Artykuł metodologiczny

Poszukiwanie szczepów drobnoustrojów do bioremediacji i rozwoju probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów

24.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60238

⸱

31 października 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1LEMM, Laboratory of Molecular Microbial Ecology, Institute of Microbiology Paulo de Góes, Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2Genome Center, University of California, Davis, 3IMAM-AquaRio - Rio de Janeiro Aquarium Research Center

W tym artykule

Podsumowanie

Zanieczyszczenie wpływa na wszystkie biomy. Szczególnie ucierpiały środowiska morskie, zwłaszcza rafy koralowe, jeden z najbardziej wrażliwych ekosystemów na Ziemi. Bioremediacja to zdolność organizmów do rozkładu zanieczyszczeń. W tym miejscu opisujemy metodologie izolowania i testowania drobnoustrojów prezentujących zdolność bioremediacji i potencjalne cechy probiotyczne dla koralowców.

Streszczenie

Zanieczyszczenie wpływa na wszystkie biomy. Szczególnie ucierpiały środowiska morskie, zwłaszcza rafy koralowe, jeden z najbardziej wrażliwych ekosystemów na Ziemi. Na całym świecie 4,5 miliarda ludzi jest ekonomicznie zależnych od morza, gdzie większość ich utrzymania zapewniają rafy koralowe. Koralowce mają ogromne znaczenie i dlatego ich wyginięcie prowadzi do katastrofalnych konsekwencji. Istnieje kilka możliwych rozwiązań w zakresie remediacji zanieczyszczeń morskich i lokalnych zanieczyszczeń, w tym bioremediacja. Bioremediacja to zdolność organizmów do rozkładu zanieczyszczeń. Podejście to ma kilka zalet, takich jak zrównoważony rozwój, stosunkowo niski koszt oraz fakt, że można je stosować w różnych ekosystemach, powodując minimalny wpływ na środowisko. Dodatkową zaletą jest to, że manipulowanie endogennymi mikrobiomami, w tym przypuszczalnie korzystnymi mikroorganizmami dla koralowców (pBMC), może mieć działanie probiotyczne dla zwierząt morskich. W tym kontekście zastosowanie dwóch podejść, bioremediacji i inokulacji pBMC w połączeniu, może być obiecujące. Strategia ta promowałaby degradację określonych zanieczyszczeń, które mogą być szkodliwe dla koralowców i innych metaorganizmów, jednocześnie zwiększając odporność i odporność gospodarza na radzenie sobie z zanieczyszczeniami i innymi zagrożeniami. Metoda ta koncentruje się na selekcji pBMC do degradacji dwóch zanieczyszczeń: syntetycznego estrogenu 17a-etynyloestradiolu (EE2) i ropy naftowej. Doniesiono, że oba mają negatywny wpływ na zwierzęta morskie, w tym koralowce i ludzi. Protokół opisuje, w jaki sposób izolować i testować bakterie zdolne do rozkładu określonych zanieczyszczeń, a następnie opisuje, jak wykryć niektóre przypuszczalnie korzystne cechy tych powiązanych mikroorganizmów z ich koralowym gospodarzem. Opisane tutaj metodologie są stosunkowo tanie, łatwe do wykonania i wysoce elastyczne. Zamiast EE2 i oleju można użyć prawie każdego rodzaju rozpuszczalnego związku docelowego.

Wprowadzenie

Zanieczyszczenie jest głównym problemem wpływającym na zdrowie ludzi, zwierząt i roślin na całym świecie. Chociaż zanieczyszczenia mogą być naturalne, takie jak popioły wulkaniczne1, główną przyczyną większości zanieczyszczeń jest działalność człowieka. Działalność antropogeniczna zanieczyszcza glebę, wodę i powietrze, co bezpośrednio lub pośrednio prowadzi do prawie 20 milionów przedwczesnych zgonów ludzi2 i dziesiątkuje miliardy innych form życia rocznie. Zanieczyszczenia są obecne nawet w najodleglejszych zakątkach planety. Na przykład metale ciężkie i trwałe związki organiczne wykryto odpowiednio u bezkręgowców głębinowych i ssaków polarnych3,4.

Środowisko morskie zostało szczególnie dotknięte zanieczyszczeniem. Przez długi czas zakładano, że ocean pozostanie nienaruszony i będzie nieskończonym źródłem dóbr ze względu na ogromną ilość wody5. Z tego powodu wszystkie rodzaje przemysłu i instytucji od wieków swobodnie uwalniają odpady do zbiorników wodnych6,7. Kilka wszelkiego rodzaju zanieczyszczeń, takich jak plastic8, syntetyczne hormony9, pestycydy10, oil11, składniki odżywcze12, heavy metals3 i odpady radioaktywne13 zostały zgłoszone jako wpływające na ekosystemy oceaniczne. W tym kontekście rafy koralowe są jednymi z najważniejszych i najbardziej wrażliwych ekosystemów w środowisku morskim14. Rafy koralowe są obrońcami wybrzeży, kluczowymi dla rozwoju tysięcy gatunków morskich, odgrywając istotną rolę w obiegu składników odżywczych i kontroli klimatu. Rafy koralowe również przyczyniają się do rozwoju gospodarki, dostarczając między innymi ryb, towarów i turystyki15. Na przykład 4,5 miliarda ludzi polega na rybach oceanicznych jako głównym źródle pożywienia16, które są w dużym stopniu wspierane przez rafy koralowe.

Bez względu na ich ekologiczne, społeczne i ekonomiczne znaczenie, rafy koralowe są dziesiątkowane17,18. Działania antropogeniczne są przede wszystkim odpowiedzialne za trzy główne przyczyny śmierci koralowców: zmiany klimatyczne, przełowienie i zanieczyszczenie wody19. Mimo że ważne jest, aby pracować nad łagodzeniem globalnego ocieplenia, ważne jest również, aby pracować nad minimalizacją lokalnych zanieczyszczeń, w tym zanieczyszczenia wody, które może krytycznie przyczynić się do spadku liczebności koralowców20. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania strategii mających na celu wydłużenie życia koralowców, co mogłoby zapewnić im dodatkowy czas na przystosowanie się i przetrwanie.

W związku z tym, niezwykle ważne jest znalezienie rozwiązań minimalizujących zanieczyszczenie i opracowanie strategii zwiększających kondycję koralowców. Strategie remediacji zanieczyszczeń morskich są bardzo zróżnicowane i można je podzielić na podejścia fizyczne, chemiczne i biologiczne. Pomocne są podejścia fizyczne. Nie zawsze jednak są one wydajne. Na przykład odpady z tworzyw sztucznych można zminimalizować poprzez fizyczne usunięcie, podczas gdy związki rozpuszczalne w wodzie wymagają innych metod, aby je wyeliminować. Przykładami takich związków są ropa naftowa, uwalniana w wyniku działalności przemysłu naftowego i wycieków, a także inne mikrozanieczyszczenia, takie jak syntetyczne hormony, zwykle stosowane jako składnik estrogenowy w doustnych środkach antykoncepcyjnych i obecne w ściekach21,22. Stosowanie substancji chemicznych w celu zmniejszenia zanieczyszczenia może rozwiązać konkretny problem, ale może również stanowić dodatkowe źródło zanieczyszczenia. Tak jest w przypadku chemicznych dyspergatorów mających na celu złagodzenie zanieczyszczenia ropą, które zostały opisane jako jeszcze bardziej toksyczne dla ekosystemów morskich niż samo zanieczyszczenie ropą23. Z tych powodów podejścia biologiczne mają kilka zalet w porównaniu z innymi metodami. Bioremediacja to zdolność organizmów żywych lub ich produktów przemiany materii do przekształcania zanieczyszczeń w mniej toksyczne lub nietoksyczne formy24. Głównymi zaletami stosowania metod biologicznych są zrównoważony rozwój, stosunkowo niski koszt, fakt, że są one przyjazne dla środowiska oraz to, że mogą być stosowane w różnych ekosystemach, powodując minimalny lub mniejszy wpływ na środowisko21,25,26,27.

