Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

Giorgia Scapin; Marie  C. Goulard; Priyanka  R. Dharampuriya; Jennifer  L. Cillis; Dhvanit I. Shah

doi:10.3791/60234

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60234

⸱

9 listopada 2019

Giorgia Scapin¹^,²^,³ , Marie C. Goulard¹^,²^,³ , Priyanka R. Dharampuriya¹^,²^,³ , Jennifer L. Cillis¹^,²^,³ , Dhvanit I. Shah¹^,²^,³

¹Nationwide Children's Hospital, ²The Ohio State University College of Medicine, ³The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Hematopoetyczne komórki progenitorowe (HSPC) przechodzą ze stanu spoczynku do stanu różnicowania dzięki ich plastyczności metabolicznej podczas tworzenia krwi. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru oddychania mitochondrialnego i glikolizy HSPC.

Streszczenie

Krwiotwórcze komórki progenitorowe (HSPC) mają wyraźną plastyczność metaboliczną, która pozwala im przejść ze stanu spoczynku do stanu różnicowania, aby sprostać wymaganiom tworzenia krwi. Jednak analiza stanu metabolicznego (oddychanie mitochondrialne i glikoliza) HSPC była trudna ze względu na ich ograniczoną liczbę i brak zoptymalizowanych protokołów dla nieprzylegających, delikatnych HSPC. W tym miejscu przedstawiamy zestaw jasnych instrukcji krok po kroku, jak mierzyć oddychanie metaboliczne (wskaźnik zużycia tlenu; OCR) i glikoliza (szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego; ECAR) mysiego szpiku kostnego - Lineage^negSca1 ⁺ c-Kit⁺ (LSK) HSPC. Protokół ten zapewnia większą ilość LSK HSPC z mysiego szpiku kostnego, poprawia żywotność HSPC podczas inkubacji, ułatwia analizy strumienia zewnątrzkomórkowego nieprzylegających HSPC i zapewnia zoptymalizowane protokoły iniekcji (stężenie i czas) dla leków ukierunkowanych na fosforylację oksydacyjną i szlaki glikolityczne. Metoda ta umożliwia przewidywanie stanu metabolicznego i zdrowia HSPC podczas rozwoju krwi i chorób.

Wprowadzenie

Ponieważ długość życia większości dojrzałych komórek krwi jest krótka, homeostaza krwi opiera się na samoodnawianiu i różnicowaniu długowiecznej, ale rzadkiej populacji hematopoetycznych komórek macierzystych (HSPC)¹. HSPC są w stanie spoczynku, ale szybko się namnażają i ulegają różnicowaniu po stymulacji, aby sprostać wymaganiom układu krwionośnego. Ponieważ każdy stan komórkowy HSPC wymaga unikalnego zapotrzebowania bioenergetycznego, zmiany metaboliczne są kluczowymi czynnikami wpływającymi na decyzje dotyczące losu HSPC. Dlatego utrata plastyczności metabolicznej, poprzez zmianę równowagi między spoczynkiem, samoodnawianiem i różnicowaniem HSPC, często prowadzi do zaburzeń mielo- lub limfoproliferacyjnych. Zrozumienie regulacji metabolicznej rozwoju HSPC ma kluczowe znaczenie dla odkrycia mechanizmów leżących u podstaw nowotworów hematologicznych²^,³^,⁴^,⁵.

Oddychanie mitochondrialne i glikoliza generują ATP do napędzania reakcji wewnątrzkomórkowych i wytwarzania elementów budulcowych niezbędnych do syntezy makromolekuł. Ponieważ HSPC mają niską masę mitochondrialną w porównaniu z komórkami zróżnicowanymi⁶ i utrzymują stan spoczynku w niedotlenionych niszach szpiku kostnego, HSPC polegają głównie na glikolizie. Aktywacja HSPC zwiększa ich metabolizm mitochondrialny, co prowadzi do utraty spoczynku, a następnie ich wejścia do cyklu komórkowego. Taka plastyczność metaboliczna HSPC pozwala na utrzymanie puli HSPC przez całe dorosłe życie⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Dlatego tak ważne jest zbadanie ich aktywności metabolicznej, takiej jak wskaźnik zużycia tlenu (OCR; wskaźnik fosforylacji oksydacyjnej) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR; wskaźnik glikolizy) w celu analizy aktywacji HSPC i stanu zdrowia. Zarówno OCR, jak i ECAR mogą być mierzone jednocześnie, w czasie rzeczywistym, za pomocą zewnątrzkomórkowego analizatora strumienia. Jednak obecna metoda wymaga dużej liczby komórek i jest zoptymalizowana pod kątem komórek przylegających¹³. Ponieważ HSPC nie mogą być izolowane w dużych ilościach od myszy¹⁴, wymagają sortowania w celu uzyskania czystej populacji, są komórkami nieprzylegającymi¹⁵ i nie mogą być hodowane przez noc bez uniknięcia różnicowania¹⁶, trudno było zmierzyć OCR i ECAR HSPC. W tym miejscu udostępniamy zestaw jasnych instrukcji krok po kroku, które towarzyszą samouczkom wideo na temat pomiaru oddychania metabolicznego i glikolizy kilku tysięcy mysich szpiku kostnego - Lineage^negSca1 ⁺ c-Kit ⁺ (LSK) HSPC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Nationwide Children's Hospital Animal Care and Use Committee (IACUC).

