Artykuł metodologiczny

Standaryzacja nieletalnej metody charakterystyki stanu rozrodczego i rozwoju larwalnego małży słodkowodnych (Bivalvia: Unionida)

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60244

⸱

4 października 2019

 ,  , 
1Wetland and Aquatic Research Center, United States Geological Survey, 2Garcon Point Aquatic Research Center, Florida Fish and Wildlife Conservation Commission

W tym artykule

Podsumowanie

Ochrona małży słodkowodnych zależy od monitorowania wzorców i procesów reprodukcyjnych gatunków. Badanie to standaryzuje nieśmiertelny protokół pobierania próbek zawartości skrzeli, charakteryzowania rozwoju larwalnego i zapewnienia cyfrowego repozytorium zebranych danych. Ten pakiet protokołów i baz danych będzie ważnym narzędziem dla badaczy małży w odbudowie zagrożonych gatunków.

Streszczenie

Aktywne monitorowanie czasu, rozwoju i wzorców reprodukcyjnych zagrożonych gatunków jest kluczowe przy zarządzaniu odbudową populacji. Małże słodkowodne są jednymi z najbardziej zagrożonych organizmów na świecie, ale w przypadku wielu gatunków nadal brakuje informacji na temat wczesnego rozwoju larw (glochidiów) i okresów lęgowych. Wcześniejsze badania koncentrowały się na złożonym etapie historii życia, kiedy samice małży są gotowe do pasożytowania na rybach żywicielach, ale niewiele badań koncentrowało się na okresie lęgowym i czasie rozwoju larw. Opisany tutaj protokół pozwala naukowcom na nieśmiertelną ocenę stanu ciężkości samic małży. Wyniki tego badania pokazują, że metoda ta nie wpływa na zdolność samic małży do pozostawania w ciężarze lub ponownego stawania się ciężarem po pobraniu próbek. Zaletą tej metody może być jej stosowanie w przypadku gatunków zagrożonych wyginięciem lub zagrożonych wyginięciem lub innych populacji o wysokim stopniu ochrony. Protokół ten może być dostosowany do stosowania zarówno na osobnikach zakonserwowanych, jak i żywych i został przetestowany na różnych gatunkach małży. Udostępniona baza danych jest repozytorium szerokich informacji na temat czasu powstawania nawyków reprodukcyjnych i ułatwi przyszłe badania, ochronę i wysiłki na rzecz odbudowy małży słodkowodnych.

Wprowadzenie

Przetrwanie populacji w systemach słodkowodnych zależy od powodzenia reprodukcji i rekrutacji. W przypadku organizmów pasożytniczych identyfikacja zawiłości cyklu życiowego (np. etapów rozwoju larw i strategii przyciągania żywiciela) może dać wgląd w nawyki reprodukcyjne organizmu i krytyczne procesy, które wpływają na rekrutację. Takie informacje stają się ważne, gdy gatunki są zagrożone i potrzebna jest skuteczna rekrutacja do utrzymania pozostałych populacji lub jeśli odbudowa wymaga użycia rozmnażania w niewoli w celu odtworzenia wymarłych populacji.

Małże słodkowodne (Bivalvia: Unionida) są uważane za jedną z najbardziej zagrożonych grup organizmów na świecie, a zestawienie specyficznych dla danego gatunku nawyków reprodukcyjnych mogłoby pomóc w wysiłkach badawczych1,2,3,4,5. Z ponad 800 obecnie uznanymi gatunkami rozmieszczonymi na całym świecie, małże słodkowodne mają punkty największej różnorodności w Ameryce Północnej i Południowej oraz południowo-wschodniej Azji, ale podstawowe informacje o historii życia są nieznane dla wielu gatunków2,5,6,7. Rodziny w tym rzędzie charakteryzują się pasożytniczymi stadiami larwalnymi, które przechodzą metamorfozę w wolno żyjące młode osobniki podczas przyczepiania do żywiciela7,8. Ten unikalny etap historii życia przyczynia się do różnorodności biologicznej w systemach słodkowodnych, które obecnie znajdują się w kryzysie9. Wysoki poziom zagrożenia można przypisać wielu zagrożeniom antropogenicznym, w tym zanieczyszczeniu dróg wodnych, zmianom i niszczeniu siedlisk, zmniejszeniu liczebności i różnorodności ryb żywicielskich oraz wprowadzeniu gatunków inwazyjnych1,10. Jako filtry bentosowe, małże zakopują się w podłożu i są podatne na zanieczyszczenia i zanieczyszczenia, które spływają do zlewni11. Odbudowa gatunków małży jest istotna, ponieważ zapewniają one szeroką gamę usług ekosystemowych, w tym sekwestrację dwutlenku węgla, źródło pożywienia i oczyszczanie wody przez filtrowanie przez karmienie11. Ponadto stwierdzono, że małże wskazują na zdrowie ekosystemu, promują różnorodność biologiczną, a co za tym idzie, zwiększają odporność ekosystemu12.

Wiele badań nad małżami słodkowodnymi skupiało się na badaniu wymagań wczesnej historii życia, aby lepiej informować o ocenie stanu gatunków i strategiach zarządzania. Rodziny małży słodkowodnych istotne dla tego badania (np. Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) mają unikalną strategię historii życia, w której samice wysiadują larwy (glochidia) w skrzelach torbaczy8. Za pomocą różnych strategii samica omułka wydala dojrzałe glochidia ze skrzeli torbaczy, aby pasożytować na żywicielu kręgowców za pomocą glochidia13. Badania nad rozwojem gałki żółtej w obrębie skrzeli zostały zmodyfikowane na podstawie techniki wykorzystującej strzykawki podskórne do pobierania próbek płynu gonadowego z żywych małży i oceny produkcji gamet14,15,16. Gdy naukowcy zweryfikowali tę nieśmiertelną metodologię pobierania próbek gonad, została ona zaadaptowana do pobierania próbek skrzeli torbaczy w celu oceny rozwoju czerwiu15,16. Rozwój lęgu może być wykorzystany do rozszyfrowania powiązań filogenetycznych, ponieważ niektóre gatunki małży mogą wysiadywać glochidia tylko w dwóch zewnętrznych skrzelach (ectobranchus), tylko w dwóch wewnętrznych skrzelach (endobranchus) lub we wszystkich czterech skrzelach (tetrabranchus), ale ta cecha nie jest znana dla każdego gatunku17. Wzorce lęgowe były wcześniej używane do klasyfikowania gatunków małży według tego, czy samice małży wysiadują glochidię zimą (brazytyczny), czy przez krótki okres w lecie (tachytyczny)18. Nadmierne zimowanie lęgów małży zostało potwierdzone badaniem cyklu rozrodczego Anodonta19. Jednak podstawowa biologia reprodukcyjna była badana dokładniej przez lata i odkryła, że ta dychotomia jest ogólnym uogólnieniem, a okresy lęgowe niektórych gatunków są znacznie bardziej złożone, niż pierwotnie zakładano20,21. Na przykład zaobserwowano gatunki z rodzaju Hyridella (rodzina Hyriidae), Glebula i Elliptio (rodzina Unionidae) z ponad trzema lęgami w sezonie lęgowym22,23,24. Złożoność nawyków reprodukcyjnych specyficznych dla gatunku, a czasem nawet dla populacji20, doprowadziła do luki w wiedzy na temat czasu i czasu trwania lęgu oraz liczby lęgów, które samica małża może wyprodukować.