Dodatkowo, manipulacja społecznością mikrobiologiczną obecną w środowisku pozwala na dodatkową potencjalną przewagę. Istnieją mikrobiomy, które są związane z gospodarzami i są niezbędne dla ich zdrowia. Powszechnie wiadomo, że te powiązane symbiotyczne mikrobiomy są niezbędne do utrzymania homeostazy gospodarza19. Manipulacja tymi powiązanymi mikroorganizmami została dobrze zbadana w przypadku gospodarzy takich jak rośliny i ssaki28,29, ale stosowanie probiotyków koralowych jest nadal nowe15. Koralowce są również gospodarzami, oddziałują z dużymi i specyficznymi populacjami mikroorganizmów, aby przetrwać19. Rola tych społeczności mikrobiologicznych w zdrowiu i dysbiozie koralowców jest aktywnie badana, ale wciąż jest daleka od pełnego zrozumienia30. Jedna z najpopularniejszych hipotez nazywa się hipotezą probiotyku koralowców. Sugeruje to istnienie dynamicznego związku między symbiotycznymi mikroorganizmami a warunkami środowiskowymi, który prowadzi do wyboru najkorzystniejszych metaorganizmów koralowych31. Na podstawie tych informacji zaproponowano kluczowe potencjalne mechanizmy probiotyczne, a także strategie izolacji, manipulacji i dostarczania pożytecznych mikroorganizmów dla koralowców (BMC) do kilku celów, zaproponowano 32 i przetestowano33. Te potencjalnie korzystne cechy obejmują między innymi odporność na wzrost temperatury, ochronę przed reaktywnymi formami tlenu (ROS), wiązanie azotu, odporność na zanieczyszczenia i biologiczną kontrolę przed patogenami32.

To badanie skupia się na selekcji BMC i wolno żyjących mikroorganizmów wykazujących zdolność do degradacji dwóch zanieczyszczeń powszechnie występujących w środowisku morskim: syntetycznego estrogenu 17a-etynyloestradiolu (EE2) i ropy naftowej. Zanieczyszczenia zawierające hormony czynne są często obecne w zbiornikach wodnych34,35,36,37,38,39,40,41,42. Wśród nich syntetyczne estrogenowe związki zaburzające gospodarkę hormonalną (EDC) naśladują działanie estrogenów na komórki docelowe, powodując szereg skutków dla zwierząt, w tym raka piersi, bezpłodność i hermafrodytyzm9. EE2 jest wydalany przez ludzi z powodu stosowania doustnych środków antykoncepcyjnych. Nie jest usuwany ze ścieków przez tradycyjne oczyszczalnie ścieków i ma negatywne skutki nawet przy bardzo niskich stężeniach (np. ng/L lub μg/L)43,44,45. Niewiele wiadomo na temat wpływu estrogenów na fizjologię koralowców46,47. Jednak w przypadku innych bezkręgowców morskich, takich jak gąbki, skorupiaki i, estrogeny powodują kilka negatywnych skutków związanych głównie z reprodukcją, takich jak rozwój i/lub stymulacja gamet, zmiany w działaniu enzymatycznym i białkowym, problemy w procesach embrionalnych i inne48,49,50,51,52. Negatywne konsekwencje spowodowane zanieczyszczeniem EE2 podkreślają konieczność opracowania zrównoważonych metod usuwania tego związku ze środowiska bez wpływu na życie morskie.

Równocześnie, ponieważ ropa naftowa stanowi obecnie prawie 40% światowych źródeł energii53, w pobliżu raf często dochodzi do chronicznych zanieczyszczeń i wycieków ropy11. Stwierdzono, że zanieczyszczenie olejem powoduje negatywne skutki u kilku gatunków zwierząt morskich, ptaków, roślin i ludzi54,55,56,57. Na koralowcach powoduje blaknięcie, zmniejsza odporność larw na stres termiczny58, zakłóca społeczności związane z mikroorganizmami21 i powoduje martwicę tkanek. Ponadto dyspergatory chemiczne, technika remediacji ropy naftowej powszechnie stosowana przez firmy naftowe do remediacji wycieków, są jeszcze bardziej toksyczne dla koralowców niż sama ropa23. Z kolei pożyteczne mikroorganizmy wyizolowane z koralowców są znane z tego, że odgrywają kluczową rolę w zdrowiu gospodarza. Jednak manipulacja tymi potencjalnymi probiotykami musi być lepiej zbadana w celu zbadania możliwych negatywnych skutków ubocznych i zdolności metabolicznych, które można przebadać w celu poprawy sprawności metaorganizmu. W tym kontekście należy skupić się na takich cechach, jak między innymi aktywność przeciwdrobnoustrojowa przeciwko patogenom koralowców, produkcja katalazy w celu zwalczania stresu oksydacyjnego, zdolność do degradacji mocznika (który może odgrywać ważną rolę w procesie zwapnienia) oraz obecność genów, które nadają potencjalnie korzystne cechy. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób bioremediacja i probiotyki mogą być stosowane w celu jednoczesnego łagodzenia skutków zanieczyszczeń i poprawy zdrowia koralowców. Rozwój innowacyjnych podejść, które mogą być wykorzystane jako interwencje mające na celu zwiększenie trwałości gatunków morskich, stanowi krok w kierunku bardziej zrównoważonej i zdrowszej planety.

Protokół

1. Zbieranie i przechowywanie wody i koralowców w celu izolacji mikrobiologicznej

UWAGA: Ważne jest, aby zmierzyć współrzędne i temperaturę miejsc pobierania próbek. Jeśli to możliwe, metadane, takie jak zasolenie, pH, głębokość i natężenie światła, mogą również pomóc w znalezieniu precyzyjnych podejść do uprawy i przyszłej interpretacji danych. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, próbki należy przechowywać jak najkrócej przez możliwie najkrótszy czas. Mikrobiomy wodne/koralowe mogą ulec znacznym zmianom, jeśli próbki nie są przechowywane w odpowiedniej temperaturze i/lub są przechowywane przez długi czas. Jeżeli etap izolacji nie zostanie przeprowadzony natychmiast po pobraniu, kluczowe znaczenie ma utrzymanie próbek w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia. Im dłużej próbki są przechowywane, nawet w temperaturze 4 °C, tym bardziej zmienia się społeczność mikrobiologiczna.

  1. Pobieraj próbki i przechowuj wodę morską.
    1. Zebrać 500 ml próbek wody w co najmniej trzech egzemplarzach z każdego docelowego miejsca pobierania próbek. Najlepiej używać sterylnych butelek z zakrętkami.
    2. Jeśli przetwarzasz wodę natychmiast po pobraniu, trzymaj butelki w temperaturze RT przez krótki czas. Jeśli przetwarzanie próbki odbywa się później, należy przechowywać butelki w temperaturze 4 °C.
  2. Pobieraj próbki i przechowuj koralowce.
    1. Użyj sterylnej pary szczypiec, aby wyciąć fragmenty koralowców z tego samego miejsca pobierania próbek, co próbki wody. Aby uniknąć zanieczyszczenia, dotykaj koralowców tylko sterylnymi rękawiczkami.
    2. Opłucz próbkowany fragment koralowca za pomocą 20 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (3% NaCl w wodzie destylowanej) lub sztucznej wody morskiej, aby pozbyć się luźno przyczepionych wolno żyjących bakterii z wody morskiej.
    3. Za pomocą kleszczy umieść każdy fragment koralowca w sterylnym pojemniku o pojemności 250-500 ml z zakrętką zawierającą sterylny roztwór soli fizjologicznej.
    4. W laboratorium, za pomocą sterylnych kleszczy i szczypiec, zważ 5 g fragmentów koralowca za pomocą sterylnych szalek Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm na wadze.
    5. Przenieść 5 g próbki koralowca do sterylnego moździerza i zmacerować za pomocą sterylnego tłuczka.
    6. Za pomocą sterylnej szpatułki przenieść zmacerowaną próbkę do sterylnej kolby hodowlanej zawierającej 45 ml 3% sterylnego roztworu NaCl i 10−15 szklanych kulek o średnicy 5 mm. Użyj części 45 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby umyć zaprawę i odzyskać maksymalną ilość maceratu.
    7. Kolby należy stale mieszać (150 x g) przez 16 godzin w temperaturze wody w miejscu pobierania próbek.
      UWAGA: Dla koralowców płytkowodnych optymalna temperatura będzie wynosić od 24−28 °C. Ten krok odłączy mikroorganizmy od różnych przedziałów koralowców, takich jak te przyczepione do komórek gospodarza lub te żyjące w tkance i szkielecie. Po tym etapie maceraty koralowe nie powinny być przechowywane, a etap izolacji musi być natychmiast wykonany.