UWAGA: Protokół jest opisany w porządku chronologicznym, który obejmuje okres dwóch dni. Używaj świeżych odczynników zgodnie z opisem w poniższym protokole.

1. Przygotowanie odczynników w dniu poprzedzającym test

Uwodnić wkład czujnika.
1. Inkubować przez noc 5 ml kalibru (tabela materiałów) w inkubatorze o temperaturze 37 °C niezawierającej CO₂ °C.
2. Otwórz zestaw do oznaczania topnika (tabela materiałów) i oddziel wkład czujnika (zielony; u góry) od tabliczki znamionowej (przezroczysty; na dole). Następnie umieść wkład czujnika do góry nogami i przylegaj do tabliczki użytkowej.
3. Sterylną wodą napełnij studzienki na tabliczce użytkowej (200 μL) oraz komory wokół studni (400 μL).
4. Zanurz wkład czujnika w tabliczce narzędziowej, upewniając się, że czujniki są całkowicie pokryte wodą. Stuknij 3x, aby uniknąć tworzenia się bąbelków.
5. Umieść na noc wkład zanurzony w tabliczce narzędziowej w inkubatorze bez emisji_CO2 37 °C. Aby zapobiec parowaniu wody, upewnij się, że inkubator jest odpowiednio nawilżony. Umieść otwartą zlewkę zawierającą_H2Ojako dodatkowy środek ostrożności obok płytki nabojowej, szczególnie jeśli używasz zwykłego piekarnika.
Przygotować płytkę do oznaczania.
1. Wysterylizuj powierzchnię komory bezpieczeństwa biologicznego klasy 2 przy użyciu 70% etanolu. Otwórz płytkę testową pod maską.
2. Dodaj 40 μl dostępnego w handlu 0,01% (w/v) roztworu poli-L-lizyny (PLL) do każdego dołka płytki testowej pod maską.
3. Przykryj płytkę testową pokrywką znajdującą się w zestawie. Inkubować zamkniętą płytkę testową w temperaturze pokojowej (RT) pod maską przez 1 h.
  nuta: Celem inkubacji jest umożliwienie PLL pokrycia powierzchni płytki testowej w celu ułatwienia przylegania komórek zawiesiny do powierzchni płytki testowej.
4. Po 1 godzinie inkubacji płytki testowej usunąć nadmiar roztworu za pomocą sterylnego aspiratora próżniowego i wysuszyć studzienkę pod pokrywą.
  nuta: Wysuszenie na powietrzu dołków płytki testowej zajmuje ~30-60 minut po nadmiernym usunięciu PLL za pomocą aspiratora.