Chociaż strzykawki podskórne były używane do ekstrakcji zawartości skrzeli, raportowanie wyników jest skomplikowane ze względu na brak standaryzacji zapewniającej porównywalne wyniki we wszystkich badaniach. Wcześniej u Unionidae zidentyfikowano cztery etapy rozwojowe glochidii (tj. jajo, zarodek, niedojrzały, w pełni rozwinięty) ale nie zostały one przyjęte do standardowej procedury16,25,26. Inne badania z udziałem przedstawicieli Margaritiferidae zastąpiły klasyfikację "niedojrzałych glochidii" klasyfikacją "rozwijających się glochidii", co prowadzi do potencjalnego zamieszania27,28. Brak spójności w charakterystyce różnych etapów rozwoju larwalnego sprawił, że wielu badaczy ogólnie opisuje samice lęgowe jako "ciężarne", co nie obejmuje zawiłości rozwoju larw. Badania historii życia przeprowadzające próby z rybami żywicielami priorytetowo potraktowały zapotrzebowanie na ciężarne samice z w pełni rozwiniętymi glochidiami, ale informacje te są rozproszone w opublikowanej i nieopublikowanej literaturze29,30. Obecnie brakuje danych na temat nawyków reprodukcyjnych wielu gatunków małży, w tym czasu przejścia między jajem, niedojrzałymi glochidiami i w pełni rozwiniętymi glochidiami gotowymi do przyczepienia się do żywicieli. W przypadku większości gatunków nie jest jasne, jak długo samice wysiadują glochidię i jak szybko w pełni rozwijają się zapłodnione jaja. Luki w wiedzy są często większe w przypadku gatunków budzących obawy o ochronę, co stwarza potrzebę ustandaryzowanej metody ekstrakcji zawartości skrzeli, która została przetestowana pod kątem skutków nieśmiertelnych i może być promowana w społeczności naukowej w celu uzupełnienia głównych metodologii gromadzenia danych, nie stanowiąc zagrożenia dla chronionych populacji24,31,32.

To badanie miało trzy cele: 1) sformalizować technikę pobierania próbek skrzeli i przetestować ją pod kątem śmiertelnych i nieśmiertelnych skutków dla samic małży in situ, 2) scharakteryzować różne etapy rozwoju glochidialnego i opisać znormalizowaną metodę identyfikacji i raportowania różnych stadiów larwalnych, oraz 3) stworzyć publiczne repozytorium dla zebranych danych. Badania terenowe, długoterminowe projekty monitoringu i kolekcje muzealne stanowią szansę na wdrożenie opisanego tu protokołu i zebranie dodatkowych danych dla szerszego grona zainteresowań. Sformalizowany protokół zawiera wizualizacje i opisy postaci w celu rozróżnienia każdego etapu rozwoju larw. Poprzez standaryzację kategorii, zebrane wyniki można porównać między wszystkimi występowaniami i gatunkami. Po zebraniu danych wszystkie mogą zostać przesłane do Almanachu Grawitacji Małży Słodkowodnych (FMGA), który jest bazą danych zawierającą informacje o grawitacji zebrane przy użyciu tego protokołu. Produkt końcowy do przechowywania i kompilowania wszystkich zebranych informacji o grawitacji zapewni narzędzie badawcze, które ułatwi przyszłe badania, ochronę i wysiłki związane z odzyskiwaniem. Włączenie tej metodologii do różnych projektów dotyczących omułków i przedłożenie danych do FMGA poszerzyłoby zakres wiedzy na temat stanu ciężkości gatunków małży w ciągu roku. Ze względu na to, że jest to grupa organizmów wysoce zagrożonych, protokół ten i wynikająca z niego baza danych na temat zwyczajów reprodukcyjnych małży słodkowodnych mają zasadnicze znaczenie dla zrozumienia dynamiki populacji i ułatwienia ochrony tych gatunków.

Protokół

1. Zbieranie ciężarnych samic

UWAGA: W celu uzyskania wytycznych dotyczących prawidłowego badania terenu próbkowania pod kątem występowania gatunków zagrożonych lub narażonych na wyginięcie, należy odnieść się do protokołu badań małży słodkowodnych (Freshwater Mussel Survey Protocol) Służby Ryb i Dzikiej Przyrody33. Przed rozpoczęciem zbierania w terenie gatunków chronionych należy uzyskać odpowiednie pozwolenia federalne, a w przypadku wszystkich występujących gatunków – pozwolenia stanowe.

  1. Zebrać żywe małże z terenu, stosując metody dotykowo-wzrokowe (krok 1.2), lub wykorzystać okazy zakonserwowane z muzeum (krok 1.3).
    UWAGA: Ważne jest, aby po zebraniu utrzymywać żywe małże w chłodzie i wilgoci, aby zapobiec ich wysychaniu i zmniejszyć stres; istotne jest również minimalne manipulowanie małżami w stanie grawidności, aby uniknąć przedwczesnego uwolnienia zawartości skrzeli przez samice34.
  2. Ocenić grawidność samic poprzez inspekcję wzrokową podczas zbioru (np. obecność przynęty płaszcza, konglutinatów itp.) lub poprzez inspekcję wzrokową po zbiorze (np. delikatne rozchylenie skrzydeł muszli na tyle, aby zajrzeć do środka i sprawdzić, czy skrzela są rozdęte, patrz Rysunek 1).
    UWAGA: Gatunki różnią się sposobem inkubacji glochidiów w skrzelach torbielowatych; czasami tylko dwa zewnętrzne skrzela (ektobranchus), tylko dwa wewnętrzne skrzela (endobranchus) lub wszystkie cztery skrzela (tetragenous) pełnią funkcję torby inkubacyjnej17. Protokół można w tym miejscu przerwać, a grawidne samice przetransportować do laboratorium w celu pobrania próbek skrzeli.

Proces renowacji małży; dłonie sprawdzające stan muszli małży w ramach badania terenowego.
Rycina 1: Delikatne otwieranie osobników.Aby sprawdzić stan zapłodnienia żywej małży, należy delikatnie rozchylić małżowiny kciukami (A) lub ostrożnie użyć wziernika bądź szczypiec odwróconych, aby otworzyć małżowiny (B). Należy zapoznać się z krokiem 2.3 protokołu w celu poznania środków ostrożności związanych z tą metodą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przeprowadź inspekcję wizualną zakonserwowanych okazów, otwierając małże i badając skrzela, aby ustalić, czy dany osobnik jest ciążną samicą (Rysunek 2).

Schemat anatomii małży, z zaznaczonymi strukturami wewnętrznymi, stosowany w analizach badań biologicznych.
Rycina 2: Sposób identyfikacji ciążnej samicy. Skrzela marsupialne samicy małża wydają się nadmuchane, gdy samica jest ciążna i wysiaduje potomstwo. Zdjęcia A i C przedstawiają skrzela z perspektywy bocznej, natomiast zdjęcia B i D przedstawiają widok brzuszny skrzeli. Czerwone ramki obrysowują skrzela, aby podkreślić różnice między samicą ciążną (A/B) a nieciążną (C/D) małża Lampsilis straminea. Całkowita długość osobników wynosi 79 mm (A/B) oraz 88 mm (C/D). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Pobieranie próbek zawartości skrzeli

UWAGA: Niniejszy protokół można dostosować w zależności od tego, czy pobieranie próbek odbywa się z żywych małży w terenie i laboratorium, czy z okazów utrwalonych.

