Protokół krio-proszkowania do przetwarzania łap myszy w celu oceny molekularnych szlaków zapalenia tkanek w modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem

Summary

Metoda rozdrabniania kriogenicznego do przetwarzania mysich łap za pomocą młyna zamrażającego ciekły azot została opracowana w celu poprawy wydajności i jakości RNA lub białka ekstrahowanego z tkanek i umożliwienia analizy profili molekularnych związanych z reakcjami zapalnymi.

Abstract

Profilowanie zmian molekularnych w lokalnych tkankach jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmu(ów) działania kandydatów na terapię in vivo. W dziedzinie badań nad zapaleniem stawów wiele badań koncentruje się na stanach zapalnych stawów, które składają się ze złożonej mieszaniny kości, chrząstek, mięśni, komórek zrębu i komórek odpornościowych. W tym miejscu opracowaliśmy niezawodną i solidną mechaniczną metodę rozbijania zapalnych łap myszy na jednorodne, sproszkowane próbki w kontrolowanym środowisku kriogenicznym. Lizaty białek i RNA poddano obróbce, aby umożliwić uzyskanie proteomicznych i transkrypcyjnych punktów końcowych oraz molekularną charakterystykę istotnych szlaków chorobowych w tkance lokalnej.

Introduction

Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest przewlekłą ogólnoustrojową chorobą zapalną z utrzymującym się symetrycznym zapaleniem stawów i dodatkowym zajęciem stawowym narządów, takich jak skóra, serce, płuca i oczy¹. Chociaż ogólnoustrojowe objawy odpowiedzi immunologicznej są widoczne u ludzi, jedną z cech charakterystycznych patologii RZS jest infiltracja komórek odpornościowych w tkance maziowej i proliferacja komórek fibroblastów maziowych².

Podobnie jak u człowieka, model zapalenia stawów wywołanego kolagenem myszy (CIA) wywołuje silne zapalenie tkanek z aktywnymi odpowiedziami immunologicznymi w tkankach maziowych i przedziałach ogólnoustrojowych. Podatność różnych szczepów myszy na model CIA łączy się z haplotypem głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) oraz interakcjami limfocytów T i limfocytów B specyficznych dla antygenu^3,4. Ponadto w tym modelu widocznych jest również wiele szlaków patogennych w ludzkim RZS, w tym wytwarzanie autoprzeciwciał, odkładanie kompleksu immunologicznego, aktywacja komórek szpikowych, objawy wielostawowe i tworzenie łuszczycy z infiltracją immunologiczną błony maziowej^5,6. Badacze wykorzystali ten dobrze znany model CIA do zbadania efektów leczenia cytokinami przeciwzapalnymi⁷. Wiele leków biologicznych zatwierdzonych do leczenia chorób autoimmunologicznych lub zapalnych, takich jak anty-TNFα i anty-IL-6, okazuje się skutecznych w modelu CIA^8,9.

Profilowanie interakcji układu odpornościowego w tkance maziowej jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów molekularnych związanych z patogenezą RZS. W warunkach klinicznych u ludzi powszechną praktyką jest wykonywanie biopsji maziowej igłowej pod kierunkiem obrazowania ultrasonograficznego. W warunkach przedklinicznych mniejsza architektura mysich stawów sprawia, że procedury biopsji są znacznie trudniejsze, jeśli nie niemożliwe. Niedawno zademonstrowaliśmy wykorzystanie mysiego modelu CIA do oceny kombinacji leków w celu wpływu na rozbieżne punkty końcowe i rozwiązania choroby w podejściu kombinatorycznym¹⁰. Zastosowano metodę proszkowania opartą na młynie kriogenicznym w zamrażarce, aby przetworzyć zapalone łapy myszy na jednorodne drobne proszki i ustalić dalsze procesy ekstrakcji RNA i białek. Metoda ta chroni RNA i białko przed enzymatycznymi i chemicznymi procesami degracyjnymi i umożliwia zastosowanie wielu metod analitycznych do jednego homogenizowanego źródła próbki.

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) firmy Janssen R&D.