2. Dzień próby

Przygotuj wkład.
1. Podnieś wkład czujnika. Umieść go do góry nogami w kapturze do hodowli tkankowych i wylej wodę z płytki użytkowej.
2. Napełnij studzienki na płytki użytkowe 200 μl wstępnie podgrzanego kalibru.
3. Napełnij komory wokół studni 400 μl kalibru.
4. Zanurz wkład czujnika w płycie narzędziowej, upewniając się, że czujniki są całkowicie zakryte przez kaliber. Stuknij 3x, aby uniknąć tworzenia się bąbelków.
5. Wyrównaj wkład czujnika zanurzony w tabliczce użytkowej w inkubatorze bez CO₂ 37 °C na 45−60 min.
Zbierz mysie HSPC LSK pochodzące ze szpiku kostnego.
1. Aby pomieścić wystarczającą liczbę kontrprób biologicznych, należy zaplanować użycie HSPC pochodzących od jednej myszy na studzienkę płytki testowej.
  nuta: Ta metoda pozyskiwania szpiku kostnego zapewnia ~ 50 000-80 000 LSK HSPC od każdej myszy. Ten protokół pomiaru strumienia zewnątrzkomórkowego jest zoptymalizowany dla ~ 70 000 LSK HSPC na dołek 96-dołkowej płytki.
2. Eutanazja myszy z użyciem przedawkowania CO₂ i zwichnięcia szyjki macicy, zgodnie z lokalnymi metodami zatwierdzonymi przez IACUC.
3. Wysterylizuj powierzchnię narzędzi sekcyjnych i ławkę za pomocą 70% etanolu.
4. Dla każdej myszy należy wstępnie napełnić jedną szalkę Petriego 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 2% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w temperaturze RT.
  nuta: Nie używaj wstępnie schłodzonego PBS, ponieważ w kolejnych krokach utworzy on grudki.
5. Spryskaj 70% etanolem (v/v) całą mysz poddaną eutanazji. Odizoluj wszystkie kości, w tym kończyny górne i dolne, kości biodrowe, mostek, klatkę piersiową i kręgosłup, od mouse¹⁷^,¹⁸. Wyciągnij istotę białą z rdzenia kręgowego myszy, ponieważ może ona zanieczyścić komórki LSK. Umieść wszystkie kości w 1x PBS (+ 2% FBS), podczas ich zbierania, na szalce Petriego do dalszego użycia.
6. Odwróć stożkową probówkę o pojemności 50 ml (za każdym razem nową) i użyj jej do rozdrobnienia kości zanurzonych w 1x PBS (+ 2% FBS) na szalce Petriego.
7. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, pipetuj w górę i w dół (~10x), aby równomiernie wypłukać komórki z kości, po zmiażdżeniu kości.
8. Umieść sitko o pojemności 40 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Wstępnie zwilż powierzchnię sitka, przepuszczając 1 ml 1x PBS (+ 2% FBS).
9. Zawiesinę komórkową pochodzącą ze szpiku kostnego pobrać z etapu 2.2.7 i przepuścić przez wstępnie zwilżoną powierzchnię sitka komórkowego w celu usunięcia resztek kostnych.
10. Powtarzać kroki od 2.2.6 do 2.2.9, aż wszystkie materiały kostne zmienią kolor na biały jako marker, że większość komórek szpiku kostnego została zebrana w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  nuta: Często potrzeba dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml na mysz, aby zebrać wszystkie komórki pochodzące ze szpiku kostnego.
11. Odwirować 50 ml stożkowych probówek zawierających komórki pochodzące ze szpiku kostnego przez 5 minut przy 500 x g i RT.
12. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki pochodzące ze szpiku kostnego (połączyć zawartość obu probówek o pojemności 50 ml) w 5 ml 1x PBS (+ 2% FBS) jako ostateczną objętość i utrzymać komórki w temperaturze pokojowej.
Zbierz monojądrzaste mysie komórki szpiku kostnego.
1. Dodać 5 ml pożywki o gradiencie gęstości (tj. Ficollu) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Następnie powoli dodawać 5 ml zawiesiny komórek szpiku kostnego. Upewnij się, że komórki pozostają jako warstwa powyżej ośrodka gradientu gęstości.
2. Wirować przez 30 minut przy 500 x g i RT. Nie używaj hamulca w wirówce. Upewnij się, że wirówka ma najniższe możliwe przyspieszenie (np. 1 przyspieszenie i 0 opóźnienia).
3. Zebrać środkową granicę faz komórek jednojądrowych (kolor biały) po odwirowaniu do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