  1. Przygotować plastikową probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL zawierającą około 1 mL sterylnej wody, jeśli zawartość skrzeli zostanie oceniona w ciągu 24 h od ekstrakcji35, lub etanolu (EtOH), jeśli ocena próbki nie może nastąpić w ciągu 24 h od pobrania lub jeśli zawartość skrzeli pochodzi z okazu muzealnego konserwowanego w EtOH. W przypadku przeznaczenia glochidi do obrazowania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) należy użyć 70% EtOH, a jeśli glochidie będą wykorzystane do testów genetycznych, należy użyć nienasyconego 95% EtOH36.
  2. Zdjąć papierowe opakowanie z jednej sterylnej igły 20 G ze ściętą końcówką osadzonej na strzykawce 10 mL. Odkręcić zatyczkę, aby odsłonić igłę, i przygotować plastikową probówkę 1.5 mL do pobrania zawartości skrzeli. Wcisnąć tłok strzykawki do końca, tak aby czarny zatwór znajdował się na linii 0 mL/cc.
    UWAGA: Przy każdym pobieraniu zawartości skrzeli należy używać sterylnej strzykawki. Używaną strzykawkę można wysterylizować w terenie, zanurzając końcówkę w 10% roztworze wybielacza, a następnie płucząc strzykawkę poprzez napełnienie jej 1 mL sterylnej wody i cofnięcie tłoka do 0 mL/cc, a na koniec osuszając strzykawkę czystą szmatką.
  3. Ująć ciążną samicę i delikatnie rozsunąć dwie małżowiny, używając opuszek kciuków.
    OSTRZEŻENIE: Należy uważać, aby nie zranić zwierzęcia. Zbyt szerokie lub zbyt szybkie otwarcie małżowin może nadmiernie rozciągnąć mięśnie przymknijne i doprowadzić do śmierci osobnika. Szczególnie narażone na tym etapie są okazy o cienkich skorupach (np. gatunki z rodzajów Anodonta, Leptodea, Utterbackia itp.) oraz osobniki młode. Gwałtowne obchodzenie się z gatunkami o delikatnych skorupach może spowodować ich pęknięcie i śmierć zwierzęcia. W niektórych przypadkach ściskanie zwierząt o cienkich skorupach od przedniego i tylnego brzegu małżowiny, przy jednoczesnym patrzeniu na powierzchnię brzuszną, spowoduje ugięcie się i lekkie uchylenie skorupy, co pozwoli na zaobserwowanie skrzeli lub rozsunięcie małżowin bez uszkodzenia delikatnego brzegu skorupy.
    UWAGA: W tym kroku można posiłkować się narzędziami, jednak mogą one doprowadzić do śmierci zwierzęcia, jeśli nie będą używane ostrożnie, dlatego należy ich unikać tak często, jak to możliwe. Na przykład można użyć wziernika lub zmodyfikowanych szczypiec odwróconych, aby pomóc w otwarciu osobnika, a klin może posłużyć do podtrzymania otwartych małżowin. Instrumenty te mogą być zbędne, jeśli dostępna jest druga osoba do pomocy (tj. jedna osoba trzyma zwierzę w pozycji otwartej, podczas gdy druga operuje strzykawką w celu ekstrakcji). Uszkodzenie lub oddzielenie tkanki płaszcza od periostrakonu może spowodować deformacje wzrostu i śmierć37; dlatego kluczowe jest unikanie przerwania połączenia między tkanką płaszcza a zewnętrznym brzegiem skorupy.
  4. Używając końcówki igły strzykawki, delikatnie przebić pojedynczą rurkę wodną nadmuchanego skrzela marsupialnego. Następnie, wykorzystując ściętą końcówkę igły, delikatnie wyssać zawartość skrzeli.
    UWAGA: Zawartość skrzeli ma zazwyczaj mleczno-białą konsystencję, która powinna być widoczna na ściętej końcówce igły.
    1. Przenieść zawartość strzykawki bezpośrednio do szalki Petriego, jeśli mikroskop jest pod ręką. W przeciwnym razie przechowywać zawartość w plastikowej probówce do mikrocentryfugi 1.5 mL z odpowiednim płynem (patrz krok 2.1) do późniejszej oceny.
      UWAGA: Należy zminimalizować zaburzenia i manipulowanie próbkami glochidi podczas transportu, aby uniknąć ich uszkodzenia i zmniejszenia żywotności32,35.
  5. Zapisać informacje dotyczące identyfikacji rodzaju i gatunku, stanu ciążności, długości samicy (mm), dane zbieracza i kontakt, stan, hrabstwo, dorzecze, konkretną lokalizację pobrania, szerokość i długość geograficzną, unikalny identyfikator próbki skrzeli, unikalny identyfikator miejsca badania oraz datę pobrania zawartości skrzeli (Rycina 3). Należy nanieść unikalny identyfikator na każdym naczyniu zbiorczym, aby zapewnić dokładność rekordów danych podczas transportu.
    1. Zrobić zdjęcie zewnętrznej prawej małżowiny małża w celu weryfikacji tożsamości, dołączając do zdjęcia probówkę z widocznym, czytelnym unikalnym identyfikatorem. Opcjonalnie można zebrać inne parametry abiotyczne i biotyczne, aby uzupełnić informacje o środowisku i społeczności, w której znaleziono małża (sugestie znajdują się na Rycynie 3).

Arkusz danych dotyczących ciąży małży USGS, tabela badawcza do rejestracji płci, gatunku i danych środowiskowych.
Rysunek 3: Przykład terenowego arkusza danych dotyczących ciąży. Dokładne raportowanie danych jest niezbędne, jeśli pobierana jest próbka skrzeli w celu uzyskania wiarygodnych informacji. Jest to przykład arkusza terenowego z minimalnym zestawem pól oraz dodatkowymi parametrami abiotycznymi, które należy zebrać wraz z każdą próbką skrzeli. Bardziej szczegółowe informacje znajdują się w kroku 4.1 protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Laboratoryjna ocena zawartości skrzeli

  1. Jeśli zawartość skrzeli znajduje się w probówce 1,5 mL, należy przenieść ją do szalki Petriego i wypełnić dno szalki wodą. Delikatnie zakręcić szalką Petriego, aby zebrać zawartość w jej centrum, co pozwoli na uzyskanie bardziej skoncentrowanego obrazu próbki.
    UWAGA: Jeśli zawartość skrzeli przylega do ścianek probówki, może być konieczne przepłukanie probówki 1,5 mL za pomocą butelki z rozpylaczem lub pipety transferowej wypełnionej wodą.
  2. Umieścić szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym w celu oceny próbki. Jeśli to możliwe, należy wykonać zdjęcie próbki skrzeli pod mikroskopem i opisać je unikalnym identyfikatorem danej próbki.
    1. Zarejestrować wyniki dotyczące tego, jakie stadia rozwojowe występują w każdej próbce skrzeli. Jako pomoc w charakterystyce każdego stadium rozwojowego należy wykorzystać Rysunek 4. W niektórych przypadkach samice mogą inkubować larwy na wielu stadiach rozwojowych; dlatego należy zgłosić każde stadium rozwojowe zaobserwowane w danej próbce (np. „EGG/DG/IMG/FDG”). Po ocenie zakonserwowanych glochidii należy przejść do sekcji 4. Jeśli zidentyfikowano w pełni rozwinięte glochidie, a do konserwacji nie użyto EtOH, należy przejść do kroku 3.3.
      UWAGA: EGG – masy jaj; DG – rozwijające się glochidie; IMG – niedojrzałe glochidie; FDG – w pełni rozwinięte glochidie.