2. Izolacja bakterii rozkładających EE2 z wody morskiej i/lub koralowców

  1. Wybierz bacteria.
    UWAGA: Po krokach 1.1.2 i 1.2.7 stężenie mikroorganizmów w wodzie morskiej, które oderwały się od różnych maceratów koralowców, będzie nieznane i zmienne. Aby zagwarantować izolację pojedynczych kolonii drobnoustrojów na szalkach Petriego zawierających podłoże agarowe, konieczne są seryjne rozcieńczenia.
    1. Wykonaj seryjne rozcieńczenia do 10-9 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej dla próbek koralowców i do 10-6 dla próbek wody. Rozcieńczenia pipety w górę i w dół 5 razy przed wyrzuceniem końcówki. Wirować próbki przez 5 s za każdym razem przed wykonaniem kolejnego seryjnego rozcieńczania.
    2. Odpipetować 100 μl każdego rozcieńczenia na szalkach Petriego zawierających 3% bulionu lizogennego NaCl (LB) pożywki agarowej i umieścić je na płytce.
      UWAGA: Użyj agaru morskiego (MA) jako alternatywnego podłoża. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, wymagane są trzykrotne powtórzenia każdego rozcieńczenia.
    3. Inkubować płytki przez 1-3 dni w temperaturze docelowej (np. 26 °C). Sprawdzaj tabliczki raz dziennie.
    4. Selekcjonować i izolować kolonie o odmiennej morfologii wzrostu na nowych płytkach przy użyciu techniki płytki smugowej. Powtórz ten krok tyle razy, ile potrzeba, aby na płytkach wyrosły czyste kolonie.
    5. Jeżeli procedura nie jest natychmiast kontynuowana do kroku 2.3.1, należy przechowywać izolaty w temperaturze 4 °C lub w glicerolu, jak opisano w sekcji 2.2.
  2. Przygotuj zapasy glicerolu.
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i może być stosowany do długoterminowego przechowywania zapasów bakterii.
    1. Pobrać pojedyncze kolonie ze świeżej płytki lub z płytek przechowywanych w temperaturze 4 °C i niezależnie je zaszczepić w 2 ml sterylnej pożywki LB.
    2. Umieścić probówki pod stałym mieszaniem (150 x g) w temperaturze 24−28 °C przez noc (WŁ.).
    3. Dodać 1 ml kultur bakteryjnych z kroku 2.2.2 i sterylnego glicerolu do końcowego stężenia 20% do 2 ml kriowialiów.
    4. Pozostawić kriowiale włączone w temperaturze 4 °C.
    5. Umieścić bulion bakteryjny glicerolu w temperaturze -80 °C, aż będzie potrzebny.
  3. Wykonaj test zdolności do degradacji EE2.
    1. Aktywuj izolaty w bulionie LB lub alternatywnym podłożu. W tym celu należy wybrać pojedynczą kolonię ze świeżych płytek lub płytki przechowywanej w temperaturze 4 °C i zaszczepić 2 ml sterylnej pożywki LB. W przypadku, gdy jest to bulion glicerolowy, najpierw rozłóż go na płytkach agarowych LB i inkubuj w temperaturze 24−28 °C ON, aby wyrosły pojedyncze kolonie. Umieścić probówkę zawierającą pożywkę LB nachyloną pod stałym mieszaniem (150 x g) w temperaturze 24−28 °C ON.
    2. Po wzroście bakterii osadzaj komórki, odwirowując je przy 8 000 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej (RT). Wyrzucić supernatant i delikatnie pipetując w górę i w dół, ponownie zawiesić komórki w równej objętości (2 ml) soli fizjologicznej, aby zmyć pozostały bulion LB.
    3. Powtórzyć krok 2.3.2 dwukrotnie, aby upewnić się, że nie ma śladowych ilości źródła węgla, ponownie zawieszając ogniwa w równej objętości roztworu soli fizjologicznej. Na przykład, jeśli rozpoczęto od hodowli o pojemności 2 ml, ponownie zawieś komórki w końcowej objętości 2 ml roztworu soli fizjologicznej.
    4. Zaszczepić umyte i ponownie zawieszone komórki w minimalnej pożywce hodowlanej Bushnell Haas (bulion BH) zawierającej EE2 jako jedyne źródło węgla59.
      UWAGA: EE2 rozpuszcza się w etanolu w końcowym stężeniu 5 mg/l w pożywce hodowlanej. W razie potrzeby należy wprowadzić zmiany w rodzaju i/lub stężeniu zanieczyszczenia.
    5. Oceń wzrost bakterii na podstawie gęstości optycznej przy 600 nm i/lub jednostkach tworzących kolonie (CFU) na pożywce agarowej LB 33, przez 16−72 h inkubacji.
      UWAGA: Alternatywnie, mikroorganizmy można bezpośrednio wyizolować na minimalnej pożywce zawierającej EE2 lub inne związki jako jedyne źródło węgla. Ten krok ukierunkowałby selekcję i pozwolił uniknąć niepożądanego wzrostu.

3. Izolacja bakterii rozkładających ropę naftową z wody morskiej i/lub koralowców

  1. Przygotuj minimalną ilość pożywki zawierającej frakcję rozpuszczalną w wodzie olejową (oWSF) i frakcję nierozpuszczalną w wodzie oleju (oWIF) jako jedyne źródło węgla21.
    1. Dodaj 1-2% ropy naftowej do 500 ml sterylnej wody destylowanej. Użyj kolby filtracyjnej otwartej na dnie, aby usunąć frakcję rozpuszczalną bez naruszania górnej warstwy frakcji nierozpuszczalnej.
    2. Mieszaninę należy stale mieszać w temperaturze 24−28 °C przy 150 x g przez 48 godzin.
    3. Kolbę filtracyjną zawierającą frakcje ropy naftowej umieścić na stabilnej powierzchni i odczekać 10-20 minut, aby umożliwić oddzielenie frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej.
    4. Przenieść oWSF do nowej sterylnej kolby, oszczędzając oWIF poprzez otwarcie dolnej kolby filtracyjnej i wyjęcie frakcji rozpuszczalnej.
    5. Wykorzystując cały oWSF odzyskany w poprzednim kroku (~400 ml), przygotuj 1 l minimalnej pożywki agarowej BH zawierającej oWSF jako jedyne źródło węgla.
    6. Korzystając z oWIF pozostałego w kolbie z kroku 3.1.4, przygotować 1 l minimalnej pożywki agarowej BH zawierającej oWIF jako jedyne źródło węgla.
  2. Wyizoluj bakterie rozkładające oWSF i oWIF.
    1. Używając maceratu wodnego i koralowego z etapów odpowiednio 1.1.2 i 1.2.7, rozcieńczyć próbki do 10-6 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, jak opisano w kroku 2.1.1.
    2. Pobrać pipetą 100 μl każdego rozcieńczenia na szalki Petriego zawierające podłoża agarowe BH-oWSF i BH-oWIF i płytkować je.
    3. Powtórz procedury opisane od kroku 2.1.3 do kroku 2.1.5.

