Charakterystyka wpływu inhibitorów migrastatycznych na inwazję sferoidalną guza 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości

Podsumowanie

Wpływ inhibitorów migracji na migrację komórek raka glejaka w trójwymiarowych (3D) testach inwazji z użyciem inhibitora deacetylazy histonowej (HDAC) charakteryzuje się mikroskopią konfokalną o wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Odkrywanie i opracowywanie leków w badaniach nad rakiem coraz częściej opiera się na badaniach przesiewowych leków w formacie 3D. Nowe inhibitory ukierunkowane na potencjał migracyjny i inwazyjny komórek nowotworowych, a w konsekwencji na przerzutowe rozprzestrzenianie się choroby, są odkrywane i rozważane jako uzupełniające metody leczenia wysoce inwazyjnych nowotworów, takich jak glejaki. W związku z tym wymagane jest generowanie danych umożliwiających szczegółową analizę komórek w środowisku 3D po dodaniu leku. Opisana tutaj metodologia, łącząca testy inwazji sferoidalnej z przechwytywaniem obrazu o wysokiej rozdzielczości i analizą danych za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM), umożliwiła szczegółową charakterystykę wpływu potencjalnego inhibitora antymigracyjnego MI-192 na komórki glejaka. Sferoidy wygenerowano z linii komórkowych do testów inwazji na 96-dołkowych płytkach o niskiej przyczepności, a następnie przygotowano do analizy CLSM. Opisany przebieg pracy był preferowany w stosunku do innych powszechnie stosowanych technik generowania sferoid zarówno ze względu na łatwość, jak i powtarzalność. To, w połączeniu ze zwiększoną rozdzielczością obrazu uzyskaną za pomocą mikroskopii konfokalnej w porównaniu z konwencjonalnymi metodami szerokokątnymi, umożliwiło identyfikację i analizę wyraźnych zmian morfologicznych w komórkach migrujących w środowisku 3D po leczeniu migrastatycznym lekiem MI-192.

Wprowadzenie

Trójwymiarowe technologie sferoidalne do przedklinicznego odkrywania leków i rozwoju potencjalnych leków na raka są coraz częściej preferowane w stosunku do konwencjonalnych badań przesiewowych leków; dlatego też obserwuje się większy rozwój leków migrastatycznych - zapobiegających migracji i inwazji. Uzasadnienie tych postępów w leczeniu nowotworów jest jasne: testy sferoidalne 3D reprezentują bardziej realistyczne podejście do badań przesiewowych potencjalnych leków przeciwnowotworowych, ponieważ wierniej naśladują architekturę guza 3D niż hodowle jednowarstwowe komórek, dokładniej podsumowują interakcje lek-guz (kinetykę) i umożliwiają charakterystykę aktywności leku w warunkach związanych z nowotworem. Ponadto, wzrost oporności na leki chemotoksyczne w wielu typach nowotworów i wysoka śmiertelność wśród pacjentów z rakiem z powodu przerzutów wzmocnionych przez zdolność komórek rakowych do migracji do odległych miejsc nowotworu przemawia za włączeniem chemioterapeutyków ukierunkowanych na potencjał migracyjny komórek nowotworowych jako leczenia uzupełniającego w przyszłych klinicznych badaniach klinicznych nad rakiem¹. Dzieje się tak szczególnie w przypadku nowotworów wysoce inwazyjnych, takich jak glejaki wielopostaciowy o wysokim stopniu złośliwości (GBM). Leczenie GBM obejmuje chirurgię, radioterapię i chemioterapię. Jednak nawet w przypadku leczenia skojarzonego u większości pacjentów dochodzi do nawrotu choroby w ciągu 1 roku od wstępnej diagnozy, a mediana przeżycia wynosi 11-15 miesięcy^2,3. W ciągu ostatnich kilku lat poczyniono ogromne postępy w dziedzinie technologii 3D: systemy obrotowe, mikrofabrykowane struktury i rusztowania 3D oraz inne indywidualne testy są stale ulepszane, aby umożliwić rutynowe testy na dużą skalę^4,5,6,7. Jednak wyniki uzyskane z tych testów muszą być analizowane w sensowny sposób, ponieważ interpretacja danych jest często utrudniana przez próby analizy danych generowanych w 3D za pomocą systemów analizy obrazów 2D.

