Standaryzacja nieletalnej metody charakterystyki stanu rozrodczego i rozwoju larwalnego małży słodkowodnych (Bivalvia: Unionida)

Summary

Ochrona małży słodkowodnych zależy od monitorowania wzorców i procesów reprodukcyjnych gatunków. Badanie to standaryzuje nieśmiertelny protokół pobierania próbek zawartości skrzeli, charakteryzowania rozwoju larwalnego i zapewnienia cyfrowego repozytorium zebranych danych. Ten pakiet protokołów i baz danych będzie ważnym narzędziem dla badaczy małży w odbudowie zagrożonych gatunków.

Abstract

Aktywne monitorowanie czasu, rozwoju i wzorców reprodukcyjnych zagrożonych gatunków jest kluczowe przy zarządzaniu odbudową populacji. Małże słodkowodne są jednymi z najbardziej zagrożonych organizmów na świecie, ale w przypadku wielu gatunków nadal brakuje informacji na temat wczesnego rozwoju larw (glochidiów) i okresów lęgowych. Wcześniejsze badania koncentrowały się na złożonym etapie historii życia, kiedy samice małży są gotowe do pasożytowania na rybach żywicielach, ale niewiele badań koncentrowało się na okresie lęgowym i czasie rozwoju larw. Opisany tutaj protokół pozwala naukowcom na nieśmiertelną ocenę stanu ciężkości samic małży. Wyniki tego badania pokazują, że metoda ta nie wpływa na zdolność samic małży do pozostawania w ciężarze lub ponownego stawania się ciężarem po pobraniu próbek. Zaletą tej metody może być jej stosowanie w przypadku gatunków zagrożonych wyginięciem lub zagrożonych wyginięciem lub innych populacji o wysokim stopniu ochrony. Protokół ten może być dostosowany do stosowania zarówno na osobnikach zakonserwowanych, jak i żywych i został przetestowany na różnych gatunkach małży. Udostępniona baza danych jest repozytorium szerokich informacji na temat czasu powstawania nawyków reprodukcyjnych i ułatwi przyszłe badania, ochronę i wysiłki na rzecz odbudowy małży słodkowodnych.

Introduction

Przetrwanie populacji w systemach słodkowodnych zależy od powodzenia reprodukcji i rekrutacji. W przypadku organizmów pasożytniczych identyfikacja zawiłości cyklu życiowego (np. etapów rozwoju larw i strategii przyciągania żywiciela) może dać wgląd w nawyki reprodukcyjne organizmu i krytyczne procesy, które wpływają na rekrutację. Takie informacje stają się ważne, gdy gatunki są zagrożone i potrzebna jest skuteczna rekrutacja do utrzymania pozostałych populacji lub jeśli odbudowa wymaga użycia rozmnażania w niewoli w celu odtworzenia wymarłych populacji.

Małże słodkowodne (Bivalvia: Unionida) są uważane za jedną z najbardziej zagrożonych grup organizmów na świecie, a zestawienie specyficznych dla danego gatunku nawyków reprodukcyjnych mogłoby pomóc w wysiłkach badawczych^1,2,3,4,5. Z ponad 800 obecnie uznanymi gatunkami rozmieszczonymi na całym świecie, małże słodkowodne mają punkty największej różnorodności w Ameryce Północnej i Południowej oraz południowo-wschodniej Azji, ale podstawowe informacje o historii życia są nieznane dla wielu gatunków^2,5,6,7. Rodziny w tym rzędzie charakteryzują się pasożytniczymi stadiami larwalnymi, które przechodzą metamorfozę w wolno żyjące młode osobniki podczas przyczepiania do żywiciela^7,8. Ten unikalny etap historii życia przyczynia się do różnorodności biologicznej w systemach słodkowodnych, które obecnie znajdują się w kryzysie⁹. Wysoki poziom zagrożenia można przypisać wielu zagrożeniom antropogenicznym, w tym zanieczyszczeniu dróg wodnych, zmianom i niszczeniu siedlisk, zmniejszeniu liczebności i różnorodności ryb żywicielskich oraz wprowadzeniu gatunków inwazyjnych^1,10. Jako filtry bentosowe, małże zakopują się w podłożu i są podatne na zanieczyszczenia i zanieczyszczenia, które spływają do zlewni¹¹. Odbudowa gatunków małży jest istotna, ponieważ zapewniają one szeroką gamę usług ekosystemowych, w tym sekwestrację dwutlenku węgla, źródło pożywienia i oczyszczanie wody przez filtrowanie przez karmienie¹¹. Ponadto stwierdzono, że małże wskazują na zdrowie ekosystemu, promują różnorodność biologiczną, a co za tym idzie, zwiększają odporność ekosystemu¹².