Koncepcja równowagi statycznej na obrazie mikroskopowym; analiza strukturalna nasion; schemat; pokazana skala.
Rycina 4: Przedstawienia różnych stadiów rozwoju glochidiów w skrzela marsupialne.(A) Agregaty jaj (EGG) posiadają błonę, która powoduje ich skupianie się. Wewnątrz każdej błony jajowej znajduje się nieprzezroczysta sferyczna masa różnicujących się komórek. Nieprzezroczysta sfera może podzielić się na wiele mas sferycznych podczas wczesnego podziału komórkowego, jednak nadal należy ją zapisywać jako EGG, dopóki nie zostanie zaobserwowany wyraźny kształt dwudławkowy. (B) Niedojrzałe glochidia (IMG) mają wyraźną masę w kształcie dwudławkowym zawartą w błonie jajowej. (C) Rozwijające się glochidia (DG) mają wyraźny kształt dwudławkowy, brak błony jajowej oraz nieuporządkowaną tkankę wewnątrz, często o rozmytym wyglądzie. Rozwijające się glochidia (DG) nie reagują na ekspozycję na NaCl i podczas zapisywania danych są klasyfikowane jako „DG(T)”. (D) W pełni rozwinięte glochidia (FDG) mają charakterystyczny kształt dwudławkowy oraz wyraźną tkankę mięśnia przywodziciela, która umożliwia zamykanie się glochidiów. W pełni rozwinięte glochidia (FDG) są często obserwowane jako dwie otwarte muszle po utrwaleniu. Dwie otwarte muszle zazwyczaj gwałtownie się zamykają lub otwierają i zamykają pod wpływem NaCl i są klasyfikowane jako „FDG(T)”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przeprowadź test z chlorkiem sodu (NaCl), aby dalej ocenić żywotność w pełni rozwiniętych glochidiów, dodając kryształ NaCl do jednej z kropel próbki skrzeli35. Żywe glochidia zareagują na NaCl, zamykając swoje zastawki z pozycji otwartej. Podczas zapisywania danych, glochidia przebadane solą należy oznaczać symbolem „(T)” na końcu nazwy.
    UWAGA: W pełni rozwinięte glochidia mogą również aktywnie otwierać i zamykać zastawki bez kontaktu z NaCl.

4. Raportowanie do bazy danych

  1. Wejdź na stronę FMGA (http://arcg.is/089uee), która została opracowana przy użyciu programów online38,39,40. Strona FMGA zawiera link do formularza wprowadzania danych w wersji desktopowej oraz możliwość pobrania aplikacji na urządzenia mobilne. Aplikacja mobilna umożliwia wprowadzanie danych w terenie oraz automatyczną georeferencję41.
    UWAGA: Kalendarz ciążności oraz inne grafiki związane z cyklem życiowym gatunków małż słodkowodnych można znaleźć również na panelu sterowania (Dashboard) FMGA.
    1. Użyj aplikacji mobilnej lub strony desktopowej, aby zapisać wyniki w formularzu wprowadzania danych, korzystając z menu rozwijanych i pól tekstowych. W przypadku dużych, istniejących już zbiorów danych, skontaktuj się z autorami w celu uzyskania arkusza szablonu. Wprowadź zapisane dane w odpowiednich kolumnach, pamiętając, że każdy wpis, czyli wiersz w arkuszu, reprezentuje obserwacje próbki skrzeli jednego ciężarnego osobnika.
    2. Prześlij wyniki; zostaną one dodane do bazy danych FMGA po weryfikacji przez administratora, który może skontaktować się z osobą pobierającą próbki w celu uzyskania dodatkowych szczegółów lub zdjęć.
      UWAGA: Po zweryfikowaniu i zestawieniu danych w bazie FMGA wszystkie kalendarze ciążności oraz inne interaktywne grafiki wyświetlane na panelu sterowania FMGA zostaną zaktualizowane.

Wyniki

Protokół ten został zastosowany podczas badania metodą odłowu, znakowania i ponownego odłowu, w ramach którego monitorowano populację małży słodkowodnych na odcinku 750 m2 potoku Bruce Creek (hrabstwo Walton, Floryda) od stycznia 2015 do grudnia 2015 roku. Próbkowanie terenowe planowano przeprowadzać co cztery tygodnie; jednak ze względu na wezbrania wód, próbkowania nie przeprowadzono w kwietniu ani we wrześniu 2015 roku. W badaniach terenowych oraz pobieraniu próbek skrzeli pomogły agencje stanowe i federalne, w tym U.S. Geological Survey, U.S. Fish and Wildlife Service oraz Florida Fish and Wildlife Conservation Commission. Każda napotkana podczas badania samica z jajami została poddana terenowemu pobraniu zawartości skrzeli zgodnie z powyższym protokołem, oznakowana (patrz Tabela materiałów) i umieszczona z powrotem w substracie rzecznym. Próbki skrzeli przechowywano w 95% EtOH i przetransportowano do laboratorium Wetland and Aquatic Research Center w U.S. Geological Survey w celu oceny zawartości skrzeli.

Poprzez znakowanie samic i ich ponowne odławianie w odstępach miesięcznych przez cały rok, oceniliśmy zarówno letalne, jak i nieletalne skutki protokołu pobierania próbek skrzeli u łącznie 90 osobników. W trakcie niniejszego badania ponownie odłowiono siedem następujących gatunków: Elliptio pullata (n = 5), Fusconaia burkei (n = 1), Hamiota australis (n = 19), Obovaria choctawensis (n = 1), Strophitus williamsi (n = 1), Villosa lienosa (n = 60) oraz Villosa vibex (n = 3). Nasze próbkowanie objęło osobniki o całkowitej długości od 24 mm do 80 mm oraz dwa gatunki (F. burkei i H. australis) chronione przez amerykańską ustawę o gatunkach zagrożonych (Endangered Species Act). Wszystkie dane wykorzystane w tym badaniu są publicznie dostępne; udostępniliśmy nasz zbiór danych w serwisie ScienceBase (https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)42.

Przeżywalność oceniano na podstawie liczby osobników odłowionych ponownie żywych po pobraniu próbki skrzeli. W trakcie badania zaobserwowano wysoką przeżywalność (97%), przy czym odnotowano niektóre przypadki śmiertelności, które na podstawie obserwacji w terenie mogły wynikać z drapieżnictwa. Wyniki wykazały, że około 51% osobników (46 z 90) pozostawało w stanie ciążowym pomiędzy kolejnymi próbkowaniami. Kolejne 10% osobników (9 z 90) było początkowo w stanie ciążowym, podczas ponownego odłowu nie było w stanie ciążowym, a następnie ponownie stwierdzono u nich stan ciążowy. Około 39% osobników (35 z 90) w niniejszym badaniu było w stanie ciążowym w momencie pobrania próbki skrzeli, lecz przy ponownych odłowach w ciągu roku nigdy więcej nie stwierdzono u nich stanu ciążowego. Wyniki wskazują, że opisany tutaj protokół nie jest letalny ani subletalny i nie zakłóca w istotnym stopniu aktualnego okresu inkubacji po pobraniu próbki skrzeli.