4. Umyj komórki, zebrane z pożywki o gradiencie gęstości, 5 ml 1x PBS (+ 2% FBS). Wirować przez 5 minut przy 500 x g i temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
5. Powtórz krok 2.3.4.
6. Zawiesić zawartość komórek w probówce w 300 μl 1x PBS (+ 2% FBS). Podwielokrotność 10 μl zawiesiny komórek do niebarwionej lub jednobarwnej kontroli w probówce FACS.
Zbierz LSK HSPC z monojądrzastych komórek mysiego szpiku kostnego.
1. Przygotuj koktajl przeciwciał biotyny, mieszając 3 μl na próbkę następujących przeciwciał: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Dodać 15 μl koktajlu biotyny i przeciwciał do 300 μl jednojądrowych komórek szpiku kostnego.
  nuta: Każde przeciwciało stosuje się w rozcieńczeniu 1:100.
2. Inkubować komórki z koktajlem biotyny i przeciwciał przez 30 minut w temperaturze 4 °C z mieszaniem, aby uniknąć zlepiania się komórek na dnie probówki.
3. Dodaj 10 ml wstępnie schłodzonego 1x PBS (+ 2% FBS) do komórek zmieszanych z koktajlem biotyny i przeciwciał.
4. Odwirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 500 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 400 μl 1x PBS (+ 2% FBS). Podwielokrotność 10 μl do kontroli pojedynczego koloru streptawidyny.
5. Przed użyciem krótko wymieszaj mikrogranulki antybiotyny (tabela materiałów). Dodać 80 μl mikrogranulek do każdej próbki komórek (z 400 μl). Dobrze wymieszać i inkubować przez dodatkowe 20 minut w temperaturze 4 °C, mieszając.
6. Dodaj 10 ml wstępnie schłodzonego 1x PBS (+ 2% FBS) do komórek. Wirować probówkę przez 5 minut przy 500 x g i temperaturze 4 °C.
7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml 1x PBS (+ 2% FBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C podczas ustawiania jednostki separacji magnetycznej.
8. Umieścić kolumnę (Tabela materiałów) w polu magnetycznym separatora do sortowania komórek wspomaganych magnetycznie (MACS) w temperaturze 4 °C. Przygotować kolumnę do separacji magnetycznej, przepłukując ją 3 ml 1x PBS (+ 2% FBS) pod przepływem grawitacyjnym w temperaturze 4 °C.
9. Dodać zawiesinę komórek z kroku 2.4.7 do wstępnie zwilżonej kolumny w temperaturze 4 °C. Pozwolić, aby komórki przeszły przez kolumnę w temperaturze 4 °C i zebrać ścieki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  nuta: Frakcja z nieznakowanymi komórkami w takich ściekach reprezentuje wzbogacone komórki ujemne linii.
10. Przemyć kolumnę 3 ml 1x PBS (+ 2% FBS) w temperaturze 4 °C. Powtórzyć 3 razy. Zebrać przepływ i utrzymać go w temperaturze 4 °C. Policz eluowane żywe komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru.
11. Odwirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą przepływowy płyn przez 5 minut w temperaturze 500 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml 1x PBS (+ 2% FBS) i przenieść zawartość do probówki FACS.
12. Dodaj 24 μl koktajlu przeciwciał LSK do każdych^10-7 komórek. Koktajl przeciwciał zawiera równe stężenie przeciwciała 450-streptawidyny, przeciwciała PE-CY7-Sca1 i przeciwciała APC-c-Kit.
13. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z mieszaniem w ciemności (przykryte folią aluminiową).
14. Dodaj 3 ml 1x PBS (+ 2% FBS) do probówki FACS. Wirować przez 5 minut przy 500 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
15. Ponownie zawiesić komórki znakowane przeciwciałami w 1 ml 1x PBS (+ 2% FBS). Dodać 1 μl 1 mg/ml jodku propidyny do zawiesiny komórek tuż przed sortowaniem.
16. Przefiltrować zawartość probówki FACS za pomocą sitka 40 μm tuż przed sortowaniem komórek LSK.
17. Zebrać komórki LSK, poprzez sortowanie FACS, do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 0,5 ml kompletnej pożywki uzupełnionej 2 mM glutaminy, 3 mg / ml glukozy, 1 mM pirogronianu, 1x trombopoetyny (TPO), 1x czynnika komórek macierzystych (SCF), 0,5x penicyliny/streptomycyny (P / S), pH 7,4 (Tabela 1).