Wiele badań nad małżami słodkowodnymi skupiało się na badaniu wymagań wczesnej historii życia, aby lepiej informować o ocenie stanu gatunków i strategiach zarządzania. Rodziny małży słodkowodnych istotne dla tego badania (np. Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) mają unikalną strategię historii życia, w której samice wysiadują larwy (glochidia) w skrzelach torbaczy⁸. Za pomocą różnych strategii samica omułka wydala dojrzałe glochidia ze skrzeli torbaczy, aby pasożytować na żywicielu kręgowców za pomocą glochidia¹³. Badania nad rozwojem gałki żółtej w obrębie skrzeli zostały zmodyfikowane na podstawie techniki wykorzystującej strzykawki podskórne do pobierania próbek płynu gonadowego z żywych małży i oceny produkcji gamet^14,15,16. Gdy naukowcy zweryfikowali tę nieśmiertelną metodologię pobierania próbek gonad, została ona zaadaptowana do pobierania próbek skrzeli torbaczy w celu oceny rozwoju czerwiu^15,16. Rozwój lęgu może być wykorzystany do rozszyfrowania powiązań filogenetycznych, ponieważ niektóre gatunki małży mogą wysiadywać glochidia tylko w dwóch zewnętrznych skrzelach (ectobranchus), tylko w dwóch wewnętrznych skrzelach (endobranchus) lub we wszystkich czterech skrzelach (tetrabranchus), ale ta cecha nie jest znana dla każdego gatunku¹⁷. Wzorce lęgowe były wcześniej używane do klasyfikowania gatunków małży według tego, czy samice małży wysiadują glochidię zimą (brazytyczny), czy przez krótki okres w lecie (tachytyczny)¹⁸. Nadmierne zimowanie lęgów małży zostało potwierdzone badaniem cyklu rozrodczego Anodonta¹⁹. Jednak podstawowa biologia reprodukcyjna była badana dokładniej przez lata i odkryła, że ta dychotomia jest ogólnym uogólnieniem, a okresy lęgowe niektórych gatunków są znacznie bardziej złożone, niż pierwotnie zakładano^20,21. Na przykład zaobserwowano gatunki z rodzaju Hyridella (rodzina Hyriidae), Glebula i Elliptio (rodzina Unionidae) z ponad trzema lęgami w sezonie lęgowym^22,23,24. Złożoność nawyków reprodukcyjnych specyficznych dla gatunku, a czasem nawet dla populacji²⁰, doprowadziła do luki w wiedzy na temat czasu i czasu trwania lęgu oraz liczby lęgów, które samica małża może wyprodukować.

Chociaż strzykawki podskórne były używane do ekstrakcji zawartości skrzeli, raportowanie wyników jest skomplikowane ze względu na brak standaryzacji zapewniającej porównywalne wyniki we wszystkich badaniach. Wcześniej u Unionidae zidentyfikowano cztery etapy rozwojowe glochidii (tj. jajo, zarodek, niedojrzały, w pełni rozwinięty) ale nie zostały one przyjęte do standardowej procedury^16,25,26. Inne badania z udziałem przedstawicieli Margaritiferidae zastąpiły klasyfikację "niedojrzałych glochidii" klasyfikacją "rozwijających się glochidii", co prowadzi do potencjalnego zamieszania^27,28. Brak spójności w charakterystyce różnych etapów rozwoju larwalnego sprawił, że wielu badaczy ogólnie opisuje samice lęgowe jako "ciężarne", co nie obejmuje zawiłości rozwoju larw. Badania historii życia przeprowadzające próby z rybami żywicielami priorytetowo potraktowały zapotrzebowanie na ciężarne samice z w pełni rozwiniętymi glochidiami, ale informacje te są rozproszone w opublikowanej i nieopublikowanej literaturze^29,30. Obecnie brakuje danych na temat nawyków reprodukcyjnych wielu gatunków małży, w tym czasu przejścia między jajem, niedojrzałymi glochidiami i w pełni rozwiniętymi glochidiami gotowymi do przyczepienia się do żywicieli. W przypadku większości gatunków nie jest jasne, jak długo samice wysiadują glochidię i jak szybko w pełni rozwijają się zapłodnione jaja. Luki w wiedzy są często większe w przypadku gatunków budzących obawy o ochronę, co stwarza potrzebę ustandaryzowanej metody ekstrakcji zawartości skrzeli, która została przetestowana pod kątem skutków nieśmiertelnych i może być promowana w społeczności naukowej w celu uzupełnienia głównych metodologii gromadzenia danych, nie stanowiąc zagrożenia dla chronionych populacji^24,31,32.

To badanie miało trzy cele: 1) sformalizować technikę pobierania próbek skrzeli i przetestować ją pod kątem śmiertelnych i nieśmiertelnych skutków dla samic małży in situ, 2) scharakteryzować różne etapy rozwoju glochidialnego i opisać znormalizowaną metodę identyfikacji i raportowania różnych stadiów larwalnych, oraz 3) stworzyć publiczne repozytorium dla zebranych danych. Badania terenowe, długoterminowe projekty monitoringu i kolekcje muzealne stanowią szansę na wdrożenie opisanego tu protokołu i zebranie dodatkowych danych dla szerszego grona zainteresowań. Sformalizowany protokół zawiera wizualizacje i opisy postaci w celu rozróżnienia każdego etapu rozwoju larw. Poprzez standaryzację kategorii, zebrane wyniki można porównać między wszystkimi występowaniami i gatunkami. Po zebraniu danych wszystkie mogą zostać przesłane do Almanachu Grawitacji Małży Słodkowodnych (FMGA), który jest bazą danych zawierającą informacje o grawitacji zebrane przy użyciu tego protokołu. Produkt końcowy do przechowywania i kompilowania wszystkich zebranych informacji o grawitacji zapewni narzędzie badawcze, które ułatwi przyszłe badania, ochronę i wysiłki związane z odzyskiwaniem. Włączenie tej metodologii do różnych projektów dotyczących omułków i przedłożenie danych do FMGA poszerzyłoby zakres wiedzy na temat stanu ciężkości gatunków małży w ciągu roku. Ze względu na to, że jest to grupa organizmów wysoce zagrożonych, protokół ten i wynikająca z niego baza danych na temat zwyczajów reprodukcyjnych małży słodkowodnych mają zasadnicze znaczenie dla zrozumienia dynamiki populacji i ułatwienia ochrony tych gatunków.

Protocol

1. Kolekcja ciężarnych kobiet

UWAGA: Zapoznaj się z Protokołem Badania Małży Słodkowodnych Fish and Wildlife Service³³, aby uzyskać wskazówki, jak prawidłowo badać miejsce pobierania próbek pod kątem zagrożonych lub zagrożonych gatunków. Przed zbiorem terenowym gatunków chronionych należy uzyskać odpowiednie zezwolenia federalne oraz zezwolenia stanowe na wszystkie obecne gatunki.

