Artykuł metodologiczny

Monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzyludzkich za pomocą mikroskopii konfokalnej

DOI:

10.3791/60270

⸱

30 stycznia 2020

 , 
1Department of Dentistry and Oral Health, Aarhus University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje hodowlę międzykrólestwowych biofilmów składających się z Candida albicans i Streptococcus mutans oraz przedstawia metodę opartą na mikroskopii konfokalnej do monitorowania pH zewnątrzkomórkowego wewnątrz tych biofilmów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilmy między królestwami, składające się zarówno z komórek grzybowych, jak i bakteryjnych, są zaangażowane w różne choroby jamy ustnej, takie jak infekcje endodontyczne, zapalenie przyzębia, infekcje błony śluzowej i, przede wszystkim, próchnica we wczesnym dzieciństwie. We wszystkich tych warunkach pH w matrycy biofilmu wpływa na interakcje między drobnoustrojami a gospodarzem, a tym samym na postęp choroby. Niniejszy protokół opisuje metodę opartą na mikroskopii konfokalnej do monitorowania dynamiki pH wewnątrz biofilmów między królestwami, w tym Candida albicans i Streptococcus mutans. Widmo podwójnej emisji zależne od pH i właściwości barwiące sondy ratiometrycznej C-SNARF-4 są wykorzystywane do określania spadków pH w zewnątrzkomórkowych obszarach biofilmów. Zastosowanie ratiometrii pH z sondą wymaga skrupulatnego doboru parametrów obrazowania, dokładnej kalibracji barwnika oraz starannego, opartego na progach przetwarzania końcowego danych obrazu. Przy prawidłowym zastosowaniu technika ta pozwala na szybką ocenę pH zewnątrzkomórkowego w różnych obszarach biofilmu, a tym samym na monitorowanie zarówno poziomych, jak i pionowych gradientów pH w czasie. Podczas gdy zastosowanie mikroskopii konfokalnej ogranicza profilowanie Z do cienkich biofilmów o wielkości 75 μm lub mniejszej, zastosowanie ratiometrii pH idealnie nadaje się do nieinwazyjnego badania ważnego czynnika wirulencji w biofilmach między królestwami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilmy między królestwami, zawierające zarówno gatunki grzybów, jak i bakterii, są zaangażowane w kilka stanów patologicznych w jamie ustnej. Candida spp. były często izolowane od zakażeń endodontycznych1 oraz od zmian w przyzębiu2,3. Wykazano, że w infekcjach błony śluzowej gatunki paciorkowców z grupy mitis zwiększają tworzenie biofilmu grzybów, inwazję tkanek i rozprzestrzenianie się zarówno w modelach in vitro, jak i mysich4,5,6,7. Co najciekawsze, udowodniono, że doustne nosicielstwo Candida spp. jest związane z występowaniem próchnicy u dzieci8. Jak wykazano w modelach gryzoni, symbiotyczny związek między Streptococcus mutans i Candidas albicans zwiększa produkcję zewnątrzkomórkowych polisacharydów i prowadzi do powstawania grubszych i bardziej próchnicotwórczych biofilmów9,10.

We wszystkich wyżej wymienionych warunkach, w szczególności w próchnicy we wczesnym dzieciństwie, pH biofilmu ma znaczenie dla postępu choroby, a wybitna rola matrycy biofilmu w rozwoju mikrośrodowisk kwasotwórczych11 wymaga metodologii, które pozwalają badać zmiany pH wewnątrz biofilmów między królestwami. Opracowano proste i dokładne podejścia oparte na mikroskopii konfokalnej do monitorowania pH w biofilmach bakteryjnych12 i fungal13. Dzięki barwnikowi ratiometrycznemu C-SNARF-4 i procesowi końcowemu obrazu opartemu na progach, zewnątrzkomórkowe pH można określić w czasie rzeczywistym we wszystkich trzech wymiarach biofilmu14. W porównaniu z innymi opublikowanymi technikami monitorowania pH biofilmów na podstawie mikroskopii, ratiometria pH z C-SNARF-4 jest prosta i tania, ponieważ nie wymaga syntezy cząstek lub związków, które zawierają referencyjny barwnik 15 ani stosowania wzbudzenia dwufotonowego16. Użycie tylko jednego barwnika zapobiega problemom z komoracją sondy, fluorescencyjnym przebijaniem i selektywnym wybielaniem16,17,18, jednocześnie umożliwiając niezawodne różnicowanie między wewnątrz- i zewnątrzkomórkowym pH. Wreszcie inkubacja z barwnikiem odbywa się po wzroście biofilmu, co pozwala na badanie zarówno biofilmów laboratoryjnych, jak i hodowanych in situ.