4. Wybór członków konsorcjum

  1. Wyodrębnij i zsekwencjonuj DNA w celu identyfikacji taksonomicznej.
    1. Aktywować izolaty znajdujące się w glicerolu zgodnie z opisem w kroku 2.3.1.
    2. Ekstrahować DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA (patrz tabela materiałów).
    3. Użyj starterów 27f (5′-AGA, GTT, TGA, TGA, TGG, CTC, AG-3′) i 1492r (5′-GTT, TAC, CTT, GTT, ACG, ACT, T-3′) do amplifikacji genu 16S rRNA.
    4. Wykonaj 50 μL reakcji PCR zgodnie z następującym protokołem: 5 μL 10x buforu polimerazy, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 5 mM każdego startera, 10 ng genomowego DNA i 2,5 U polimerazy Taq DNA. Dodać kontrole ujemne (tj. ślepe próby ekstrakcji DNA i reakcje PCR bez matrycowego DNA), aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia.
    5. Ustaw następujące etapy cykli termicznych: pierwszy cykl denaturacji w temperaturze 94 °C przez 4 minuty; 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 1 minutę, następnie 50 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 2,5 minuty; końcowy cykl przedłużania przez 10 minut w temperaturze 72 °C.
    6. Sprawdź integralność amplikonu w 1,2% żelu agarozowym przy użyciu 80 V.
    7. Żel oczyszczać próbki za pomocą zestawu do oczyszczania żelu (patrz tabela materiałów).
    8. Określ ilościowo produkty PCR za pomocą fluorometru.
    9. Wyślij produkt do sekwencjonowania.
      UWAGA: Dla lepszej klasyfikacji taksonomicznej zalecana jest metoda Sangera60, ponieważ zapewnia długie sekwencje. Uniwersalne startery 27f i 1492r mogą być używane do amplifikacji prawie całej długości genu 16S rRNA61. Jeśli kontigi nie mogą być złożone przy użyciu jednej pary starterów, należy rozważyć dodatkową parę w środku sekwencji.
  2. Określ krzywą wzrostu.
    1. Aktywować izolaty w zapasach glicerolu z kroku 2.2.5, jak opisano w kroku 2.3.1, ale używając 5 ml zamiast 2 ml.
    2. Dodać 1% (v/v) wyhodowanej kultury o pojemności 5 ml z kroku 4.2.1 w trzech powtórzeniach do kolby o pojemności 250 ml zawierającej 100 ml pożywki o stężeniu 3% LB. Upewnij się, że przygotowałeś również trzy egzemplarze kontroli negatywnej (bez inokulum).
    3. Umieścić kolby w inkubatorze pod stałym mieszaniem (150 x g) w temperaturze 24−28 °C.
    4. Przyjmować 1 ml porcji co 4 godziny przez 48 godzin. Jeśli szczepy wykazują wysokie tempo wzrostu, zmniejsz odstęp 4 godzin.
    5. Zmierzyć oszacowanie gęstości optycznej (OD) przy długości fali 600 nm i jednostkach tworzących kolonie (CFU) liczonych z seryjnych rozcieńczeń posianych na płytkach z multimediami (100 μl należy zaszczepić w każdej płytce i znormalizować do objętości 1 ml).
    6. Wykreślić krzywe OD i CFU i przeanalizować korelację OD/CFU każdego pojedynczego szczepu. Od teraz obliczaj liczbę komórek na podstawie wartości OD.
  3. Wykonaj test antagonizmu.
    1. Aktywuj izolaty zgodnie z opisem w kroku 2.3.1.
    2. Zaszczepiaj jeden szczep na raz wzdłuż środka płytek zawierających podłoże agarowe, a pozostałe prostopadłe do środkowej. Powtarzaj, aż każdy wybrany szczep drobnoustrojów zostanie przetestowany pod kątem wszystkich innych.
    3. Inkubować płytki w temperaturze 24−28 °C i monitorować je codziennie, aby zaobserwować potencjalne halo wskazujące na aktywność antagonistyczną. Jeśli zaobserwuje się aureole wskazujące na antagonistyczną aktywność między dwoma szczepami, jeden z nich powinien zostać wykluczony.
  4. Wykonaj montaż konsorcjum.
    1. Aktywuj izolaty zgodnie z opisem w kroku 2.3.1.
    2. Granulować komórki o masie 3 500 x g i delikatnie umyć je 2x w równej objętości roztworu soli fizjologicznej. Ponownie zawiesić komórki w równej objętości (tj. jeśli końcowa objętość wynosiła 2 ml komórek, przemyj je 2 ml roztworu soli fizjologicznej i ponownie zawieś w końcowej objętości 2 ml).
    3. Zaszczepić 1 ml kultury w 100 ml 3% Pożywki NaCl LB i inkubować ON w temperaturze 150 x g.
    4. Powtórzyć krok 4.5.2, zaszczepić 100 ml wyhodowanych, umytych i ponownie zawieszonych kultur w 10 litrowych kulturach. Inkubować ON w sterylnych bioreaktorach z podnośnikiem powietrznym, otrzymując przefiltrowane powietrze z pompy. Jeśli potrzebna jest większa liczba kultur, zawsze zaszczepiaj 1% wyhodowanej kultury w świeżej pożywce.
    5. Odwirować wyhodowane kultury w temperaturze 8 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu odrzucić sklarowany sklarant.
    6. Umyj granulkę, delikatnie zawieszając komórki w 500 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
    7. Powtórz kroki 4.5.5 i 4.5.6.
    8. Ponownie zawiesić każdą pojedynczą hodowlę w 100 ml roztworu soli i zmierzyć OD, aby oszacować liczbę komórek.
    9. Obliczyć objętość każdej kultury niezbędną do osiągnięcia końcowego stężenia 10-7 komórek mL-1.
    10. Wykonaj obliczenia CFU na multimediach w celu ostatecznego potwierdzenia żywotności i stężenia komórek.
    11. Wymieszać równą objętość każdej kultury w sterylnych kolbach i podzielić konsorcjum na sterylne probówki o pojemności 50 ml.
    12. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu zaszczepienia.
      UWAGA: Przygotuj zespół konsorcjum tak świeży, jak to możliwe, aby zagwarantować, że ogniwa będą nadal żywotne. Alternatywnie, liczenie CFU można wykonać przed inokulacją. Aby stworzyć idealne konsorcjum, konieczne jest użycie izolatów o różnych i uzupełniających się zdolnościach metabolicznych. Zwykle do tworzenia konsorcjów używa się 6-10 izolatów, ale liczba ta będzie się różnić w zależności od cech i celów członków.

5. Wykrywanie przypuszczalnie korzystnych cech koralowców

  1. Aktywuj izolaty z zapasów glicerolu, rozrzucając je na płytkach agarowych LB i inkubując je w temperaturze 24−28 °C ON, aby uzyskać wzrost pojedynczych kolonii. Wybierz pojedynczą kolonię z płytek i zaszczep ją w 2 ml sterylnego podłoża LB. Umieścić probówkę zawierającą pożywkę LB nachyloną pod stałym mieszaniem (150 x g) w temperaturze 24−28 °C ON.
  2. Przeprowadzić ekstrakcję DNA w sposób opisany w punkcie 4.1 w celu wykrycia potencjalnie korzystnych genów metodą PCR.
    UWAGA: Warunki reakcji PCR i startery będą zależeć od docelowego genu. Metodologie badania charakterystyki BMC poszczególnych szczepów i wykrywania PCR pod kątem potencjalnie korzystnych genów opisano w tabeli 1.

Wyniki

Na podstawie opisanych tutaj metod, możliwe było wyizolowanie mikroorganizmów z różnych źródeł wody i guzków koralowców o domniemanych cechach BMC i zdolnych do degradacji różnych klas zanieczyszczeń (Rysunek 1). Korzystając z próbek wody pobranych w oczyszczalni ścieków, uzyskanych z CESA-UFRJ (Eksperymentalne Centrum Sanityzacji Środowiska Uniwersytetu Federalnego w Rio de Janeiro) i w oparciu o przedstawioną tutaj procedurę, wyizolowano 33 szczepy bakterii zdolne do rozkładu EE2 w końcowym stężeniu 5 mg / L (Rysunek 2A). Dodatkowo, korzystając z techniki selekcji bakterii rozkładających olej, wyizolowano 20 szczepów zdolnych do degradacji zarówno oWSF (Rysunek 2B), jak i oWIF (Rysunek 2C).

Przypuszczalne cechy BMC zostały przebadane na mikroorganizmach wyizolowanych z różnych gatunków koralowców w różnych warunkach. Wśród nich znaleziono szczep wykazujący silną aktywność antagonistyczną wobec patogenu koralowca Vibrio coralliilyticus (Ryc. 3A), szczepy zdolne do degradacji mocznika (Ryc. 3B), dobry producent katalazy (Ryc. 3C) oraz mikroorganizmy prezentujące potencjalnie korzystne geny (Ryc. 3D).

