Method Article

Obrazowanie 3D próbek tkanek miękkich przy użyciu metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego i nanoskopowej tomografii komputerowej

DOI:

10.3791/60251

⸱

October 24th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Munich School of BioEngineering, Technical University of Munich, 2Department of Diagnostic and Interventional Radiology, School of Medicine and Klinikum rechts der Isar, Technical University of Munich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół do wizualizacji 3D mikroskopijnych struktur tkanek za pomocą metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego, przeznaczonej do rentgenowskiej tomografii komputerowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstrujemy laboratoryjną metodę łączącą mikrotomografię rentgenowską i nanoCT ze specyficznym barwieniem rentgenowskim, które celuje w cytoplazmę komórki. Opisany protokół jest łatwy w aplikacji, szybki i odpowiedni dla większych próbek tkanek miękkich. Przedstawiona metodologia umożliwia scharakteryzowanie kluczowych struktur tkankowych w trzech wymiarach i jest demonstrowana na całej nerce myszy. Podejście wieloskalowe pozwala na zobrazowanie całej nerki myszy i wspiera wybór dalszych interesujących nas objętości, które są pozyskiwane w wyższych rozdzielczościach w zakresie nanometrów. W ten sposób odtwarzana jest morfologia tkanek miękkich o podobnym poziomie szczegółowości, jak odpowiadające jej obrazy histologicznej mikroskopii świetlnej. Za pomocą metod histologicznych uzyskuje się głębszy wgląd w konfigurację 3D struktur tkankowych bez utrudniania dalszych badań.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pełna charakterystyka próbek tkanek miękkich wymaga informacji o mikrostrukturze tkanek 3D. Obecnie złotym standardem w analizie próbek tkanek miękkich jest histopatologia. Morfologia tkanek i komórek próbki jest badana w 2D w wybranych obszarach zainteresowania (ROI) za pomocą mikroskopii optycznej1. Ta metoda ma jednak kilka wad. Przygotowanie próbki jest czasochłonne, skomplikowane, destrukcyjne i podatne na artefakty. Produkowane preparaty mikroskopowe dostarczają jedynie informacji 2D równolegle do płaszczyzny przekroju. Często liczba badanych sekcji histologicznych jest ograniczona ze względu na ograniczenia czasowe2,3.

W ostatnich latach dziedzina histologii 3D ewoluowała. Tutaj dostępne są wirtualne wycinki tkanek z dowolnej pożądanej płaszczyzny przestrzennej. Pozwala to na śledzenie struktur w całej próbce, co prowadzi do głębszego zrozumienia architektury tkanek 3D i zmian strukturalnych związanych z różnymi patologiami. Opracowano różne metody generowania danych objętościowych 3D. Obejmują one zarówno podejścia oparte na przekrojach seryjnych, które wykorzystują mikroskopię świetlną lub elektronową4,5,6,7,8, jak i metody obrazowania blokowego, takie jak episkopowe obrazowanie 3D lub skaningowa mikroskopia elektronowa7,8,9. Wszystkie wymienione metody polegają jednak na przecięciu lub całkowitym zniszczeniu próbki, co nie pozwala na dalsze badania. Uzyskana rozdzielczość jest w dużym stopniu zależna od tego, czy proces cięcia jest podatny na artefakty, jak opisano w konwencjonalnej histologii. Te metody cierpią również z powodu artefaktów wyrównania.

Techniki obrazowania rentgenowskiego 3D, takie jak mikroskopowa i nanoskopowa tomografia komputerowa (mikroCT i nanoCT) dążą do generowania danych 3D o wysokiej rozdzielczości bez niszczenia próbki tkanki. Do tej pory słaby kontrast tłumienia promieniowania rentgenowskiego tkanek miękkich i ograniczony dostęp do wysokich rozdzielczości w środowisku laboratoryjnym utrudniały ich wykorzystanie do wizualizacji 3D mikroskopijnych struktur tkankowych. Ostatnie postępy w kierunku laboratoryjnej tomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości pozwalają na uzyskanie rozdzielczości znacznie poniżej 1 μm10,11,12,13.

Brak kontrastu w tkance miękkiej w konwencjonalnym obrazowaniu rentgenowskim opartym na tłumieniu jest kompensowany przez środki barwiące, które zwiększają kontrast tłumienia promieniowania rentgenowskiego. Często stosuje się środki barwiące znane z innych technik obrazowania, takie jak tetratlenek osmu (OsO4), jodek jodu potasu (IKI) czy kwas fosfowolframowy (PTA)14,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24,25. Środki barwiące, które pozwalają na (i) specyficzne ukierunkowanie biologiczne, (ii) jednorodne i całkowite barwienie, (iii) łatwą obsługę, (iv) szybką penetrację tkanki bez tworzenia artefaktów, takich jak pierścienie dyfuzyjne, (v) duże i gęste barwienie tkanek oraz (vi) pełną kompatybilność z histopatologią, są wymagane do ustanowienia rentgenowskiej tomografii komputerowej jako narzędzia do wizualizacji 3D mikroskopijnych struktur tkankowych. W tej pracy pokazujemy, w jaki sposób próbki tkanek miękkich są przygotowywane do obrazowania rentgenowskiego za pomocą specyficznego dla cytoplazmy barwienia rentgenowskiego na bazie eozyny, które spełnia wymagania określone powyżej26.

Podejście do obrazowania wieloskalowego zapewnia ocenę jakości barwienia poprzez przegląd pomiarów mikrotomografii komputerowej i wybór interesujących objętości (VOI) do dalszych badań w wysokiej rozdzielczości. Jakość barwienia jest analizowana, koncentrując się na parametrach barwienia, takich jak (i) kompletność, (ii) wygląd pierścieni dyfuzyjnych, (iii) wzmocnienie kontrastu, (iv) pojawienie się artefaktów CT, takich jak smugi i (v) jednorodność. Laboratoryjna matryca nanoCT, która wykorzystuje powiększenie geometryczne do osiągnięcia rozdzielczości do 100 nm, wizualizuje morfologię tkanek miękkich na poziomie (sub)komórkowym10,27. Analiza porównawcza wycinków nanoCT z odpowiadającymi im obrazami histologicznej mikroskopii świetlnej potwierdza odtworzenie architektury tkankowej z podobną szczegółowością na poziomie mikroskopowym w 2D, umożliwiając histopatologiczną charakterystykę próbki tkanki. Ten szczegółowy protokół wideo ma na celu zwiększenie świadomości i podkreślenie potencjału tej metodologii jako nieniszczącego narzędzia do obrazowania tkanek miękkich 3D, które jest przedmiotem zainteresowania szerokiej społeczności naukowej, takiej jak zoolodzy, biolodzy i pracownicy służby zdrowia.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Kilka substancji chemicznych użytych w protokole jest silnie toksycznych i rakotwórczych. Podczas wykonywania protokołu barwienia należy stosować wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa, w tym stosowanie kontroli inżynieryjnych (dygestoria, komora podręczna) i środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, spodnie na całej długości, buty z zakrytymi palcami).

Wykorzystane zwierzęta:
Hodowla zwierząt została przeprowadzona w Klinikum rechts der Isar Uniwersytetu Technicznego w Monachium zgodnie z wytycznymi Unii Europejskiej 2010/63. Pobranie narządów zostało zatwierdzone przez wewnętrzną komisję ochrony zwierząt w Klinikum rechts der Isar, Monachium, Niemcy (numer wewnętrzny 4-005-09). Wszystkie procedury były zgodne z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Wszystkie laboratoria są kontrolowane pod kątem zgodności z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej OECD.

1. Protokół barwienia eozyny

  1. Aby utrwalić próbki tkanek miękkich, napełnij probówkę wirówkową o pojemności 50 ml roztworem utrwalającym zawierającym 9,5 ml 4% (v/v) roztworu formaldehydu (FA) i 0,5 ml lodowatego kwasu octowego (AA).
    UWAGA: Roztwór FA należy przygotować świeżo z 37% bezkwasowego roztworu FA stabilizowanego około 10% metanolem. Roztwór FA należy rozcieńczyć roztworem FA roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco. Wybierz DPBS bez wapnia i magnezu. Rozcieńczony roztwór FA należy przechowywać nie dłużej niż jeden miesiąc. Podczas zakwaszania pH roztworu utrwalającego zmienia się z obojętnego na około 3,
    UWAGA: Ponieważ FA jest toksyczny na narządy, i rakotwórczy, stosowanie okapu wyciągowego jest obowiązkowe i należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
    1. Dodaj świeżo usuniętą próbkę tkanek miękkich do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wstaw do lodówki probówkę wirówkową o pojemności 50 ml przez 24-72 godz.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    2. Próbkę tkanek miękkich przemywać roztworem DPBS przez 1 godzinę.
  2. Aby wybarwić utrwaloną próbkę tkanek miękkich (np. całą nerkę myszy), należy umieścić tkankę miękką w 2 ml roztworu do barwienia eozyną Y i inkubować próbkę przez 24 godziny. Przechowywać próbkę na poziomej płycie wstrząsającej, aby uzyskać płynne kołysanie (ok. 60 obr./min) podczas procesu inkubacji.
    UWAGA: Roztwór do barwienia eozyną Y ma stężenie 30% (w/v) w wodzie destylowanej. Wybrać objętość roztworu barwiącego w taki sposób, aby próbka była całkowicie pokryta roztworem barwiącym i umożliwić próbce swobodne przemieszczanie się w pojemniku na próbkę. Czas inkubacji może być różny dla innych próbek i musi być odpowiednio dostosowany.
  3. Po barwieniu ostrożnie wyjmij próbkę tkanek miękkich z pojemnika na próbkę.
    1. Ostrożnie usuń nadmiar środka barwiącego za pomocą bibuły celulozowej.
    2. Umieścić próbkę tkanek miękkich w stożkowym pojemniku na próbkę powyżej fazy parowej etanolu w celu przechowywania i dalszego wykorzystania.
      UWAGA: Stożkowy pojemnik na próbkę musi zawsze zawierać kilka kropli 70% (v/v) etanolu na dnie probówki, aby utrzymać wilgotność próbki tkanek miękkich i zapobiec artefaktom.

2. Obrazowanie rentgenowskie mikrotomografii

komputerowej

UWAGA: Pomiary rentgenowskie mikroCT zostały wykonane za pomocą skanera mikroCT, który oferuje przegląd pomiarów CT (możliwość obrazowania całej próbki w polu widzenia (FOV)) oraz wykonywanie pomiarów CT o wysokiej rozdzielczości (możliwość skupienia się na jednej pożądanej objętości zainteresowania (VOI) tej samej próbki) do 1 μm.

  1. Zamontuj próbkę tkanek miękkich w odpowiednim uchwycie na próbkę. Upewnij się, że próbka jest ściśle dopasowana do uchwytu próbki, aby zapobiec przesuwaniu się próbki podczas pomiarów rentgenowskich CT.
    1. W przypadku zabarwionej nerki myszy: Przygotować uchwyt na próbkę z dwiema probówkami wirówkowymi, przy czym dno jednej probówki jest odcięte. Sklej ze sobą dwie probówki wirówkowe za pomocą kleju dwuskładnikowego. Zapewnić proste wyrównanie probówek wirówkowych wokół osi obrotu. Poczekaj, aż klej stwardnieje.
    2. Gdy uchwyt na próbkę jest gotowy do użycia, przenieś nerkę myszy do nienaruszonej probówki wirówkowej, która zawiera kilka kropli 70% (v/v) etanolu na dnie probówki.
      UWAGA: Stabilność próbki ma kluczowe znaczenie. Poświęć trochę czasu na przygotowanie próbki do pomiarów rentgenowskich TK. Próbka tkanek miękkich jest przechowywana w fazie parowej etanolu, aby utrzymać wilgotność próbki podczas pomiarów rentgenowskich CT i zapobiec kurczeniu się próbki tkanek miękkich i innym artefaktom. Próbka tkanek miękkich nie powinna stykać się z rozpuszczalnikiem, aby zapobiec gromadzeniu się rozpuszczalnika wokół próbki podczas pomiaru rentgenowskiego tomografii komputerowej, co może prowadzić do ruchu próbki podczas pomiaru lub może powodować problemy podczas rekonstrukcji. Jeżeli uchwyt próbki nie pozwala na utrzymanie rozpuszczalnika na dnie, w uchwycie na próbkę można umieścić papier celulozowy zwilżony 70% (v/v) etanolem. Należy zauważyć, że nie zaobserwowano artefaktów skurczu spowodowanych rozpuszczalnikiem etanolowym.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  2. Po dokładnym wyrównaniu próbki wybierz parametry akwizycji, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu. W przypadku prezentowanych danych z mikrotomografii komputerowej należy uzyskać skan przy napięciu szczytowym 50 kV, prądzie 3,5 W przy użyciu 1601 projekcji równomiernie rozłożonych w 360°,
    UWAGA: Parametry akwizycji dla przeglądowego skanu CT zostały wybrane w celu uzyskania najlepszej jakości obrazu. W związku z tym obiektyw aparatu 0,39x został wybrany tak, aby pokryć całą próbkę w polu widzenia (FOV). W ten sposób uzyskano efektywny rozmiar piksela wynoszący 12 μm. Czas naświetlania wynoszący 2 s na projekcję zapewnił dobry stosunek sygnału do szumu. Zwrot z inwestycji w tomografię komputerową o wysokiej rozdzielczości został określony na podstawie danych mikrotomografii komputerowej ze skanu przeglądowego. Skanery MicroCT często zawierają zintegrowane narzędzie programowe, które pozwala na precyzyjny wybór wyznaczonego zwrotu z inwestycji. Do danych CT o wysokiej rozdzielczości wybrano obiektyw kamery 4x, co dało efektywny rozmiar piksela 3,3 μm. W tym przypadku potrzebny był czas naświetlania wynoszący 15 s na projekcję.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  3. Po uzyskaniu danych z tomografii rentgenowskiej należy odpowiednio przetworzyć projekcje w celu rekonstrukcji objętości 3D. W przypadku prezentowanych danych z mikrotomografii komputerowej: Zrekonstruuj dane rentgenowskie tomografii komputerowej za pomocą zintegrowanego oprogramowania.
    UWAGA: Renderingi objętościowe danych mikroCT pokazane w Rysunek 1 i Rysunek 2 zostały wygenerowane przy użyciu oprogramowania do wizualizacji.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Obrazowanie rentgenowskie nanoCT

UWAGA: Skaner rentgenowski nanoCT został opracowany wewnętrznie. Przyrząd bez soczewek jest wyposażony w nanoogniskowe źródło promieniowania rentgenowskiego i detektor zliczający pojedyncze fotony. Można generować dane 3D o rozdzielczości do 100 nm10. Ogólnie rzecz biorąc, systemy nanoCT, w tym te z optyką rentgenowską, są dostępne na rynku i nie ograniczają się do opisywanego skanera nanoCT.

  1. Przygotowanie próbki za pomocą NanoCT
    1. Przygotować VOI próbki tkanek miękkich. Pokrój tkankę miękką na bardzo małe kawałki o długości krawędzi około 0,5 mm za pomocą skalpela i mikroskopu stereoskopowego. W przypadku nerki myszy: Przetnij nerkę myszy na dwie połówki wzdłuż najdłuższej osi. Weź połowę nerki myszy i przygotuj różne obszary anatomiczne, takie jak kora nerkowa i rdzeń nerki.
      UWAGA: Druga połowa nerki myszy została przeniesiona do histopatologii, gdzie próbka została zanurzona w parafinie i odpowiednio przetworzona, aby uzyskać typowe skrawki histologiczne, jak widać na Rysunek 3c i Rysunek 3d.
    2. Przenieś małe kawałki przed pierwszym etapem suszenia na nową szalkę Petriego, gdzie pozostają przez wszystkie kolejne etapy.
    3. Odwodnić próbki, stosując stężenia (wszystkie v/v) w %: 50, 60, 70, 80, 90, 96 i 100 etanolu zrównoważonych wodą destylowaną. Wykonuj każdy etap odwadniania przez 1 godzinę każdy.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Małe kawałki tkanki należy przechowywać przez noc w 100% etanolu.
    4. Punkt krytyczny suchy (CPD) małych kawałków tkanki.
      UWAGA: Zastosowanie CPD umożliwia całkowite odwodnienie próbki tkanki poprzez wymianę rozpuszczalnika (w tym przypadku etanolu) na środek suszący (w tym przypadku CO2 ). Było to konieczne, aby zapewnić, że próbka może być zamontowana w uchwytach na próbki nanoCT, nie porusza się podczas pomiaru i może być umieszczona bardzo blisko źródła promieniowania rentgenowskiego, aby umożliwić najlepsze powiększenie geometryczne. Konfiguracja nanoCT opiera się wyłącznie na powiększeniu geometrycznym, przy czym współczynnik powiększenia jest definiowany jako odległość od źródła do detektora w stosunku do odległości od źródła do próbki. Technika suszenia została po raz pierwszy wprowadzona przez Andersona w celu zachowania struktury 3D próbek biologicznych do mikroskopii elektronowej28. Przegląd tej techniki znajduje się w Bray29.
      1. Napełnij komorę próżniową 100% etanolem. Przenieś małe kawałki tkanki do mikroporowatej kapsułki i umieść ją w komorze próżniowej CPD. Zamknij system.
        UWAGA: Ponieważ w procesie CPD występuje wysokie ciśnienie, upewnij się, że wszystkie części CPD, w szczególności złączki, są nienaruszone, a system jest prawidłowo zamknięty.
      2. Schłodzić komorę do 6-8°C i napełnić ciekłym CO2 .
      3. Mieszając odczekaj 3 minuty, aby umożliwić prawidłowe wymieszanie dwóch składników. Ostrożnie opróżnij komorę. Upewnij się, że uchwyt próbki jest nadal pokryty rozpuszczalnikiem. Powtórzyć ten krok dziesięć razy, aby umożliwić całkowite zastąpienie etanolu CO2 w próbce.
      4. Po ostatecznym napełnieniu komory CO2 należy podgrzać maszynę do punktu krytycznego CO2 (31 °C i 73,8 bar), a następnie bardzo powoli uwalniać gazowy CO2 przez czas 30 min.
        UWAGA: Uwalnianie gazu powinno odbywać się bardzo powoli, ponieważ w przeciwnym razie na próbce może powstać skroplona woda. Upewnij się, że temperatura nie spadnie poniżej punktu krytycznego CO2 . Maszynę CPD należy otwierać dopiero wtedy, gdy całe ciśnienie zostanie uwolnione z systemu.
      5. Kawałki tkanek CPD należy szybko wyjąć z urządzenia i umieścić je na nowej szalce Petriego przechowywanej w eksykatorze przed dalszym użyciem.
        UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  2. Zamontuj kawałki tkanki CPD w odpowiednim uchwycie na próbkę. Upewnij się, że próbka jest ściśle dopasowana do uchwytu próbki, aby zapobiec przesuwaniu się próbki podczas pomiarów CT. W przypadku fragmentów tkanki nerkowej myszy CPD: Przykleić kawałki tkanki za pomocą kleju superglue do uchwytu na próbkę.
    UWAGA: Każdy niepożądany ruch próbki podczas pomiarów CT może powodować problemy podczas rekonstrukcji objętości - szczególnie podczas pozyskiwania zestawu danych o nanometrowym rozmiarze wokseli.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  3. Po dokładnym wyrównaniu próbki wybierz parametry akwizycji, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu. W przypadku prezentowanych danych nanoCT: Uzyskać projekcje przy napięciu szczytowym 60 kV z 1599 projekcjami równomiernie rozłożonymi w zakresie 360° i wielkością woksela około 400 nm.
    UWAGA: Pojedynczy pomiar CT uzyskany przy rozmiarze woksela 400 nm ma pole widzenia 75 μm w kierunku osi obrotu (pionowo) i około 560 μm w kierunku prostopadłym do osi obrotu (w poziomie). Aby badać większe objętości, rozszerzenie pola widzenia wzdłuż osi obrotu można uzyskać, łącząc wiele skanów w różnych pozycjach pionowych. Dodatkowo można wykonać tomografię lokalną w celu pomiaru próbek o większej średnicy próbki prostopadłej do osi obrotu niż podawana przez pole widzenia globalnego skanu CT. Dane z nanoCT uzyskano przy czasie naświetlania wynoszącym 4 s na projekcję. W związku z tym całkowity czas akwizycji na zestaw danych wynosił około 3,5 godz.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  4. Po uzyskaniu danych z tomografii komputerowej należy odpowiednio przetworzyć projekcje w celu odtworzenia objętości 3D.
    1. W przypadku prezentowanych danych z nanoCT należy znormalizować uzyskane projekcje za pomocą obrazów płaskiego pola. Zwiększ ostrość projekcji, używając algorytmu dekonwolucji Richardsona-Lucy'ego30,31. Użyj obrotowo symetrycznej funkcji Gaussa z odchyleniem standardowym wynoszącym jeden piksel jako jądra dekonwolucji.
    2. Zastosuj algorytm odzyskiwania fazy Paganina do wyostrzonych obrazów, aby zwiększyć kontrast tkanek miękkich. Ustaw parametry algorytmu, aby zoptymalizować jakość obrazu32. Zrekonstruuj wstępnie przetworzone projekcje za pomocą najnowocześniejszego algorytmu filtrowanej projekcji wstecznej.
      UWAGA: Rysunek 3 ocenia uzyskane dane nanoCT z odpowiednimi przekrojami histologicznymi, które miały grubość około 7 μm. W związku z tym wygenerowano warstwy projekcji o minimalnej intensywności 18 sąsiadujących ze sobą warstw nanoCT o wirtualnej grubości około 7 μm, obliczając minimalną wartość dla każdego piksela w odpowiednich warstwach. Do renderowania objętości danych nanoCT użyto oprogramowania do wizualizacji, które są wyświetlane w Rysunek 4.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje warstwy tomografii komputerowej i renderowanie objętości danych mikroCT o niskiej rozdzielczości, podkreślając poprawę kontrastu po barwieniu. Rysunek 2 pokazuje wycinki tomografii komputerowej i renderowanie objętości danych mikrotomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości pochodzących z lokalnej tomografii całej nerki myszy. Rysunek 3 pokazuje wycinki danych z tomografii komputerowej nanoCT w porównaniu z odpowiadającymi im przekrojami histologicznymi. Rysunek 4 pokazuje renderowanie warstw i objętości danych nanoCT za pomocą tomografii komputerowej, podkreślając szczegóły strukturalne na poziomie komórkowym. Pomiar mikrotomografią komputerową o niskiej rozdzielczości pozwala na przegląd całego narządu i pomaga zidentyfikować objętości zainteresowania (VOI) dla pomiaru mikrotomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości. Dzięki temu wieloskalowemu podejściu określa się VOI dla nanoCT. NanoCT umożliwia bardzo szczegółowy wgląd w próbkę tkanek miękkich na poziomie komórkowym. Badanie porównawcze z odpowiednim wycinkiem histologicznym wykazuje pełną zgodność z histopatologią. W tym przypadku podejście do obrazowania multimodalnego potwierdza wyniki uzyskane przy użyciu obu modalności.

figure-results-1
Rysunek 1. Warstwy CT i renderowanie objętościowe danych mikroCT o niskiej rozdzielczości. (a,b) Obrazy przeglądowe tej samej nerki myszy odpowiednio przed i po barwieniu, z podkreśleniem wzmocnienia kontrastu uzyskanego po zastosowaniu protokołu barwienia opartego na eozynie. Oba zestawy danych z mikrotomografii komputerowej uzyskano przy użyciu identycznych parametrów akwizycji. Rozmiar woksela w obu zestawach danych wynosi 12 μm. Wzmocnienie kontrastu uzyskane w (b) umożliwia identyfikację następujących anatomicznych obszarów strukturalnych: kora (I), rdzeń zewnętrzny (II) z dalszym rozróżnieniem na zewnętrzne paski rdzenia zewnętrznego (IIa) i wewnętrzne paski rdzenia zewnętrznego (IIb), rdzenia wewnętrznego (III), brodawki (IV) i miedniczki nerkowej (V). (c) Renderowanie objętościowe danych z mikrotomografii komputerowej pokazujące wirtualny przekrój strzałkowy przez całą nerkę myszy. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Busse i Müller et al.26 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Renderowanie warstwowe i objętościowe tomografii komputerowej danych mikroCT o wysokiej rozdzielczości pochodzących z tej samej nerki myszy po zastosowaniu opracowanego protokołu barwienia opartego na eozynie. (a) W lewym rogu znajduje się ogólny obraz mikrotomografii komputerowej, z wyróżnieniem ROI (niebieskie pole) dla wyświetlanego obrazu o wysokiej rozdzielczości. Możliwe do zidentyfikowania są następujące anatomiczne obszary strukturalne: kora (I), rdzeń zewnętrzny (II) z dalszym rozróżnieniem w zewnętrznych paskach rdzenia zewnętrznego (IIa) i wewnętrznych paskach rdzenia zewnętrznego (IIb), rdzenia wewnętrznego (III), kielicha mniejszego (IV) i naczyń (V i VI). b) Oddawanie objętości zainteresowania danych mikrotomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości uzyskanych przy objętości woksela 3,3 μm. Pokazano obszar rdzenia i wirtualny przekrój przez naczynie pochodzące z miejscowej tomografii całej nerki. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Busse i Müller et al.26. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Wycinki CT danych nanoCT (a,b) w porównaniu z wycinkami histologicznymi (c,d) uzyskanymi z tej samej nerki myszy po zastosowaniu opracowanego protokołu barwienia opartego na eozynie. (a) Obraz nanoCT tej samej próbki nerki myszy po barwieniu, rozbiorze i CPD pokazuje szczegółowe struktury regionu (IIb) widzianego w Rysunek 1 i Rysunek 2. Są one znane jako grube wznoszące się kończyny pętli Henlego. b) Wycinek projekcji o minimalnej intensywności pochodzący z tego samego zestawu danych nanoCT pokazanego w lit. a) o grubości wirtualnego przekroju wynoszącej około 7 μm, co pozwala na wyraźną wizualizację jąder komórkowych. (c) Reprezentatywny przekrój histologiczny ukazujący grube wznoszące się kończyny pętli Henlego z wyraźnym uwidocznieniem jąder komórkowych i obrzeża szczotek. Wycinek histologiczny ma przybliżoną grubość 7 μm i został uzyskany z tej samej próbki nerki myszy po zastosowaniu barwienia na bazie eozyny i zatopieniu w bloku parafinowym. d) Reprezentatywny przekrój histologiczny z zastosowaniem hematoksyliny z przeciw barwieniu, z uwydatnieniem jąder komórkowych na fioletowo. Przygotowanie przekroju histologicznego w pobliżu przekroju pokazanego w lit. c) o przybliżonej grubości 7 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Busse i Müller et al.26 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Renderowanie warstwowe i objętościowe danych nanoCT. (a) Obraz nanoCT tej samej próbki nerki myszy, przedstawiający struktury znane jako grube wznoszące się kończyny pętli Henlego. Jest to szczegółowy widok obszaru (IIb) widzianego w Rysunek 1 i Rysunek 2 uzyskany z małego fragmentu nerki o rozmiarze woksela około 400 nm. Przygotowanie próbki obejmowało barwienie, preparację i CPD. (b) Renderowanie objętościowe danych nanoCT wizualizujących strukturę 3D grubych wznoszących się kończyn pętli Henlego. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Busse i Müller et al.26 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie eozyna jest stosowana jako standardowy protokół histologiczny do znakowania cytoplazmy komórki. Środek barwiący nakłada się w postaci 0,1% (w/v) roztworu wodnego na mikroskopijne wycinki tkanek miękkich (zwykle cięte o grubości 2-10 μm)33. Zastosowanie tego znormalizowanego protokołu histologicznego do próbek tkanek 3D, takich jak cała nerka myszy, nie powoduje uzyskania obrazu CT ze wzmocnieniem kontrastu tłumienia. Z jednej strony można to przypisać niskim właściwościom tłumienia wewnętrznego tkanek miękkich dla zwykle stosowanych energii promieniowania rentgenowskiego w laboratoryjnych systemach mikrotomografii komputerowej. Zwykle tkanka miękka składa się głównie z węgla, wodoru, tlenu i azotu34, a zatem nie powoduje wzmocnienia kontrastu. Z drugiej strony, czynnikiem ograniczającym było niskie stężenie eozyny używanej do barwienia. Mimo że jedna cząsteczka eozyny zawiera cztery atomy bromku (pierwiastek bromu o wysokiej liczbie atomowej o Z = 3534), poziomy czułości wymagane do obrazowania rentgenowskiego TK nie zostały spełnione.

Aby sprostać temu wyzwaniu, jakim jest kontrast o niskim tłumieniu, zbadano kilka stężeń eozyny. Ograniczeniem jest tutaj maksymalna rozpuszczalność eozyny w wodzie, która wynosi 30% (w/v) w roztworze wodnym. Najlepsze wzmocnienie kontrastu tłumienia w obrębie tkanek miękkich zaobserwowano przy najwyższym stężeniu eozyny, którego oczekiwano zgodnie z prawem Lamberta-Beera. W związku z tym przeprowadzono końcowy protokół barwienia z najwyższym stężeniem.

Na pytanie, jak optymalnie przygotować tkankę miękką na poziomie molekularnym do procedury barwienia, aby jeszcze bardziej poprawić wzmocnienie kontrastu, odpowiedziano poprzez dostosowanie pH. W tym przypadku kluczowe okazało się zakwaszenie próbki tkanek miękkich podczas utrwalania lub przed barwieniem. Zostało to również wykazane przez Hong i wsp.35. Większą akumulację czynnika barwiącego w cytoplazmie komórki przez kwas osiągnięto dzięki poprawie oddziaływań jonowych, które były wynikiem protonowania łańcuchów bocznych aminokwasów białek i peptydów obecnych w cytoplazmie komórki. Reprezentatywny wynik podkreślający wzmocnienie kontrastu w porównaniu z niebarwioną próbką tkanek miękkich przedstawiono na rysunku 1a,b. W tym przypadku uzyskano przegląd strukturalny całej nerki myszy, wizualizujący kluczowe obszary anatomiczne, takie jak kora, rdzeń, brodawka i miedniczka nerkowa.

Prezentowany protokół barwienia jest prosty w aplikacji i składa się tylko z trzech kroków. Wymagane odczynniki są łatwo dostępne. Całkowity czas barwienia wynoszący 24 godziny jest szybki w przypadku barwienia całego narządu, co umożliwia wizualizację 3D próbek tkanek miękkich (Rysunek 1c, Rysunek 2b i Rysunek 4b) w środowisku laboratoryjnym w wielu skalach aż do poziomu komórkowego. Należy zauważyć, że całkowity czas barwienia i objętość potrzebnego roztworu barwiącego mogą wymagać pewnych dostosowań w zależności od charakteru próbki. Niemniej jednak protokół barwienia oparty na eozynie nadaje się do barwienia całych narządów, co umożliwia obrazowanie całych narządów za pomocą mikrotomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości. Nie zaobserwowano artefaktów skurczu spowodowanych rozpuszczalnikiem etanolem, który był używany do utrzymywania wilgoci próbki podczas pomiarów mikrotomografii komputerowej. W przypadku obrazowania nanoCT, które pozwala na badanie mniejszych fragmentów tkanek pobranych z oryginalnej próbki, wymagane są dodatkowe etapy przygotowawcze. Jeśli chodzi o przyszłe zastosowania histopatologiczne, skany przeglądowe dostarczą cennych informacji na temat zmienionych regionów i struktur anatomicznych, co pozwoli na określenie ROI, jak pokazano na rycinie 2a. Można je badać w 3D za pomocą mikrotomografii komputerowej (ryc. 1c i ryc. 2b) lub nanotomografii komputerowej (ryc. 4b) i oceniać w 2D z histologią (ryc. 3).

Kolejną mocną stroną protokołu jest pełna zgodność z histopatologią w odniesieniu do procedury barwienia H&E. Zastosowanie procedury barwienia na bazie eozyny do próbek zbiorczych nie utrudnia dalszych badań histologicznych (ryc. 3), mimo że zastosowane stężenie eozyny jest znacznie wyższe w porównaniu z roztworem do barwienia histologicznego. Wycinek nanoCT o wirtualnej grubości około 400 nm (ryc. 3a) wypada już bardzo dobrze w porównaniu z przekrojem histologicznym (ryc. 3c), który pochodził z odpowiedniej próbki tkanek miękkich. Biorąc pod uwagę przybliżoną grubość przekroju histologicznego wynoszącą 7-10 μm, wygenerowanie warstw projekcji o minimalnej intensywności danych nanoCT (rysunek 3b), które odpowiadają wirtualnej grubości około 7 μm, pozwala na lepsze porównanie z przekrojem histologicznym (rysunek 3c). W tym przypadku jądra komórkowe są wyraźnie widoczne jako obszar nieatenuacyjny, ponieważ eozyna specyficznie barwi białka i peptydy w cytoplazmie komórki33.

Możliwe jest zastosowanie dalszego barwienia przeciwstawnego standardowymi metodami histologicznymi, nawet jeśli kolejność barwienia w porównaniu ze standardową procedurą barwienia histologicznego została odwrócona. Rozpoczęcie od opracowanego protokołu barwienia opartego na eozynie do tomografii komputerowej, a następnie barwienie przeciwstawne tych histologicznych skrawków opartych na eozynie za pomocą hematoksyliny, pozwala na pełną kompatybilność i skutkuje wysokiej jakości barwieniem wykazującym oczekiwaną formę wyglądu. Specyficzne dla jąder komórkowych barwienie kwaśną hematoksyliną Mayera zastosowano do przekroju histologicznego, podkreślając jądra komórkowe na fioletowo (ryc. 3d). Stosowanie histologicznego barwienia przeciwstawnego jest obecnie ograniczone do barwienia H. Należy ocenić inne standardowe histologiczne barwienia przeciwstawne, takie jak kwas periodyczny, zasada Schiffa, Elastica van Gieson lub srebro Gomori, a także przetestować zgodność z technikami immunohistologicznymi.

Protokół barwienia oparty na eozynie pozwala na (i) celowanie specyficzne dla cytoplazmy komórek, (ii) jednorodne i całkowite barwienie, (iii) łatwą implementację, (iv) szybką penetrację tkanki bez tworzenia artefaktów, takich jak pierścienie dyfuzyjne, (v) barwienie dużych i gęstych próbek tkanek miękkich oraz (vi) pełną zgodność z histopatologią w odniesieniu do barwienia H&E. Wymagania te są ważne, aby umożliwić wizualizację tkanek miękkich za pomocą tomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości aż do poziomu komórkowego. W połączeniu z niedawno opracowanymi urządzeniami nanoCT 12,36,37 możliwe jest nieniszczące generowanie wirtualnych wycinków histologicznych, które są porównywalne pod względem kontrastu i rozdzielczości z konwencjonalnymi danymi histologicznymi. To połączone podejście umożliwi ustanowienie tomografii rentgenowskiej jako cennego narzędzia do wizualizacji 3D mikroskopijnych struktur tkankowych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Enkenowi Drecollowi za dyskusje histologiczne i niezwykle pomocny zespół z Excillum AB, Szwecja. Dziękujemy za wsparcie finansowe za pośrednictwem Klastra Doskonałości DFG, Monachijskiego Centrum Zaawansowanej Fotoniki (MAP) oraz Programu DFG im. Gottfrieda Wilhelma Leibniza. Ponadto projekt badawczy uzyskał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie dotacji "Maria Skłodowska-Curie" nr H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
50-ml probówka wirówkowa firmy FalconVWR734-0453
Roztwór formaldehydu, 37%Carl RothCP10.2bezkwasowy, stabilizowany ~10% MeOH
Lodowaty kwas octowyAlfa Aesar36289.AP
Sól disodowa eozyny YSigma-AldrichE4382certyfikowany przez Biological Stain Commission
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)MerckL1825Forma Dulbecco, bez wapnia i magnezu
Probówki na próbki firmy NalgeneCarl RothATK5.1
Wytrząsarka na biegunach ST5CAT60281-0000
Bibułka celulozowaVWR115-0600
Kleszcze, firmy USBECK Laborgerä TeVWR232-0096
Probówki do mikrowirówek firmy EppendorfVWR211-2120Safe-lock, 2,0 ml
Absolut etanolu firmy Baker AnalizowaneVWR80252500
jednorazowego użytku firmy AesculapVWR 
szalka Petriego firmy SterilinVWR391-2019
Plastikowa pipeta PasteuraCarl RothEA68.1z podziałką, 1 ml
Eksykator firmy DuranVWRSCOT247826954
Smar silikonowy firmy BayerSigma-Aldrich85404wysokopróżniowy
Butla na dwutlenek węgla ze stojakiemLinde370011310 kg, krótki
mikroporowata kapsułka zabiegowaPLANO GmbH4614wielkość porów 78 i mikro; m (B)
Bal-Tec CPD 030Bal-Tec AGCO2 jako środek osuszający
Mikroskop stereoskopowy Stemi 2000-C z wyświetlaczem LCD KL 1500Zeissten mikroskop stereoskopowy został zaktualizowany(1)
Zeiss Xradia Versa 500Zeissten skaner mikroCT został zaktualizowany(2)
Avizo Fire 8.1Thermo Fisher Scientific
Detektor PILATUS jako część skanera nanoCTDetektor zliczania pojedynczych fotonów Dectris (4,5) dostępne na rynku systemy nanoCT (6,7)
wysokostrumieniowa lampa transmisyjna promieniowania rentgenowskiego nanofokus(3); dostępne na rynku systemy nanoCT (6,7)
>(1) Niemcy, Z. Informacje o produkcie ZEISS: Mikroskopy stereoskopowe ZEISS https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (06 września 2019 r.).
(2) Niemcy, Z. Informacje o produkcie ZEISS: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (10 kwietnia 2019 r.).
(3) Nachtrab, F. et al. Opracowanie detektora opartego na Timepix dla projektu NanoXCT. Dziennik Oprzyrządowania 10 (11), C11009, (2015).
(4) Kraft, P. i wsp. Wydajność modułów detektora PILATUS zliczających pojedyncze fotony. Dziennik Promieniowania Synchrotronowego 16 (3), 368-375, (2009).
(5) Kraft, P. i wsp. Charakterystyka i kalibracja detektorów PILATUS. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009).
(6) Niemcy, Z. Informacje o produkcie ZEISS: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (9 kwietnia 2019 r.).
(7) Firma, GE Informacje o produkcie: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (10 kwietnia 2019 r.).
Bezpieczny skalpel AESCBA210nanofocus źródło promieniowania rentgenowskiego w ramach skanera nanoCT Excillum

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Theory and Practice of Histological Techniques. 7th edn. , Churchill Livingstone Elsevier. (2013).
  2. Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 18 (4), 111-116 (2014).
  3. McInnes, E. Artefacts in histopathology. Comparative Clinical Pathology. 13 (3), 100-108 (2005).
  4. Andreasen, A., Drewes, A., Assentoft, J., Larsen, N. Computer-assisted alignment of standard serial sections without use of artificial land-marks. A practical approach to the utilization of incomplete information in 3-d reconstruction of the hippocampal region. Journal of Neuroscience Methods. 45 (3), 199-207 (1992).
  5. Braverman, M. S., Braverman, I. M. Three-dimensional reconstructions of objects from serial sections using a microcomputer graphics system. Journal of Investigative Dermatology. 86 (3), 290-294 (1986).
  6. Denk, W., Hortsmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  7. Mohun, T. J., Weninger, J. W. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 573-578 (2011).
  8. Weninger, J. W., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-d reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anatomy and Embryology. 197 (5), 341-348 (1998).
  9. Odgaard, A., Andersen, K., Melsen, F., Gundersen, H. J. G. A Direct Method for Fast 3-Dimensional Serial Reconstruction. Journal of Microscopy. 159, 335-342 (1990).
  10. Müller, M., et al. Myoanatomy of the velevt worm leg revealed by labratory-based nanofocus X-ray source tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12378-12383 (2017).
  11. Salomon, M., Hanke, R., Krüger, P., Uhlmann, N., Voland, V. Realization of a computed tomography setup to achieve resolutions below 1 µm. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A. 591, 50-53 (2008).
  12. Tkachuk, A., et al. X-ray computed tomography in Zernike phase contrast mode at 8 keV with 50-nm resolution using Cu rotating anode X-ray source. Zeitschrift für Kristallographie. 222, 650-655 (2007).
  13. Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10, 26-34 (2007).
  14. Jahn, H., et al. Evaluation of contrasting techniques for X-ray imaging of velvet worms (Onychophora). Journal of Microscopy. 270 (3), 343-358 (2018).
  15. Martins de S. e Silva, J., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Scientific Reports. 5, 14088(2015).
  16. Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238, 632-640 (2009).
  17. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11(2009).
  18. Mitzutani, R., et al. X-Ray Microtomographic Imaging of Three-Dimensional Structure of Soft Tissues. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 359-363 (2008).
  19. Pauwels, E., Loo, D. v, Cornillie, P., Brabant, L., Hoorebeke, L. v An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250, 21-31 (2013).
  20. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  21. Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLOS ONE. 12 (2), 0170597(2017).
  22. Jeffrey, N. S., Stephenson, R. S., Gallagher, J. A., Cox, P. Micro-computed tomography with iodine staining resolves the arrangement of muscle fibres. Journal of Biomechanics. 44, 189-192 (2011).
  23. Johnson, J. T., et al. Virtual Histology of Transgenic Mouse Embryos for High-Throughput Phenotyping. PLOS Genetics. 2, 61(2006).
  24. Leszczyński, B., et al. Visualization and Quantitative 3D Analysis of Intraocular Melanoma and Its Vascularization in a Hamster Eye. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 332(2018).
  25. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Mircon. 43, 104-115 (2012).
  26. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  27. Müller, M., et al. Non-destructive high-resolution 3D virtual histology enabled through a cell nucleus-specific stain for X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8, 17855(2018).
  28. Anderson, T. F. Techniques for the preservation of three-dimensional structure in preparing specimens for the electron microscope. Transactions of the New York Academy of Sciences. 13 (4), Series II 130-134 (1951).
  29. Bray, D. Supercritical Fluid Methods and Protocols. Methods in Biotechnology. Williams, J. R., Clifford, A. A. 13, Humana Press. 235-243 (2000).
  30. Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-765 (1974).
  31. Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. The Journal of the Optical Society of America. 62 (1), 55-59 (1972).
  32. Paganin, F., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206, 33-40 (2002).
  33. Riedelsheimer, B., Büchl-Zimmermann, S. Mikroskopische Technik. Mulisch, M., Welsch, U. , Spektrum-Verlag GmbH. Berlin Heidelberg. Ch. 10 193-194 (2015).
  34. Hubbell, J. H., Seltzer, S. M. Tables of Xray mass attenuation coefficients and mass energy-absorption coefficients from 1 keV to 92 keV and 48 additional substances of dosimetric interest, Table 3. National Institute of Standards and Technology. , (1995).
  35. Hong, H. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. An Eosin Y Method for Protein Determination in Solution. Analytical Letters. 32 (12), 2427-2442 (1999).
  36. Dierick, M., et al. Recent Micro-CT Scanner Developments at UGCT. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B. 324, 35-40 (2014).
  37. Kastner, J., Plank, B., Heinzl, C. Advanced X computed tomography methods: High resolution CT, quantitative CT, 4DCT and phase contrast CT. Proceedings of Digital Industrial Radiology and Computed Tomography. , 120-132 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

X ray Staining MethodEosin Y StainingX ray MicroCTX ray NanoCTSoft Tissue Imaging3D Tissue VisualizationMouse Kidney ImagingSample Preparation ProtocolCritical Point DryingMultiscale Imaging Approach

Related Articles