Mimo że wielkości prób w niniejszym badaniu są nierówne dla poszczególnych gatunków, uzyskane wyniki podkreślają korzystne i praktyczne zastosowania tego protokołu. Kalendarz ciąż dla V. lienosa ilustruje, że ciężarne samice inkubujące FDG występowały w niemal każdym miesiącu roku z wyjątkiem sierpnia, kiedy stwierdzono obecność wyłącznie samic inkubujących EGG (Rycina 5A). Samica H. australis stwierdzono, że nie były ciążąwe (NG) w lipcu, sierpniu i grudniu. Większa proporcja samic wysiedziała jaja (FDG) w styczniu i lutym, lecz występowały one również w październiku i listopadzie (Rycina 5B). Nie stwierdzono osobników *E. pullata* stwierdzono obecność osobników inkubujących FDG, mimo że samice inkubowały EGG od maja do czerwca, a w czerwcu odnotowano jedną samicę ciążną (GFR) (Rysunek 5C). Jedyna ciążowa F. burkei samica została odnaleziona w stanie GFR w czerwcu i ponownie odłowiona w stanie NG w lipcu. Ta sama O. choctawensis osobnika pobrano FDG w lutym i ponownie odłowiono NG w lipcu. Tylko jeden *S. williamsi* znaleziono i odłowiono ponownie trzy razy. Samicę tę znaleziono w stanie FDG w marcu, NG w maju, GFR w czerwcu oraz EGG w sierpniu (Rycina 5C). Ciężarne samice V. vibex inkubujące FDG odnaleziono między lutym a czerwcem (Rycina 5C).

Wykresy słupkowe stanu ciążności; Villosa lienosa, Hamiota australis; trendy miesięcznych danych z próbek.
Rycina 5: Wyniki badania w Bruce Creek, FL przedstawione w formacie kalendarza ciążności.(A) Kalendarz ciążności dla osobników schwytanych/ponownie schwytanych Villosa lienosa. (B) Kalendarz ciążności dla osobników schwytanych/ponownie schwytanych Hamiota australis. (C) Kalendarze ciążności dla wszystkich gatunków, dla których pobrano próbki od mniej niż 10 osobników. Oś y zawiera skróty miesięcy: styczeń (Ja), luty (F), marzec (Mr), maj (My), czerwiec (Jn), lipiec (Jl), sierpień (A), październik (O), listopad (N) i grudzień (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Znaczenie

Ochrona zagrożonych gatunków zależy od udanej rekrutacji w istniejących populacjach. W niektórych przypadkach może być konieczne sztuczne rozmnażanie w celu zwiększenia rekrutacji tych zagrożonych populacji. Wymaga to od naukowców informowania o czasie czynnego rozrodu każdego gatunku i ewentualnego stosowania różnych metodologii lub praktyk zarządzania w celu złagodzenia wpływu na rekrutację. Ze względu na to, że jesteśmy zagrożoną grupą organizmów, niezwykle ważne jest ustanowienie ustandaryzowanego i nieśmiercionośnego podejścia do badania nawyków reprodukcyjnych oraz zapewnienie platformy, na której można gromadzić i wizualizować dane w celu informowania społeczności naukowej o najbardziej aktualnych dostępnych informacjach. Badanie to zapewnia protokół krok po kroku, aby zapewnić podjęcie środków ostrożności, a zawartość skrzeli może być odpowiednio pobrana i oceniona z samic małży. Protokół ten został przetestowany pod kątem skutków śmiertelnych i nieletalnych, co pozwoliło badaczom i menedżerom na odpowiedzialne wdrożenie tej metodologii. Opracowaliśmy również zestaw narzędzi i aplikacji do zarządzania bazami danych, aby ułatwić kompilację informacji o ciężarze na publicznie dostępnym, przyjaznym dla użytkownika pulpicie nawigacyjnym. Badania nad epidemiologią, morfologią glochidii, historią życia, filogenetyką, rozmnażaniem i translokacjami mogą przynieść korzyści i wykorzystać to repozytorium informacji o ciężarności czasowej dla wszystkich gatunków małży słodkowodnych.

Samo to badanie potwierdziło wcześniejsze wyniki badań dotyczących nawyków reprodukcyjnych niektórych gatunków, ale także ujawniło nowe informacje na temat innych. Chociaż V. vibex został zebrany w mniejszej liczbie niż V. lienosa, podobieństwa między nimi można znaleźć na podstawie danych dotyczących grawitacji. Wydaje się, że oba gatunki Villosa wysiadują w pełni rozwinięte glochidia przez dużą część roku, co charakteryzuje je jako zimujący lęg. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami na innych gatunkach Villosa 43,44,45. Wyniki tego badania sugerują, że H. australis można znaleźć w stanie ciężarnym od października i zimującym do czerwca, z wyjątkiem tego, że w grudniu nie stwierdzono żadnych schwytanych osobników. Wcześniej opublikowane badanie zidentyfikowało kongener H. altilis z okresem ciąży wynoszącym cztery miesiące, od marca do czerwca, 46,47. Odkrycie to ilustruje dłuższy okres ciąży niż wcześniej sądzono i ogólnie grupuje H. australis jako zimujący lęg. Ponieważ H. altilis i H. australis są gatunkami chronionymi federalnie, różne okresy lęgowe mogą mieć wpływ na decyzje dotyczące zarządzania w celu lepszej ochrony populacji w okresie aktywności reprodukcyjnej. Elliptio pullata stwierdzono w ciężarze EGG dopiero w maju i czerwcu, co odpowiada ich charakterystyce jako gatunku tachytycznego o bardzo krótkim okresie lęgowym 24,48,49,50. Ponieważ dane na temat gatunków Elliptio są opracowywane przy użyciu tego protokołu, szczegółowe informacje mogą sprawić, że wysiłki terenowe będą bardziej efektywne, gdy ukierunkowane są pewne etapy rozwoju glochidii, ponieważ glochidia występuje tylko przez kilka miesięcy w roku. Wnioskowanie na podstawie innych gatunków o mniejszych rozmiarach próby jest ograniczone, ale w miarę kompilowania danych do bazy danych, większe rozmiary próbek dadzą wgląd w zwyczaje reprodukcyjne dodatkowych gatunków małży.

Uwagi proceduralne

Wiadomo, że małże słodkowodne i ich glochidia są podatne na stresory antropogeniczne10,35. Podczas kontroli grawitacji zawory małży mogą nie być łatwe do otwarcia, a nieostrożne forsowanie zaworów może spowodować niezamierzone obrażenia i spowodować stres lub śmiertelność. Niektóre gatunki o delikatnych skorupach (np. Anodonta, Leptodea, Utterbackia itp.) i mniejsze osobniki mogą mieć bardzo delikatne muszle i słabe mięśnie przywodzicieli, które mogą się łatwo łamać i rozdzierać. Pobieranie próbek skrzelowych można uznać za czynnik stresogenny, jeśli obchodzenie się z nimi nie odbywa się w sposób odpowiedzialny i ostrożny. Poprzednie badanie wykazało, że obchodzenie się z małżami i narażenie ich z powietrza w okresie aktywności rozrodczej może powodować różne stresy fizjologiczne, w tym przedwczesne uwalnianie zawartości skrzeli34. Jednak badanie wykorzystujące podobną metodologię, jak opisana tutaj, wykazało, że obchodzenie się z ciężarnymi samicami małży podczas pobierania próbek skrzeli nie przerwało obecnego lęgu ani nie spowodowało przedwczesnego uwolnienia zarówno u krótko-, jak i długoterminowych gatunków lęgowych16. Ponadto podczas tego protokołu należy użyć sterylnej strzykawki, aby zapobiec niezamierzonej infekcji lub zanieczyszczeniu krzyżowemu podczas nakłuwania skrzeli wielu osób. Ponadto glochidia są delikatne, a lęgi mogą dojrzewać i być zestresowane, ale nie wydalane. Dojrzała glochidia w złym stanie zdrowia może spowodować, że mniej osób zareaguje na testy soli35. Dokonując rozróżnienia między DG(T) i FDG(T), ważne jest, aby przeprowadzić test soli na dużej próbie, sporządzić notatki na temat obserwacji, aby dokładnie zidentyfikować różnice między DG i FDG glochidia przy użyciu opisów zawartych w tym badaniu. Przy zachowaniu odpowiedniej ostrożności minimalny stres wywołany tą procedurą może pozwolić samicom małży na kontynuowanie wylęgu w naturalny sposób i zmniejszyć wpływ na rekrutację w populacji.