Celem obecnej pracy jest rozszerzenie zastosowania ratiometrii pH i dostarczenie metody badania zmian pH w biofilmach między królestwami. Jako dowód słuszności koncepcji, metodę tę stosuje się do monitorowania pH w dwugatunkowych biofilmach składających się z S. mutans i C. albicans narażonych na działanie glukozy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół pobierania śliny został sprawdzony i zatwierdzony przez Komisję Etyki Hrabstwa Aarhus (M-20100032).

1. Uprawa biofilmów między królestwami

  1. Uprawiaj S. mutans DSM 20523 i C. albicans NCPF 3179 na płytkach z agarem z krwią w temperaturze 37 °C w warunkach tlenowych.
  2. Przenieś pojedyncze kolonie każdego organizmu do probówek wypełnionych 5 ml naparu z mózgu, serca (BHI). Rosnąć przez 18 godzin w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C.
  3. Odwirować nocne kultury przy 1 200 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w soli fizjologicznej i dostosować OD550 nm do 0,5 dla C. albicans (~107 komórek/ml) i S. mutans (~108 komórek/ml). Rozcieńczyć zawiesinę S. mutans w stosunku 1:10 sterylną solą fizjologiczną (~107 komórek/ml).
  4. Odpipetować 50 μl sterylnego roztworu śliny, przygotowanego zgodnie z metodą de Jong et al.19, do studzienek 96-dołkowej płytki optycznej w celu mikroskopii. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć studzienki 3x 100 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Opróżnij studnie.
  5. Dodać 100 μl zawiesiny C. albicans do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 min. Przemyć 3x sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
    UWAGA: Nie opróżniaj całkowicie studzienek podczas mycia. Pozostaw zbiornik o pojemności 20 μl, aby uniknąć nadmiernych sił ścinających.
  6. Dodać 100 μl inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (inaktywowanej w temperaturze 56 °C przez 30 min) do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Przemyć 3x sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Opróżnij studzienki, pozostawiając zbiornik o pojemności 20 μl.
  7. Dodać 100 μl zawiesiny S. mutans (przygotowanej w kroku 1.3) do każdej studzienki. Dodać 150 μl BHI zawierającego 5% sacharozy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny lub dłużej. W przypadku uprawy starszych biofilmów należy codziennie zmieniać podłoże na świeże BHI. Pod koniec fazy wzrostu biofilmu między królestwami przemyj 5x sterylną solą fizjologiczną.

2. Ratiometryczne obrazowanie pH

UWAGA:Obrazowanie ratiometryczne pH musi być wykonane natychmiast po zakończeniu wzrostu biofilmu.