1. Zbierz żywe małże z terenu za pomocą metod dotykowo-wizualnych (krok 1.2) lub wykorzystaj zachowane okazy z muzeum (krok 1.3).
   UWAGA: Ważne jest, aby żywe małże były chłodne i mokre po zebraniu, aby zapobiec wysuszeniu i zmniejszyć stres, a minimalne obchodzenie się z małżami ciężarnymi jest ważne, aby uniknąć przedwczesnego uwalniania zawartości skrzeli przez samice³⁴.
2. Oceń ciężarność samicy albo przez oględziny podczas zbierania (np. obecność przynęty płaszczowej, konglutynatów itp.), albo przez oględziny po zebraniu (np. delikatnie podważając zawory na tyle, aby zajrzeć do środka i zobaczyć, czy skrzela są napompowane, patrz Rysunek 1).
   UWAGA: Gatunki różnią się pod względem tego, jak glochidia są wysiadywane w skrzelach torbaczy, ponieważ czasami tylko dwa zewnętrzne skrzela (ectobranchus), tylko dwie wewnętrzne skrzela (endobranchus) lub wszystkie cztery skrzela (tetrageniczne) są torbacze¹⁷. W tym miejscu protokół można wstrzymać, a ciężarne samice mogą zostać przetransportowane z powrotem do laboratorium w celu pobrania próbek skrzeli.

Rysunek 1: Delikatnie podważające osoby otwierają. Aby sprawdzić ciężarność żywego małża, delikatnie podważ zawory kciukami (A) lub ostrożnie użyj wziernika lub szczypiec wstecznych, aby podważyć zawory (B). Zapoznaj się z krokiem 2.3 w protokole, aby zapoznać się z ostrzeżeniami związanymi z tą metodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przeprowadź oględziny na zakonserwowanych próbkach, otwierając zawory i sprawdzając skrzela, aby ustalić, czy dana osoba jest ciężarną samicą (Rysunek 2).

Rycina 2: Jak rozpoznać ciężarną samicę. Skrzela torbacza samic małży wydają się napompowane, gdy samica jest ciężarna i wysiaduje. Zdjęcia A i C pokazują skrzela z perspektywy bocznej, podczas gdy zdjęcia B i D zapewniają widok brzuszny skrzeli. Czerwone ramki obrysowują skrzela, aby podkreślić różnice między samicą małża Lampsilis straminea gravid (A/B) i nieciężarną (C/D). Całkowita długość osobników wynosi 79 mm (A/B) i 88 mm (C/D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Próbkowanie zawartości skrzeli

UWAGA: Ten protokół może być dostosowany niezależnie od tego, czy pobieranie próbek odbywa się na żywych małżach w terenie i laboratorium, czy na zakonserwowanych próbkach.

1. Przygotuj 1,5 ml plastikowej probówki do pobierania mikrowirówek z około 1 ml sterylnej wody, jeśli zawartość skrzeli zostanie oceniona w ciągu 24 godzin od ekstrakcji³⁵ lub etanolu (EtOH), jeśli ocena próbki nie może nastąpić w ciągu 24 godzin od pobrania lub jeśli zawartość skrzeli pochodzi z próbki muzealnej zachowanej w EtOH. Jeśli glochidia jest przeznaczona do obrazowania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM), użyj 70% EtOH, a jeśli glochidia będzie używana do badań genetycznych, użyj niedenaturowanego 95% EtOH³⁶.
2. Usuń papierowe opakowanie na jedną sterylną igłę 20 G ze skośną końcówką na strzykawce o pojemności 10 ml. Odkręć nakrętkę, aby odsłonić igłę i przygotuj plastikową tubkę o pojemności 1,5 ml do zbierania zawartości skrzeli. Popchnąć uchwyt strzykawki całkowicie w dół, tak aby korek znalazł się na linii 0 ml/cm3.
   UWAGA: Przy każdym pobieraniu próbki zawartości skrzeli należy używać sterylnej strzykawki. Zużytą strzykawkę można wysterylizować w terenie, zanurzając końcówkę w 10% roztworze wybielacza, następnie przepłukując strzykawkę, napełniając ją 1 ml sterylnej wody i wciskając tłok z powrotem do 0 ml/cm3, a na koniec osuszając strzykawkę czystą szmatką.
3. Podnieś ciężarną samicę i delikatnie podważ oba zawory za pomocą końcówek kciuków.
   UWAGA: Uważaj, aby nie zaszkodzić zwierzęciu. Zbyt szerokie lub zbyt szybkie otwarcie zastawek może nadmiernie rozciągnąć mięśnie przywodzicieli i spowodować śmiertelność. Na tym etapie szczególnie narażone są okazy o cienkiej skorupie (np. gatunki Anodonta, Leptodea, Utterbackia itp.) oraz młode osobniki. Siłowe obchodzenie się z gatunkami o delikatnych skorupach może spowodować pęknięcie muszli i spowodować śmiertelność. W niektórych przypadkach ściskanie zwierząt o cienkiej skorupie z przedniego i tylnego brzegu muszli, patrząc na powierzchnię brzuszną, spowoduje lekkie wygięcie i rozwarcie skorupy, co pozwoli obserwować skrzela lub podważyć muszle i uniknąć uszkodzenia delikatnego brzegu muszli.
   UWAGA: Narzędzia mogą być używane do pomocy na tym etapie, ale mogą również powodować śmiertelność, jeśli nie są używane ostrożnie i należy ich unikać, gdy tylko jest to możliwe. Na przykład wziernik lub zmodyfikowany zestaw szczypiec do odwracania może być użyty, aby podważyć pojedynczą osobę, a klin może być użyty do podparcia zaworów. Przyrządy te mogą nie być konieczne, jeśli inna osoba jest dostępna do pomocy (np. jedna osoba trzyma zwierzę otwarte, podczas gdy inna manewruje strzykawką w celu ekstrakcji). Uszkodzenie lub oddzielenie tkanki płaszcza od okostnej może powodować deformacje wzrostu i śmiertelność³⁷; Dlatego tak ważne jest, aby unikać zerwania połączenia między tkanką płaszcza a zewnętrznym brzegiem skorupy.
4. Za pomocą końcówki igły strzykawki delikatnie wniknąć w pojedynczą rurkę z wodą napompowanego skrzela torbacza. Następnie delikatnie zgarnij zawartość skrzeli, używając ściętej końcówki igły.
   UWAGA: Zawartość skrzelowa ma zwykle mlecznobiałą konsystencję, która powinna być widoczna na ściętej końcówce igły.
   1. Umieścić zawartość strzykawki bezpośrednio na szalce Petriego, jeśli mikroskop jest łatwo dostępny. W przeciwnym razie przechowuj zawartość w plastikowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml z wyznaczonym płynem (patrz krok 2.1) do późniejszej oceny.
      UWAGA: Zminimalizuj zakłócenia i obchodzenie się z próbkami glochidii podczas transportu, aby uniknąć uszkodzeń i zmniejszenia żywotności^32,35.
5. Zapisz informacje na temat identyfikacji gatunku rodzaju, statusu ciężaru, długości samicy (mm), informacji o zbieraczu i danych kontaktowych, stanie, hrabstwie, drenażu, konkretnym miejscu zbierania, szerokości i długości geograficznej, niepowtarzalnym identyfikatorze próbki skrzeli, niepowtarzalnym identyfikatorze miejsca badania oraz dacie pobrania, jeśli pobrano zawartość skrzeli (Rysunek 3). Na każdym zbiorniku zbiorczym należy umieścić niepowtarzalny identyfikator, aby zapewnić dokładny zapis danych podczas transportu.
   1. Należy sfotografować zewnętrzną prawą zastawkę małża w celu potwierdzenia tożsamości i dołączyć probówkę oznaczoną niepowtarzalnym identyfikatorem czytelnym na zdjęciu. Opcjonalnie zbierz inne parametry abiotyczne i biotyczne, aby uzupełnić informacje o środowisku i społeczności, w której znaleziono małża (zobacz Rysunek 3 dla sugestii).