Pomimo tego, że są preferowane pod względem szybkości pozyskiwania obrazów i zmniejszonej fototoksyczności, większość systemów o szerokim polu widzenia pozostaje ograniczona przez rozdzielczość⁸. Tak więc, oprócz odczytów danych dotyczących skuteczności leku, szczegółowy wpływ działania leku na struktury komórkowe 3D migrujących komórek jest nieuchronnie utracony, jeśli jest obrazowany przy użyciu systemu szerokokątnego. I odwrotnie, konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM) rejestruje wysokiej jakości, optycznie przekrojone obrazy, które można zrekonstruować i renderować w 3D po akwizycji za pomocą oprogramowania komputerowego. W związku z tym CLSM można łatwo zastosować do obrazowania złożonych struktur komórkowych 3D, umożliwiając w ten sposób badanie wpływu inhibitorów antymigrastatycznych na struktury 3D i dogłębne analizy mechanizmów migracji komórek. Niewątpliwie będzie to miało wpływ na przyszły rozwój leków migrastatycznych. W tym miejscu opisano połączony proces generowania sferoidów, leczenia farmakologicznego, protokołu barwienia i charakterystyki za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości.

Protokół

1. Generowanie sferoid komórkowych

Dzień 1

1. Przygotować wzorcową pożywkę hodowlaną zgodnie z wymaganiami badanej linii komórkowej.
2. Wszystkie etapy związane z hodowlą tkankową należy przeprowadzić w kapturze do hodowli tkankowej przy użyciu sterylnych technik obchodzenia się z nimi.
3. Trypsynizuj i policz komórki rakowe. Użyć 20 ml zawiesiny komórkowej na płytkę. Zawiesiny komórek należy przechowywać w wyraźnie oznakowanych, sterylnych probówkach uniwersalnych.
4. Dodaj z góry określoną liczbę komórek do każdej studzienki. Zarówno początkowa liczba komórek, jak i ostateczny wymagany rozmiar sferoidy zależą od tempa proliferacji badanej linii komórkowej.
   nuta: W przypadku ustalonych linii komórkowych glejaka, takich jak U251 i KNS42^9,10, 5 x 10³ komórki/ml wytworzą mikroskopijnie widoczną sferoidę (200 lub 800 μm) po 4 dniach inkubacji.
5. Ponownie zawieś komórki w uniwersalnych probówkach przez delikatne odwrócenie, aby uniknąć zlepiania się komórek. Odpipetować 200 μl zawiesiny komórek do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Jeśli wszystkie studzienki nie są wymagane, zaleca się dodanie 200 μl 1x PBS do każdej pustej studzienki, aby uniknąć parowania.
6. Inkubować komórki w inkubatorze w normalny sposób w temperaturze 37 °C.
   nuta: Linie komórkowe, takie jak linie komórkowe raka glejaka, utworzą sferoidy w ciągu 24 godzin. Pozwól na uformowanie się architektury komórkowej 3D poprzez inkubację sferoidy przez 72 godziny.

Dzień 2

7. Sprawdź komórki za pomocą mikroskopii w jasnym polu po 24 godzinach. W zależności od linii komórkowej, komórki mogły utworzyć sferoidę wykrywalną na dnie studzienki.
   nuta: Ustalone linie komórkowe raka glejaka łatwo tworzą sferoidy w ciągu 24 godzin. Linie komórkowe raka glejaka pochodzące od pacjenta mogą trwać do 1-2 tygodni.