Stosując połączenie dwóch podejść (tj. bioremediacji i inokulacji BMC), możliwe było zabezpieczenie koralowców przed wpływem na działanie ropy. W tym celu konsorcjum bioremediatorów oleju pBMC, wyizolowanych z koralowca Mussismilia harttii, zostało zaszczepione na guzkach koralowców wystawionych na działanie 1% oleju w trilikatach21. Zabiegi poddane działaniu oleju wykazywały postępujący spadek Fv/Fm od czwartego dnia, osiągając wartości bliskie zeru w dziesiątym dniu. Zmienna fluorescencja/maksymalna fluorescencja (Fv/Fm) dostarczyła miary maksymalnej wydajności fotochemicznej fotosystemu II (PSII) zooksantelli, reprezentując pośredni pomiar zdrowia koralowców. Z drugiej strony, guzki koralowców obecne w akwariach zaszczepionych konsorcjum wykazały lepiej zachowaną zdolność fotochemiczną (Ryc. 4).

figure-results-1
Rysunek 1: Podsumowanie głównych etapów wyboru i montażu konsorcjum bioremediator-pBMC. Schemat etapów selekcji mikroorganizmów rozkładających zanieczyszczenia (w kolorze szarym) i końcowych etapów selekcji mikrobiologicznej konsorcjum (sekwencjonowanie DNA, krzywa wzrostu, test antagonizmu i montaż konsorcjum na czerwono). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wybór bakterii rozkładających zanieczyszczenia. (A) Izolaty bakteryjne rosnące na płytkach z minimalną ilością pożywki zawierającej EE2 jako jedyne źródło węgla. (B) Kolonie bakterii rosnące na minimalnych płytkach zawierających oWSF jako jedyne źródło węgla. (C) Kolonie bakterii rosnące na minimalnych płytkach zawierających oWIF jako jedyne źródło węgla. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Wykrywanie charakterystyki pBMC. (A) Plamki w trzech egzemplarzach szczepu wykazującego aktywność antagonistyczną wobec patogenu koralowca Vibrio coralliilyticus (w kolorze czarnym) i szczepu kontrolnego (w kolorze zielonym). (B) Szczepy rosnące na pożywkach zawierających mocznik jako jedyne źródło węgla. (C) Szczep wytwarzający katalazę (+) i zły szczep wytwarzający katalazę (-). (D) Przykład wykrywania genu nirK metodą PCR (tor 1 = drabinka 1 kb; tor 2 = ślepa kontrola ujemna ekstrakcji DNA; tor 3 = wykrywanie nirK; tor 4 = reakcje PCR bez matrycowego DNA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 4: Pomiary Fv/Fm nubbinów M. harttii przystosowanych do ciemności o godzinie 17:00, przy użyciu fluorometru chlorofilowego nurkującego PAM. Pomiary Fv/Fm w konsorcjum kontrolnym zabiegów, oleju i oleju z konsorcjum wykonywano w trzech egzemplarzach codziennie przez 10 dni. Pokazane jest odchylenie standardowe. Cechy wykresu zostały zmodyfikowane za zgodą poprzednich wyników21, dostępnych na https://www.nature.com/articles/srep18268 na licencji Creative Commons Attribution 4.0. Pełne warunki na http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział SZT.
MoamikroorganizmTechnika wykrywaniaOdwołania
Regulacja klimatu; jazda na rowerze; związki przeciwdrobnoustrojowe; zwiększenie ochrony antyoksydacyjnej komórek.Aspergillus sydowiiPCR w kierunku genu dddPRozdział 81
Pseudovibrio sp. P12Pożywka hodowlana z DMSPRozdział 82
Pseudoalteromonas sp.PCR dla genu dmdA33 Rozdział 33
Biologiczna regulacja patogenów.Mikrobiom ze śluzu Acropora palmataWyraźna strefa zahamowaniaRozdział 83
Ekstrakty z koralowcówTest zahamowania wzrostuRozdział 84
Marinobacter sp.Testy rojuRozdział 85
Pseudoalteromonas sp.Krzyżowanie się z płytką agarowąRozdział 86
Pseudoalteromonas sp.Metoda dyfuzji agarowej33 Rozdział 33
Korzyści dla procesu zwapnienia; źródło azotu dla koralowców skleraktynowych.Symbiodinium spp.Metoda kolorymetrycznaRozdział 87
Mikrobiom ze śluzu Stylophora pistillata___Rozdział 88
Mikrobiom z Acropora alciminataMetoda Bollanda i wsp.80Rozdział 89
Cykl azotowy; zwiększ wiązanie azotu.Społeczność mikrobiologicznaqPCR (badanie qPCR)90
Społeczność mikrobiologicznaMetoda PCR91
Społeczność mikrobiologicznaqPCR (badanie qPCR)Rozdział 92
Społeczność mikrobiologicznaDostosowana technika redukcji acetylenu (C2H2)93 Rozdział 93
Pseudoalteromonas sp. i Halomonas taeanensisMetoda PCR33 Rozdział 33
Cykl azotowy; spadek stężenia amonu.Pseudoalteromonas sp.Metoda PCR33 Rozdział 33
Mikrobiom z Tubastraea coccineaMetoda PCR94 Rozdział 94
Mikrobiom z Xestospongia testudinariaPredykcyjna analiza metagenomu95 Rozdział 95
Ochrona holobiontowa przed reaktywnymi formami tlenu (ROS).Pseudoalteromonas sp., Cobetia marina i Halomonas taeanensisTest katalazy33 Rozdział 33
Symbiodinium spp.Amplex czerwony96 Rozdział 96
Vibrio pelagius i Sync- chococcus sp.Metoda peroksydazy chrzanowo-skopoletynowej97 Rozdział 97
Vibrio fischeri (Vibrio fischeri)Wiele metodRozdział 98

Tabela 1: Wykrywanie przypuszczalnych cech BMC, mechanizm działania (MOA), zgłoszone mikroorganizmy prezentujące potencjał i technikę użytą do wykrycia cechy.

Dyskusja

W ciągu ostatnich 50 lat podejścia bioremediacyjne były szeroko badane. Na przykład ponad 200 mikroorganizmów wśród bakterii, sinic, mikroalg i grzybów w kilku różnych siedliskach zostało wyznaczonych jako zdolne do wskazania obecności i/lub degradacji węglowodorów ropopochodnych 62,63,64. Ponadto inne klasy związków, które mają wpływ na środowisko i ludzi, takie jak plastik, bisfenol A, substancje zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego i metale ciężkie, są celem rozwoju technik bioremediacji 65,66,67. Z drugiej strony, rozwój probiotyków morskich został ograniczony do dziedzin, które mają oczywisty wpływ na gospodarkę, takich jak probiotyki rybne w akwakulturze 68,69. Jednak izolacja i charakterystyka pożytecznych mikroorganizmów w celu ochrony raf koralowych, ekosystemów morskich, które wspierają rybołówstwo, turystykę i inne dochodowe działania, zaczynają być cenione15. W tym miejscu opisano tani, łatwy i dostępny protokół selekcji mikroorganizmów rozkładających zanieczyszczenia, które mogą również wykazywać potencjalnie korzystne cechy dla lokalnych ekosystemów morskich, zwłaszcza przypuszczalnie korzystne mikroorganizmy dla koralowców (pBMC).

Ponadto zaprezentowana tutaj metoda jest wysoce elastyczna w odniesieniu do kilku związków i różnych rodzajów źródeł mikrobiologicznych. Możliwe jest ukierunkowanie na różne zanieczyszczenia poprzez zastąpienie jedynego źródła węgla dodanego do minimalnej ilości mediów. W tym celu zamiast oleju lub EE2 należy dodać inne związki o pożądanym stężeniu. Byłaby to presja selekcyjna mająca na celu wyizolowanie degraderów docelowych zanieczyszczeń. Na przykład mikroorganizmy zdolne do rozkładu innych klas substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego zostały już wybrane i przetestowane przy użyciu tej samej metodyki70. Co więcej, jako źródła mikroorganizmów rozkładających można wykorzystać inne organizmy morskie i lądowe, takie jak gąbki i rośliny71,72, a także różne rodzaje próbek środowiskowych, takie jak gleba, paliwo i skały 25,73,74. Na przykład udało się wykryć i wyizolować bakterie rozkładające węglowodory z różnych próbek gleby i osadów 25,54,63,64,75. Wreszcie, dokonując niewielkich modyfikacji w pożywce, mikroorganizmy inne niż bakterie można łatwo wybrać jako drobnoustroje rozkładające. Na przykład zgłoszono szczep mikroalg zdolny do wydajnej degradacji związków estrogenowych.

Idealnie byłoby, gdyby konsorcja bioremediacyjno-probiotyczne były tworzone dla każdego konkretnego związku lub obszaru. Drobnoustroje, które rozwijają się w określonym środowisku, mogą nie rozwijać się tak dobrze w nowych miejscach w porównaniu z ich naturalnymi warunkami. Ponieważ naukowcy nie znaleźli produktu, który mógłby być skutecznie stosowany we wszystkich różnych warunkach środowiskowych, dla każdej konkretnej sytuacji należy organizować nowe konsorcja. Byłoby to podobne do medycyny spersonalizowanej w celu powrotu do zdrowia dostosowanego do środowiska. Z tego powodu utworzenie centralnego banku szczepów drobnoustrojów o potencjalnych właściwościach probiotycznych i zdolności do degradacji jest kluczowym krokiem dla postępu w tej dziedzinie. Inicjatywa ta pozwoliłaby zaoszczędzić czas i pracę, przyczyniając się do tworzenia nowych konkretnych konsorcjów na całym świecie.