Rysunek 3: Przykład arkusza danych dotyczących ciężaru pola. Dokładne raportowanie danych jest konieczne, jeśli próbka skrzeli jest pobierana w celu uzyskania wiarygodnych informacji. Jest to przykład arkusza danych pola z minimalną liczbą pól i dodatkowymi parametrami abiotycznymi, które należy pobrać wraz z każdą próbką skrzeli. Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje, zobacz krok 4.1 w protokole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Laboratoryjna ocena zawartości skrzeli

1. Jeśli zawartość skrzeli znajduje się w probówce o pojemności 1,5 ml, przenieś ją na szalkę Petriego i napełnij dno naczynia wodą. Delikatnie obracaj szalkę Petriego okrężnymi ruchami, aby zebrać zawartość w środku szalki w celu uzyskania bardziej skoncentrowanego widoku próbki.
   UWAGA: Probówkę o pojemności 1.5 ml może być konieczne przepłukanie za pomocą butelki ze spryskiwaczem lub pipety do przenoszenia wypełnionej wodą, jeśli zawartość skrzeli przykleja się do ścianek probówki.
2. Umieścić szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym, aby ocenić próbkę. Jeśli to możliwe, należy wykonać fotografię próbki skrzeli pod mikroskopem i oznaczyć ją niepowtarzalnym identyfikatorem tej próbki.
   1. Zapisać wyniki, w których stwierdza się, jakie stadia rozwojowe są obecne w każdej próbce skrzeli. Użyj Rysunek 4 jako przewodnika do scharakteryzowania każdego etapu rozwoju. W niektórych przypadkach samice mogą być larwami wysiadującymi na wielu etapach rozwoju; W związku z tym należy podać każdy etap rozwoju zaobserwowany w danej próbce (np. "JAJO/DG/IMG/FDG"). Po ocenie zachowanych glochidii przejdź do sekcji 4. Jeśli zidentyfikowano w pełni rozwiniętą glochidię, a EtOH nie został użyty do konserwacji, przejdź do kroku 3.3.
      UWAGA: JAJKO, masy jajeczne; Dyrekcja Generalna ds. Rozwoju Glocidii; IMG, niedojrzałe glochidia; FDG, w pełni rozwinięta glochidia.