2. Test inwazji kolagenu

Dzień 3

1. Umieść kolagen, 5x pożywkę hodowlaną, 1 M NaOH i jedną probówkę 20 ml na lodzie.
2. Ostrożnie i powoli dodaj 10,4 ml zimnego kolagenu do schłodzonej probówki hodowlanej. Unikaj bąbelków. Taka ilość kolagenu wystarcza na jedną płytkę 96-dołkową. Skalowanie w górę jest możliwe, ale zaleca się przygotowanie jednej probówki o pojemności 20 ml na płytkę na raz.
3. Delikatnie dodaj 1,52 ml zimnej sterylnej pożywki 5x. Unikaj bąbelków.
4. Tuż przed użyciem delikatnie dodać 72 μL zimnego, sterylnego 1 M NaOH. Roztwór należy przechowywać na lodzie.
5. Delikatnie wymieszać, pipetując. Unikaj bąbelków. Wydajne mieszanie prowadzi do zmiany koloru (z czerwonego na pomarańczowo-czerwony (pH 7,4) w pożywce. Pozostaw mieszaninę na lodzie do czasu użycia.
6. Kluczowy krok: Usunąć 190 μl supernatantu z 96-dołkowej płytki przygotowanej w dniu 1. Uważaj, aby nie przeszkadzać sferoidom, które utworzyły się na dnie studni. Używaj pipety pod kątem w stronę boku, a nie do środka studni.
7. Delikatnie dodaj 100 μl mieszanki kolagenowej do każdego dołka. Aby zapobiec zakłóceniom sferoidalnym, odpipetuj mieszaninę wzdłuż boku studzienki. Unikaj bąbelków. Pozostałą mieszankę kolagenu w probówce o pojemności 20 ml należy przechowywać w temperaturze pokojowej, aby ocenić polimeryzację.
8. Inkubować płytkę w inkubatorze przez co najmniej 10 minut, aby umożliwić polimeryzację kolagenu. Jako wskazówkę, jeśli resztki kolagenu stwardniały, stając się półstałe i gąbczaste, sferoidy są gotowe do leczenia inhibitorem.
9. Dodaj leki lub inhibitory w stężeniu 2x do pożywki hodowlanej. Delikatnie dodaj pożywkę do każdej studzienki (100 μl na studzienkę). Ponownie odpipetuj pożywkę z boku studzienki, aby uniknąć zakłóceń sferoidalnych.
10. Obserwuj i zobrazuj każdą sferoidę za pomocą mikroskopii jasnego pola w czasie T = 0 h, 24 h, 48 h i 72 h, aby ocenić aktywność leku. Następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
    nuta: W zależności od inwazyjnego zachowania linii komórkowej, migrację od pierwotnego rdzenia sferoidalnego można zaobserwować od 24 godzin.

3. Przygotowanie sferoid osadzonych w kolagenie i komórek migrujących do mikroskopii konfokalnej

1. Umieścić płytkę w kapturze do hodowli tkankowej i delikatnie usunąć supernatant (200 μl). Ponownie należy uważać, aby nie naruszyć sferoidy i unikać dotykania kolagenu, ponieważ może to kolidować z korkiem kolagenowym.
2. Zastąp supernatant 100 μl 1x PBS. Powtórz ten krok prania 3 razy.
3. Usuń końcowe płukanie i zastąp 4% formaldehydem w 1x PBS (100 μL na studzienkę).
   ostrożność: Formaldehyd jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym. Obchodź się z nią ostrożnie, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa.
4. Umieść 96-dołkową płytkę na stole laboratoryjnym, przykryj folią i pozostaw na 24 godziny w temperaturze pokojowej.
5. Ostrożnie usuń formaldehyd i zastąp go 1x PBS. Powtórz to 1x pranie PBS 3x.
6. Przygotuj 0,1% Triton X-100 w 1x PBS. Usunąć 1x PBS wash i zastąpić 100 μl roztworu Triton X-100. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj roztwór blokujący z 1x PBS i 0,05% odtłuszczonego mleka w proszku i dokładnie wymieszaj.
7. Wyjmij Triton X-100 i umyj 3x 1x PBS. Dodać 100 μl roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut.
8. Rozcieńczyć wymagane przeciwciało pierwszorzędowe w buforze blokującym w ustalonym stężeniu. Tutaj użyj przeciwciała przeciwko mysiej acetylowanej tubulinie IgG (1:100).
9. Odwirować mieszaninę pierwotnych blokujących przeciwciała przez 5 minut przy 15 682 x g. Ostrożnie usunąć roztwór blokujący i dodać supernatant (25−50 μl) do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
10. Usunąć roztwór przeciwciała i przemyć 3x 1x PBS (100 μL na studzienkę).
11. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym w zalecanym lub z góry określonym stężeniu, jako dodatek do wszelkich dodatkowych barwników fluorescencyjnych. Tutaj użyj przeciwciała sprzężonego 1:500 anty-mysiego fluoroforu-488, falloidyny-594 (1:500) do barwienia aktyny i barwienia DNA (DAPI).
12. Ponownie odwirować wtórny roztwór przeciwciała przez 5 minut przy 13 000 obr./min.
13. Usuń roztwór blokujący z każdej studzienki i dodaj 25-50 μl mieszanki przeciwciał drugorzędowych / falloidyny / DAPI. Inkubować w ciemności przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
14. Usunąć wtórny roztwór barwnika przeciwciała i przemyć 3x 1x PBS (100 μL na studzienkę).
15. Ostrożnie podnieś poszczególne korki kolagenowe przez odsysanie plastikową pipetą (200 μl) na środek wysokiej jakości szkiełka podstawowego ze szkła.
16. Dodaj jedną kroplę odpowiedniego mocowania do korka kolagenowego, upewniając się, że korek jest całkowicie zakryty. Unikaj bąbelków.
17. Nałożyć szkiełko nakrywkowe o grubości optymalnej dla obiektywu mikroskopu, który będzie używany do obrazowania i pozostawić na noc. Przechowuj szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności.