  1. Do ratiometrycznego obrazowania pH należy użyć odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z 63-krotną soczewką zanurzeniową w oleju lub wodzie, linią laserową 543 nm i systemem obrazowania spektralnego (tj. detektorem META), aby umożliwić obrazowanie nakładających się sygnałów fluorescencyjnych. Za pomocą inkubatora ogrzać stolik mikroskopu do temperatury 35 °C.
  2. Ustaw detektor tak, aby zapewniał detekcję zielonej fluorescencji od 576−608 nm i jednoczesną detekcję czerwonej fluorescencji od 629−661 nm. Wybierz odpowiednią moc i wzmocnienie lasera, aby uniknąć prześwietlenia i niedoświetlenia.
    UWAGA: Ekspozycja obrazów jest najlepiej widoczna na obrazach z paletą z fałszywym kolorowaniem.
  3. Ustaw rozmiar otworka na 1 jednostkę Airy lub plasterek optyczny ~0,8 μm. Ustaw rozmiar obrazu na 512 x 512 pikseli, a szybkość skanowania na 2. Wybierz średnią liniową z liczby 2, używając opcji średniej.
    UWAGA: Na początku serii eksperymentów sprawdź, czy wybrane ustawienia mikroskopu zapewniają wyraźny kontrast między komórkami bakteryjnymi, ścianami komórkowymi grzybów, matrycą biofilmu i cytoplazmą grzyba.
  4. Przygotować 100 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej zawierającego 0,4% (w/v) glukozy, miareczkowanego do pH 7. Przygotować roztwór podstawowy C-SNARF-4 (1 mM w dimetylosulfotlenku). Dodać barwnik do końcowego stężenia 30 μM.
    UWAGA: Podczas pracy z barwnikiem ratiometrycznym należy nosić rękawice nitrylowe.
  5. Opróżnij jedną ze studzienek biofilmem międzykrólestwowym, pozostawiając zbiornik o pojemności 20 μl. Dodać sterylną sól fizjologiczną zawierającą glukozę i barwnik ratiometryczny. Umieść 96-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu i rozpocznij obrazowanie biofilmu.
  6. Pozyskiwanie pojedynczych obrazów lub stosów Z w różnych miejscach biofilmu. Zaznacz pozycję X-Y w oprogramowaniu mikroskopu, aby śledzić zmiany pH w określonych polach widzenia w czasie. W regularnych odstępach czasu rób zdjęcia z wyłączonym laserem, aby skorygować przesunięcie detektora.
  7. Powtórz kroki 2.4–2.6 dla analizy każdego biofilmu wyhodowanego w innym dołku.

3. Kalibracja barwnika ratiometrycznego

UWAGA: Kalibracja barwnika i dopasowanie krzywej kalibracyjnej mogą być wykonane w innym dniu niż obrazowanie ratiometryczne pH.

  1. Przygotować serię 50 mM buforu kwasu 2-morfolinoetanosulfonowego (MES) miareczkowanego do pH 4,0−7,8 w krokach co 0,2 jednostki pH w temperaturze 35 °C. Odpipetować 150 μl każdego roztworu buforowego do studzienek 96-dołkowej płytki z dnem optycznym do mikroskopii.
  2. Dodać barwnik do wypełnionych buforem studzienek 96-dołkowej płytki do końcowego stężenia 30 μM. Pozostaw do równowagi przez 5 minut.
  3. Podgrzej stolik mikroskopu do temperatury 35 °C. Wybierz te same ustawienia mikroskopu, co w przypadku ratiometrycznego obrazowania pH. Umieść 96-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu. Skoncentruj się na dnie studni. Uzyskaj dwa obrazy (kanał zielony i czerwony) dla wszystkich roztworów buforowych, 5 μm powyżej dna studni. W regularnych odstępach czasu rób zdjęcia z wyłączonym laserem, aby skorygować przesunięcie detektora.
  4. Przeprowadzić eksperyment kalibracyjny w trzech egzemplarzach.
  5. Eksportuj wszystkie obrazy jako pliki TIF. Zaimportuj je do dedykowanego oprogramowania do analizy obrazów (np. ImageJ20). Odejmij obrazy wykonane przy wyłączonym laserze od odpowiednich obrazów roztworów buforowych, klikając przycisk Process (Proces) | Kalkulator obrazów | Odejmowanie).
    UWAGA: W razie potrzeby przytnij obrazy, aby wyeliminować artefakty na obramowaniach obrazu, wykonując prostokątne zaznaczenie za pomocą opcji Obraz | Przyciąć.
  6. Podziel obrazy kanału zielonego na obrazy kanału czerwonego i oblicz średnią intensywność fluorescencji na wynikowych obrazach, klikając przycisk Analizuj | Histogram.
  7. Na podstawie potrójnych doświadczeń wykreśl średnie proporcje koloru zielonego i czerwonego w stosunku do pH. Użyj dedykowanego oprogramowania, aby dopasować funkcję do danych kalibracyjnych (np. MyCurveFit).