Ryc. 4: Reprezentacje różnych etapów rozwoju glochidii w skrzelach torbaczy. (A) Masy jajowe (EGG) mają błonę, która sprawia, że jaja zlepiają się ze sobą. Wewnątrz każdej błony jajowej znajduje się nieprzezroczysta kulista masa różnicujących się komórek. Nieprzezroczysta masa kulista może rozpaść się na wiele kulistych mas podczas wczesnego podziału komórki, ale nadal powinna być rejestrowana jako EGG, dopóki nie zostanie zaobserwowany wyraźny kształt małży. (B) Niedojrzałe glochidia (IMG) mają wyraźną dwuskorupową masę zawartą w błonie jajowej. (C) Rozwijające się glochidia (DG) mają wyraźny kształt małży, brak błony jajowej i niezorganizowaną tkankę wewnątrz, często rozmytą w wyglądzie. Rozwijające się glochidia (DG) nie reagują reaktywnie, gdy są wystawione na działanie NaCl i klasyfikowane jako "DG(T)" podczas rejestrowania danych. (D) W pełni rozwinięte glochidia (FDG) mają wyraźny kształt małży i oczywistą tkankę mięśniową przywodziciela, co pozwala glochidii na zamknięcie. W pełni rozwiniętą glochidię (FDG) często obserwuje się jako dwie otwarte zastawki po zakonserwowaniu. Dwa otwarte zawory zwykle zamykają się zatrzaskowo lub otwierają się i zamykają pod wpływem NaCl i są klasyfikowane jako "FDG(T)". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przeprowadź test chlorku sodu (NaCl) w celu dalszej oceny żywotności każdej w pełni rozwiniętej glochidii, dodając kryształ NaCl do podzbioru kropli próbki skrzeli³⁵. Żywotne glochidia zareagują na NaCl, zamykając swoje zawory z pozycji otwartej. Zgłaszać wszystkie glochidie badane pod wpływem soli, z oznaczeniem "(T)" na końcu oznaczenia, gdy rejestrowane są dane.
   UWAGA: W pełni rozwiniętą glochidię można również zaobserwować aktywne otwieranie i zamykanie bez ekspozycji na NaCl.

4. Zgłoś do bazy danych

1. Uzyskaj dostęp do strony internetowej FMGA (http://arcg.is/089uee), która została opracowana przy użyciu programów online^38,39,40. Na stronie FMGA znajduje się link do formularza wprowadzania danych na komputery stacjonarne oraz aplikacja do pobrania na urządzenia mobilne. Aplikacja mobilna umożliwia wprowadzanie danych w terenie i automatyczne georeferencje⁴¹.
   UWAGA: Kalendarz grawitacji i inne grafiki związane z wydarzeniami z historii życia gatunków małży słodkowodnych można również znaleźć na pulpicie nawigacyjnym FMGA.
   1. Użyj aplikacji mobilnej lub witryny na komputery, aby zarejestrować wyniki w formularzu wprowadzania danych, korzystając z menu rozwijanych i pól wprowadzania tekstu. W przypadku dużych, istniejących zestawów danych skontaktuj się z autorami, aby uzyskać arkusz kalkulacyjny szablonu. Wprowadź zarejestrowane dane pod odpowiednimi nagłówkami kolumn, pamiętając, że każdy rekord lub wiersz w arkuszu kalkulacyjnym reprezentuje obserwacje próbki skrzeli od jednej grawitej osoby.
   2. Prześlij wyniki, a zostaną one dodane do bazy danych FMGA po zatwierdzeniu przez administratora, który może skontaktować się z osobą zbierającą dane, aby uzyskać więcej szczegółów lub zdjęć.
      UWAGA: Po zweryfikowaniu i skompilowaniu danych w bazie danych FMGA wszystkie kalendarze grawitacji i inne interaktywne grafiki wyświetlane na pulpicie nawigacyjnym FMGA zostaną zaktualizowane.

Results

Ten protokół został zastosowany podczas badania typu capture-mark-recapture, które monitorowało społeczność małży słodkowodnych na odcinku 750 m² od Bruce Creek (hrabstwo Walton, Floryda) od stycznia 2015 do grudnia 2015. Pobieranie próbek w terenie zaplanowano co cztery tygodnie; jednak ze względu na zdarzenia związane z wysokim przepływem nie przeprowadzono pobierania próbek w kwietniu i wrześniu 2015 r. Agencje stanowe i federalne, w tym U.S. Geological Survey, U.S. Fish and Wildlife Service oraz Florida Fish and Wildlife Conservation Commission, pomagały w badaniach terenowych i pobieraniu próbek skrzeli. Każda ciężarna samica napotkana podczas badania została poddana pobraniu próbek zawartości skrzeli w terenie przy użyciu protokołu opisanego powyżej, oznaczona (patrz Tabela Materiałów) i umieszczona z powrotem w podłożu rzecznym. Próbki skrzeli przechowywano w 95% EtOH i przetransportowano do laboratorium Centrum Badań nad Mokradłami i Wodą U.S. Geological Survey w celu oceny zawartości skrzeli.

Oznaczając samice i odławiając je w miesięcznych odstępach czasu przez cały rok, oceniliśmy zarówno letalny, jak i nieśmiertelny wpływ protokołu pobierania próbek skrzeli na łącznie 90 osobników. Podczas tego badania odłowiono następujące siedem gatunków: Elliptio pullata (n = 5), Fusconaia burkei (n = 1), Hamiota australis (n = 19), Obovaria choctawensis (n = 1), Strophitus williamsi (n = 1), Villosa lienosa (n = 60) i Villosa vibex (n = 3). Nasze próbki obejmowały osobniki o długości całkowitej od 24 mm do 80 mm oraz dwa gatunki (F. burkei i H. australis) chronione przez amerykańską ustawę o gatunkach zagrożonych. Wszystkie dane wykorzystane w tym badaniu są publicznie dostępne. Udostępniliśmy dostęp do naszego zestawu danych w ScienceBase (https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)⁴².

