwencjonowania z ~500 komórek (tutaj użyto 2 ng RNA).

  1. Podgrzewać próbki w temperaturze 65 °C przez 15 minut i wirować co 5 minut, aby zakończyć lizę komórek.
  2. Umieść próbki na lodzie na 5 minut. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi wytrącania kwasów nukleinowych (części "Wytrącanie całkowitej ilości kwasów nukleinowych" i "Usuwanie zanieczyszczającego DNA z preparatów całkowitych kwasów nukleinowych").
  3. Zawiesić osad RNA w 10 μl buforu TE wolnego od RNaz.
  4. Dodaj inhibitor RNazy (opcjonalnie).
  5. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

8. Kontrola jakości RNA, jakości i swoistości

  1. Oszacuj jakość i stężenie RNA. Ze względu na małą objętość i stężenie, użyj tutaj chipów RNA 6000 Pico. Dobrej jakości RNA definiuje się jako niezdegradowane, widoczne jako niska linia podstawowa z ostrymi pikami odpowiadającymi rRNA.
  2. RT-qPCR do kontroli tożsamości posortowanych komórek
    1. Wykonaj odwrotną transkrypcję z 2 ng całkowitych RNA, używając losowych heksamerów jako starterów. Wykonaj RT na drugorzędowym RNA komórkowym i RNA-
      UWAGA: cDNA można rozcieńczać, porcjować i przechowywać w stanie zamrożonym do późniejszego wykorzystania.
    2. Wykonuj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu odpowiednich par starterów w celu ilościowego określenia genów porządkowych (alfa-tubulina, 18S rRNA), drugorzędowych genów specyficznych dla komórek (MSA, Rab19, Abd-B) i głównego genu specyficznego dla komórki (peptyd płciowy).

9. Sekwencjonowanie (przygotowanie biblioteki cDNA, sekwencjonowanie i analiza danych)

  1. Użyj 2 ng całkowitego RNA do syntezy cDNA ze starterami polydT. Użyj technologii SMARTer, aby je wzmocnić w celu wzmocnienia.
  2. Użyj zestawu Nextera XT, aby przygotować bibliotekę.
  3. Sekwencjonowanie przy użyciu multipleksowania, sekwencjonowanie pojedynczych odczytów 100 nukleotydów (mimo że 50 odczytów nukleotydów jest odpowiednich dla większości celów), aby uzyskać około 30 milionów odczytów dla każdej próbki.

10. Analiza danych

  1. Uruchom FastQC.
  2. Użyj nakładki STAR, aby zmapować odczyty w genomie referencyjnym UCSC dm6 Drosophila i wygenerować pliki .bam. Użyj przeglądarki Integrative Genomics Viewer (IGV), aby zwizualizować odczyty w przeglądarce genomu.
  3. Użyj HTSeq do zliczania genów.
  4. Użyj metody przyciętej średniej wartości M (TMM), aby znormalizować liczbę genów22. Użyj edgeR do przeprowadzenia analizy statystycznej wyrażeń różniczkowych, wykresów MA i PCA.
  5. Do analizy i statystyki ekspresji genów należy użyć ogólnego modelu liniowego, testu F quasi-prawdopodobieństwa ze wskaźnikiem fałszywej wykrywalności (FDR) oraz korekcji Benjaminiego i Hochberga (BH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia jednemu badaczowi wyizolowanie komórek wtórnych z gruczółszyk męskich Drosophila oraz ekstrakcję ich RNA w ciągu jednego dnia (Rycina 1).

Wykorzystujemy konstrukt Abd-B-GAL418 do znakowania białkiem GFP komórek wtórnych (SC), ale nie komórek głównych (MC) (Rycina 2A). Jedny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metody dysocjacji komórek z tkanek Drosophila, takich jak dyski wyobrażeniowe, zostały już opisane23. Nasze próby prostego zastosowania tych procedur na gruczołach dodatkowych nie powiodły się, co zachęciło nas do opracowania tego nowego protokołu. Trawienie proteazy i mechaniczne roztrząsanie były kluczowymi krokami, które rozwiązaliśmy dla powodzenia procedury, dlatego umieściliśmy wiele notatek w sekcjach od 2 do 5, aby pomóc eksperymentatorom w uzyskaniu zadowalających wyników. Aby dy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawniają żadnych informacji.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni członkom laboratorium Karch, formowi płytki genomiki iGE3, głównemu ośrodkowi cytometrii przepływowej Uniwersytetu Genewskiego oraz dr Jean-Pierre Aubry-Lachainaye, który ustalił protokół dla FACS. Dziękujemy Luce Stickleyowi za pomoc w wizualizacji odczytów na IGV. Dziękujemy sobie za delikatną zgodę na ponowne wykorzystanie rysunków, a redaktorom za zachęcenie nas do kreatywnego pisania.

Te badania zostały sfinansowane przez Stan Genewski (CI, RKM, FK), Szwajcarski Narodowy Fundusz Badań (www.snf.ch) (FK i RKM) oraz darowizny od Fundacji Claraz (FK).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowejVWR734-2325
Lornetka mikroskopowa do preparacji
Lornetka ze źródłem światła do GFP
Bunsen
Draq7 0,3mMBioStatus DR71000
Mikroprobówki plastikowe 1,5 mlEppendorf
FACSBeckmanCoulter MoFlo Astrios
Kleszcze
Surowica bydlęca płoduGibco10270-106inaktywowana termicznie przed użyciem
Szklane naczynia do preparacji
Wiadro
System odwrotnej transkrypcji ImProm-IIPromegaA3800
Zestaw do oczyszczania RNA MasterPureEpicentreMCR85102
zestaw Nextera XTilluminahttps://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000Gilson
P20Gilson
P200Gilson
Papaina50U / ml
PBSdomowej roboty
Penicylina-StreptomycynaGibco15070-063
Startery
Losowe startery heksamerowe
RNA 6000 Zestaw PicoAgilent
Schneider' s Drosophila mediumGibco21720-001
SMARTer zestaw do syntezy cDNATakarahttps://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select Master mix for CFXapplied biosystems4472942
Thermo ShakerHangzhou Allsheng instrumentsMS-100
Tipone 1250 μ L końcówka z podziałkąStarlabS1161-1820
Tipone 200 μ L Końcówka ze skosemStarlabS1161-1800
TrypLE Express EnzymeGibco12604013
Vortex
do precyzyjnego rozwarstwianiana lódPolydT

Bibliografia

  1. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
  2. Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
  3. League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
  4. Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
  5. Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
  6. Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
  7. Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
  8. Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
  9. Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
  10. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  11. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238(2007).
  12. Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).
  13. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
  14. Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
  15. Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
  16. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
  17. Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
  18. Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395(2013).
  19. Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302(2012).
  20. Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519(2018).
  21. Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
  22. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25(2010).
  23. Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
  24. Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
  25. Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
  26. Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
  27. Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Gruczol dodatkowy Drosophilasortowanie FACSekstrakcja RNAreporter GFPtrawienie tkanekdysocjacja kom rekmikroskopia fluorescencyjnaRT qPCRsekwencjonowanie RNA
Oparty na FACS protokół izolacji RNA z komórek wtórnych męskich gruczołów dodatkowych Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.