Mikroorganizmy związane z koralowcami (tj. mikroalgi, bakterie, archeony, grzyby i wirusy) odgrywają złożoną i skomplikowaną rolę w utrzymaniu homeostazy gospodarza19. Stresory środowiskowe, takie jak zanieczyszczenie, mogą również destabilizować mikrobiom koralowców, powodując dysbiozę, która może powodować choroby i śmiertelność30. Mechanizmy, za pomocą których mikrobiom koralowców może wspierać zdrowie koralowców, zaczynają być ujawniane. Mechanizmy te są kluczem do zrozumienia odporności koralowców i odporności na stresory środowiskowe, a w konsekwencji do promowania trwałości i ochrony raf. Ponadto odkrycia w tej dziedzinie pomogą zrozumieć ogólne interakcje między gospodarzem a mikrobiomem, co może przyczynić się do opracowania lepszych probiotyków i strategii prozdrowotnych w innych obszarach. Ważne jest również, aby lepiej zbadać, w jaki sposób te szczepienia probiotykami mogą wpływać na zdrowie metaorganizmu podczas zdarzeń stresowych. Na przykład nadal potrzebne są prace wykazujące, że poprawa wydajności koralowców jest spowodowana probiotykami, a nie tylko koralowcami wykorzystującymi bakterie jako źródło pożywienia.

Równolegle ogromne znaczenie ma rozwój nowych podejść do realizacji zadań przez konsorcja i doskonalenie już istniejących. Alternatywne metody unieruchamiania konsorcjum, a także innowacyjne podejścia, takie jak inokulacja pokarmu koralowców (tj. artemii i wrotków) i wykorzystanie ich jako wektorów, są obiecujące. Te systemy dostarczania mogą być również modyfikowane w celu zwalczania innych organizmów morskich i będą miały zasadnicze znaczenie dla sukcesu w dziedzinie probiotyków morskich.

Ograniczanie zanieczyszczeń i trwałość raf koralowych to obecnie dwa główne tematy regularnie poruszane na konferencjach poświęconych ochronie środowiska. Agenda 2030, dokument opublikowany przez Organizację Narodów Zjednoczonych, który opisuje globalne cele, jakie społeczeństwo powinno osiągnąć, aby umożliwić zrównoważoną przyszłość, poświęca konkretne cele dla każdej kwestii. Podczas gdy cel 6 podkreśla znaczenie poprawy jakości wody poprzez zmniejszenie zanieczyszczenia, cel 14 wzmacnia znaczenie ochrony i zrównoważonego wykorzystania oceanów, mórz i zasobów morskich77. W tym kontekście ochrona raf koralowych zależy od zmian, które powinny zostać osiągnięte w najbliższej przyszłości, w tym od ograniczenia zanieczyszczeń. Ma to ogromne znaczenie, ponieważ do największych strat koralowców doszło, gdy do zdarzeń klimatycznych dodano inne czynniki, takie jak niszczenie lokalnych siedlisk i zanieczyszczenie78,79. W artykule tym wykazano, że możliwe jest połączenie bioremediacji i inokulacji pBMC w celu degradacji określonych zanieczyszczeń, przy jednoczesnym zwiększeniu odporności i odporności koralowców na zanieczyszczenia i inne problemy. Optymalizacja istniejących protokołów i/lub opracowanie innowacyjnych metod, połączonych lub stosowanych niezależnie, będzie miało kluczowe znaczenie dla określenia przyszłości ekosystemów morskich.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało przeprowadzone w połączeniu z trwającym projektem badawczo-rozwojowym zarejestrowanym jako ANP 21005-4, "PROBIO-DEEP - Survey of potential impacts caused by oil and gas exploration on deep-sea marine holobionts and selection of potential bioindicators and bioremediation processes for these ecosystems" (UFRJ / Shell Brasil / ANP) - "PROBIO-DEEP - Levantamento de potenciais impactos causados pela exploração de óleo e gá s em holobiontes marinhos em mar profundo e seleção de potenciais bioindicadores e processos biorremediadores para esses ecossistemas", sponsorowany przez Shell Brasil w ramach opłaty badawczo-rozwojowej ANP jako "Compromisso de Investimentos com Pesquisa e Desenvolvimento. Autorzy dziękują również Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) oraz Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) za wsparcie finansowe oraz Camili Messias, Phillipe Rosado i Henrique Fragoso dos Santos za udostępnione zdjęcia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Butelka do przechowywania mediów PYREX o pojemności 500 mlthomas scientific/Corning1743E20/1395-500Służy do pobierania próbek wody.
Butelki z aspiratorem 500 mlthomas scientific/Corning1234B28/1220-2XSłuży do oddzielania frakcji oleju.
6-calowe szczypce do cięcia drututhomas scientific/Restek1173Y64/23033Służy do cięcia fragmentów koralowców.
17a-etynyloestradiolLGC WzorceDRE-C13245100Używany jako jedyne źródło węgla do produkcji pożywek selektywnych.
AgarHimediaPCT0901-1KGSłuży do wytwarzania pożywek stałych.
Bushnell Haas BrothHimediaM350-500GStosowany jako minimalna pożywka, która ma być uzupełniona źródłami węgla.
Kolba Erlenmeyerathomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble)4882H35/26500-125Służy do inkubacji maceratu koralowego ze szklanymi kulkami.
Zestaw do oczyszczania DNA i opaski żelowej GFX PCRHealthcare28903470Służy do oczyszczania produktów PCR przed wysłaniem ich do sekwencjonowania.
Koraliki szklaneMP Biomedicals1177Q81/07DP1070Służy do oddzielania mikroorganizmów od struktur koralowców.
z przepływem laminarnymPotrzebny do pracy w sterylnych warunkach.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth)HimediaM1245-1KGStosowany jako bogate podłoże do hodowli bakterii.
Agar morski 2216 (Zobell Marine Agar)HimediaM384-500GStosowany jako bogate podłoże do hodowli bakterii.
wytrząsarką orbitalnąSłuży do inkubacji płynnych pożywek i oleju.
InkubatorSłuży do inkubacji płytek.
Moździerz i tłuczek porcelanowyThomas scientific/United Scientific Supplies1201U69/JMD150Służy do maceracji fragmentów koralowców.
Qubit 2.0 FluorometrInvitrogenSłuży do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych DNA i produktów PCR.
WirówkaSłuży do wirowania kultur bakterii.
SpektrofotometrSłuży do pomiaru gęstości optycznej kultur bakteryjnych.
Zestaw do oczyszczania genomowego DNA WizardPromegaA1120Służy do ekstrakcji DNA szczepów drobnoustrojów.
GE Okap Inkubator z płytkowy z chłodzeniem