4. Mikroskopia fluorescencyjna

1. Uchwyć obrazy fluorescencyjne za pomocą odpowiedniego mikroskopu konfokalnego.

Wyniki

Technologia trójwymiarowych sferoidów przyczynia się do lepszego zrozumienia oddziaływań między lekami a guzami, ponieważ w większym stopniu odzwierciedla ona specyficzne środowisko nowotworowe. Generowanie sferoidów można przeprowadzić na kilka sposobów; w niniejszym protokole wykorzystano płytki 96-dołkowe o niskim stopniu przylegania. Po przetestowaniu kilku produktów różnych producentów, wybrano płytki użyte w tej metodzie, ponieważ wykazywały one najstabilniejsze wyniki pod kątem sku...

Dyskusja

Opisano nowy sposób tworzenia sferoid komórek nowotworowych w celu identyfikacji migracyjnej aktywności leków za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Zastosowanie płytek o niskiej przyczepności w porównaniu z innymi technikami, takimi jak wiszące krople¹⁵, ułatwiło generowanie powtarzalnych i jednolitych sferoid do stosowania w testach migracji i inwazji kolagenu. Punktami krytycznymi w tym protokole są usunięcie pożywki wzrostowej z płytki 96-dołkowej przed osadzeniem sferoid...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagen I, ogon szczura, 100 mg	Corning	354236	do testu inwazji glejaka; jest on oferowany przez wielu dystrybutorów/producentów i będzie musiał zostać określony zarówno dla rodzaju zamierzonego testu, jak i użytych linii komórkowych. W przypadku linii komórkowych raka glejaka preferowanym wyborem jest kolagen szczurzego ogona typu 1 (np. Corning). Kolagen powinien być przechowywany w temperaturze 4 stopni; C, w ciemności, dopóki nie będzie to wymagane. Nie zaleca się mieszania kolagenu z różnych partii, ponieważ może to wpłynąć na konsystencję spolimeryzowanego kolagenu.
Szkiełka nakrywkowe	różne		do obrazowania mikroskopowego,
proszek DMEM	Sigma	D5648	potrzebny w stężeniu 5x do roztworu kolagenu do testu inwazji glejaka;   Można go nabyć w postaci sproszkowanej, przygotowanej w podwójnie destylowanej wodzie i, w zależności od końcowego składu pożywki, uzupełnionej wszelkimi wymaganymi dodatkami. Kompletny roztwór 5x należy przefiltrować przez strzykawkowy system filtracyjny (0,22 μ m) przed użyciem.
Surowica cielęca płodu	Sigma	F7524-500ML	potrzebna do hodowli komórek linii komórkowych glejaka
Szkiełka	podstawowe różne		do obrazowania mikroskopowego
DMEM o wysokim poziomie glukozy	Gibco	41965062	potrzebne do hodowli komórkowej linii komórkowych glejaka
Inhibitor	Tocris	różne	różne - według projektu eksperymentalnego; inhibitory można kupić od producentów takich jak Selleckchem i Tocris. Producenci ci oferują szczegółowy opis charakterystyki inhibitora, linki do powiązanych odniesień i sugestie dotyczące stężeń roboczych. Podobnie jak w przypadku wszystkich inhibitorów, mogą one być potencjalnie toksyczne i należy się z nimi obchodzić zgodnie z wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa. Inhibitory są przygotowywane w postaci roztworów podstawowych zgodnie z zaleceniami producenta. Jako przykład użyliśmy inhibitora migrastatycznego MI-192, aby zademonstrować zastosowanie takich inhibitorów. Przetestowaliśmy w ten sposób szereg inhibitorów migrastatycznych z porównywalnymi wynikami.
Mocowanie	różne	różne	do obrazowania mikroskopowego
NaOH (1 M)	różne	różne	NaOH można kupić o wymaganej molowości lub przygotować z postaci stałej. Przygotowany roztwór należy wysterylizować filtrem za pomocą systemu filtrów strzykawkowych. Jeden M NaOH jest i należy zachować ostrożność podczas przygotowywania roztworu.