Dodatkowe dane mogą być rejestrowane w celu uzupełnienia bazy danych i zapewnienia szerokiego kontekstu dla zwyczajów rozrodczych małży słodkowodnych. Zaobserwowano, że niektóre gatunki (np. gatunki Fusconaia) mają skrzela o różnych kolorach w zależności od etapu rozwoju glochidii51. Podczas wstępnej kontroli ciężaru samicy opis koloru skrzeli może zostać włączony do zgłaszanych danych, aby umożliwić przeprowadzenie przyszłych badań. Również w tym momencie protokołu naukowcy mogą zauważyć, czy wylęgająca się samica została znaleziona w wylęgającej się glochidii w dwóch zewnętrznych skrzelach (ectobranchus), dwóch wewnętrznych skrzelach (endobranchus), czy we wszystkich czterech skrzelach (tetragennych)17. Informacje te mogą zostać dodane do FMGA i pomóc w wypełnieniu luk w danych dotyczących wylęgu dla każdego badanego gatunku. Warunki środowiskowe, w szczególności temperaturę wody, mogą być zbierane i rejestrowane w terenie w celu bardziej kompleksowej obserwacji stanu grawitacji i czasu występowania gatunków w różnych zakresach równoleżnikowych. Badania pokazują, że parametry środowiskowe, takie jak temperatura, fotoperiod, natężenie przepływu i dostępność pokarmu, mogą indukować zdarzenia reprodukcyjne u małży słodkowodnych 52,53,54,55,56. Dodatkowe pola mogą być dodawane do bazy danych w miarę ich składania, aby wspierać przyszłe badania nad czynnikami abiotycznymi wpływającymi na grawitację. Modyfikacja chwytania-znaku-ponownego chwytania, wzorowana na naszym badaniu, może być również dodana do tego protokołu, co pozwoliłoby naukowcom monitorować nawyki reprodukcyjne określonego małża i ujawnić informacje o wielu lęgach rocznie.

Dokładność informacji w FMGA zależy od źródła. Na przykład błędna identyfikacja małży słodkowodnych jest powszechna ze względu na to, że wiele gatunków ma podobne cechy zewnętrzne, które utrudniają rozróżnienie gatunków57. Próbka skrzeli od błędnie zidentyfikowanego osobnika może powodować zamieszanie i fałszywe informacje na temat okresu lęgowego gatunku. Jeśli pobierana jest próbka skrzeli, należy zrobić zdjęcia wnętrza obu zaworów (jeśli dana osoba nie żyje), na zewnątrz prawej zastawki oraz umbo (zawias, w którym łączą się dwie zastawki) i przesłać je wraz z danymi dotyczącymi grawitacji za pośrednictwem strony komputerowej lub aplikacji mobilnej. Mile widziane są również zdjęcia zawartości skrzeli. W formularzach zgłoszeniowych znajduje się rozwijane menu, w którym zbieracz może wskazać swój poziom pewności co do identyfikacji gatunków. Zanim zapis zostanie zatwierdzony, informacje te zostaną wzięte pod uwagę podczas sprawdzania identyfikacji kolektora pod kątem prawdopodobnego rozkładu itp. Ze względu na wysoki stopień wewnątrzgatunkowej zmienności morfologicznej u gatunków Unionidae, zachęca się do pobierania próbek tkanek i może być konieczne w celu ułatwienia identyfikacji molekularnej.

Implikacje na przyszłość

Jako metoda nieśmiercionośna, protokół ten może być stosowany zarówno do gatunków pospolitych, jak i zagrożonych. Kalendarze grawitacji dla zagrożonych gatunków mogą pomóc osobom zarządzającym ochroną przyrody zaangażowanym w prawodawstwo dotyczące zagrożonych gatunków i planowanie odbudowy, dostarczając informacji na temat okresów, w których gatunki są aktywne reprodukcyjnie. Agencje stanowe i federalne, które zarządzają zagrożonymi gatunkami, mogą lepiej doradzać w przydzielaniu zezwoleń na okresy, w których gatunek nie jest wrażliwy i nie rozmnaża się, a nawet ograniczyć odławianie ryb żywicielskich w czasie, gdy małże wysiadują w pełni rozwinięte glochidia. Ponadto badania terenowe mogą być ukierunkowane na gatunki w okresach nierozrodczych, aby zminimalizować wpływ na procesy rekrutacji. Publicznie dostępna baza danych FMGA stanowi narzędzie dla badaczy i kadry kierowniczej w celu uzyskania ważnych informacji na temat rozrodu dowolnych docelowych gatunków małży słodkowodnych. Baza danych uwypukli również luki w danych, zachęcając do dalszych badań nad specyficznymi dla danego gatunku wzorcami lęgowymi. Ponieważ zrozumienie wzorca reprodukcyjnego gatunku pozwala na podejmowanie odpowiednich decyzji dotyczących zarządzania, mamy nadzieję, że nasz protokół i baza danych ułatwią przyszłe badania, ochronę i odbudowę małży słodkowodnych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować źródłom finansowania: U.S. Fish and Wildlife Service oraz U.S. Geological Survey. Specjalne podziękowania dla Andrew Hartzoga i Sandry Pursifull za zorganizowanie ekip terenowych i zbieranie danych, a także dla Lauren Patterson i Chrisa Andersona za ich cenny wkład w rozwój baz danych. Chcielibyśmy również podziękować wszystkim, którzy pomogli w terenie i laboratorium, w tym Sherry Bostick, Markowi Cantrellowi, Sahale Casebolt, Jordanowi Holcombowi, Howardowi Jelksowi, Gary'emu Mahonowi, Johnowi McLeodowi, Kyle'owi Moonowi, Cayli Morningstar, Emmie Pistole, Mattowi Rowe'owi, Channingowi St. Aubinowi i Jimowi Williamsowi. Jakiekolwiek użycie nazw handlowych, firm lub produktów służy wyłącznie celom opisowym i nie oznacza poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe zatrzaskowe 1,5 mlUSA Scientific1615-5510Probówki zatrzaskowe są ważne w terenie, aby luźna nakrętka nie została zgubiona.
Igła 20 G na jednorazowej strzykawce 10 mlExelint International26255sterylna jednorazowa strzykawka 10 ml z igłą Model: 10 ml końcówka Luer Lock W / 20G X 1 1/2 "
Mikroskop preparacyjnydowolny
długopis do znakowaniaFisher Scientific13-379-4Tego właśnie użyliśmy, ale wystarczy każdy marker, który może pisać na małych plastikowych rurkach. Ten jest dość etanolowy i wodoodporny.
Etanol klasy molekularnejdowolnydowolny Potrzebne do zachowania zawartości skrzeli. Niedenaturowane 95% jest potrzebne do prac genetycznych, 70% jest potrzebne do prac związanych z obrazowaniem SEM.
Papierdowolny Potrzebne do zapisania informacji o pobranych próbkach.
Długopis/ołówekdowolnyJeśli jesteś w terenie, lepiej pisać ołówkiem na wodoodpornym papierze, aby się nie rozmazywał. Jeśli jesteś w muzeum/laboratorium, każde przybory do pisania są w porządku.
szalka PetriegoDWK Nauki Przyrodnicze (Kimble)23000-9050To jest to, czego używaliśmy, ale każda dostępna szalka Petriego jest w porządku. Przyjemniej jest mieć wyższe ściany na wypadek, gdyby zużyto zbyt dużo wody.
Chlorek sodudowolnydowolny potrzebny do testu NaCl na reaktywne glochidie. Zachowane próbki tego nie wymagają.
WziernikdowolnyPotrzebne tylko wtedy, gdy potrzebujesz pomocy w otwieraniu zaworów żywego małża.
Sterylna wodadowolnaDodano do próbek skrzelowych, które należy ocenić pod kątem reaktywności w ciągu 24 godzin od pobrania.
Super klejGorillaGorilla super glue gelSłuży do nakładania znaczników i jest potrzebny tylko w przypadku przeprowadzania badania przechwytywania, znakowania i ponownego przechwytywania.
Tags:HallprintFPN 8x4Potrzebne tylko w przypadku przeprowadzania badania przechwytywania, znakowania i ponownego przechwytywania.
Pipeta transferowaThermo Scientific Samco225To jest to, czego używamy, ale każda pipeta transferowa lub butelka ze spryskiwaczem ma zastosowanie.
PęsetadowolnaPotrzebne do przenoszenia kryształów NaCl do testu soli. Zachowane próbki tego nie wymagają.
Wodoodporny papierRainWriterdowolnyPotrzebny tylko do wykonywania prac w terenie. Pozwala to na rejestrowanie informacji o każdej pojedynczej zawartości skrzeli, z której pobierana jest zawartość.
Drewniany pickdowolny Potrzebny tylko wtedy, gdy potrzebujesz pomocy w otwieraniu zaworów żywego małża.
, :