Bibliografia

  1. Durand, M., Grattan, J. Effects of volcanic air pollution on health. Lancet. 357, 164(2001).
  2. Ramaswami, A., Russell, A. G., Culligan, P. J., Sharma, K. R., Kumar, E. Meta-principles for developing smart, sustainable, and healthy cities. Science. 352, 940-943 (2016).
  3. Dökmeci, A. H., Yildiz, T., Ongen, A., Sivri, N. Heavy metal concentration in deepwater rose shrimp species (Parapenaeus longirostris, Lucas, 1846) collected from the Marmara Sea Coast in Tekirdağ. Environmental Monitoring and Assessment. 186, 2449-2454 (2014).
  4. Skaare, J. U., et al. Ecological risk assessment of persistent organic pollutants in the arctic. Toxicology. 181-182, 193-197 (2002).
  5. Garstang, W. The impoverishment of the sea. A critical summary of the experimental and statistical evidence bearing upon the alleged depletion of the trawling grounds. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 6, 1-69 (1900).
  6. Korajkic, A., Brownell, M. J., Harwood, V. J. Investigation of human sewage pollution and pathogen analysis at Florida Gulf coast beaches. Journal of Applied Microbiology. 110, 174-183 (2011).
  7. Liu, J., Yang, W. Water sustainability for China and beyond. Science. 337, 649-650 (2012).
  8. Eriksen, M., et al. Plastic pollution in the world’s oceans: more than 5 trillion plastic pieces weighing over 250,000 tons afloat at sea. PLoS One. 9, 111913(2014).
  9. Vilela, C. L. S., Bassin, J. P., Peixoto, R. S. Water contamination by endocrine disruptors: Impacts, microbiological aspects and trends for environmental protection. Environmental Pollution. 235, 546-559 (2018).
  10. Ueno, D., et al. Global pollution monitoring of PCBs and organochlorine pesticides using skipjack tuna as a bioindicator. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 45, 378-389 (2003).
  11. Villela, H. D. M., Peixoto, R. S., Soriano, A. U., do Carmo, F. L. Microbial bioremediation of oil contaminated seawater: A survey of patent deposits and the characterization of the top genera applied. Science of the Total Environment. 666, 743-758 (2019).
  12. Rabalais, N. N., et al. Eutrophication-driven deoxygenation in the coastal ocean. Oceanography. 27, 172-183 (2014).
  13. Calmet, D. P. Ocean disposal of radioactive waste. Status report. IAEA Bulletin. 31, 47-50 (1989).
  14. Swart, P. K. Coral Reefs: Canaries of the Sea, Rainforests of the oceans. Nature Education Knowledge. 4, 5(2013).
  15. National Academies of Sciences and Medicine, E. A Research Review of Interventions to Increase the Persistence and Resilience of Coral Reefs. , The National Academies Press. Washington, D.C. (2019).
  16. Béné, C., et al. Feeding 9 billion by 2050-Putting fish back on the menu. Food Security. 7, 261-274 (2015).
  17. Hughes, T. P., et al. Global warming and recurrent mass bleaching of corals. Nature. 543, 373(2017).
  18. Hughes, T. P., et al. Spatial and temporal patterns of mass bleaching of corals in the Anthropocene. Science. 359, 80-83 (2018).
  19. Rosenberg, E., Koren, O., Reshef, L., Efrony, R., Zilber-Rosenberg, I. The role of microorganisms in coral health, disease and evolution. Nature Reviews Microbiology. 5, 355(2007).
  20. Shaver, E. C., Burkepile, D. E., Silliman, B. R. Local management actions can increase coral resilience to thermally-induced bleaching. Nature Ecology & Evolution. 2, 1075-1079 (2018).
  21. Santos, H., et al. Impact of oil spills on coral reefs can be reduced by bioremediation using probiotic microbiota. Scientific Reports. 5, 18268(2015).
  22. Whitman, W. B. Bacteria and the fate of estrogen in the environment. Cell Chemical Biology. 24, 652-653 (2017).
  23. DeLeo, D. M., Ruiz-Ramos, D. V., Baums, I. B., Cordes, E. E. Response of deep-water corals to oil and chemical dispersant exposure. Deep-Sea Research. Part II Topical Studies in oceanography. 129, 129-147 (2016).
  24. Zinicovscaia, I., Cepoi, L. Cyanobacteria for bioremediation of wastewaters. , Springer. Berlin, Germany. (2016).
  25. Cury, J. C., et al. Microbial diversity and hydrocarbon depletion in low and high diesel-polluted soil samples from Keller Peninsula, South Shetland Islands. Antarctic Science. 27, 263-273 (2015).
  26. Sinha, R. K., Valani, D., Sinha, S., Singh, S., Herat, S. Bioremediation of contaminated sites: a low-cost nature’s biotechnology for environmental clean up by versatile microbes, plants, earthworms. Solid Waste Management and Environmental Remediation. , 971-978 (2009).
  27. Maila, M. P., Cloete, T. E. Bioremediation of petroleum hydrocarbons through landfarming: Are simplicity and cost-effectiveness the only advantages. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 3, 349-360 (2004).
  28. Madsen, K., et al. Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function. Gastroenterology. 121, 580-591 (2001).
  29. Saleem, M., Arshad, M., Hussain, S., Bhatti, A. S. Perspective of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) containing ACC deaminase in stress agriculture. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 34, 635-648 (2007).
  30. Sweet, M. J., Bulling, M. T. On the importance of the microbiome and pathobiome in coral health and disease. Frontiers in Marine Science. 4, 9(2017).
  31. Reshef, L., Koren, O., Loya, Y., Zilber-Rosenberg, I., Rosenberg, E. The coral probiotic hypothesis. Environmental Microbiology. 8, 2068-2073 (2006).
  32. Peixoto, R., Rosado, P. M., Leite, D. C. deA., Rosado, A. S., Bourne, D. G. Beneficial Microorganisms for Corals (BMC): Proposed Mechanisms for Coral Health and Resilience. Frontiers in Microbiology. 8, 341(2017).
  33. Rosado, P., et al. Marine probiotics: increasing coral resistance to bleaching through microbiome manipulation. The The ISME Journal. 13, 921-936 (2019).
  34. Heberer, T., Reddersen, K., Mechlinski, A. From municipal sewage to drinking water: fate and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment in urban areas. Water Science and Technology. 46, 81-88 (2002).
  35. Barel-Cohen, K., et al. Monitoring of natural and synthetic hormones in a polluted river. Journal of Environmental Management. 78, 16-23 (2006).
  36. Balest, L., Mascolo, G., Di Iaconi, C., Lopez, A. Removal of endocrine disrupter compounds from municipal wastewater by an innovative biological technology. Water Science and Technology. 58, 953-956 (2008).
  37. Liu, Z., Kanjo, Y., Mizutani, S. A review of phytoestrogens: Their occurrence and fate in the environment. Water Research. 44, 567-577 (2010).
  38. Chapman, H. F., et al. A national approach to health risk assessment, risk communication and management of chemical hazards from recycled water. Waterlines. 48, (2011).
  39. Rocha, M. J., Cruzeiro, C., Ferreira, C., Rocha, E. occurrence of endocrine disruptor compounds in the estuary of the Iberian Douro River and nearby Porto Coast (NW Portugal). Toxicological and Environmental Chemistry. 94, 252-261 (2012).
  40. Nie, M., et al. Environmental estrogens in a drinking water reservoir area in Shanghai: occurrence, colloidal contribution and risk assessment. Science of the Total Environment. 487, 785-791 (2014).
  41. Ribeiro, C., Ribeiro, A. R., Tiritan, M. E. Priority substances and emerging organic pollutants in Portuguese aquatic environment: a review. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 238, 1-44 (2016).
  42. Wu, C., Huang, X., Lin, J., Liu, J. Occurrence and fate of selected endocrine-disrupting chemicals in water and sediment from an urban lake. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 68, 225-236 (2015).
  43. Shi, W., Wang, L., Rousseau, D. P. L., Lens, P. N. L. Removal of estrone, 17α-ethinylestradiol, and 17ß-estradiol in algae and duckweed-based wastewater treatment systems. Environmental Science and Pollution Research. 17, 824-833 (2010).
  44. Ternes, T., Bonerz, M., Schmidt, T. Determination of neutral pharmaceuticals in wastewater and rivers by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 938, 175-185 (2001).
  45. Ternes, T. A., Andersen, H., Gilberg, D., Bonerz, M. Determination of estrogens in sludge and sediments by liquid extraction and GC/MS/MS. Analytical Chemistry. 74, 3498-3504 (2002).
  46. Tarrant, A. M., Atkinson, M. J., Atkinson, S. Effects of steroidal estrogens on coral growth and reproduction. Marine Ecology Progress Series. 269, 121-129 (2004).
  47. Atkinson, S., Atkinson, M. J., Tarrant, A. M. Estrogens from sewage in coastal marine environments. Environmental Health Perspectives. 111, 531-535 (2003).
  48. Schoenmakers, H. J. N., Van Bohemen, C. G., Dieleman, S. J. Effects of Oestradiol-17 β on the Ovaries of the Starfish Asterias rubens. Development Growth and Differentiation. 23, 125-135 (1981).
  49. Sarojini, R., Jayalakshmi, K., Sambashivarao, S. Effect of external steroids on ovarian development in freshwater prawn, Macrobrachium lamerrii. Journal of Advanced Zoology. 7, 50(1986).
  50. Hathaway, R. R., Black, R. E. Interconversions of estrogens and related developmental effects in sand dollar eggs. General and Comparative Endocrinology. 12, 1-11 (1969).