Paraformaldehyd	różne	różne	do mocowania sferoid i komórek; uzupełniać w 4%, zachować ostrożność zagrożenie dla zdrowia, upewnić się, że przestrzegane są przepisy BHP dotyczące roztworu kolagenu do testu inwazji
Pasety (pipeta z podziałką, 3 ml)	różne	różne	do testu inwazji, usuwanie
roztworu PBS, sterylne do hodowli tkankowej	Sigma	D1408-500ML	potrzebne do hodowli komórkowej linii komórkowych glejaka i myjek do barwienia
Pióro / paciorkowiec (antybiotyki)	Sigma	P4333	potrzebna do hodowli komórkowej linii komórkowych glejaka
Przeciwciało pierwszorzędowe, przeciwciało drugorzędowe, DAPI, falloidyna	różne	różne	istnieje wielu producentów tych odczynników, dla przeciwciał znakowanych wtórnie zalecamy Alexa Fluor (sondy molekularne). Tutaj użyliśmy mysiego przeciwciała przeciwko acetylowanej tubulinie (1/100, Abcam). Do przeciwciał drugorzędowych użyliśmy przeciwciała skoniugowanego 1/500 anty-mysiego Alexa Fluor 488, sondy molekularne. Do barwienia jądrowego użyliśmy DAPI (wielu producentów) i barwnika aktynowego Phalloidin (wielu producentów), oba w zalecanym rozcieńczeniu 1/500.
Wodorowęglan sodu	Sigma	S5761	potrzebny do roztworu kolagenu do testu inwazji glejaka w stężeniu 5x
Pirogronian sodu	Sigma	P5280	potrzebny do roztworu kolagenu do testu inwazji glejaka w stężeniu 5x
Trypsyna	Sigma	T4049	do trypsynizacji
Płytki mocujące o ultra niskim poziomie	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	do testu inwazji glejaka; Wymagana jest płytka o niskiej przyczepności, przy czym preferowane są płytki 96-dołkowe, aby umożliwić badania przesiewowe badanych związków na dużą skalę. Na rynku dostępnych jest kilka płyt o niskiej przyczepności; Zaleca się testowanie różnych płytek w celu optymalnego generowania sferoidów. Z naszego doświadczenia wynika, że Costar Ultra Low Cluster z pokrywką, z okrągłym dnem, najlepiej sprawdza się w generowaniu sferoid z komórek raka glejaka pod względem 100% tworzenia sferoidów i odtwarzalności. Płytki te zostały również z powodzeniem wykorzystane do wytworzenia sferoid glejaka z materiału pochodzącego od pacjenta, komórek raka pęcherza moczowego i jajnika w naszym laboratorium. Ponadto w tych płytkach można zastosować neurosfery pnia lub progenitorowe, aby ułatwić generowanie standaryzowanych neurosferyczno-sferoidalnych
Pasiaków (pipety serologiczne, sterylne, 5 ml i 10 ml)	różne, np. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	do hodowli tkankowych i preparatu kolagenu
Różne wielokanałowe (50 - 250 μ L) i pipety jednokanałowe (10 μ L, 50 i mu; L, 200 μ L 1 mL)	różne		różne do obsługi komórek i sferoid
Mikroskopia szerokokątna	różne	różne	do obserwacji generowania sferoidów i obrazowania sferoidalnego; tutaj obrazy fluorescencji szerokokątnej zostały wykonane za pomocą systemu obrazowania komórek EVOS FL (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM wyposażony w obiektyw olejowy Plan Apochromat 63x 1.4 NA	Cytat Zeiss	od producenta	Obrazy konfokalne zostały wykonane za pomocą obiektywu olejowego Zeiss LSM 880 CLSM wyposażonego w obiektyw olejowy Plan Apochromat 63x 1.4 NA. Diody 405nm, 458/488/514 nm argon multiline i HeNe 594nm zostały użyte do wzbudzenia odpowiednio Phalloidine 594, Alexa Fluor 488 i DAPI. Dla każdego obrazu zarejestrowano pojedynczy reprezentatywny przekrój optyczny, przy czym wszystkie ustawienia, zarówno przed, jak i po zarejestrowaniu obrazu, zostały zachowane w celach porównawczych. Wszystkie obrazy zostały następnie przetworzone przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do obrazowania Zen i programu Adobe Photoshop.