4. Cyfrowa analiza obrazu

UWAGA:Cyfrowa analiza obrazu może być przeprowadzona w dowolnym momencie po kalibracji barwnika i ratiometrycznym obrazowaniu pH.

  1. Przechowuj obrazy biofilmu kanału zielonego i czerwonego w osobnych folderach i zmień nazwy obu serii plików na kolejne numery (np. GREEN_0001). Zaimportuj obrazy do dedykowanego oprogramowania do analizy obrazów (np. ImageJ). Kliknij pozycję Analizuj | Histogram, aby określić średnią intensywność fluorescencji na zdjęciach wykonanych przy wyłączonym laserze i odjąć wartość od obrazów biofilmu, klikając przycisk Process | Matematyka | Odejmować.
  2. Zaimportuj 2 serie obrazów do dedykowanego oprogramowania do analizy obrazów (np. daime21). Wykonaj segmentację obrazów kanału czerwonego na podstawie progów (Segment | Automatyczna segmentacja | Próg niestandardowy). Ustaw "niski" próg powyżej intensywności fluorescencji cytoplazmy grzyba, a "wysoki" próg poniżej intensywności ścian komórkowych grzyba i bakterii.
    UWAGA: Po wybraniu odpowiednich progów tylko obszary zewnątrzkomórkowe są rozpoznawane jako obiekty.
  3. Przenieś warstwę obiektów z serii obrazów podzielonych na segmenty do serii obrazów z kanałem zielonym. Aby to zrobić, kliknij Segment | Przenieś warstwę obiektu.
    UWAGA: Jeśli kontrast między obszarami zewnątrzkomórkowymi a cytoplazmą grzyba jest zbyt słaby w poszczególnych kanałach kolorów, dodaj serię obrazów kanału zielonego do serii kanałów czerwonych przed segmentacją, klikając Edytuj | Kalkulator obrazów | Dodatek. Wykonaj segmentację zgodnie z opisem w punkcie 4.2 i przenieś warstwę obiektów serii obrazów podzielonych na segmenty zarówno do serii obrazów kanału zielonego, jak i czerwonego.
  4. Użyj edytora obiektów, aby usunąć piksele niebędące obiektami z serii obrazów kanału czerwonego i zielonego (Visualizer | Edytor obiektów | Na wszystkich zdjęciach | Usuń piksele niebędące obiektami). Teraz obrazy biofilmu są usuwane zarówno z komórek bakteryjnych, jak i grzybiczych. Eksportuj przetworzone serie obrazów jako pliki TIF.
  5. Zaimportuj obie serie obrazów do ImageJ. ImageJ przypisuje intensywność 0 do wszystkich pikseli niebędących obiektami. Usuń te piksele, dzieląc czerwoną serię obrazów (R1) przez siebie (Process | Kalkulator obrazów | Obraz 1: R1; Operacja: Podziel; Rysunek 2: R1) i pomnożąc wynikową serię obrazów (R2) przez oryginalną czerwoną serię obrazów (Process | Kalkulator obrazów | Obraz 1: R1; Operacja: Mnożenie; Obraz 2: R2). Powstaje trzecia seria obrazów (R3), identyczna z R1, z wyjątkiem tego, że NaN jest przypisane do wszystkich pikseli o intensywności 0 w R1. Postępuj w ten sam sposób z serią zielonych obrazów.
  6. Użyj filtru "Średnia" (punkt menu Proces | Filtry | Średnia | Promień | 1 piksel) na serii obrazów kanału czerwonego i zielonego, aby skompensować szumy detektora. Podziel serię obrazów kanału zielonego przez serię obrazów kanału czerwonego (punkt menu Process | Kalkulator obrazów | Obraz 1: G3; Operacja: Podziel; Zdjęcie 2: R3). Wynikowa seria obrazów (G3/R3) pokazuje stosunek koloru zielonego/czerwonego dla wszystkich pikseli obiektu.
  7. Obliczanie średniego współczynnika dla każdego obrazu (Analizuj | Histogram). Zastosuj fałszywe kolorowanie, aby uzyskać lepszą wizualną reprezentację proporcji na obrazach (punkt menu Obraz | Tabele przeglądowe). Przeliczyć stosunek koloru zielonego/czerwonego na wartości pH, stosując funkcję zamontowaną w ppkt 3.6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po 24 h i 48 h, w płytach studziennych rozwinęły się solidne biofilmy między królestwami. C. albicans wykazywał różny stopień nitkowatego wzrostu, a S. mutans tworzył gęste skupiska o wysokości do 35 μm. Pojedyncze komórki i łańcuchy S. mutans zgrupowane wokół strzępek grzybów i dużych przestrzeni międzykomórkowych wskazywały na obecność obszernej macierzy (ryc. S1).