Bibliografia

  1. Williams, J. D., Warren, M. L., Cummings, K. S., Harris, J. L., Neves, R. J. Conservation status of freshwater mussels of the United States and Canada. Fisheries. 18 (9), 6-22 (1993).
  2. Lopes-Lima, M., et al. Conservation status of freshwater mussels in Europe: state of the art and future challenges. Biological Reviews. 92 (1), 572-607 (2017).
  3. Zieritz, A., et al. Diversity, biogeography and conservation of freshwater mussels (Bivalvia: Unionida) in East and Southeast Asia. Hydrobiologia. 810 (1), 29-44 (2018).
  4. Haag, W. R., Williams, J. D. Biodiversity on the brink: an assessment of conservation strategies for North American freshwater mussels. Hydrobiologia. 735 (1), 45-60 (2014).
  5. Ferreira-Rodríguez, N., et al. Research priorities for freshwater mussel conservation assessment. Biological Conservation. 231, 77-87 (2019).
  6. Graf, D. L., Cummings, K. S. Review of the systematics and global diversity of freshwater mussel species (Bivalvia: Unionoida). Journal of Molluscan Studies. 73 (4), 291-314 (2007).
  7. Lydeard, C., Cummings, K. Freshwater mollusks of the world: a distribution atlas. , Johns Hopkins University Press. Baltimore, MD. (2019).
  8. Wächtler, K., Dreher-Mansur, M. C., Richter, T. Larval types and early postlarval biology in naiads (Unionoida). Ecology and evolution of the freshwater mussels Unionoida. Bauer, G., Wächtler, K. , Springer. Berlin, Heidelberg. 93-125 (2001).
  9. Dudgeon, D., et al. Freshwater biodiversity: importance, threats, status and conservation challenges. Biological Reviews. 81 (2), 163-182 (2006).
  10. Downing, J. A., Van Meter, P., Woolnough, D. A. Suspects and evidence: a review of the causes of extirpation and decline in freshwater mussels. Animal biodiversity and Conservation. 33 (2), 151-185 (2010).
  11. Vaughn, C. C. Ecosystem services provided by freshwater mussels. Hydrobiologia. 810 (1), 15-27 (2018).
  12. Aldridge, D. C., Fayle, T. M., Jackson, N. Freshwater mussel abundance predicts biodiversity in UK lowland rivers. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 17 (6), 554-564 (2007).
  13. Barnhart, M. C., Haag, W. R., Roston, W. N. Adaptations to host infection and larval parasitism in Unionoida. Journal of the North American Benthological Society. 27 (2), 370-394 (2008).
  14. Saha, S., Layzer, J. B. Evaluation of a nonlethal technique for determining sex of freshwater mussels. Journal of the North American Benthological Society. 27 (1), 84-89 (2008).
  15. Tsakiris, E. T., Randklev, C. R., Conway, K. W. Effectiveness of a nonlethal method to quantify gamete production in freshwater mussels. Freshwater Science. 35 (3), 958-973 (2016).
  16. Gascho, L., Andrew, M., Stoeckel, J. A. Multi-stage disruption of freshwater mussel reproduction by high suspended solids in short-and long-term brooders. Freshwater Biology. 61 (2), 229-238 (2016).
  17. Bauer, G., Wächtler, K. Ecology and evolution of the freshwater mussels Unionoida. , Springer Science and Business Media. Berlin, Germany. (2012).
  18. Ortmann, A. E. Notes upon the families and genera of the najades. Annals of the Carnegie Museum. 8 (2), 222(1912).
  19. Heard, W. H. Sexuality and other aspects of reproduction in Anodonta (Pelecypoda: Unionidae). Malacologia. 15, 81-103 (1975).
  20. Heard, W. H. Brooding patterns in freshwater mussels. Malacological Review. 7, Supplement 7: Bivalvia 105-121 (1998).
  21. Watters, G. T., O'Dee, S. H. Glochidial release as a function of water temperature: beyond bradyticty and tachyticty. Proceedings of the Conservation, Captive Care, and Propagation of Freshwater Mussels Symposium. , 135-140 (1998).
  22. Parker, R. S., Hackney, C. T., Vidrine, M. F. Ecology and Reproductive Strategy of a South Louisiana Freshwater Mussel, Glebula Rotundata (Lamarck) (Unionidae: Lampsilini). Freshwater Invertebrate Biology. 3 (2), 53-58 (1984).
  23. Jones, H. A., Simpson, R. D., Humphrey, C. L. The reproductive cycles and glochidia of fresh-water mussels (Bivalvia: Hyriidae) of the Macleay River, Northern New South Wales, Australia. Malacologia. 27 (1), 185-202 (1986).
  24. Price, J. E., Eads, C. B. Brooding patterns in three freshwater mussels of the genus Elliptio in the Broad River in South Carolina. American Malacological Bulletin. 29 (1), 121-126 (2011).
  25. Haag, W. R., Staton, J. L. Variation in fecundity and other reproductive traits in freshwater mussels. Freshwater Biology. 48 (12), 2118-2130 (2003).
  26. Soler, J., Wantzen, K. M., Jugé, P., Araujo, R. Brooding and glochidia release in Margaritifera auricularia (Spengler, 1793) (Unionoida: Margaritiferidae). Journal of Molluscan Studies. 84 (2), 182-189 (2018).
  27. Smith, D. G. Notes on the biology of Margaritifera margaritifera margaritifera (Lin.) in Central Massachusetts. American Midland Naturalist. , 252-256 (1976).
  28. O'Brien, C., Nez, D., Wolf, D., Box, J. B. Reproductive biology of Anodonta californiensis, Gonidea angulata, and Margaritifera falcata (Bivalvia: Unionoida) in the Middle Fork John Day River, Oregon. Northwest Science. 87 (1), 59-73 (2013).
  29. Haag, W. R., Warren, M. L. Host fishes and reproductive biology of 6 freshwater mussel species from the Mobile Basin, USA. Journal of the North American Benthological Society. 16 (3), 576-585 (1997).
  30. O'Dee, S. H., Watters, G. T. New or confirmed host identifications for ten freshwater mussels. Proceedings of the Conservation, Captive Care, and Propagation of Freshwater Mussels Symposium. , 77-82 (1998).
  31. Johnson, N. A., McLeod, J. M., Holcomb, J., Rowe, M., Williams, J. D. Early life history and spatiotemporal changes in distribution of the rediscovered Suwannee moccasinshell Medionidus walkeri (Bivalvia: Unionidae). Endangered Species Research. 31, 163-175 (2016).
