Metoda rozdrabniania kriogenicznego do przetwarzania mysich łap za pomocą młyna zamrażającego ciekły azot została opracowana w celu poprawy wydajności i jakości RNA lub białka ekstrahowanego z tkanek i umożliwienia analizy profili molekularnych związanych z reakcjami zapalnymi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Protokół krio-proszkowania do przetwarzania łap myszy w celu oceny molekularnych szlaków zapalenia tkanek w modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Profilowanie zmian molekularnych w lokalnych tkankach jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmu(ów) działania kandydatów na terapię in vivo. W dziedzinie badań nad zapaleniem stawów wiele badań koncentruje się na stanach zapalnych stawów, które składają się ze złożonej mieszaniny kości, chrząstek, mięśni, komórek zrębu i komórek odpornościowych. W tym miejscu opracowaliśmy niezawodną i solidną mechaniczną metodę rozbijania zapalnych łap myszy na jednorodne, sproszkowane próbki w kontrolowanym środowisku kriogenicznym. Lizaty białek i RNA poddano obróbce, aby umożliwić uzyskanie proteomicznych i transkrypcyjnych punktów końcowych oraz molekularną charakterystykę istotnych szlaków chorobowych w tkance lokalnej.
Wprowadzenie
Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest przewlekłą ogólnoustrojową chorobą zapalną z utrzymującym się symetrycznym zapaleniem stawów i dodatkowym zajęciem stawowym narządów, takich jak skóra, serce, płuca i oczy1. Chociaż ogólnoustrojowe objawy odpowiedzi immunologicznej są widoczne u ludzi, jedną z cech charakterystycznych patologii RZS jest infiltracja komórek odpornościowych w tkance maziowej i proliferacja komórek fibroblastów maziowych2.
Podobnie jak u człowieka, model zapalenia stawów wywołanego kolagenem myszy (CIA) wywołuje silne zapalenie tkanek z aktywnymi odpowiedziami immunologic....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) firmy Janssen R&D.
1. Metoda proszkowania oparta na młynie do zamrażania kriogenicznego
- Po zakończeniu badania CIA należy złożyć ofiary na myszach z 1,5% izofluranem, a następnie zwichnąć szyjkę macicy.
- W dniu przetwarzania tkanek należy wstępnie schłodzić wszystkie narzędzia (szpatułki, fiolki do mielenia itp.) na suchym lodzie przez co najmniej 10 minut. Nosić rękawice termiczne, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych zamarzaniem.
- Odetnij tylne łapy nożycami na li....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Poniżej, na Rysunku 2A, przedstawiamy reprezentacyjny obraz wizualizacji żelu dla RNA wyekstrahowanego z przednich łap myszy w modelu CIA. Prążki 28S rRNA oraz 18S rRNA wskazują, że wszystkie próbki zawierają wystarczającą ilość nienaruszonego RNA. Następnie, na Rysunku 2B>, prezentujemy reprezentacyjny wykres rozrzutu stężeń całkowitego białka wyznaczonego na podstawie analizy BCA białek. Stężen.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż istnieją silne naukowe przesłanki do oceny szlaków molekularnych w tkankach maziowych, wiele doniesień na temat profilowania immunologicznego mysiego modelu CIA koncentrowało się na krwi obwodowej, podczas gdy dane z analizy białek i RNA łap w stanie zapalnym są raczej ograniczone. Istnieje kilka możliwych przyczyn tego uprzedzenia: mysie stawy skokowe nie są większe niż ~2 cm; Dotknięte obszary składają się ze skóry, kości i tkanek łącznych, które często są trudne do homogenizacji przy użyciu tradycyjnych metod,.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy BJ, SH, ML, RM, ML, TO i FS są pracownikami Janssen Research & Development Inc i są udziałowcami spółki macierzystej, Johnson & Johnson, Inc.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Edith Janssen za krytyczną recenzję rękopisu oraz Navinowi Rao i Jennifer Towne za wsparcie publikacji tego rękopisu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Koralik ze stali nierdzewnej 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| beta-merkaptoetanol | Sigma | M6250 | Środek redukujący próbki, który hamuje enzymy RNASE |
| Zestaw bioanalizatora | Agilent | 5067-1511 | Zestaw kwalifikacyjny RNA |
| b-merkaptoetanol | Sigma | M6250 | |
| Woda klasy hodowli komórkowej | Corning | 25-055-CI | Woda |
| Roztwór podstawowy do lizy komórek | Sygnalizacja komórkowa | 9803 | |
| Probówka Eppendorf | Eppendorf | 22363204 | Probówki do mikrofuge |
| Skrzynka wirówkowa probówkowa Eppendorf | Nalgene | 5055 | Skrzynka do trzymania probówek eppendorf w poziomym układzie probówek |
| Everlast 247 o zmiennej prędkości | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Młyn zamrażarkowy | Spex Sample Prep | 6875 | Zamrażarka/młyn do przetwarzania łap na sproszkowany proszek |
| Fiolka do mielenia | Spex Sample Prep | 6801 | Fiolka z poliwęglanu do przetwarzania łap na sproszkowany proszek |
| Zestaw Pierce BCA | Pierce | 23225 | Zestaw do ilościowego oznaczania całkowitego białka |
| Zestaw koktajli inhibitorów proteazy 1 | Calbiochem | 539131 | Inhibitory |
| proteazyZestaw białkowy BCA | Pierce | 23225 | |
| Zestaw Quantigene | Zestaw do analizy bDNA | Thermofisher | QP1013 |
| Mikrowirówka z chłodzeniem | Eppendorf | 5417R | Wirowanie |
| Bufor RLT | Qiagen | 79216 | Bufor do ekstrakcji RNA |
| Mini zestaw RNeasy | Qiagen | 74104 | w tym kolumna RNeasy, bufor RLT i bufor RW1 |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | kołyskowa/wytrząsarka |
| VWR | 10806-412 | Szpatułka do przenoszenia proszku | |
| Koralik ze stali nierdzewnej | Qiagen | 69989 | Koralik do mieszania podczas ekstrakcji białek |
| Ekstraktor do probówek | Spex Sample Prep | 6884 | Ekstraktor do usuwania górnej części fiolki do mielenia |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Mieszanie próbek |
Bibliografia
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