  51. Ghosh, D., Ray, A. K. Subcellular action of estradiol-17β in a freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. General and Comparative Endocrinology. 90, 274-281 (1993).
  52. Aris, A. Z., Shamsuddin, A. S., Praveena, S. M. occurrence of 17α-ethynylestradiol (EE2) in the environment and effect on exposed biota: a review. Environment International. 69, 104-119 (2014).
  53. International Energy Agency. Key World Energy Statistics (KWES). , (2018).
  54. Carmo, F. L., et al. Bacterial structure and characterization of plant growth promoting and oil degrading bacteria from the rhizospheres of mangrove plants. Journal of Microbiology. 49, 535-543 (2011).
  55. Piatt, J. F., Lensink, C. J., Butler, W., Kendziorek, M., Nysewander, D. R. Immediate impact of the'Exxon Valdez'oil spill on marine birds. The Auk. 107 (2), 387-397 (1990).
  56. White, H. K., et al. Impact of the Deepwater Horizon oil spill on a deep-water coral community in the Gulf of Mexico. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20303-20308 (2012).
  57. Abdel-Shafy, H. I., Mansour, M. S. M. A review on polycyclic aromatic hydrocarbons: source, environmental impact, effect on human health and remediation. Egyptian Journal of Petroleum. 25, 107-123 (2016).
  58. Negri, A. P., Hoogenboom, M. O. Water contamination reduces the tolerance of coral larvae to thermal stress. PLoS One. 6, 19703(2011).
  59. Brown, E. J., Resnick, S. M., Rebstock, C., Luong, H. V., Lindstrom, J. UAF radiorespirometric protocol for assessing hydrocarbon mineralization potential in environmental samples. Biodegradation. 2, 121-127 (1991).
  60. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
  61. Vergin, K. L., et al. Screening of a Fosmid Library of Marine Environmental Genomic DNA Fragments Reveals Four Clones Related to Members of the Order Planctomycetales. Applied and Environmental Microbiology. 64 (8), 3075-3078 (1998).
  62. Yakimov, M. M., Timmis, K. N., Golyshin, P. N. Obligate oil-degrading marine bacteria. Current Opinion in Biotechnology. 18, 257-266 (2007).
  63. Santos, H. F., Cury, J. C., Carmo, F. L., Rosado, A. S., Peixoto, R. S. 18S rDNA sequences from microeukaryotes reveal oil indicators in mangrove sediment. PLoS One. 5, 12437(2010).
  64. Jurelevicius, D., Cotta, S. R., Peixoto, R., Rosado, A. S., Seldin, L. Distribution of alkane-degrading bacterial communities in soils from King George Island, Maritime Antarctic. European Journal of Soil Biology. 51, 37-44 (2012).
  65. Paço, A., et al. Biodegradation of polyethylene microplastics by the marine fungus Zalerion maritimum. Science of the Total Environment. 586, 10-15 (2017).
  66. Zhang, W., Yin, K., Chen, L. Bacteria-mediated bisphenol A degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97, 5681-5689 (2013).
  67. Gadd, G. M. Metals, minerals and microbes: geomicrobiology and bioremediation. Microbiology. 156, 609-643 (2010).
  68. Balcázar, J. L., et al. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology. 114, 173-186 (2006).
  69. Gatesoupe, F. J. The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture. 180, 147-165 (1999).
  70. Ren, Y. X., Nakano, K., Nomura, M., Chiba, N., Nishimura, O. Effects of bacterial activity on estrogen removal in nitrifying activated sludge. Water Research. 41, 3089-3096 (2007).
  71. Santos-Gandelman, J. F., Giambiagi-deMarval, M., Muricy, G., Barkay, T., Laport, M. S. Mercury and methylmercury detoxification potential by sponge-associated bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 106, 585-590 (2014).
  72. Yamaga, F., Washio, K., Morikawa, M. Sustainable biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoaceticus P23 isolated from the rhizosphere of duckweed Lemna aoukikusa. Environmental Science & Technology. 44, 6470-6474 (2010).
  73. Soriano, A. U., et al. Microbiological aspects of biodiesel and biodiesel/diesel blends biodeterioration. International Biodeterioration & Biodegradation. 99, 102-114 (2015).
  74. Da Cunha, C. D., Rosado, A. S., Sebastián, G. V., Seldin, L., Von der Weid, I. Oil biodegradation by Bacillus strains isolated from the rock of an oil reservoir located in a deep-water production basin in Brazil. Applied Microbiology and Biotechnology. 73, 949-959 (2006).
  75. Prantera, M. T., Drozdowicz, A., Leite, S. G., Rosado, A. S. Degradation of gasoline aromatic hydrocarbons by two N 2-fixing soil bacteria. Biotechnology Letters. 24, 85-89 (2002).
  76. Lai, K. M., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Biotransformation and bioconcentration of steroid estrogens by Chlorella vulgaris. Applied and Environmental Microbiology. 68, 859-864 (2002).
  77. United Nations. Transforming our World: The 2030 Agenda for Sustainable Development. , (2015).
  78. Bellwood, D. R., Hughes, T. P., Folke, C., Nyström, M. Confronting the coral reef crisis. Nature. 429, 827(2004).
  79. Pandolfi, J. M., et al. Global trajectories of the long-term decline of coral reef ecosystems. Science. 301, 955-958 (2003).
  80. Bolland, E. G., Cook, A. R., Turner, N. A. Urea as a sole source of nitrogen for plant growth. I. The development of urease activity in Spirodela oligorrhiza. Planta. 83, 1-12 (1968).
  81. Kirkwood, M., Todd, J. D., Rypien, K. L., Johnston, A. W. B. The opportunistic coral pathogen Aspergillus sydowii contains dddP and makes dimethyl sulfide from dimethylsulfoniopropionate. The ISME Journal. 4, 147-150 (2010).
  82. Raina, J., Tapiolas, D., Motti, C., Foret, S., Seemann, T. Isolation of an antimicrobial compound produced by bacteria associated with reef-building corals. Peer J. 4, 2275(2016).
  83. Ritchie, K. B. Regulation of microbial populations by coral surface mucus and mucus-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 322, 1-14 (2006).
  84. Gochfeld, D. J., Aeby, G. S. Antibacterial chemical defenses in Hawaiian corals provide possible protection from disease. Marine Ecology Progress Series. 362, 119-128 (2008).
  85. Alagely, A., Krediet, C. J., Ritchie, K. B., Teplitski, M. Signaling mediated cross-talk modulates swarming and biofilm formation in a coral pathogen Serratia marcescens. The ISME Journal. 5, 1609-1620 (2011).
  86. Kvennefors, E. C. E., et al. Regulation of bacterial communities through antimicrobial activity by the coral holobiont. Microbial Ecology. 63, 605-618 (2012).
  87. Biscere, T., et al. Enhancement of coral calcification via the interplay of nickel and urease. Aquatic Toxicology. 200, 247-256 (2018).
  88. Grover, R., Maguer, J., Allemand, D., Ferrier-Pages, C. Urea uptake by the scleractinian coral Stylophora pistillata. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 332, 216-225 (2006).
  89. Crossland, C. J., Barnes, D. J. The Role of Metabolic Nitrogen in Coral Calcification. Marine Biology. 28, 325-332 (1974).
  90. Olson, N. D., Ainsworth, T. D., Gates, R. D., Takabayashi, M. Diazotrophic bacteria associated with Hawaiian Montipora corals: diversity and abundance in correlation with symbiotic dinoflagellates. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 371, 140-146 (2009).
  91. Lema, K. A., Willis, B. L., Bourneb, D. G. Corals form characteristic associations with symbiotic nitrogen-fixing bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 78, 3136-3144 (2012).
  92. Santos, H. F., et al. Climate change affects key nitrogen-fixing bacterial populations on coral reefs. The ISME Journal. 8, 2272-2279 (2014).
  93. Cardini, U., et al. Functional significance of dinitrogen fixation in sustaining coral productivity under oligotrophic conditions. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282, 20152257(2015).
  94. Yang, S., Sun, W., Zhang, F., Li, Z. Phylogenetically diverse denitrifying and ammonia-oxidizing bacteria in corals Alcyonium gracillimum Tubastraea coccinea. Marine Biotechnology. 15, 540-551 (2013).
  95. de Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. M., Polonia, A. R. M., Gomes, N. C. M. Bacterial community composition and predicted functional ecology of sponges, sediment and seawater from the thousand islands reef complex, West Java, Indonesia. FEMS Microbiology Ecology. 91, (2015).
  96. Suggett, D. J., et al. Photosynthesis and production of hydrogen peroxide by Symbiodinium (Pyrrhophyta) phylotypes with different thermal tolerances. Journal of Phycology. 44, 948-956 (2008).
  97. Petasne, R. G., Zika, R. G. Hydrogen peroxide lifetimes in south Florida coastal and offshore waters. Marine Chemistry. 56, 215-225 (1997).
  98. McFall-Ngai, M. J. Consequences of evolving with bacterial symbionts: insights from the squid-Vibrio associations. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 30, 235-256 (1999).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Opracowywanie probiotyk wmikrobiom koralowc wdegradacja EE2degradacja olej wizolacja bakteriirozcie czenia seryjneprzesiewanie koloniipo ywki minimalneaktywno antagonistyczna

Powiązane artykuły