Kalibracja barwnika ratiometrycznego daje asymetryczną krzywą sigmoidalną

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne protokoły hodowli międzykrólestwowych biofilmów z udziałem C. albicans i Streptococcus spp. zostały opisane wcześniej 9,22,23,24,25. Jednak obecna konfiguracja koncentruje się na prostych warunkach wzrostu, harmonogramie zgodnym z regularnymi dniami roboczymi, zrównoważonym składzie gatunkowym i rozwoju obszernej matrycy biofil...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anette Aakjær Thomsen i Javier E. Garcia są doceniani za doskonałe wsparcie techniczne. Autorzy dziękują Rubensowi Spin-Neto za owocne dyskusje na temat analizy obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki z agarem do krwiStatens Serum Institut677
Napar z mózgu na serceOxoidCM1135
Napar z serca mózgu + 5 % sacharozyMateriały laboratoryjne BDH10274
Candida albicansNarodowa Kolekcja Grzybów ChorobotwórczychNCPF 3179
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG8270
daime: cyfrowa analiza obrazu w ekologii mikrobiologicznejUniversitä t WienN/A Freeware; Wersja 2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
DimetylosulfotlenekLife TechnologiesD12345
Surowica bydlęca płoduGibco Life technologies10270
Wirówka z chłodzeniem GS-6RBeckmanN/A
ImageJNational Institutes of HealthNie dotyczydarmowego oprogramowania; Wersja 1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
JavaOracleN/A Freewareniezbędne do uruchomienia ImageJ; Wersja 8.0; https://java.com/en/download
µ-Płytka 96 Well BlackIbidi89626
MyCurveFitMyAssays Ltd.N/A
kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES)Bioworld700728
PHM210 pH-metrRadiometr Analityczny
Plan-Apochromat 63-krotny obiektyw zanurzeniowy w olejuZeissN/ANA=1,4
SNARF®-4F Kwas 5-(i-6)-karboksylowy LifeTechnologiesS23920
Sterylna sól fizjologicznaVWR6404
Streptococcus mutansDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenDSM 20523
Spektrofotometr VWR V-3000PCVWRN/A
XL InkubatorPeCONN/A
Zeiss LSM 510 METAZeissN/A
Bufor

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
  2. Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527(2019).
  3. De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
  4. Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
  5. Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
  6. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967(2009).
  7. Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
  8. Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
  9. Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
  10. Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407(2017).
  11. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  12. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622(2016).
  13. Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
  14. Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
  15. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
  16. Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
  17. Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
  18. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
  19. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  21. Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
  22. Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457(2016).
  23. Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
  24. Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242(2017).
  25. Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920(2017).
  26. Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
  27. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
  28. Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
  29. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299(2011).
  30. Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
  31. Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
  32. Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Monitorowanie pH zewn trzkom rkowegoratiometria pHsonda C SNARF 4Candida albicansStreptococcus mutanswzrost biofilmusegmentacja obrazuobrazowanie fluorescencyjne

Powiązane artykuły