Przeżywalność została oceniona na podstawie liczby osób, które zostały ponownie schwytane żywe po pobraniu próbki skrzeli. Podczas badania zaobserwowaliśmy wysoką przeżywalność (97%) z pewną śmiertelnością, która może być spowodowana drapieżnictwem, na co wskazują obserwacje na miejscu. Wyniki wykazały, że u około 51% osób (46 z 90) stwierdzono pozostawanie ciężaru między kolejnymi zdarzeniami pobierania próbek. Kolejne 10% osobników (9 z 90) stwierdzono w stanie ciężkim, schwytano ponownie bez ciężaru i ponownie stwierdzono ciężar. Około 39% osobników (35 z 90) w tym badaniu stwierdzono ciężar, pobrano próbkę skrzeli, ale po ponownym schwytaniu w ciągu roku, nigdy nie stwierdzono ich ciężaru po raz drugi. Wyniki wskazują, że opisany tutaj protokół nie jest ani letalny, ani subletalny i nie zakłóca w istotny sposób obecnego okresu lęgowego po pobraniu próbki ze skrzeli.

Chociaż wielkość próby w tym badaniu jest nierówna między gatunkami, wyniki tego badania podkreślają korzystne i praktyczne zastosowania tego protokołu. Kalendarz ciężaru V. lienosa ilustruje, że ciężarne samice wysiadujące FDG znajdowano prawie w każdym miesiącu roku z wyjątkiem sierpnia, kiedy znaleziono tylko samice wysiadujące jaja (Ryc. 5A). Samice H. australis zostały znalezione bez ciężaru (NG) w lipcu, sierpniu i grudniu. Większy odsetek samic wysiadywał FDG w styczniu i lutym, ale znaleziono je również w październiku i listopadzie (Ryc. 5B). Nie znaleziono osobników E. pullata wysiadujących FDG, chociaż samice wysiadywały jaja od maja do czerwca, a jedną ciężarną samicę (GFR) zarejestrowano w czerwcu (Ryc. 5C). Jedyna ciężarna samica F. burkei została znaleziona w czerwcu i ponownie schwytana w lipcu. Ten sam osobnik O. choctawensis został zebrany FDG w lutym i ponownie schwytany NG w lipcu. Znaleziono tylko jednego S. williamsi, który został schwytany trzy razy. Samica ta została znaleziona FDG w marcu, NG w maju, GFR w czerwcu, a EGG w sierpniu (Ryc. 5C). Ciężarne samice V. vibex wysiadujące FDG znaleziono między lutym a czerwcem (Ryc. 5C).

Rycina 5: Wyniki badania przeprowadzonego w Bruce Creek na Florydzie przedstawione w formie kalendarza ciężkości. (A) Kalendarz grawitacyjny dla schwytanych/odłowów Villosa lienosa. (B) Kalendarz ciężaru dla schwytanych/odłowionych Hamiota australis. (C) Kalendarze grawitacji dla wszystkich gatunków, od których pobrano mniej niż 10 próbek. Oś y zawiera skróty dla miesięcy styczeń (Ja), luty (F), marzec (Mr), maj (My), czerwiec (Jn), lipiec (Jl), sierpień (A), październik (O), listopad (N) i grudzień (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Znaczenie

Ochrona zagrożonych gatunków zależy od udanej rekrutacji w istniejących populacjach. W niektórych przypadkach może być konieczne sztuczne rozmnażanie w celu zwiększenia rekrutacji tych zagrożonych populacji. Wymaga to od naukowców informowania o czasie czynnego rozrodu każdego gatunku i ewentualnego stosowania różnych metodologii lub praktyk zarządzania w celu złagodzenia wpływu na rekrutację. Ze względu na to, że jesteśmy zagrożoną grupą organizmów, niezwykle ważne jest ustanowienie ustandaryzowanego i nieśmiercionośnego podejścia do badania nawyków reprodukcyjnych oraz zapewnienie platformy, na której można gromadzić i wizualizować dane w celu informowania społeczności naukowej o najbardziej aktualnych dostępnych informacjach. Badanie to zapewnia protokół krok po kroku, aby zapewnić podjęcie środków ostrożności, a zawartość skrzeli może być odpowiednio pobrana i oceniona z samic małży. Protokół ten został przetestowany pod kątem skutków śmiertelnych i nieletalnych, co pozwoliło badaczom i menedżerom na odpowiedzialne wdrożenie tej metodologii. Opracowaliśmy również zestaw narzędzi i aplikacji do zarządzania bazami danych, aby ułatwić kompilację informacji o ciężarze na publicznie dostępnym, przyjaznym dla użytkownika pulpicie nawigacyjnym. Badania nad epidemiologią, morfologią glochidii, historią życia, filogenetyką, rozmnażaniem i translokacjami mogą przynieść korzyści i wykorzystać to repozytorium informacji o ciężarności czasowej dla wszystkich gatunków małży słodkowodnych.

Samo to badanie potwierdziło wcześniejsze wyniki badań dotyczących nawyków reprodukcyjnych niektórych gatunków, ale także ujawniło nowe informacje na temat innych. Chociaż V. vibex został zebrany w mniejszej liczbie niż V. lienosa, podobieństwa między nimi można znaleźć na podstawie danych dotyczących grawitacji. Wydaje się, że oba gatunki Villosa wysiadują w pełni rozwinięte glochidia przez dużą część roku, co charakteryzuje je jako zimujący lęg. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami na innych gatunkach Villosa 43,44,45. Wyniki tego badania sugerują, że H. australis można znaleźć w stanie ciężarnym od października i zimującym do czerwca, z wyjątkiem tego, że w grudniu nie stwierdzono żadnych schwytanych osobników. Wcześniej opublikowane badanie zidentyfikowało kongener H. altilis z okresem ciąży wynoszącym cztery miesiące, od marca do czerwca^{, 46,47}. Odkrycie to ilustruje dłuższy okres ciąży niż wcześniej sądzono i ogólnie grupuje H. australis jako zimujący lęg. Ponieważ H. altilis i H. australis są gatunkami chronionymi federalnie, różne okresy lęgowe mogą mieć wpływ na decyzje dotyczące zarządzania w celu lepszej ochrony populacji w okresie aktywności reprodukcyjnej. Elliptio pullata stwierdzono w ciężarze EGG dopiero w maju i czerwcu, co odpowiada ich charakterystyce jako gatunku tachytycznego o bardzo krótkim okresie lęgowym 24,48,49,50. Ponieważ dane na temat gatunków Elliptio są opracowywane przy użyciu tego protokołu, szczegółowe informacje mogą sprawić, że wysiłki terenowe będą bardziej efektywne, gdy ukierunkowane są pewne etapy rozwoju glochidii, ponieważ glochidia występuje tylko przez kilka miesięcy w roku. Wnioskowanie na podstawie innych gatunków o mniejszych rozmiarach próby jest ograniczone, ale w miarę kompilowania danych do bazy danych, większe rozmiary próbek dadzą wgląd w zwyczaje reprodukcyjne dodatkowych gatunków małży.