1. Metoda proszkowania oparta na młynie do zamrażania kriogenicznego

1. Po zakończeniu badania CIA należy złożyć ofiary na myszach z 1,5% izofluranem, a następnie zwichnąć szyjkę macicy.
2. W dniu przetwarzania tkanek należy wstępnie schłodzić wszystkie narzędzia (szpatułki, fiolki do mielenia itp.) na suchym lodzie przez co najmniej 10 minut. Nosić rękawice termiczne, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych zamarzaniem.
3. Odetnij tylne łapy nożycami na linii futra, jak pokazano na Rysunek 1A.
4. Przenieś każdą łapę do jednej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, natychmiast zamroź w ciekłym azocie i przechowuj zamrożone łapy w temperaturze -80 °C. Nie przechowywać próbek w stanie zamrożonym dłużej niż jeden tydzień.
5. Napełnij młyn zamrażarki ciekłym azotem, jak pokazano na Rysunek 1B i pozwól mu się zrównoważyć przez co najmniej 10 minut.
6. Nieprzetworzoną próbkę należy przechowywać na suchym lodzie i unikać cykli zamrażania i rozmrażania.
7. Przenieś jedną tylną łapę do wstępnie schłodzonej dużej fiolki do mielenia z poliwęglanu z dolną stalową zatyczką, włóż wstępnie schłodzony stalowy impaktor i zamknij fiolkę do mielenia z poliwęglanu wstępnie schłodzoną górną stalową zatyczką (Rysunek 1C).
8. Przenieś duże fiolki do mielenia z poliwęglanu wraz z próbkami do młynka zamrażarki wstępnie napełnionego płynem i zamknij pokrywę gumowym zatrzaskiem znajdującym się z przodu urządzenia.
9. Pozwól próbkom ostygnąć w ciekłym azocie przez 1 minutę.
10. Ustaw młynek zamrażarkowy na program 1-minutowy z 10 cyklami na sekundę i naciśnij przycisk start. Poczekaj, aż młyn zamrażający zakończy swój cykl.
    nuta: Maszyna wydaje dźwięk bębnienia, gdy stalowy impaktor porusza się w przód iw tył. Używaj zatyczek do uszu, aby uniknąć utraty słuchu.
11. Otwórz pokrywę młynka zamrażarki, wyjmij dużą fiolkę do mielenia z poliwęglanu i umieść ją w ekstraktorze, jak pokazano na Rysunek 1D. Zdejmij górną stalową zatyczkę, naciskając w dół na uchwyt, aż stalowa zaślepka wysunie się z rurki poliwęglanowej.
12. Przenieść otwartą dużą fiolkę do mielenia z poliwęglanu na suchy lód. Zdejmij stalowy impaktor za pomocą wstępnie schłodzonych kleszczy.
13. Przenieść zamrożony proszek do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
14. Odważyć 30-50 mg zamrożonego proszku do wytarowanej zamrożonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml do ekstrakcji RNA i 100-200 mg zamrożonego proszku do ekstrakcji białka.
    nuta: Zamrożony proszek powinien wyglądać jak biały lub jasnoróżowy drobny piasek, jak pokazano na Rysunek 1E.
15. Sproszkowane próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C i w ciągu 24 godzin poddać izolacji RNA i białek.

2. Ekstrakcja RNA

1. Dodać 10 μl β-merkaptoetanolu (β-ME) na 1 ml buforu RLT.
2. Obliczyć objętość buforu RLT odpowiadającą stosunkowi 23,3 ml/mg tkanki i dodać odpowiednią objętość buforu RLT z β-ME do probówki z zamrożonym proszkiem. Stosunek ten został empirycznie określony jako idealny dla łap myszy.
3. Wirować próbkę z prędkością 3,000 obr./min przez 10 s.
4. Dobrze wymieszać, energicznie pipetując 10 razy w górę i w dół za pomocą pipetora o pojemności 1 ml.
5. Ponownie wirować próbkę z prędkością 3,000 obr./min przez 20 s.
6. Odwirować probówkę o masie 13 000 x g przez 2 minuty.
7. Przenieść 700 μl supernatantów do świeżej probówki i dodać 700 μl 70% etanolu.
   nuta: Jeśli w probówce znajduje się <700 μl, dopuszczalne jest kontynuowanie, nadal dodając równoważną objętość 70% etanolu.
8. Załadować 700 μl próbki do kolumny oczyszczającej RNA.
9. Odwirować probówkę o stężeniu 10 000 x g ≥ przez 30 s.
10. Odrzucić przepływ i załadować pozostałą część próbki do kolumny RNeasy.
11. Odwirować probówkę o stężeniu 10 000 x g ≥ przez 30 s.
12. Odrzucić przepływ i przepłukać kolumnę, dodając 700 μl buforu RW1 z odwirowaniem ≥10 000 x g przez 30 s. W przypadku przeprowadzania opcjonalnej mineralizacji DNASE, przed poddaniem działaniu DNASE dodaje się 350 μl RW1. A po poddaniu działaniu DNASE dodaje się dodatkowe 350 μl RW1
.
13. Opcjonalnie) Wykonaj etap mineralizacji DNazy zgodnie z instrukcjami producenta.
14. Przemyć probówkę dwukrotnie, dodając 500 μl buforu RPE, a następnie odwirować przy ≥10 000 x g przez 30 s. Za każdym razem wyrzuć przepływ
.
15. Wysuszyć kolumnę przez odwirowanie w stężeniu 10 000 x g ≥ przez 2 min.
16. Eluować RNA, dodając 50 μl wody z odwirowaniem w ≥10 000 x g przez 2 min. Zebrać przepływ i przenieść do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
17. Określić ilość RNA przy użyciu metody wybranej przez badacza i przechowywać w temperaturze -80 °C przed dalszą analizą.