  32. McLeod, J. M., Jelks, H. L., Pursifull, S., Johnson, N. A. Characterizing the early life history of an imperiled freshwater mussel (Ptychobranchus jonesi) with host-fish determination and fecundity estimation. Freshwater Science. 36 (2), 338-350 (2017).
  33. Carlson, S., Lawrence, A., Blalock-Herod, H., McCafferty, K., Abbott, S. Freshwater mussel survey protocol for the Southeastern Atlantic Slope and Northeastern Gulf drainages in Florida and Georgia. US Fish and Wildlife Service, Ecological Services and Fisheries Resources Offices and Georgia Department of Transportation, Office of Environment and Location. , Atlanta, Georgia. (2008).
  34. Waller, D. L., Rach, J. J., Cope, G. W., Miller, G. A. Effects of handling and aerial exposure on the survival of unionid mussels. Journal of Freshwater Ecology. 10 (3), 199-207 (1995).
  35. Fritts, A. K., et al. Assessment of toxicity test endpoints for freshwater mussel larvae (glochidia). Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (1), 199-207 (2014).
  36. Christian, A. D., Monroe, E. M., Asher, A. M., Loutsch, J. M., Berg, D. J. Methods of DNA extraction and PCR amplification for individual freshwater mussel (Bivalvia: Unionidae) glochidia, with the first report of multiple paternity in these organisms. Molecular Ecology Notes. 7 (4), 570-573 (2007).
  37. Henley, W. F., Grobler, P. J., Neves, R. J. Non-invasive method to obtain DNA from freshwater mussels (Bivalvia: Unionidae). Journal of Shellfish Research. 25 (3), 975-978 (2006).
  38. ESRI. ArcGIS Desktop 10.6.1.9270. Environmental Systems Research Institute (ESRI). , (2017).
  39. ESRI. ArcGIS Online. ESRI Geospatial Cloud: Survey123 Field Application for ArcGIS 3.3.64. Environmental Systems Research Institute (ESRI). , (2019).
  40. ESRI. ArcGIS Online. ESRI Geospatial Cloud: Survey123 Connect for ArcGIS 3.3.51. Environmental Systems Research Institute (ESRI). , (2019).
  41. ESRI. ArcGIS Online. ESRI Geospatial Cloud: Operations Dashboard for ArcGIS. Environmental Systems Research Institute (ESRI). , (2019).
  42. Johnson, N. A., Beaver, C. E. Empirical data supporting a non-lethal method for characterizing the reproductive status and larval development of freshwater mussels (Bivalvia: Unionida). U.S. Geological Survey data release. , (2019).
  43. Ortmann, A. E. A monograph of the naides of Pennsylvania. Memoirs of the Carnegie Museum. 8, (1919).
  44. Posey, W. R. Life History and Population Biology of the State Special Concern Ouachita Creekshell, Villosa arkansasensis (I. Lea 1862). Arkansas Game and Fish Commission. , (2007).
  45. Asher, A. M., Christian, A. D. Population characteristics of the mussel Villosa iris (Lea) (rainbow shell) in the Spring River watershed, Arkansas. Southeastern Naturalist. 11 (2), 219-239 (2012).
  46. Haag, W. R., Warren, M. L., Shillingsford, M. Host fishes and host-attracting behavior of Lampsilis altilis and Villosa vibex (Bivalvia: Unionidae). The American Midland Naturalist. 141 (1), 149-158 (1999).
  47. Roe, K. J., Hartfield, P. D. Ham,iota a new genus of freshwater mussel (Bivalvia: Unionidae) from the Gulf of Mexico drainages of the southeastern United States. Nautilus-Sanibel. 119 (1), 1-10 (2005).
  48. Williams, J. D., Butler, R. S., Warren, G. L., Johnson, N. A. Freshwater mussels of Florida. , University of Alabama Press. Tuscaloosa, AL. (2014).
  49. Jirka, K. J., Neves, R. J. Reproductive biology of four species of freshwater mussels (Molluscs: Unionidae) in the New River, Virginia and West Virginia. Journal of Freshwater Ecology. 7 (1), 35-44 (1992).
  50. Watters, G. T., O'Dee, S. H., Chordas, S. Patterns of vertical migration in freshwater mussels (Bivalvia: Unionoida). Journal of Freshwater Ecology. 16 (4), 541-549 (2001).
  51. Richardson, F., Martínez, P. Anodonta propagation studies: determination of mussel sexual maturity and Glochidia release agents. Proceedings of the Gulf and Caribbean Fisheries Institute. 48, 535-538 (2004).
  52. Heinricher, J. R., Layzer, J. B. Reproduction by individuals of a nonreproducing population of Megalonaias nervosa (Mollusca: Unionidae) following translocation. The American Midland Naturalist. 141 (1), 140-148 (1999).
  53. Watters, G. T., O'Dee, S. H. Glochidia of the freshwater mussel Lampsilis overwintering on fish hosts. Journal of Molluscan Studies. 65 (4), 453-459 (1999).
  54. Hastie, L. C., Young, M. R. Timing of spawning and glochidial release in Scottish freshwater pearl mussel (Margaritifera margaritifera) populations. Freshwater Biology. 48 (12), 2107-2117 (2003).
  55. Galbraith, H. S., Vaughn, C. C. Temperature and food interact to influence gamete development in freshwater mussels. Hydrobiologia. 636 (1), 35-47 (2009).
  56. Kobayashi, O., Kondo, T. Reproductive ecology of the freshwater pearl mussel Margaritifera togakushiensis (Bivalvia: Margaritiferidae) in Japan. Venus (Japan). 67 (3-4), 189-197 (2009).
  57. Shea, C. P., Peterson, J. T., Wisniewski, J. M., Johnson, N. A. Misidentification of freshwater mussel species (Bivalvia: Unionidae): contributing factors, management implications, and potential solutions. Journal of the North American Benthological Society. 30 (2), 446-458 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ocena ciążnościpobieranie próbek z skrzelimetoda nieletalnaocena glochidiówmikroskopia sekcyjnagromadzenie danychbadania konserwatorskie
Standaryzacja nieletalnej metody charakterystyki stanu rozrodczego i rozwoju larwalnego małży słodkowodnych (Bivalvia: Unionida)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.