3. Oddychanie mitochondrialne i testy glikolizy LSK HSPC

Wysiew LSK na płytce probierczej
1. Odwirować komórki LSK z kroku 2.4.17 przez 5 minut przy 500 x g i RT. Odrzucić supernatant.
2. Zawiesić komórki w kompletnych pożywkach do końcowego stężenia co najmniej 70 000 komórek/40 μl.
3. Zawartość nasion w 40 μl pożywki (zawierającej 70 000 komórek) na 8-dołkowej płytce pokrytej PLL z kroku 1.2.4. Pozostaw wszystkie studzienki narożne puste.
4. Wirować przez 1 minutę przy 450 x g i RT. Nie włączaj hamulca. Upewnij się, że komórki są przymocowane do dna studzienki za pomocą odwróconego mikroskopu.
5. Dodać 135 μl kompletnej pożywki do komórek w każdym dołku, aby uzyskać końcową objętość 175 μl. Dodać 175 μl kompletnej pożywki do 2 rogów płytki jako ślepe próby.
6. Inkubować komórki w inkubatorze niezawierającym emisji_{CO2 przez} 2 godziny w temperaturze 37 °C.
7. Skonfiguruj program dodawania leków do każdego dołka płytki studzienki w analizatorze, używając metryki opisanej w Tabeli 2 (test stresu mitochondrialnego) i Tabeli 3 (test stresu glikolizy).
  UWAGA: Podczas inkubacji komórek włącz instrument i upewnij się, że ma temperaturę 37 °C.
Test wysiłkowy mitochondriów
1. Przygotować 45 μM roztwory podstawowe oligomycyny, 50 μM 4-(triflurometoksy)fenylohydrazonu cyjanku karbonylu (FCCP) i 25 μM roztworów podstawowych rotenonu/antymycyny A. Aby przygotować 45 μM roztwór podstawowy oligomycyny, należy rozpuścić zawartość dostępnej w handlu torebki w 280 μl kompletnej pożywki. Aby przygotować 50 μM roztwór podstawowy FCCP, należy rozpuścić zawartość dostępnej w handlu torebki w 288 μl kompletnej pożywki. Aby przygotować 25 μM roztwór podstawowy rotenonu/antymycyny A, należy rozpuścić zawartość dostępnej w handlu torebki w 216 μl kompletnej pożywki.
2. Wyjmij wkład czujnika z tabliczki użytkowej z inkubatora i załaduj jego porty (A, B i C) tak, aby każda studzienka miała końcowe stężenie 2 μM oligomycyny, 1,5 μM FCCP i 0,5 μM rotenonu/antymycyny A w razie potrzeby, zgodnie ze wskaźnikami rozcieńczenia opisanymi w tabeli 4 (dla wskaźnika zużycia tlenu).
3. Zdejmij pokrywę z wkładu czujnika zamontowanego w tabliczce narzędziowej i umieść ją na tacy na instrumenty. Rozpocznij kalibrację, która potrwa 20 minut.
4. Po kalibracji usuń tabliczkę użytkową i zastąp ją płytką testową zawierającą komórki LSK, które są teraz przyklejone do dna studzienki.
5. Naciśnij przycisk Kontynuuj, aby uruchomić program opisany w Tabeli 2. Po zakończeniu programu pobierz dane i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania Wave Desktop.
  nuta: Dane wygenerowane z testów strumienia zewnątrzkomórkowego można wykreślić za pomocą wykresu punktowego z oprogramowania Wave Desktop lub wyeksportować do internetowego programu statystycznego.
Test warunków skrajnych glikolizy
1. Glukozę rozpuścić w 300 μl (100 mM), oligomycynę w 288 μl (50 μM), glukozę 2-D (2-DG) w 300 μl (500 mM) kompletnych pożywek z dostępnego w handlu woreczka.
2. Delikatnie pipetuj w górę i w dół (~10x), aby rozpuścić związki. Wirować 2-DG przez około 1 minutę, aby zapewnić prawidłowe rozpuszczenie w pożywce.
3. Wyjmij wkład czujnika z inkubatora. Załaduj porty od A do C zgodnie z metrykami rozcieńczenia opisanymi w tabeli 5, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM glukozy, 2 μM oligomycyny i 50 mM 2-DG.
4. Powtórz kroki 3.2.3 i 3.2.4.
5. Naciśnij przycisk Kontynuuj, aby uruchomić program opisany w Tabeli 3. Po zakończeniu programu pobierz dane i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania Wave Desktop.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nasza metoda ekstrakcji pozwoliła nam na pozyskanie do ~80 000 LSK HSPCs na mysz. Żywotność i liczba komórek LSK uległy poprawie dzięki zastosowaniu naszej metody, ponieważ: (1) połączyliśmy szpik kostny z kończyn górnych i dolnych, kości biodrowych, mostka, klatki piersiowej i kręgosłupa, (2) zrezygnowaliśmy z użycia buforu do lizy erytrocytów, który zwiększyłby obumieranie komórek i ich agregację, (3) zastosowaliśmy separację komórek jednojądrowych za pomocą medium do gradientu gęstości oraz (4) uniknęliśmy użycia schł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj pokazujemy izolację maksymalnej ilości czystej i żywotnej populacji mysich HSPC LSK, a także pomiar ich glikolizy i oddychania mitochondrialnego za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. W szczególności protokół przezwycięża następujące problemy techniczne związane ze stosowaniem LSK HSPC: i) niska częstość występowania LSK HSPC w mysim szpiku kostnym¹⁴, ii) niska podstawowa aktywność metaboliczna LSK HSPC²⁶, iii) kruchość LSK HSPC²⁷