3. Ekstrakcja białka

1. Rozcieńczyć 10-krotny roztwór podstawowy do lizy komórek w 1-krotnym roztworze podstawowym do lizy komórek, używając wody o jakości do hodowli komórkowych.
2. Rozpuść zestaw koktajli inhibitorów proteazy I w 1 ml wody, aby uzyskać 100-krotny zapas inhibitora proteazy.
3. Dodaj 100 μl inhibitora proteazy do 9,9 ml 1x lizy komórek, aby uzyskać 1x końcowy roztwór podstawowy.
4. Dodaj 4 μl lodowatego lodu 1x bufor do lizy komórek na mg sproszkowanej tkanki (np. 800 μl buforu do lizy na 200 mg proszku tkankowego).
5. Dodaj jeden koralik ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm do tuby.
6. Wirować probówkę z prędkością 3 000 obr./min przez 60 s. Przenieść probówkę do mokrego lodu i kontynuować do następnej próbki.
7. Umieścić wszystkie probówki z próbkami w pudełku i potrząsać pojemnikiem wirówki na kołysce z prędkością 1 000 obr./min, 4 °C przez 1 godzinę.
   nuta: Naukowcy mogą uznać, że umieszczenie pudełka w pozycji pionowej może ułatwić lepsze mieszanie z koralikiem.
8. Odwirować probówki o ciśnieniu 10 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut.
9. Przenieś supernatanty do świeżej probówki i omijaj warstwę tłuszczu na wierzchu.
10. Określ całkowite stężenie białka. 10 do 30-krotne rozcieńczenie lizatu białkowego jest idealne do testu BCA.
11. Podwielokrotność próbki rozlać do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C przed dalszą analizą.

Results

Tutaj pokazujemy reprezentatywną wizualizację obrazu żelu RNA pobranego z przednich łap myszy CIA w Rysunek 2A. 28S rRNA i pasmo 18S rRNA wskazują, że wszystkie próbki mają wystarczającą ilość nienaruszonego RNA. Następnie pokazujemy reprezentatywny wykres punktowy całkowitych stężeń białek na podstawie analizy BCA białek w Rysunek 2B. Całkowite stężenia białka od myszy nieleczonych, myszy CIA lub myszy CIA poddanyc...

Discussion

Chociaż istnieją silne naukowe przesłanki do oceny szlaków molekularnych w tkankach maziowych, wiele doniesień na temat profilowania immunologicznego mysiego modelu CIA koncentrowało się na krwi obwodowej, podczas gdy dane z analizy białek i RNA łap w stanie zapalnym są raczej ograniczone. Istnieje kilka możliwych przyczyn tego uprzedzenia: mysie stawy skokowe nie są większe niż ~2 cm; Dotknięte obszary składają się ze skóry, kości i tkanek łącznych, które często są trudne do homogenizacji przy użyciu tradycyjnych metod,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Koralik ze stali nierdzewnej 5 mm	Qiagen	69989
beta-merkaptoetanol	Sigma	M6250	Środek redukujący próbki, który hamuje enzymy RNASE
Zestaw bioanalizatora	Agilent	5067-1511	Zestaw kwalifikacyjny RNA
b-merkaptoetanol	Sigma	M6250
Woda klasy hodowli komórkowej	Corning	25-055-CI	Woda
Roztwór podstawowy do lizy komórek	Sygnalizacja komórkowa	9803
Probówka Eppendorf	Eppendorf	22363204	Probówki do mikrofuge
Skrzynka wirówkowa probówkowa Eppendorf	Nalgene	5055	Skrzynka do trzymania probówek eppendorf w poziomym układzie probówek
Everlast 247 o zmiennej prędkości	Benchmark Scientific	BR5000
Młyn zamrażarkowy	Spex Sample Prep	6875	Zamrażarka/młyn do przetwarzania łap na sproszkowany proszek
Fiolka do mielenia	Spex Sample Prep	6801	Fiolka z poliwęglanu do przetwarzania łap na sproszkowany proszek
Zestaw Pierce BCA	Pierce	23225	Zestaw do ilościowego oznaczania całkowitego białka
Zestaw koktajli inhibitorów proteazy 1	Calbiochem	539131	Inhibitory
proteazyZestaw białkowy BCA	Pierce	23225
Zestaw Quantigene	Zestaw do analizy bDNA	Thermofisher	QP1013
Mikrowirówka z chłodzeniem	Eppendorf	5417R	Wirowanie
Bufor RLT	Qiagen	79216	Bufor do ekstrakcji RNA
Mini zestaw RNeasy	Qiagen	74104	w tym kolumna RNeasy, bufor RLT i bufor RW1
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	kołyskowa/wytrząsarka
	VWR	10806-412	Szpatułka do przenoszenia proszku
Koralik ze stali nierdzewnej	Qiagen	69989	Koralik do mieszania podczas ekstrakcji białek
Ekstraktor do probówek	Spex Sample Prep	6884	Ekstraktor do usuwania górnej części fiolki do mielenia
Vortexer	VWR	10153-838	Mieszanie próbek