Uwagi proceduralne

Wiadomo, że małże słodkowodne i ich glochidia są podatne na stresory antropogeniczne^10,35. Podczas kontroli grawitacji zawory małży mogą nie być łatwe do otwarcia, a nieostrożne forsowanie zaworów może spowodować niezamierzone obrażenia i spowodować stres lub śmiertelność. Niektóre gatunki o delikatnych skorupach (np. Anodonta, Leptodea, Utterbackia itp.) i mniejsze osobniki mogą mieć bardzo delikatne muszle i słabe mięśnie przywodzicieli, które mogą się łatwo łamać i rozdzierać. Pobieranie próbek skrzelowych można uznać za czynnik stresogenny, jeśli obchodzenie się z nimi nie odbywa się w sposób odpowiedzialny i ostrożny. Poprzednie badanie wykazało, że obchodzenie się z małżami i narażenie ich z powietrza w okresie aktywności rozrodczej może powodować różne stresy fizjologiczne, w tym przedwczesne uwalnianie zawartości skrzeli³⁴. Jednak badanie wykorzystujące podobną metodologię, jak opisana tutaj, wykazało, że obchodzenie się z ciężarnymi samicami małży podczas pobierania próbek skrzeli nie przerwało obecnego lęgu ani nie spowodowało przedwczesnego uwolnienia zarówno u krótko-, jak i długoterminowych gatunków lęgowych¹⁶. Ponadto podczas tego protokołu należy użyć sterylnej strzykawki, aby zapobiec niezamierzonej infekcji lub zanieczyszczeniu krzyżowemu podczas nakłuwania skrzeli wielu osób. Ponadto glochidia są delikatne, a lęgi mogą dojrzewać i być zestresowane, ale nie wydalane. Dojrzała glochidia w złym stanie zdrowia może spowodować, że mniej osób zareaguje na testy soli³⁵. Dokonując rozróżnienia między DG(T) i FDG(T), ważne jest, aby przeprowadzić test soli na dużej próbie, sporządzić notatki na temat obserwacji, aby dokładnie zidentyfikować różnice między DG i FDG glochidia przy użyciu opisów zawartych w tym badaniu. Przy zachowaniu odpowiedniej ostrożności minimalny stres wywołany tą procedurą może pozwolić samicom małży na kontynuowanie wylęgu w naturalny sposób i zmniejszyć wpływ na rekrutację w populacji.

Dodatkowe dane mogą być rejestrowane w celu uzupełnienia bazy danych i zapewnienia szerokiego kontekstu dla zwyczajów rozrodczych małży słodkowodnych. Zaobserwowano, że niektóre gatunki (np. gatunki Fusconaia) mają skrzela o różnych kolorach w zależności od etapu rozwoju glochidii⁵¹. Podczas wstępnej kontroli ciężaru samicy opis koloru skrzeli może zostać włączony do zgłaszanych danych, aby umożliwić przeprowadzenie przyszłych badań. Również w tym momencie protokołu naukowcy mogą zauważyć, czy wylęgająca się samica została znaleziona w wylęgającej się glochidii w dwóch zewnętrznych skrzelach (ectobranchus), dwóch wewnętrznych skrzelach (endobranchus), czy we wszystkich czterech skrzelach (tetragennych)¹⁷. Informacje te mogą zostać dodane do FMGA i pomóc w wypełnieniu luk w danych dotyczących wylęgu dla każdego badanego gatunku. Warunki środowiskowe, w szczególności temperaturę wody, mogą być zbierane i rejestrowane w terenie w celu bardziej kompleksowej obserwacji stanu grawitacji i czasu występowania gatunków w różnych zakresach równoleżnikowych. Badania pokazują, że parametry środowiskowe, takie jak temperatura, fotoperiod, natężenie przepływu i dostępność pokarmu, mogą indukować zdarzenia reprodukcyjne u małży słodkowodnych 52,53,54,55,56. Dodatkowe pola mogą być dodawane do bazy danych w miarę ich składania, aby wspierać przyszłe badania nad czynnikami abiotycznymi wpływającymi na grawitację. Modyfikacja chwytania-znaku-ponownego chwytania, wzorowana na naszym badaniu, może być również dodana do tego protokołu, co pozwoliłoby naukowcom monitorować nawyki reprodukcyjne określonego małża i ujawnić informacje o wielu lęgach rocznie.

Dokładność informacji w FMGA zależy od źródła. Na przykład błędna identyfikacja małży słodkowodnych jest powszechna ze względu na to, że wiele gatunków ma podobne cechy zewnętrzne, które utrudniają rozróżnienie gatunków⁵⁷. Próbka skrzeli od błędnie zidentyfikowanego osobnika może powodować zamieszanie i fałszywe informacje na temat okresu lęgowego gatunku. Jeśli pobierana jest próbka skrzeli, należy zrobić zdjęcia wnętrza obu zaworów (jeśli dana osoba nie żyje), na zewnątrz prawej zastawki oraz umbo (zawias, w którym łączą się dwie zastawki) i przesłać je wraz z danymi dotyczącymi grawitacji za pośrednictwem strony komputerowej lub aplikacji mobilnej. Mile widziane są również zdjęcia zawartości skrzeli. W formularzach zgłoszeniowych znajduje się rozwijane menu, w którym zbieracz może wskazać swój poziom pewności co do identyfikacji gatunków. Zanim zapis zostanie zatwierdzony, informacje te zostaną wzięte pod uwagę podczas sprawdzania identyfikacji kolektora pod kątem prawdopodobnego rozkładu itp. Ze względu na wysoki stopień wewnątrzgatunkowej zmienności morfologicznej u gatunków Unionidae, zachęca się do pobierania próbek tkanek i może być konieczne w celu ułatwienia identyfikacji molekularnej.

Implikacje na przyszłość

Jako metoda nieśmiercionośna, protokół ten może być stosowany zarówno do gatunków pospolitych, jak i zagrożonych. Kalendarze grawitacji dla zagrożonych gatunków mogą pomóc osobom zarządzającym ochroną przyrody zaangażowanym w prawodawstwo dotyczące zagrożonych gatunków i planowanie odbudowy, dostarczając informacji na temat okresów, w których gatunki są aktywne reprodukcyjnie. Agencje stanowe i federalne, które zarządzają zagrożonymi gatunkami, mogą lepiej doradzać w przydzielaniu zezwoleń na okresy, w których gatunek nie jest wrażliwy i nie rozmnaża się, a nawet ograniczyć odławianie ryb żywicielskich w czasie, gdy małże wysiadują w pełni rozwinięte glochidia. Ponadto badania terenowe mogą być ukierunkowane na gatunki w okresach nierozrodczych, aby zminimalizować wpływ na procesy rekrutacji. Publicznie dostępna baza danych FMGA stanowi narzędzie dla badaczy i kadry kierowniczej w celu uzyskania ważnych informacji na temat rozrodu dowolnych docelowych gatunków małży słodkowodnych. Baza danych uwypukli również luki w danych, zachęcając do dalszych badań nad specyficznymi dla danego gatunku wzorcami lęgowymi. Ponieważ zrozumienie wzorca reprodukcyjnego gatunku pozwala na podejmowanie odpowiednich decyzji dotyczących zarządzania, mamy nadzieję, że nasz protokół i baza danych ułatwią przyszłe badania, ochronę i odbudowę małży słodkowodnych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówki wirówkowe zatrzaskowe 1,5 ml	USA Scientific	1615-5510	Probówki zatrzaskowe są ważne w terenie, aby luźna nakrętka nie została zgubiona.
Igła 20 G na jednorazowej strzykawce 10 ml	Exelint International	26255	sterylna jednorazowa strzykawka 10 ml z igłą Model: 10 ml końcówka Luer Lock W / 20G X 1 1/2 "
Mikroskop preparacyjny	dowolny
długopis do znakowania	Fisher Scientific	13-379-4	Tego właśnie użyliśmy, ale wystarczy każdy marker, który może pisać na małych plastikowych rurkach. Ten jest dość etanolowy i wodoodporny.
Etanol klasy molekularnej	dowolny		dowolny Potrzebne do zachowania zawartości skrzeli. Niedenaturowane 95% jest potrzebne do prac genetycznych, 70% jest potrzebne do prac związanych z obrazowaniem SEM.
Papier			dowolny Potrzebne do zapisania informacji o pobranych próbkach.
Długopis/ołówek	dowolny		Jeśli jesteś w terenie, lepiej pisać ołówkiem na wodoodpornym papierze, aby się nie rozmazywał. Jeśli jesteś w muzeum/laboratorium, każde przybory do pisania są w porządku.
szalka Petriego	DWK Nauki Przyrodnicze (Kimble)	23000-9050	To jest to, czego używaliśmy, ale każda dostępna szalka Petriego jest w porządku. Przyjemniej jest mieć wyższe ściany na wypadek, gdyby zużyto zbyt dużo wody.
Chlorek sodu	dowolny		dowolny potrzebny do testu NaCl na reaktywne glochidie. Zachowane próbki tego nie wymagają.
Wziernik	dowolny		Potrzebne tylko wtedy, gdy potrzebujesz pomocy w otwieraniu zaworów żywego małża.
Sterylna woda		dowolna	Dodano do próbek skrzelowych, które należy ocenić pod kątem reaktywności w ciągu 24 godzin od pobrania.
Super klej	Gorilla	Gorilla super glue gel	Służy do nakładania znaczników i jest potrzebny tylko w przypadku przeprowadzania badania przechwytywania, znakowania i ponownego przechwytywania.
Tags:	Hallprint	FPN 8x4	Potrzebne tylko w przypadku przeprowadzania badania przechwytywania, znakowania i ponownego przechwytywania.
Pipeta transferowa	Thermo Scientific Samco	225	To jest to, czego używamy, ale każda pipeta transferowa lub butelka ze spryskiwaczem ma zastosowanie.
Pęseta	dowolna		Potrzebne do przenoszenia kryształów NaCl do testu soli. Zachowane próbki tego nie wymagają.
Wodoodporny papier	RainWriter	dowolny	Potrzebny tylko do wykonywania prac w terenie. Pozwala to na rejestrowanie informacji o każdej pojedynczej zawartości skrzeli, z której pobierana jest zawartość.
Drewniany pick			dowolny Potrzebny tylko wtedy, gdy potrzebujesz pomocy w otwieraniu zaworów żywego małża.