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest częściowo wspierana przez fundusze z National Institutes of Health (HL131645, CA016058), St. Baldrick's Foundation i Pelotonia Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,01% (w/v) roztwór poli-L-lizyny	Sigma	P8920	Używany do mocowania LSK
40 i mikro; m sitko komórkowe	Fisher Scientific	22-363-547	Używany do filtracji komórek po zmiażdżeniu kości
Mikrokulki antybiotyny	Miltenyi	130-090-485	Używany do separacji lin-
Biotyna Szczur Anti-Mouse CD45R/B220 Klon RA3-6B2	BD Biosciences	553086	Używany do separacji Lin-
Biotyna Szczur Anti-Mouse CD5 Klon 53-7.3	BD Biosciences	553019	Używany do Lin- separacja
Biotyna Szczur Anty-Mysz CD8a Klon 53-6.7	BD Biosciences	553029	Używany do separacji Lin- separacja
Biotyna Szczur Anty-Mysz Klon Ly-6G i Ly-6C RB6-8C5	BD Biosciences	553125	Używany do separacji Lin-
Szczur Biotyna Anty-mysi TER-119 / Komórki erytroidalne Klon TER-119	BD Biosciences	553672	Używany do separacji Lin- separacji
CD117 (c-Kit) Przeciwciało monoklonalne (2B8), APC	eBioscience	17-1171-83	Używany do sortowania LSK
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml	Falcon-Fischer Scientific	14-959-53A	Używany do izolacji komórek
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml	Falcon-Fischer Scientific	14-432-22	Używany do izolacji komórek
Falcon Probówki polipropylenowe z okrągłym dnem	Falcon-Fischer Scientific	14-959-11A	Używany do Sortowanie LSK
Płodowa surowica bydlęca	Neuromika	FBS001-HI	Używany w buforze FACS
Histopaque-1083	Sigma	10831	Używany do separacji gradientu fikolu
L-glutamina 100x	Fisher Scientific	25-030-081	Używany do podłoża testowego
LS Kolumna	Miltenyi	130-042-401	Używany do separacji
Ly-6A/E (Sca-1) Monoklonalny Przeciwciało (D7), PE-cyjanina7	eBioscience	25-5981-82	Używany do sortowania LSK
Mysi czynnik komórek macierzystych (SCF)	PeproTech	250-03-100UG	Używany do pożywki testowej
Mysia trombopoetyna (TPO)	PeproTech	315-14-100UG	Używany do podłoża testowego
PBS 1%	Fisher Scientific	SH3002802	Używany do buforu FACS
Penicylina-Streptomycyna ( 10 000 U/ml)	Fisher Scientific	15140122	Używany do pożywki testowej
Jodek propidyny	Fisher Scientific	P1304MP	Używany do sortowania LSK
Konik morski XFp Kultura komórkowa Minipłytka	Agilent Technologies	103025-100	Używany do siewu LSK
Pirogronian sodu (100 mM)	ThermoFisher	11360070	Używany do podłoża testowego
Streptawidyna eFluor 450 Koniugat	eBioscience	48-4317-82	Używany do sortowania LSK
XF Calibrant	Agilent Technologies	100840-000	Używany do równoważenia wkładów
Pożywki XF	Agilent Technologies	103575-100	Używany do podłoża testowego
XFp Zestaw do testów wysiłkowych glikolizy	Agilent Technologies	103017100	Leki do testu wysiłkowego glikolizy
XFp Mitochondria Zestaw do testów warunków skrajnych	Agilent Technologies	103010100	Leki do mitochondrialnego testu wysiłkowego
Wkład czujnika XFp	Agilent Technologies	103022-100	Służy do glikolizy i mitochondrialnego testu wysiłkowego

Bibliografia

Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).
Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125(2016).
Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901(2015).
Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe analiza oddychania metabolicznego pomiar glikolizy analiza strumieni zewnątrzkomórkowych izolacja szpiku kostnego magnetyczne sortowanie komórek cytometria przepływowa szybkość zużycia tlenu szybkość zakwaszania zewnątrzkomórkowego studzienki powlekane PLL

Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych