Wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę selekcji nowych wariantów ligazy białkowej biotyny E. coli BirA, która biotynyluje określony peptyd docelowy. Protokół opisuje budowę plazmidu do bakteryjnego wyświetlania docelowego peptydu, generowanie biblioteki BirA, selekcję i charakterystykę wariantów BirA.

Streszczenie

Biotyna to atrakcyjna potranslacyjna modyfikacja białek, która dostarcza potężnego znacznika do izolacji i wykrywania białka. Biotynylacja enzymatyczna przez ligazę białka biotyny E. coli BirA jest wysoce specyficzna i pozwala na biotynylację białek docelowych w ich naturalnym środowisku; jednak obecne zastosowanie biotynylacji za pośrednictwem BirA wymaga obecności syntetycznego peptydu akceptorowego (AP) w białku docelowym. Dlatego jego zastosowanie jest ograniczone do białek, które zostały zaprojektowane tak, aby zawierały AP. Celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie bakteryjnego wyświetlacza peptydu pochodzącego z niezmodyfikowanego białka docelowego do selekcji wariantów BirA, które biotynylują peptyd. System oparty jest na pojedynczym plazmidzie, który pozwala na koekspresję wariantów BirA wraz z rusztowaniem do wyświetlania peptydu na powierzchni bakterii. Protokół opisuje szczegółową procedurę włączenia docelowego peptydu do rusztowania wyświetlacza, stworzenia biblioteki BirA, wyboru aktywnych wariantów BirA i wstępnej charakterystyki izolowanych wariantów BirA. Metoda ta zapewnia wysoce skuteczny system selekcji do izolacji nowych wariantów BirA, który może być wykorzystany do dalszej ukierunkowanej ewolucji ligaz biotynowo-białkowych, które biotynylują natywne białko w złożonych roztworach.

Wprowadzenie

Biotynylacja białka tworzy potężny znacznik do jego izolacji i wykrywania powinowactwa. Biotynylacja enzymatyczna białek jest wysoce specyficzną modyfikacją potranslacyjną katalizowaną przez ligazy biotynowo-białkowe. Ligaza białka biotyny E. coli BirA jest niezwykle specyficzna i kowalencyjnie biotynyluje tylko ograniczoną liczbę naturalnie występujących białek przy określonych resztach lizyny¹. Zalety katalizowanej biotynylacji BirA są obecnie wykorzystywane poprzez fuzję białka docelowego z małym syntetycznym 15-aminokwasowym peptydem akceptorowym biotyny (AP), który jest skutecznie biotynylowany² i pozwala na wysoce specyficzną i wydajną biotynylację in vivo i in vitro poprzez koekspresję lub dodanie BirA^3,4,5. Chociaż katalizowana in vivo i in vitro ligacja białkiem biotyny z BirA jest atrakcyjną strategią znakowania, jej zastosowanie ogranicza się do próbek zawierających białka skondensowane z AP. Celem tej metody jest opracowanie nowych mutantów ligaz biotynowo-białkowych, które selektywnie biotynylują natywne niemodyfikowane białka, a tym samym rozszerzają liczbę zastosowań, w których można zastosować strategię biotynylacji enzymatycznej.

Funkcja białka może być rozwijana poprzez iteracyjne rundy mutacji genu, selekcji i amplifikacji wariantów genów o pożądanej funkcji. Silna i skuteczna strategia selekcji ma kluczowe znaczenie dla ukierunkowanej ewolucji, a aktywność ligazy biotynowo-białkowej jest łatwo selekcjonowana ze względu na silne wiązanie między biotyną a streptawidyną i jej homologami⁶. Technologie wyświetlania fagów pozwalają na wybór fagów, które wyświetlają biotynylowane peptydy^7,8. Ponieważ jednak amplifikacja izolowanych fagów wymaga zakażenia gospodarza bakteryjnego, selekcja fagów za pomocą streptawidyny tworzy wąskie gardło, ponieważ wiązanie biotyny ze streptawidyną o wysokim powinowactwie jest praktycznie nieodwracalne w warunkach niedenaturacyjnych. Aby zapewnić odwracalne wiązanie biotynylowanych fagów, zastosowano monomeryczne awidyny o niższym powinowactwie, co spowodowało skromne ~10-krotne wzbogacenie⁷. Niedawno opracowaliśmy metodę ekspozycji bakteryjnej do izolacji nowych wariantów BirA, która eliminuje potrzebę elucji z matrycy powinowactwa, a tym samym usuwa wąskie gardło z poprzednich systemów selekcji BirA⁹. Rzeczywiście, nasz bakteryjny system wyświetlania pozwala na >1 000 000-krotne wzbogacenie aktywnych klonów w jednym kroku selekcji⁹, zapewniając w ten sposób skuteczny system selekcji dla ukierunkowanej ewolucji nowych wariantów BirA.

Nasz bakteryjny system wyświetlania składa się z dwóch komponentów, BirA z C-końcowym znacznikiem 6xHis oraz białka rusztowania, które pozwala na wyświetlanie na powierzchni docelowego peptydu. Użyliśmy białka X z permutowaną koliście permutowaną błoną zewnętrzną wzmocnionego białkiem rusztowania (eCPX), ponieważ skuteczne wyświetlanie peptydów można zaobserwować zarówno na N, jak i C-końca10^,< klasa sup = "xref">11. Fuzja docelowej sekwencji peptydowej z C-końcem eCPX zapewnia biotynylację bakterii wykazujących ekspresję aktywnych wariantów BirA. Bakterie pozwalają na efektywną selekcję streptawidyny, ponieważ biotynylowany peptyd jest teraz wyświetlany na powierzchni (Rysunek 1a).

Celem tej metody jest wybranie nowych wariantów BirA, które biotynylują sekwencje peptydowe obecne w natywnych białkach. System jest kodowany przez geny obecne na plazmidzie pBAD-BirA-eCPX-AP, który zawiera indukowany arabinozą promotor kontrolujący BirA (araBAD) i promotor T7 kontrolujący eCPX⁹ (Rysunek 1b). Niniejszy protokół opisuje szczegółową procedurę 1) włączenia peptydu pochodzącego z białka docelowego do C-terminala eCPX, 2) stworzenia biblioteki mutacyjnej BirA przez podatny na błędy PCR, 3) selekcji bakterii wiążących streptawidynę przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie (MACS), 4) kwantyfikacji wzbogacenia bakterii oraz 5) wstępnej charakterystyki izolowanych klonów.

Protokół

1. Wprowadzenie sekwencji sekwencjonowania kodującego peptydy w pBAD BirA-eCPX-AP

UWAGA: Aby wybrać warianty BirA, które biotynylują natywne białko docelowe, zacznij od zidentyfikowania 15-aminokwasowej sekwencji peptydowej w podstawowej sekwencji białek, która zawiera co najmniej jedną resztę lizyny (K).

1. Przejdź do zestawu do manipulacji sekwencjami¹².
2. Wklej zidentyfikowaną sekwencję peptydów 15-aminokwasowych w polu wejściowym w formacie FASTA i naciśnij Prześlij.
3. Wybierz i skopiuj odwrotną translację 45 nukleotydów sekwencji peptydowej.
4. Pobierz plik GenBank dla pBAD-BirA-eCPX-AP z http://n2t.net/addgene:121907.
5. Załaduj plik do edytora plazmidów (np. ApE) i w oknie funkcji wybierz sekwencję AP oznaczoną jako "AviTag™".
6. Kliknij prawym przyciskiem myszy podświetloną sekwencję AP w oknie sekwencji DNA i wybierz Wklej Rev-Com z menu kontekstowego.
   nuta: Sekwencja kodująca eCPX jest w odwrotnym kierunku, a zatem sekwencja kodująca peptydy powinna być wklejona jako odwrotne uzupełnienie.
7. Kliknij prawym przyciskiem myszy podświetloną sekwencję i wybierz opcję Nowy obiekt.
8. Dodaj opisową nazwę wstawionej sekwencji i naciśnij OK.
9. Wybierz opcję Zapisz jako w menu Plik, aby zapisać zmodyfikowany plik.
10. Zaprojektuj starter do przodu tak, aby zawierał ostatnie 30 nukleotydów odwrotnego dopełniacza sekwencji kodującej peptydy i dodaj sekwencję nukleotydową wiążącą plazmid (3'-GCGGCCGCCTGC-5') do jej końca 5'.
11. Zaprojektuj odwrotny starter tak, aby zawierał pierwsze 30 nukleotydów odwrotnego dopełniacza sekwencji kodującej peptyd i dodaj sekwencję nukleotydową wiążącą plazmid (3'- CTTAAGTAATGTTTAACGAATTCGAG-5') do jej końca 5'.
12. Ustawić reakcję PCR o objętości 20 μl w cienkościennej probówce do PCR, dodając odczynniki wymienione w tabeli 1.
13. Przenieść probówkę do termocyklera i przeprowadzić PCR przy użyciu programu z początkową denaturacją w temperaturze 98 °C przez 30 s, 30 cyklami [15 s w 98 °C, 15 s w 60 °C i 3 min w 72 °C], końcowym przedłużeniem przez 2 minuty w temperaturze 72 °C i utrzymaniem w temperaturze 4 °C.
14. Przeprowadzić 5 μl reakcji PCR na 1% żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację produktu PCR o zawartości ~6 kb.
    nuta: Jeśli nie zaobserwuje się żadnego produktu PCR, zoptymalizuj warunki PCR zgodnie z instrukcjami producenta. W tym miejscu protokół można wstrzymać.
15. Dodać 1 μl DpnI do reakcji PCR i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C
16. Przekształć kompetentną E. coli za pomocą 2 μl strawionej reakcji PCR z dpnI i umieść ją na płytkach bulionu lizogenicznego (LB)/Amp. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
17. Zaszczepić 5 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny pojedynczą kolonią. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    nuta: Zaleca się przetestowanie co najmniej 6 kolonii.
18. Przygotuj zapasy do zamrożenia 850 μl każdej kultury przez noc, dodając glicerol do końcowego stężenia 15% do kultury. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
19. Ekstrahuj plazmidowe DNA z pozostałych 4 ml kultury za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA mini-prep.
20. Potwierdź prawidłowe wprowadzenie sekwencji kodującej peptyd przez sekwencjonowanie DNA przy użyciu startera terminala T7 (GCTAGTTATTGCTCAGCGG).

2. Generowanie biblioteki BirA

UWAGA: Początkowa biblioteka mutacji BirA (Rysunek 1c, krok 1) jest tworzona przez podatny na błędy PCR. Inne metody generowania biblioteki mutacyjnej BirA prawdopodobnie również będą działać.

1. Zsyntetyzować zmutowane megaprimery ze starterami BirA-6xHis do przodu (ATGAAGGATAACACCGTGCC) i do tyłu (TCAATGATGATGATGATGTTT), używając 1 ng pBAD-BirA-eCPX z docelową sekwencją peptydową (przygotowaną i potwierdzoną w kroku 1.20) jako matrycą i 35 cyklami PCR z temperaturą wyżarzania 60 °C zgodnie z instrukcją producenta.
2. Przeprowadzić 5 μl reakcji amplifikacji na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić amplifikację produktu PCR o wartości 984 pz.
3. Oczyść produkt PCR z pozostałych 45 μl reakcji amplifikacji za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR i użyj spektrofotometru do ilościowego określenia wydajności DNA.
   nuta: Oczyszczanie z pojedynczej reakcji amplifikacji o pojemności 45 μl na ogół daje wystarczającą wydajność (>250 ng).
4. Przygotować próbkę reakcji w cienkościennej probówce do PCR, dodając odczynniki wymienione w tabeli 2.
5. Przenieść mieszaninę reakcyjną do termocyklera i przeprowadzić PCR ze zmutowanymi megastarterami przygotowanymi w kroku 2.3, stosując następujące parametry: 1 min w temperaturze 95 °C i 25 cykli po 50 s w temperaturze 95 °C, 50 s w temperaturze 60 °C i 12 min w temperaturze 68 °C. Przechowywać reakcję w temperaturze 4 °C.
6. Dodać 1 μl enzymu restrykcyjnego DpnI bezpośrednio do reakcji amplifikacji i delikatnie wymieszać.
7. Odwirować mieszaninę reakcyjną i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
8. Przekształć kompetentne komórki E. coli T7 Express lysY/Iq za pomocą 2 μl reakcji DpnI.
9. Zaszczepić 100 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny przekształconymi komórkami i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
10. Przygotować zapasy do zamrażania z 10 ml nocnej kultury w LB z 15% glicerolem i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Wybór bakterii wykazujących ekspresję biotynylowanego peptydu

UWAGA: Ta część protokołu obejmuje kroki 2-5 z Rysunek 1c. Zdecydowanie zaleca się, aby podejście selekcyjne było skonfigurowane przy użyciu pBAD-BirA-eCPX-AP i pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) jako kontroli dodatnich i negatywnych.

1. Zaszczepić 100 ml LB zawierającego 1% glukozy i 100 μg/ml ampicyliny 1 ml biblioteki BirA i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
2. Zaszczepić 5 ml LB zawierającego 1% glukozy i 100 μg/ml ampicyliny 100 μl nocnej hodowli.
3. Inkubować przez 2 godziny i 30 minut, aż kultura osiągnie OD₆₀₀ około 0,5.
4. Indukować ekspresję eCPX i BirA za pomocą 0,2% w/v L-arabinozy, 100 μM izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i 100 μM biotyny i wstrząsać kulturą z prędkością 200 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
5. Odwirować kulturę przez 10 minut przy 5 000 x g i usunąć supernatant.
6. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego PBS i odwirować przy 5 000 x g przez 5 minut.
7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 400 μl lodowatego PBS i przechowywać komórki na lodzie.
8. Usuń 10 μl zawieszonych komórek i przechowuj na lodzie w probówce o pojemności 1,5 ml oznaczonej "Wejście".
9. Przemyć 20 μl kulek magnetycznych streptawidyny w 1 ml lodowatego PBS i umieścić probówkę w laboratoryjnym separatorze magnetycznym przed ostrożnym usunięciem supernatantu.
10. Ponownie zawiesić kulki magnetyczne streptawidyny w 20 μl lodowatego PBS i przenieść do 390 μl zawieszonych komórek z kroku 3.8.
11. Wymieszać delikatnie pipetując, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    nuta: Nie należy wirować, ponieważ może to spowodować lizę komórek. Agregacja kulek jest często obserwowana przy dużej liczebności bakterii wykazujących biotynylowany peptyd.
12. Umieścić kolumnę z kulkami ferromagnetycznymi w magnetycznym separatorze cząstek i przemyć 5 ml lodowatego PBS.
13. Przenieś komórki i kulki magnetyczne streptawidyny do kolumny przymocowanej w separatorze.
14. Po opróżnieniu zbiornika kolumny dodać 500 μl lodowatego PBS i powtarzać, aż kolumna zostanie przemyta całkowitą objętością 5 ml lodowatego PBS.
15. Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją w probówce o pojemności 1,5 ml.
16. Odpipetować 1 ml lodowatego PBS na kolumnę i wymyć magnetycznie znakowane komórki, nakładając tłok dostarczony z kolumną.
17. Przenieś probówkę o pojemności 1,5 ml do separatora stołowego i umyj magnetycznie oznakowaną komórkę 1 ml lodowatego PBS.
18. Delikatnie ponownie zawieś magnetycznie znakowane komórki w 1 ml lodowatego PBS przed wyjęciem i przechowywaniem 10 μl reprodukcji w probówce o pojemności 1,5 ml oznaczonej "Wyjście".
19. Zaszczepić 100 ml LB zawierającego 1% glukozy i 100 μg/ml ampicyliny magnetycznie znakowanymi komórkami i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
20. Następnego dnia użyj 10 ml kultury przez noc do przygotowania bulionu zamrażarskiego z komórkami w LB z 15% glicerolem i przechowuj w temperaturze -80 °C i 1 ml kultury przez noc do następnej rundy selekcji, tj. kroku 3.2.
    nuta: Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się 3-5 rund selekcji w celu wzbogacenia bakterii wiążących streptawidynę.

4. Kwantyfikacja wzbogacenia

UWAGA: Kwantyfikacja żywych bakterii w próbkach "wejściowych" i "wyjściowych" jest przeprowadzana po każdej rundzie selekcji poprzez posiewanie seryjnych rozcieńczeń próbek i późniejsze liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU).

1. Dodać 990 μl lodowatego PBS do próbek wejściowych (od kroku 3.8) i wyjściowych (od kroku 3.18) i oznaczyć probówki odpowiednio "Wejście ^10-2" i "Wyjście ^10-2".
2. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia próbek "Wejście ^10-2" i "Wyjście ^10-2" w lodowatym PBS, aż do osiągnięcia końcowego rozcieńczenia ^10-10 w próbce wejściowej i ^10-4 w próbce wyjściowej.
3. Umieścić 100 μl próbek z "wejścia ^10-6", "wejścia ^10-8", "wejścia ^10-10", "wyjścia ^10-2", "wyjścia ^10-3" i "wyjścia ^10-4" na płytkach LB/Amp i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
4. Policz liczbę kolonii na płytkach z wyraźnie oddzielonymi koloniami. Pomnóż liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia, aby uzyskać liczbę stężeń bakterii/100 μl.
5. Obliczyć całkowitą liczbę bakterii w próbkach wejściowych i wyjściowych, mnożąc stężenie komórek odpowiednio przez objętość wejściową (400 μl) i wyjściową (1 ml), a następnie oszacuj wzbogacenie, dzieląc wynik wyjściowy przez liczbę komórek wejściowych.
   nuta: Znaczne wzbogacenie powinno być widoczne po 3-5 rundach selekcyjnych

5. Charakterystyka wybranego wariantu BirA

UWAGA: Charakterystykę można przeprowadzić po wybraniu wariantów BirA z pierwszej biblioteki BirA; jednak warianty BirA zazwyczaj mają niską aktywność w stosunku do peptydu. W związku z tym przed charakterystyką można również przeprowadzić dodatkową rundę mutacji i selekcji. Zazwyczaj 10 klonów z ostatniej rundy selekcyjnej jest izolowanych w celu dalszej charakteryzacji.

1. Zaszczepić 5 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny wybranymi klonami z ostatniej rundy selekcyjnej. Ponadto zaszczepić 5 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny T7 Express lysY/Iq E. coli przekształconym za pomocą pBAD-BirA-eCPX-AP, który zostanie wykorzystany jako kontrola pozytywna dla western blot opisanego poniżej.
2. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
3. Przygotuj zapasy do zamrożenia 850 μl każdej kultury przez noc, dodając glicerol do końcowego stężenia 15% do kultury. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
4. Zaszczepić 5 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny 100 μl nocnej hodowli i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 2 godziny.
5. Wyodrębnij plazmidowe DNA z pozostałych 4 ml kultury za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA mini-prep. Wykonaj sekwencję DNA w kierunku do przodu i do tyłu wariantów BirA za pomocą starterów pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) i pTrcHis rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG).
6. Dodać 0,2% w/v L-arabinozy i 100 μM IPTG oraz 100 μM biotyny do kultur z kroku 5.4 i wstrząsać kulturą z prędkością 200 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu wywołania ekspresji wariantów eCPX i BirA.
7. Przenieść 65 μl kultury do probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 25 μl buforu ładującego próbkę i 10 μl środka redukującego.
8. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
9. Załadować próbkę (łącznie z kontrolą dodatnią) na 12% żel poliakryloamidowy SDS wraz ze znacznikiem wielkości i przeprowadzić elektroforezę żelową pod napięciem 200 V przez około 45 minut, aż do wyraźnego rozdzielenia standardowych pasm 20, 25 i 37 kDa.
10. Uwolnij żel z kasety i zmontuj kanapkę do osuszania żelu na membranie PVDF.
11. Elektroblot przy 35 V przez 2 godziny na lodzie.
12. Usunąć membranę PVDF i inkubować w buforze blokującym [PBS, 0,05% Tween-20, 3% odtłuszczone mleko w proszku] przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wstrząsaniem.
13. Przygotować roztwór do wykrywania biotyny, rozcieńczając streptawidynę-HRP w stosunku 1:1000 w PBST.
    nuta: Bufor blokujący zawiera biotynę i dlatego nie powinien być stosowany jako bufor rozcieńczający streptawidynę-HRP.
14. Odrzucić bufor blokujący, szybko przemyć membranę w PBST [PBS, 0,05% Tween-20] i dodać roztwór do wykrywania biotyny. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.
15. Wyrzuć roztwór do wykrywania biotyny i dokładnie umyj membranę w PBST przez 5 minut dwa razy i 10 minut raz, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
16. Wyrzuć PBST, dodaj 2 ml mieszanki ECL i inkubuj przez 1 minutę z wytrząsaniem.
17. Szybko wysuszyć membranę na bibułce i wywołać obraz na kliszy rentgenowskiej lub w cyfrowym systemie obrazowania żelowego.
    nuta: Na torze obciążonym kontrolą pozytywną powinny być wyraźnie widoczne dwa wyraźne prążki reakcji streptawidyny: biotynylowane białko endogennie eksprymowane o masie 30 kDa i pasmo eCXP-AP o masywie ~22 kDa. Jeśli 10 wybranych kolonii może biotynylować wyświetlany peptyd, powinno być widoczne pasmo o wartości ~22 kDa. Intensywność tych pasm jest na ogół niższa niż w przypadku kontroli dodatniej i w związku z tym może wymagać dłuższych czasów ekspozycji.

Wyniki

Western blot bakterii eksprymujących pBAD-BirA-eCPX-AP wytwarza pasmo reagujące na streptawidynę ~22 kDa zgodne z masą cząsteczkową eCPX (Rysunek 2a). W przeciwieństwie do BirA-6xHis, biotynylowany eCPX-AP był obecny zarówno w kulturach nieindukowanych, jak i indukowanych (Rysunek 2a) ze względu na niewielki stopień aktywności promotora T7 nawet w kulturach nieindukowanych, a następnie biotynylację AP przez endogenny BirA. W kulturach z ekspresją B...

Dyskusja

Jeśli chodzi o wszystkie metody selekcji, ogromne znaczenie ma surowość etapów prania. Ponieważ bakterie nie muszą być eluowane z kulek przed amplifikacją wybranych klonów, do wyboru wariantów BirA ^7,8 można zastosować wiązanie o wysokim powinowactwie między biotyną a streptawidyną, zamiast stosowania awidyn o niższym powinowactwie, jak to wcześniej robiono w systemie wyświetlania fagów. Gwarantuje to, że rzadkie klony są wybierane, a niebiotynylowane bakterie są...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% prefabrykowany żel poliakrylamidowy	Bio-Rad	4561033
Ampicilin	Sigma-Aldrich	A1593
ApE - Edytor plazmidów v2.0	NA	NA	pobrane z http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Biotyna	Sigma-Aldrich	B4501
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
DPBS (10x), bez wapnia, bez magnezu	ThermoFischer Scientific	14200083
DpnI	New England BioLabs	R0176
Dynabeads MyOne Streptawidyna C1	ThermoFischer Scientific	65001
GenElute Plasmid Miniprep	Kit Sigma-Aldrich	PLN350 PLN350
Zestaw mutagenensji GeneMorph II EZClone	Domain Agilent Technologies	200552
Glukoza	Sigma-Aldrich	G8270
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Immobilon-P Membrana PVDF	Millipore	IPVH15150
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
LS Kolumny	Miltenyi Biotec	130-042-401
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NEB 5-alfa Kompetentny E. coli	New England BioLabs	C2987
NuPAGE LDS Bufor do próbek (4x)	ThermoFischer Scientific	NP0007
NuPAGE Środek redukujący próbki (10x)	ThermoFischer Scientific	NP0009
pBAD-BirA-eCPX-AP	Addgene	121907	Użyto matrycy i kontroli pozytywnej
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)	Addgene	121908	kontroli ujemnej
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności	New England BioLabs	M0491	Do insercji sekwencji peptydowej w pBAD-BirA-eCPX-AP wystarczy dowolna polimeraza o wysokiej wierności
Separator QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
Mleko odtłuszczone Proszek	Sigma-Aldrich	70166
Streptavidin-HRP	Agilent Technologies	P0397
T7 Express lysY/IQ Kompetentny E. coli	New England BioLabs	C3013
Trypton	Millipore	T9410
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL103001EA
Ekstrakt z drożdży	Sigma-Aldrich	Y1625